Summary
Die Rolle der kürzlich entdeckten krankheitsassoziierten Gene bei der Pathogenese neuropsychiatrischer Störungen bleibt unklar. Eine modifizierte bilaterale in utero Elektroporation Technik ermöglicht den Gentransfer in großen Populationen von Neuronen und Untersuchung der ursächlichen Auswirkungen von Genexpressionsänderungen auf das Sozialverhalten.
Abstract
Da genomweite Assoziationsstudien die heterogenen genetischen Grundlagen vieler neurologischer Erkrankungen beleuchten, steigt die Notwendigkeit, den Beitrag bestimmter Gene zur Entwicklung und Funktion des Gehirns zu untersuchen. Sich auf Mausmodelle zu verlassen, um die Rolle spezifischer genetischer Manipulationen zu untersuchen, ist nicht immer möglich, da transgene Mauslinien recht teuer sind und viele neuartige krankheitsassoziierte Gene noch keine kommerziell verfügbaren genetischen Linien haben. Darüber hinaus kann es Jahre der Entwicklung und Validierung dauern, um eine Mauslinie zu erstellen. In der Gebärmutter bietet die Elektroporation eine relativ schnelle und einfache Methode, die Genexpression in einer zelltypspezifischen Weise in vivo zu manipulieren, die nur die Entwicklung eines DNA-Plasmids erfordert, um eine bestimmte genetische Manipulation zu erreichen. Bilateral ein utero Elektroporation kann verwendet werden, um große Populationen von frontalen Kortex pyramidalen Neuronen zu zielen. Die Kombination dieser Gentransfermethode mit Verhaltensansätzen ermöglicht es, die Auswirkungen genetischer Manipulationen auf die Funktion präfrontaler Kortexnetzwerke und das soziale Verhalten von jugendlichen und erwachsenen Mäusen zu untersuchen.
Introduction
Genomweite Assoziationsstudien (GWAS) haben die Entdeckung neuartiger Kandidatengene vorangetrieben, die mit Hirnpathologienverbundensind 1,2,3,4. Diese Studien waren besonders nützlich beim Verständnis verheerender neuropsychiatrischer Störungen wie Schizophrenie (SCZ), wo die Untersuchung neuartiger Gene als Ausgangspunkt für neue Forschungslinien und therapeutischeInterventionendiente 5,6. Gene, die ein Risiko für SCZ bergen, zeigen eine voreingenommene Expression im präfrontalen Kortex (PFC) während der pränatalen und frühen postnatalen Entwicklung, einer Region, die in die Pathologie mehrerer neuropsychiatrischer Erkrankungen verwickelt ist7. Zusätzlich weisen Mausmodelle psychiatrischer Störungen eine abnormale Aktivität in PFC-Netzwerken6,8,9auf. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass SZC-assoziierte Gene eine Rolle bei der Entwicklungsverdrahtung dieser Region spielen könnten. Weitere Untersuchungen mit Tiermodellen sind erforderlich, um den Beitrag dieser Kandidatengene zur Etablierung von Verbindungen im PFC zu verstehen und festzustellen, ob diese Gene eine ursächliche Rolle bei der Pathogenese neuropsychiatrischer Störungen spielen. Genetische Manipulationstechniken bei Mäusen, die die Untersuchung von Genexpressionsänderungen an bestimmten neuronalen Schaltkreisen während der pränatalen und frühen postnatalen Entwicklung ermöglichen, sind eine vielversprechende Methode, um die molekularen Mechanismen zu verstehen, die Genexpressionsänderungen mit PFC-Dysfunktion verknüpfen.
Genetische Mauslinien bieten eine Methode, um die Auswirkungen bestimmter Gene auf die Entwicklung und Funktion des Gehirns zu untersuchen. Die Abhängigkeit von transgenen Mäusen kann jedoch einschränkend sein, da es nicht immer kommerziell verfügbare Linien gibt, um die Auswirkungen bestimmter Gene auf die Entwicklung neuronaler Schaltkreise zu untersuchen. Darüber hinaus kann es extrem teuer und zeitaufwändig sein, benutzerdefinierte Mauslinien zu entwickeln. Die Verwendung von intersektionalen genetischen Manipulationsstrategien, die transgene Mäuse mit viralen Ansätzen kombinieren, hat das Verständnis des Gehirns revolutioniert10,11,12. Trotz vieler Fortschritte haben virale Strategien je nach viralem Vektortyp gewisse Einschränkungen, einschließlich Beschränkungen der Verpackungskapazität, die die virale Expression13 einschränken können, und die Zelltoxizität im Zusammenhang mit der viralen Expression14. Darüber hinaus erfordert eine robuste Genexpression mit Adeno-assoziierten Viren (AAVs) unter den meisten experimentellen Bedingungen etwa 2 bis 4 Wochen15, was routinemäßige virale Strategien unmöglich macht, um Gene während der frühen postnatalen Entwicklung zu manipulieren.
In der Utero-Elektroporation (IUE) ist ein alternativer Ansatz, der einen schnellen und kostengünstigen Gentransfer16,17 ermöglicht, der in Verbindung mit fluoreszierender Etikettierung und pharmakogenetischen oder optogenetischen Ansätzen eine leistungsstarke Plattform bietet, um die Funktion neuronaler Schaltkreise zu sezieren. Darüber hinaus können mit der Entwicklung von CRISPR-Cas9 Genom-Editing-Genen überexprimiert oder präzise verändert werden, indem zelltypspezifische Knock-down oder Knock-out von bestimmten Genen oder durch die Modulation der Promotoren18,19. Genmanipulationsansätze mit IUE sind besonders vorteilhaft, wenn die Wirkung von Genen auf neuronale Schaltkreise während schmaler Entwicklungsfenster getestet werden muss20. IUE ist eine vielseitige Technik und Überexpression kann leicht erreicht werden, indem ein Gen in einen Expressionsvektor unter einem bestimmten Promotor eingefügt wird. Eine zusätzliche Kontrolle der Genexpression kann erreicht werden, indem die Expression mit Promotoren unterschiedlicher Stärken angetrieben wird oder induzierbare Promotoren verwendet werden, die in der Lage sind, die Genexpression zeitlich zu kontrollieren21,22. Darüber hinaus ermöglicht IUE die Ausrichtung von Zellen innerhalb bestimmter kortikaler Schichten, Zelltypen und Hirnregionen, was nicht immer mit anderen Ansätzen möglich ist5,17. Jüngste Fortschritte in der IUE-Konfiguration auf der Grundlage der Verwendung von drei Elektroden, die eine effizientere Verteilung des elektrischen Feldes erzeugen, haben das funktionelle Repertoire dieser Methode erweitert und es Wissenschaftlern ermöglicht, neue Zelltypen anzusprechen und die Effizienz, Genauigkeit und Anzahl der Zellen zu erhöhen, die zielgerichtet sein können23,24. Diese Technik wurde vor kurzem verwendet, um die ursächliche Rolle der Komplementkomponente 4A (C4A), ein Gen, das mit SCZ verbunden ist, in der PFC-Funktion und frühen Kognition zu bestimmen5.
Präsentiert wird hier eine experimentelle Pipeline, die Gentransferansätze kombiniert, um große Populationen von exzitatorischen Neuronen im frontalen Kortex, einschließlich der PFC, mit Verhaltensparadigmen zu erreichen, die nicht nur die Untersuchung von Zell- und Schaltkreis-Änderungen ermöglichen, sondern auch die Überwachung des Verhaltens während der frühen postnatalen Entwicklung und des Erwachsenenalters ermöglicht. Zuerst beschrieben ist eine Methode, um große Populationen von Schicht (L) 2/3 pyramidalen Neuronen in frontalen kortikalen Regionen bilateral zu transfekieren. Als nächstes werden Aufgaben zur Assay-Sozialverhalten bei jugendlichen und erwachsenen Mäusen skizziert. Zellzählungen können nach Abschluss von Verhaltensaufgaben ermittelt werden, um das Ausmaß und die Position der Zelltransfektion zu quantifizieren. Darüber hinaus kann die Anzahl der transfizierten Zellen mit Verhaltensdaten korreliert werden, um festzustellen, ob eine größere Anzahl transfizierter Zellen zu größeren Verhaltensstörungen führt.
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Protocol
Alle experimentellen Protokolle wurden gemäß den Richtlinien der National Institutes of Health (NIH) für die Tierforschung durchgeführt und vom Boston University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) genehmigt.
1. DNA-Lösungsvorbereitung
- Kaufen Sie ein kommerzielles Plasmid oder subklonieren Sie ein Gen von Interesse in Plasmid mit gewünschtem Promotor. Hierbei wurde ein Plasmid verwendet, das EGFP unter dem CAG-Promotor (pCAG-EGFP) enthält.
HINWEIS: Bestimmen Sie den gewünschten Promotor basierend auf der erforderlichen Ausdrucksebene. Im Allgemeinen können Plasmide unter dem CAG-Promotor verwendet werden, um hohe Konzentrationen des Transgens zu erreichen, während zelltypspezifische Promotoren (z. B. Synapsin für Neuronen) tendenziell weniger aktiv sind. Der Experimentator sollte empirisch die geeigneten Expressionsniveaus für jedes Plasmid bestimmen. - Transformieren Sie Bakterien und wachsen Bestände in bakteriellen Medien mit dem entsprechenden Antibiotikum.
- Entfernen Sie kompetente Zellen (DH5-Zellen) von -80 °C und tauen Sie 20 min auf Eis.
- Mischen Sie 100 pg -100 ng der Plasmid-DNA mit 30 l kompetenten Zellen. Inkubieren Sie die Mischung auf Eis für 20 min.
- Führen Sie einen Hitzeschock durch Inkubieren in einem 42 °C-Wasserbad für 45 s und dann die Röhre zurück auf Eis für 2 min.
- Fügen Sie den transformierten, kompetenten Zellen 200 - 1.000 L LB-Medien hinzu und wachsen Sie 45 min bei 37 °C auf einem Schüttelinkubator.
- Platte 200 l der umgewandelten Zellen in eine LB-Agarplatte, die das entsprechende Antibiotikum enthält, und bebrütet die Platte über Nacht bei 37 °C.
- Am nächsten Tag eine Bakterienkolonie in 200 ml LB-Brühe mit dem entsprechenden Antibiotikum bei 37 °C auf einem Schüttelinkubator über Nacht bebrüten.
- Reinigen Sie die Plasmid-DNA mit einem Maxiprep-Kit.
- Befolgen Sie die Anweisungen im erhaltenen maxiprep Kit. Für Elutionsschritt, nicht elute DNA in den Elutionspuffer. Stattdessen wird die DNA entweder mit 200 l sterilem 1x PBS oder molekularem Wasser verwendet.
- Stellen Sie sicher, dass die Endkonzentration der DNA größer als 1 g/l ist. Wenn das Plasmid, das das betreffende Gen enthält, kein Reportergen enthält, bereiten Sie auch ein Plasmid vor, um mit einem Reportermolekül, wie grünem Fluoreszenzprotein (GFP), mitzutranssektieren, um die Visualisierung transfizierter Zellen zu ermöglichen.
- Bereiten Sie die DNA-Lösung für die Operation vor, indem Sie die Plasmid-DNA in 1x PBS auf 1 g/l Endkonzentration jedes Plasmids verdünnen. Fügen Sie der DNA-Lösung einen schnellen grünen Farbstoff zu einer Endkonzentration von 0,1% hinzu. Für bilaterale Injektionen 60 l Lösung pro Damm (für ca. 10 Welpen) vorbereiten.
HINWEIS: Wenn Plasmid kein Reportergen enthält, ko-elektroporate mit GFP. Die Co-Elektroporationsraten liegen in der Regel bei 95 % oder höher. In unseren Händen wurde die Transfektionseffizienz durch die Kotransfektion nicht beeinträchtigt. Alle elektroporated Plasmide sollten auf 1 g/l verdünnt werden.
2. Bestellung oder Zucht von zeitschwangeren Mäusen
- Wenn Sie zeitschwangere Mäuse bestellen, bestellen Sie Mäuse, am embryonalen Tag (E) 13 oder früher anzukommen, damit die Muttertiere genügend Zeit haben, sich an tierisch zu akklimatisieren. In diesem Protokoll werden CD-1-Auszuchtmäuse für alle Experimente verwendet.
HINWEIS: Die Bestellung ein paar Tage im Voraus wird den Stress der Tiere reduzieren und zu einer höheren Überlebensrate der Welpen führen. - Wenn Sie zeitschwangere Mäuse züchten, paaren Sie weibliche Mäuse über Nacht, einmal pro Woche, mit einem Männchen. Überprüfen Sie, ob am nächsten Morgen (E0.5) ein Vaginalstecker vorliegt. Bestimmen Sie die Schwangerschaft, indem Sie das Gewicht der weiblichen Mäuse überwachen.
HINWEIS: Verschiedene Mausstämme haben unterschiedliche Gewichtszuwächse während der Schwangerschaft, so bestimmen typische Gewichtszunahme für die Maus Stamm verwendet. - Ob Bestellung oder Zucht der Mäuse, um Stress der Dämme zu reduzieren, legen Sie ein Nistpad und Maushaus in den Käfig. Die Reduzierung von Stress kann dazu beitragen, die Überlebensrate der Welpen zu erhöhen.
3. Design und Montage von drei ZinkenElektrode
- Verwenden Sie Titanbleche der Sorte 2 mit einer Dicke von 0,063 in als Lagermaterial für Elektrodenkontakte.
- Mit Standard-Bearbeitungstechniken oder Präzisionshandwerkzeugen, elektroden mit den folgenden Abmessungen: 20 mm x 5 mm mit einer abgerundeten Spitze und gerillten Rücken. Entfernen Sie alle rauen Kanten oder Grate mit feinem Sandpapier.
- Um die Elektrodenkontakte zu verdrahten, wickeln Sie 22 G litzenden Kupferdraht um die Nuten der Elektrode und sichern Sie durch Löten. Schützen Sie dieses Gelenk mit Schrumpfschläuchen.
- Befestigen Sie dann die angeschlossene Elektrode an autoklavierbaren, nicht-leitenden Zangen mit einem zusätzlichen Schrumpfschlauch, um die beiden negativen Elektroden herzustellen. Befestigen Sie die einzelne positive Elektrode an einem autoklavierbaren, nichtleitenden Material (z. B. einem Zahnbürstengriff mit abgesägtem Kopf). Passen Sie das offene Ende des Drahtes mit einem Standard-Bananenstecker an.
4. Vorbereitung auf die Operation
- Bringen Sie schwangere Muttertiere mindestens 30 min vor der Operation in den Operationsbereich, um die Reduzierung des Stressniveaus nach dem Transport aus der Tiereinrichtung zu ermöglichen.
- Sterilisieren Sie die gesamte Operationsstelle mit sterilisierenden keimtötenden Tüchern und dann 70% Ethanol. Handschuhe wechseln, bevor Sie mit der Operation beginnen.
- Sterilisieren Sie autoklavierte Werkzeuge in einem Glasperlensterilisator.
- Sterile 1x PBS (ca. 50 ml pro Damm) auf 50 ml konische Rohre übertragen und in einem Rohrträger in das auf 38-40 °C erhitzte Wasserbad legen. Überprüfen Sie die sterile Saline-Temperatur mit einem Thermometer.
- Schalten Sie die Wasserwärmeumwälzpumpe so ein, dass sie vor Beginn der Operation auf 37 °C erwärmt wird. Dadurch wird die Körpertemperatur der Maus für die Dauer der Operation beibehalten.
- Schalten Sie den Druckinjektor und Elektroporator ein und sorgen Sie für die ordnungsgemäße Funktion vor der Operation.
- Drehen Sie die Plasmid-DNA-Lösung (in Schritt 1.4 erhalten) kurz auf einer Tischzentrifuge und legen Sie sie auf Eis.
- Ziehen Sie Glaspipetten auf einen Pipettenzieher, so dass die Spitze der gezogenen Glaspipette einen Durchmesser von ca. 50 m hat.
- Füllen Sie die Pipette mit einer DNA-Lösung von 20-40 l (in Schritt 1.4 erhalten).
- Richten Sie alle notwendigen Gegenstände für die Chirurgie einschließlich Haarentfernung Lotion, Jod, 70% Ethanol, Baumwoll-Swaps, Augensalbe, Nähte, Gaze, etc.
- Bereiten Sie ein Operationsblatt vor und füllen Sie die notwendigen Informationen aus, wie Z. B. Maus-ID und Gewicht, Datum der Operation, Name des Chirurgen usw.
5. In der Utero-Elektroporationschirurgie
- Wiegen Sie die Maus vor der Operation und notieren Sie dies auf dem Operationsblatt.
- Anästhetisieren Sie eine trächtige Maus (E16) durch Einatmen in einer Induktionskammer mit 4% (v/v) Sauerstoff-Isofluran-Gemisch. Sobald die Maus induziert wurde, bewegen Sie sich zu einer Maskeninhalation und halten Sie Isofluran bei 1-1,5% (v/v) und überwachen Sie die Atmung während der gesamten Operation. Überprüfen Sie, ob die Maus vollständig beästhebt ist, sollte die Atemrate 55-65 Atemzüge pro Min. betragen.
- Präoperative Analgetika verabreichen: Buprenorphin (3,25 mg/kg; SC) und Meloxicam (1–5 mg/kg; SC) bei einem maximalen Volumen von 10-30 ml/kg.
- Verwenden Sie Haarentfernungscreme oder verwenden Sie vorsichtig ein Rasiermesser, um das Fell aus dem Bauch zu entfernen. Sterilisieren Sie den Bauch durch Abstrichen mit Povidon-Jod und 70% Ethanol und wiederholen Sie dies mindestens 3 Mal. Erstellen Sie ein steriles Feld um den Bauch mit einer sterilen Gaze, sterile Drapieren kann auch verwendet werden.
- Machen Sie einen Mittellinienschnitt (3-4 cm) in der Bauchhaut, sicher, die Haut mit Zangen zu heben, um zu vermeiden, durch den Muskel zu schneiden. Dann durch den Muskel schneiden, wieder darauf achten, den Muskel zu heben, um zu vermeiden, wichtige Organe zu schneiden.
- Ziehen Sie die Uterushörner vorsichtig mit Ringzangen aus dem Damm und legen Sie sie sanft auf das sterile Feld, um sicherzustellen, dass das Gebärmutterhorn mit Polsterung gestützt wird und nicht zu weit vom Damm entfernt ist. Von diesem Punkt an halten Sie das Gebärmutterhorn während des Rests der Operation mit dem vorgewärmten sterilen 1x PBS befeuchtet.
- Positionieren Sie einen Embryo mit Zangen oder Fingern. Legen Sie die gezogene Glaspipette vorsichtig in einem 45-Grad-Winkel in Bezug auf die horizontale Ebene des Kopfes ein und werden in den seitlichen Ventrikel eingeführt, der visuell zwischen der Mittellinie des Gehirns und des Auges identifiziert werden kann. Injizieren Sie etwa 2-3 l in jeden seitlichen Ventrikel, indem Sie entweder die Pipette in eine und dann in die andere Herzkammer (empfohlen) oder indem Sie die DNA-Lösung in einen Ventrikel injizieren, bis sie in beide seitlichen Ventrikel gelangt. Der Ventrikel wurde erfolgreich gezielt, wenn nach der Injektion eine Halbmondform vorhanden ist.
HINWEIS: Die Spitze der Glaspipette könnte während der Operation brechen. Wenn dies geschieht, ersetzen Sie die Glaspipette, um sicherzustellen, dass die Uterushörner befeuchtet gehalten werden, während eine neue Pipette vorbereitet und mit der DNA-Lösung gefüllt wird. - Um Zellen bilateral im frontalen Kortex zu transfekten, positionieren Sie die beiden negativen Elektroden an den Seiten des Embryos kopf nur seitlich und leicht kaudal zu den seitlichen Ventrikeln und positionieren Sie die positive Elektrode zwischen den Augen, direkt vor der sich entwickelnden Schnarbe.
- Stellen Sie sicher, dass der Embryo großzügig befeuchtet ist. Wenden Sie vier quadratische Impulse an (Pulsdauer = 50 ms Dauer, Pulsamplitude = 36 V, Interpulsintervall = 500 ms).
- Injizieren und elektroporate alle Embryonen, gehen nacheinander, so dass jeder Embryo sofort nach der INJEKTION der DNA-Lösung elektroporating wird. Sobald alle Embryonen elektropoiert sind, setzen Sie die Uterushörner vorsichtig wieder in die Bauchhöhle ein. Während dieses Schritts, beschichten Sie die Bauchhöhle in sterilen PBS (1x) zur Unterstützung der Uterushornplatzierung.
- Füllen Sie die Bauchhöhle mit sterilen 1x PBS, so dass keine Lufttaschen übrig bleiben, nachdem die Naht abgeschlossen ist. Besinnen Sie den Muskel mit resorbierbaren Nähten und die Haut mit Seide nicht resorbierbaren Nähten.
- Lassen Sie den Damm in einer beheizten Kammer für mindestens 1 h vollständig erholen. In den nächsten 48 h, überprüfen Sie die Dämme regelmäßig. Wenn sich der Damm von der Anästhesie erholt und das Bewusstsein wiedererlangt, beginnt er sich zu bewegen und zu flüstern.
- Verabreichen Sie postoperative Analgetika, wenn Dämme Anzeichen von Schmerzen zeigen, wie z. B. ihren Körper aufzurichten und schnell zu atmen. Nur verabreichen, wenn es Anzeichen von Schmerzen gibt, da SC-Injektionen die Dämme belasten könnten, aber wenn sie der experimentellen Gruppe verabreicht wird, wird auch an die Kontrollgruppe verabreicht, oder umgekehrt.
6. Frühes Sozialverhalten in einer mütterlichen Interaktionsaufgabe
HINWEIS: Dieses Protokoll wurde an frühere Veröffentlichungen5,25angepasst. Führen Sie diese Aufgabe aus, nachdem Mäuse vom postnatalen Tag (P) 18-21 geboren wurden.
- Mütterliches Homing-Verhalten in der aufgabe der mütterlichen Interaktion I (MI1).
- Stellen Sie sicher, dass die Käfigbetten in der Woche vor der Aufgabe nicht geändert werden.
- Erhalten oder bauen Sie eine offene Feld (OF) Arena, die leicht gereinigt werden kann (Acryl wird empfohlen) mit den folgenden Abmessungen: 50 x 50 x 30 cm (Länge-Breite-Höhe). Die Lichtverhältnisse während der Leistung von Verhaltensweisen können je nach experimenteller Frage variieren und können das Niveau von Erregungs- und Angstverhalten beeinflussen. Zeichnen Sie Verhaltensexperimente unter einem dim Licht (ca. 20 Lux) auf, das über der Mitte der Arena positioniert ist.
- Akklimatisieren Sie den Damm zwei Tage vor dem Verhaltenstest an die Arena, indem Sie ihn für fünf Min. pro Tag unter einen Mesh-Drahtbecher (z. B. einen Bleistiftbecher) in einer Ecke der Arena stellen.
- Am Testtag, der von P18-21 sein kann, bevor Mäuse entwöhnt wurden, reinigen Sie die Arena gründlich mit Desasienwipes und 70% Ethanol.
- Richten Sie die Arena mit zwei gegenüberliegenden Ecken ein, die beide saubere Bettwäsche enthalten, und eine Ecke mit verschmutzter Nestbettwäsche aus dem Hauskäfig des Welpen.
- Erlauben Sie jedem Welpen, die Arena für 3 min zu erkunden, indem sie jeden Welpen in der neutralen, leeren Ecke am Anfang platzieren.
HINWEIS: Zeichnen Sie das Verhalten mit einer Videokamera mit 30 fps auf. Reinigen Sie die Arena zwischen jedem Welpen gründlich und ersetzen Sie die frische Bettwäsche. Alternativ welche Ecke die frische versus Nest-Bettwäsche als Steuerung ist, um Auswelchen Oder aus anderen Gründen (z. B. Umgebungsgeräusche oder Licht) die Kurvenpräferenz zu vermeiden. Wenn Sie mehrere Würfe über das P18-21-Entwicklungsfenster ausführen, führen Sie Verhaltensexperimente gleichzeitig zwischen den Tagen durch. Stellen Sie außerdem sicher, dass Kontroll- und Versuchsgruppen an einem bestimmten Tag parallel ausgeführt werden.
- Mütterliche soziale Interaktion in der aufgabe der mütterlichen Interaktion II (MI2)
- Führen Sie diese Aufgabe unmittelbar nach der MI1-Aufgabe aus.
- Richten Sie die Arena so ein, dass eine Ecke einen leeren Drahtgitterbecher und die gegnerische Ecke den Damm unter einem Maschendrahtbecher enthält. Wenn Mäuse in der Lage sind, den Becher zu bewegen, wiegen Sie den Becher mit einem Gewicht, das an die Oberseite des Bechers geklebt werden kann, um Bewegung zu verhindern. Legen Sie verschmutzte Nestbetten aus dem heimischen Käfig in eine andere Ecke.
- Führen Sie den MI2-Task aus. Platzieren Sie den Welpen in der leeren Ecke und zeichnen Sie das Verhalten für fünf Min bei 30 fps auf, sodass der Pup erkunden kann. Führen Sie jeden Welpen separat und reinigen Sie gründlich die gesamte Arena und Draht-Mesh-Becher zwischen jedem Welpen.
7. Assaying Erwachsenen Soziales Verhalten Aufgabe
- Führen Sie das soziale Verhalten von Erwachsenen bei denselben Mäusen aus, die in der MI1- und MI2-Aufgabe ausgeführt wurden, sobald sie erwachsen sind (P60-P70 oder älter). Die hier gesammelten Daten wurden in einer separaten Kohorte durchgeführt.
- Behandeln Sie die erwachsenen Mäuse für 3 aufeinander folgende Tage, um die Gewöhnung an den Experimentator zu ermöglichen. Stellen Sie sicher, dass nur Experimentatoren, die mit den Mäusen vertraut gemacht wurden, Verhaltensexperimente durchführen, idealerweise alle Aufgaben von derselben Person ausführen.
- Habituate Mäuse in die OF-Arena für 3 Tage für 5 min jeden Tag.
- Assay-Verhalten in einer neuartigen Objekterkennungsaufgabe zur Messung der allgemeinen Fortbewegung und des Interesses an einem neuen Objekt. Dies wird eine sinnvollere Interpretation des sozialverhaltens ermöglichen, wenn Mäuse ein spezifisches Defizit in sozialen Interaktionen haben.
- Platzieren Sie Mäuse in der Arena für 5 min mit einem neuartigen Objekt (kleines Plastikspielzeug mit glatten, reinigenden Oberflächen) in einer Ecke der Arena. Reinigen Sie die Arena zwischen Mäusen gründlich mit 70% Ethanol.
- Zur neuartigen Objekterkennung das zuvor exponierte "Romanobjekt", das jetzt bekannt ist, in eine Ecke stellen und ein neues Romanobjekt in die gegenüberliegende Ecke stellen. Wechseln Sie für alle Aufgaben die Ecken zwischen den Versuchen als Steuerelement.
- Für neuartige soziale Interaktion, stellen Sie sicher, dass die neuartigen Mäuse sind Alter, Stamm und Geschlechtsanpassung und werden an die Mesh-Draht-Tasse für 2 aufeinander folgende Tage für 5 min jeden Tag akklimatisiert. Legen Sie für jede Prüfung eine neuartige Maus unter einen Maschendrahtbecher und platzieren Sie in der gegenüberliegenden Ecke einen leeren Maschendrahtbecher. Lassen Sie die Mäuse die Arena für 5 min erkunden, während Sie das Verhalten aufzeichnen. Reinigen Sie die Arena und Mesh-Drahtbecher gründlich zwischen jedem Versuch.
8. Analysieren von Verhaltensdaten
- Verwenden Sie DeepLabCut (https://github.com/AlexEMG/DeepLabCut), um grundlegende Körperteileverfolgung durchzuführen). Ausführliche Hinweise zur Installation und Verwendung von DeepLabCut finden Sie auf der GitHub-Seite. Ebenfalls verfügbar ist eine benutzerdefinierte Python-basierte Bibliothek 'dlc_utils' (https://github.com/balajisriram/dlc_utils) für die weitere Analyse der Daten nach Abschluss der grundlegenden Körperteileverfolgung. Weitere Informationen zur Verwendung dieser Bibliothek finden Sie auf der GitHub-Seite.
- Installieren Sie DeepLabCut mit dem anaconda-Installationsprozess. Installieren Sie eine GUI-fähige CPU-only-Version von DeepLabCut sowie die GPU-fähige Version zum Trainieren des Netzwerks.
- Folgen Sie den Anweisungen im untenstehenden Link, um ein Projekt zum Nachverfolgen von Körperteilen zu erstellen. Wählen Sie breifly eine Stichprobe von Frames aus Ihrem Datensatz aus und markieren Sie die relevanten Körperteile in diesen gesampelten Frames manuell. Trainieren Sie das DeepLabCut-Netzwerk, um die Körperteile vorherzusagen und sicherzustellen, dass das trainierte Netzwerk angemessen funktioniert.
https://github.com/AlexEMG/DeepLabCut/blob/master/examples/Demo_yourowndata.ipynb - Zum Zwecke der Verfolgung der Körperposition und der Identifizierung einfacher Wechselwirkungen in einem offenen Feld, identifizieren Sie den Schwerpunkt des Tieres, den Kopf (operativ definiert als Mittelpunkt zwischen den Ohren), die linken und rechten Ohren sowie die Schnis und die Basis des Schwanzes. Mehrere Körperteile nachverfolgt zu haben, ermöglicht die entsprechende Substitution, wenn einige Körperteile aufgrund von Okklusion im Rahmen fehlen.
- Verfolgen Sie neben tierischen Körperteilen eine Vielzahl von Punkten, die mit der Umwelt zusammenhängen: z. B. die Ränder von Verhaltensboxen. Diese ermöglichen eine wiederholbare Abschätzung solcher Punkte über mehrere Sitzungen hinweg - auch wenn sich die Position des Verhaltens-Setups zwischen den Sitzungen leicht ändert.
- Achten Sie nach dem Nachverfolgen der Körperteile aus den Verhaltensdaten darauf, die vorhergesagten Körperteilpositionen basierend auf der Mitbeschaffenden für die Vorhersage auf jedem Frame des Videos zu filtern. Niedrige Konfidenzprognosen sind in der Regel mit verschlossenen Körperteilen verbunden. Ersetzen Sie für solche Vorhersagen ein bestimmtes Körperteil durch ein anderes (falls eine solche Substitution angemessen ist) oder verwenden Sie die Positionen anderer Körperteile, um vorherzusagen, wo sich der relevante Körperteil wahrscheinlich befindet. Bei den meisten Anwendungen im offenen Feld ist der Schwerpunkt des Körpers der Nagetiere selten verdeckt und kann mit hoher Genauigkeit und Präzision vorhergesagt werden.
- Verwenden Sie die vorhergesagte Position des Schwerpunkts sowie die Position der verfolgten Punkte in der Umgebung, um eine Reihe von Merkmalen des Verhaltens des Tieres zu schätzen. In den offenen Felddaten kann z. B. die Zeitableitung der Position verwendet werden, um die Geschwindigkeit des Tieres zu berechnen.
- Um Verzerrungen zu vermeiden, führen Sie alle Experimente nach Möglichkeit "blind" in Bezug auf die experimentelle Gruppe durch, insbesondere wenn es ein subjektives Element bei der Bewertung der Ergebnisse gibt. Test auf die Auswirkungen von Geschlechtsunterschieden auf die wichtigsten experimentellen Ergebnisse durch die Bündelung von Daten in männliche und weibliche Gruppen. Alle statistischen Tests sind darauf ausgelegt, eine gleiche Anzahl von Tieren zwischen Gruppen zu testen.
9. Post-hoc-Zellzählung zur Charakterisierung des Ausmaßes der Zelltransfektion
- Bestimmen Sie die Anzahl der zellen, die pro Maus transfiziert werden, da nicht alle Mäuse eine erfolgreiche Transfektion haben und es Unterschiede in der Anzahl der transfizierten Zellen geben wird. Eine Methode, um dies zu erreichen, besteht darin, die Anzahl der transfizierten Neuronen in abwechselnden koronalen Abschnitten zu zählen, gefolgt von einer Interpolation, um die Gesamtzahl der transfizierten Zellen zu schätzen. Dazu jeden anderen koronalen Abschnitt (50 m) abbilden und zählen.
- Verwenden Sie transkardiale Perfusionen mit 4% PFA, um Gewebe zu fixieren und dann das Gehirn zu sezieren. Nach Kryoschutz, Abschnitt das Gehirn in koronalen Abschnitten bei 50 m.
- Für den frontalen Kortex die Zellen innerhalb von +2,75 und + 1,35 mm von Bregma zählen. Diese Koordinaten enthalten frontalkortikale Bereiche und einen Teil des somatosensorischen Kortex (S1). Mit dieser Methode gab es keine beobachteten transfizierten Zellen in kaudalen kortikalen Regionen oder subkortikalen Bereichen.
- Achten Sie darauf, die linke von der rechten Hemisphäre zu bezeichnen, z. B. eine Halbkugel mit einem Nadelloch während des Schnitts zu markieren, und zellen bilateral zu zählen. Verwenden Sie eine automatisierte Zellzählsoftware oder zählen Sie Zellen manuell, um das Vorhandensein eines Zellkörpers mithilfe von DAPI zu bestätigen.
- Sobald die Zellenanzahl ermittelt wurde, legen Sie einen Schwellenwert für die Aufnahme fest. Zum Beispiel beziehen Sie nur Mäuse ein, die bilateral in die Analyse einbeziehen. Für weitere Analysen korrelieren Sie die Anzahl der zellen, die mit Verhaltensreaktionen transfiziert wurden, um zu sehen, ob eine Assoziation vorliegt. Diese Technik zielt auf mehrere Gehirnbereiche ab, daher ist es notwendig, Informationen darüber bereitzustellen, welche Hirnregionen genetisch manipuliert wurden.
HINWEIS: Es ist möglich, dass die Manipulation bestimmter Gene die neuronale Migration, Spezifikation und/oder den Tod verändern könnte. Stellen Sie während der Zellzählung sicher, dass die Anatomie des Gehirns untersucht wird und sich jedes transfezierte Neuron innerhalb der Schicht befindet, die angeblich transfiziert wurde (d. h. L2/3). Bruttoanatommessungen wie kortikale Dicke können auch durch Messung des Abstands von der Pia zum kortikalen L6 quantifiziert werden.
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Representative Results
Erfolgreiche Entwicklung und Implementierung eines kundenspezifischen Elektroporators und einer dreier Prong-Elektrode.
Für IUEs wurde ein kostengünstiger, kundenspezifischer Elektroporator auf der Grundlage eines zuvor beschriebenen Entwurfs27 (Abbildung 1A und Abbildung 2) gebaut. Eine Drei-Zange-Elektrode wurde23,24 mit Kunststoffzangen mit 2 negativen Elektroden an den Spitzen der Zinken befestigt und die positive Elektrode wurde am Ende eines Zahnbürstengriffs befestigt (Abbildung 1B). Der Elektroporator und die drei Zinkenelektrode wurden getestet, um eine einwandfreie Funktion zu gewährleisten. IUE wurde durchgeführt, indem die Gebärmutterhörner freigelegt, Plasmid-DNA injiziert und jeder Embryo elektroporatingiert wurde (Abbildung 1C). Die drei Zinkenelektrode kann relativ einfach in zwei Händen gehalten werden (Abbildung 1B, rechts), mit den Zinken, um den Kopf des Embryos zu stabilisieren. L2/3 PFC-Pyramidensomas und ihre Prozesse wurden mit GFP über IUE gekennzeichnet und bestätigten damit den Erfolg des Gentransferexperiments.
Targeting einer großen Population von Neuronen bilateral in der frontalen Kortex von Mäusen.
Die Gesamtzahl der transfizierten Zellen und die Verteilung transfizierter Neuronen können sowohl für jugendliche als auch für erwachsene Mäuse quantifiziert werden5. Mit dieser bilateralen IUE-Methode wurden etwa 4000-6000 L2/3 Pyramidenneuronen mit dem pCAG-GFP-Plasmid transfiziert (Abbildung 3A). Zusätzlich wurden die meisten dieser Zellen in frontalkortikale Regionen lokalisiert, einschließlich der frontalen Assoziationsrinde, Motorverbandsbereiche, prälimbischer und fralimbischer Kortex und der orbitalen und vorderen cingulat cortex (Abbildung 3B). Ein repräsentatives Beispiel zeigt die rostral-kaudale Verteilung transfizierter Neuronen in einer Erwachsenen-Kontrollmaus (P60, Abbildung 3C) und die Verteilung zwischen Hemisphären (Abbildung 3D). Dies bestätigt die Fähigkeit bilateraler IUEs, große Populationen von L2/3-Pyramidenneuronen im frontalen Kortex gezielt und genetisch zu kennzeichnen.
Sozialverhalten bei jugendlichen und erwachsenen Mäusen.
Im ersten Teil der mütterlichen Interaktionsaufgabe wurde die Fähigkeit von P18 transfizierten Mäusen (IUE mit pCAG-GFP-Plasmid) getestet, Nestbetten zu finden (mütterliche Interaktion 1 [MI1]). Dies testet die sensorischen Fähigkeiten der Jungmäuse. Kontrollmäuse verbrachten mehr Zeit damit, ihre Nestbetten zu erkunden, als frische Bettwäsche zu erkunden. So deutet dies darauf hin, dass diese Mäuse wie erwartet intakte sensorimotorische Fähigkeiten und exploratives Verhalten aufweisen (Abbildung 4A und Abbildung 3B). Der zweite Teil der Aufgabe (MI2) nutzt die Tendenz von Mäusen, motiviert zu sein, mit ihrer Mutter zu interagieren und in der Nähe zu sein. In dieser Aufgabe verbrachten Welpen die meiste Zeit in der Nähe ihrer Mutter, während sie deutlich weniger Zeit damit verbrachten, die leere Tasse oder Nestbetten zu erkunden (Abbildung 4C,D). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass IUE-Kontrollmäuse ein normales Homing-Verhalten aufweisen.
Erwachsene Kontrollmäuse (P60) verbrachten etwa 35% der Zeit damit, ein neuartiges Objekt zu erforschen (Gesamtzeit in der Arena = 5 min, Abbildung 5A,B). Als sie mit einem neuartigen und vertrauten Objekt präsentiert wurden, verbrachten erwachsene Mäuse mehr Zeit damit, das neue Objekt zu erforschen, was auf ein intaktes Interesse an Neuheit hindeutet (Abbildung 5C,D). In der Geselligkeitsaufgabe verbrachten die kontrollierenden erwachsenen Mäuse ähnliche Zeit damit, eine neuartige Maus und eine leere Tasse zu erkunden (Abbildung 5E,F). Dieses Verhalten wurde automatisch mit der frei verfügbaren DeepLabCut Software26nachverfolgt. Beispielvideos zeigen eine erfolgreiche Beschriftung verschiedener Punkte auf einer Maus, einschließlich Gliedmaßen, Zentroid, Kopf und Ohren (Video 1). DeepLabCut wurde verwendet, um zu bestimmen, wann Mäuse aufgezogen wurden, indem die Länge des Mauskörpers untersucht wurde, da dieser Abstand kürzer wird, wenn die Maus zurückliegt (Video 2).
Abbildung 1: In der Utero-Elektroporation mit einem kundenspezifischen Elektroporator und einer Drei-Zangen-Elektrode. (A) Bild des kundenspezifischen Elektroporators (links) und seiner Frontplatte (rechts). 1: Leistungsanzeige. 2: Netzschalter. 3: Pulsanzeige. 4: Testmodus-Schalter. 5: Spannungsauswahl. 6: Pulsbreitensteuerung. 7: Elektrode (+). 8: Externer Trigger (TTL). 9: Elektrode (-). (B) Bild der eigens angefertigten Drei-Zangen-Elektrode (links) und die empfohlene Methode, um die drei Zinkenelektrode während der IUE (rechts) zu halten. (C) Links: Diagramm, das die IUE-Operation in E16-Staudämmen darstellt. Rechts: repräsentatives 20X konfokales Bild von IUE mit GFP auf L2/3 mPFC ausgerichtet. Gelbes Sternchen: L2/3 GFP+ Neuronen. Linke Skalenstange der linken Platte = 250 m. Rechte Skalenskala = 75 m. Von Comer et al., 20205angepasste Zahlen und Daten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Schaltplan des kundenspezifischen Elektroporators. Ein Diagramm, das den kundenspezifischen Elektroporatorkreislauf anhand zuvor beschriebener Beispiele27darstellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Ausrichtung auf große Populationen von L2/3 frontalen Kortex-Neuronen mit IUE. (A) Gesamtzahl der GFP+-Zellen in jugendlichen Kontrollmäusen. N = 15 Mäuse. (B) Prozentsatz der GFP+-Zellen pro Fläche bei erwachsenen Kontrollmäusen. N = 22 Kontrollmäuse. (C) Repräsentative Abschnitte, die die rostro-kaudale Ausdehnung transfizierter Zellen im frontalen Kortex zeigen. Bilder in linken Bereichen sind vergrößerte Bereiche von den rechten Feldern (rotes Quadrat). Frontalassoziation Kortex: FrA. Ergänzender Motorkortex: M2. Prälimbischer Kortex: PL. Infralimbischer Kortex: IL. Anterior cingulate cortex: ACC. Medial orbitofrontaler Kortex: MO. Ventral orbitofrontaler Kortex: VO. Lateral orbitofrontaler Kortex: LO. Vorderer insularer Kortex: AI. Frontaler Kortexbereich 3: Fr3. Primärer Motorkortex: M1. Primärer somatosensorischer Kortex: S1. Piriform cortex: Pir. Vorderer olfaktorischer Kern: AO. Caudate-putamen: Cpu. Schwarze Zahlen: Bregma-Koordinaten. Linke Plattenwaage = 0,5 mm. Rechte Skalenstange = 1 mm. Mittelwert ± SEM. (D) Daten, die die Anzahl der Zellen zeigen, die auf der rechten oder linken Hemisphäre innerhalb jeder Maus elektropoliert werden. Zeigt uninterpolierte Zellzahlen von 14 erwachsenen Mäusen, die mit pCAG-GFP-Plasmid elektropoiert wurden. Gekoppelter t-Test. p = 0,4757. Daten angepasst von Comer et al., 20205. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Bewertung der sensorimotorischen Fähigkeiten, des explorativen Verhaltens und der frühen sozialen Interaktionen bei juvenilen transfizierten Mäusen. (A) Repräsentatives Beispiel für den zurückgelegten Pfad (schwarze Ablaufverfolgung) durch einen P18-Kontrollwelpen in MI1-Task. Frische Einstreuecken (frisch 1 und 2, rosa) und Nest-Bettecke (grün). (B) Kontrollwelpen verbrachten mehr Zeit damit, die Nestbetten zu erkunden als die frische Bettwäsche in der MI1-Aufgabe. p < 0,001, ****p < 0,0001. Zwei-Wege-ANOVA und Sidaks Post-Test. (C) Repräsentatives Beispiel für den zurückgelegten Pfad (schwarze Ablaufverfolgung) durch einen P18-Kontrollwelpen in MI2-Task. Dammbecher (Damm: blau), Leerer Becher (leerer Becher: gelb), Nest-Bettzeugecke (Nest: grün). (D) Kontrollwelpen verbrachten mehr Zeit damit, mit ihrem Damm zu interagieren als mit der leeren Tasse oder Nestbettwäsche. Zwei-Wege-ANOVA und Sidaks Post-Test. p < 0,0001. N = 15 Kontrollmäuse. Von Comer et al., 20205angepasste Zahlen und Daten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Bewertung der sozialen Interaktionen bei transfizierten Mäusen bei Erwachsenen. (A) Repräsentatives Beispiel für den zurückgelegten Pfad (schwarze Ablaufverfolgung) von P60 Steuern der Erwachsenenmaus in der neuen Objektinteraktionsaufgabe. rosa Ecke = Position des neuartigen Objekts. (B) Kontrollmäuse verbrachten etwa 35% der Zeit damit, das neuartige Objekt zu erforschen (5 min Gesamtzeit). ProzentualeR Zeitaufwand in der Ecke mit dem angezeigten neuen Objekt. (C) Repräsentative Beispiele für zurückgelegte Pfade (schwarze Ablaufverfolgung) durch eine P60-Steuermaus für Erwachsene in neuartiger Objekterkennungsaufgabe. rosa Ecke: Lage des neuartigen Objekts. grüne Ecke: Position des vertrauten Objekts. (D) Kontrollmäuse verbrachten mehr Zeit damit, das neuartige Objekt zu erforschen als das vertraute Objekt. Diskriminierungsindex (DI) angezeigt; DI = ((Zeit mit romanischem Objekt – Zeit mit vertrautem Objekt) / (Zeit mit Romanobjekt + Zeit mit vertrautem Objekt)). (E) Repräsentative Beispiele für zurückgelegte Pfade (schwarze Spur) von P60 Steuern Erwachsenenmaus in Geselligkeit Aufgabe. rosa Ecke: Lage der neuartigen Maus unter Mesh-Draht-Tasse. grüne Ecke: Position des leeren Maschendrahtbechers. (F) Kontrollmäuse verbrachten im Durchschnitt gleiche Zeit damit, eine leere Tasse und eine Tasse mit einer neuartigen Maus zu erkunden. Grafik zeigt DI ((Zeit mit neuartiger Maus – Zeit mit leerem Becher) / (Zeit mit neuartiger Maus + Zeit mit leerem Becher)). Da Mäuse vor der Aufgabe nicht sozial isoliert waren, könnte der Drang, mit einer neuartigen Maus zu interagieren, abgeschwächt worden sein. Es gab jedoch noch die Erforschung der neuartigen Maus. N = 22 Kontrollmäuse. Von Comer et al., 20205angepasste Zahlen und Daten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Video 1: Verwenden von DeepLabCut zum automatischen Nachverfolgen der Tierposition bei Verhaltensaufgaben. Ein repräsentatives Video einer erwachsenen Maus in der sozialen Interaktionsaufgabe, das mit DeepLabCut beschriftet wurde. Verschiedene Teile der Maus können beschriftet werden, wie z. B. Gliedmaßen und Kopf. Die Verwendung des Schwerpunkts ist geeignet, um die Position des Tieres zu verfolgen, aber andere Punkte können verwendet werden, um komplexere Verhaltensweisen zu identifizieren, wie Z. B. Pflege oder Aufzucht. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzuzeigen. (Rechtsklick zum Download.)
Video 2: Verwenden von DeepLabCut zum automatischen Nachverfolgen der Aufzucht bei Verhaltensaufgaben. Ein repräsentatives Video einer erwachsenen Maus in der sozialen Interaktionsaufgabe, das mit DeepLabCut beschriftet wurde. Der rote Pfeil zeigt die Länge der Maus mit dem Pfeil, der auf den Kopf der Maus zeigt. Die Länge des Pfeils kann verwendet werden, um mit der Maus zu bestimmen, ist aufzucht, da die Länge der Maus und der Pfeil kleiner wird, wenn die Maus nach hinten. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzuzeigen. (Rechtsklick zum Download.)
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Discussion
Hierin wird eine Pipeline beschrieben, die die Manipulation neuartiger Gene von Interesse in großen Populationen von frontalkortikalen Neuronen mit Verhaltenstests bei Mäusen kombiniert. Darüber hinaus ermöglicht diese Pipeline die Längsuntersuchung des Verhaltens bei denselben Mäusen sowohl während der frühen postnatalen Entwicklung als auch im Erwachsenenalter. Diese Technik umgeht die Notwendigkeit, sich auf genetische Tiermodelle zu verlassen, die in Bezug auf Zeit und Kosten teuer sein können. Die Stärke dieses Protokolls ist, dass es verwendet werden kann, um neuroentwicklungs- und neuropsychiatrische Störungen zu studieren, für die kürzlich GWAS neue genetische Assoziationen entdeckt hat28,29. Obwohl diese Methode zellspezifische transfektion von exzitatorischen Neuronen bietet, ist eine Einschränkung, dass es weniger möglich ist, andere Gehirnzelltypen wie Interneurons oder Gliazellen anzusprechen. Mehrere Studien deuten jedoch auf einen modifizierten Ansatz hin, um andere Gehirnzelltypen30,31anzusprechen. Darüber hinaus können durch Die Änderung der Position der Elektroden relativ zum Kopf des Embryos und die Änderung des Timings der IUE andere Hirnregionen bilateral transfiziert werden, einschließlich Hippocampus, Amygdala, Kleinhirn und der visuellen, somatosensorischen und motorischen Kortiken24,32. Darüber hinaus können verschiedene kortikale Schichten durch die Durchführung von IUE in verschiedenen Entwicklungsstadien gezielt werden.
Obwohl IUE eine hohe Erfolgsrate haben kann, gibt es kritische Schritte und Die Fehlerbehebung der Methode, die manchmal erforderlich ist. Es ist notwendig, dass Plasmide sorgfältig in Zelllinien entworfen und validiert werden. Wie beim Klonen ist darauf zu achten, dass die richtige Genexpression wie die Bestätigung der Sequenz im Rahmen ist. Darüber hinaus sollte die Wirkung von Genmanipulation (z. B. Überexpression oder Silencing) bestätigt werden, wobei zu berücksichtigen ist, dass die Expressionsniveaus je nach Entwicklungszeitverlauf der Maus und Entwicklungsdatum von IUE variieren können. Western Blot und qPCR können verwendet werden, um das Ausmaß der genetischen Überexpression zu bestimmen5. Es wird empfohlen, ein Reportergen, wie GFP, in einem separaten Plasmid mitzuelektropoieren, da mit GFP markierte Proteine falsch gefaltet werden können oder ihre Funktion verlieren können. Wenn ein Reporter nicht verwendet wird, kann der Experimentator auch in situ-Hybridisierung, qPCR oder Western Blot verwenden, um Expressionsniveaus des Gens von Interesse zu bestimmen5.
Wenn Plasmide überprüft wurden, aber es gibt keine Tiere, die positiv für die Transfektion zu sein scheinen, gründlich überprüfen Sie alle Geräte, insbesondere den Elektroporator, um eine ordnungsgemäße Funktion zu gewährleisten. Bei der Lieferung von Spannungsimpulsen an Embryonen sollten die Gebärmutterhörner gut mit erwärmter Salzlinie befeuchtet werden und die Elektroden sollten bei der Erzeugung des Spannungsimpulses Blasen erzeugen. Wenn beim Einspeisen der Spannung keine Blasen vorhanden sind, liegt wahrscheinlich ein Problem mit dem Elektroporator vor. Alternativ wurde die cDNA möglicherweise nicht richtig in den Ventrikel injiziert. Wenn cDNA richtig in den seitlichen Ventrikel injiziert wird, wird der schnelle grüne Farbstoff in Form eines Halbmonds sichtbar sein. Schließlich ist die Position der Elektroden wichtig. Wenn die Elektroden leicht falsch positioniert sind, werden Zellen möglicherweise nicht im Interessenbereich transfiziert. Daher, bei der Überprüfung für eine erfolgreiche Transfektion, speichern Sie einige kaudale Gehirnabschnitte, um zu sehen, wenn vielleicht, die falsche Gehirnregion transfiziert wurde. Sobald diese Methode praktiziert wurde, kann ein erfahrener Chirurg mit einer Erfolgsquote von fast 90% rechnen. Dieses Protokoll kann geändert werden, um andere Gehirnregionen von Interesse anzusprechen. Beispielsweise ist es möglich, die meisten kortikalen Regionen bilateral und sogar bestimmte subkortikale Regionen, einschließlich des Hippocampus23 , anzugreifen. Es ist auch möglich, die Kosten durch den Bau eines kundenspezifischen Elektroporators weiter zu senken, der in den hier vorgestellten Daten verwendet wurde5,27.
Zukünftige Studien könnten diese Methode nutzen, um die Rolle neu entdeckter Genkandidaten bei verschiedenen neurologischen Erkrankungen zu verstehen. Die vorgestellte Pipeline bietet einen relativ schnellen Test, um die Auswirkungen spezifischer genetischer Manipulationen auf die frühe postnatale Entwicklung und das Verhalten bis ins Erwachsenenalter zu testen. Zukünftige Bemühungen mit dieser Methode haben das Potenzial zu entdecken, welche Gene eine ursächliche Rolle bei bestimmten Hirnerkrankungen spielen, einschließlich SCZ und Autismus-Spektrum-Störung.
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Disclosures
Die Autoren erklären keine konkurrierenden Interessen.
Acknowledgments
Wir danken Lisa Kretsge für das kritische Feedback und die Bearbeitung des Manuskripts. Wir danken allen wissenschaftlichen Assistenten im Cruz-Martin-Labor, die bei der Perfusion und Zellzählung von Verhaltensgehirnen von unschätzbarem Wert waren. Wir danken Andrzej Cwetsch für den Einsatz des tripolaren Elektrodens und Todd Blute und dem Boston University Biology Imaging Core für den Einsatz des konfokalen Mikroskops. Diese Arbeit wurde unterstützt durch ein NARSAD Young Investigator Grant (AC-M, #27202), den Brenton R. Lutz Award (ALC), den I. Alden Macchi Award (ALC), das NSF NRT UtB: Neurophotonics National Research Fellowship (ALC, #DGE1633516) und das Boston University Undergraduate Research Opportunities Program (WWY). Die Geldgeber spielten keine Rolle bei der Studiengestaltung, Datenerhebung und -analyse, der Entscheidung zur Veröffentlichung oder der Vorbereitung des Manuskripts.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 13mm Silk Black Braided Suture | Havel's | SB77D | Suture skin |
| Adson Forceps | F.S.T. | 11006-12 | IUE |
| C270 Webcam | Logitech | N/A | Record behavior |
| Electroporator | Custom-built | N/A | See Figure 1 and 2 and Bullmann et al, 2015 |
| EZ-500 Spin Column Plasmid DNA Maxi-preps Kit, 20preps | Bio Basic Inc. | BS466 | Pladmid preparation |
| Fast Green FCF | Sigma | F7252-5G | Dye for DNA solution |
| Fine scissors- sharp | F.S.T. | 14060-09 | IUE |
| Fisherbrand Gauze Sponges | Fisher Scientific | 1376152 | IUE |
| Gaymar Heating/Cooling | Braintree | TP-700 | Heating Pad |
| Glass pipette puller | Sutter Instrument, | P-97 | IUE |
| Glass pipettes | Sutter Instrument, | BF150-117-10 | IUE |
| Hair Removal Lotion | Nair | N/A | Hair removal |
| Hartman Hemostats | F.S.T. | 13002-10 | IUE |
| Open field maze- homemade acrylic arena | Custom-built | N/A | 50 × 50 × 30 cm length-width-height |
| pCAG-GFP | Addgene | 11150 | Mammalian expression vector for expression of GFP |
| Picospritzer III | Parker Hannifin | N/A | pressure injector |
| Retractor - 2 Pronged Blunt | F.S.T. | 17023-13 | IUE |
| Ring forceps | F.S.T. | 11103-09 | IUE |
| Sterilizer, dry bead | Sigma | Z378569 | sterelize surgical tools |
| SUTURE, 3/0 PGA, FS-2, VIOLET FOR VET USE ONLY | Havel's | HJ398 | Suture muscle |
| Water bath | Cole-Parmer | EW-12105-84 | warming sterile saline |
References
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