Summary
Il ruolo dei geni associati alle malattie recentemente scoperti nella patogenesi dei disturbi neuropsichiatrici rimane oscuro. Un bilaterale modificato nella tecnica di elettroporazione utero consente il trasferimento genico in grandi popolazioni di neuroni e l'esame degli effetti causali dei cambiamenti di espressione genica sul comportamento sociale.
Abstract
Poiché gli studi di associazione a livello genomico fanno luce sulle basi genetiche eterogenee di molte malattie neurologiche, aumenta la necessità di studiare il contributo di specifici geni allo sviluppo cerebrale e alla funzione. Affidarsi a modelli di topi per studiare il ruolo di manipolazioni genetiche specifiche non è sempre fattibile poiché le linee transgeniche del topo sono piuttosto costose e molti nuovi geni associati alle malattie non hanno ancora linee genetiche disponibili in commercio. Inoltre, possono essere necessario anni di sviluppo e convalida per creare una linea del mouse. In utero l'elettroporazione offre un metodo relativamente semplice e veloce per manipolare l'espressione genica in un modo specifico di tipo cellulare in vivo che richiede solo lo sviluppo di un plasmide di DNA per ottenere una particolare manipolazione genetica. L'elettroporazione bilaterale in utero può essere utilizzata per colpire grandi popolazioni di neuroni piramidali della corteccia frontale. La combinazione di questo metodo di trasferimento genico con approcci comportamentali consente di studiare gli effetti delle manipolazioni genetiche sulla funzione delle reti di corteccia prefrontale e il comportamento sociale dei topi giovani e adulti.
Introduction
Studi di associazione a livello genomico (GWAS) hanno guidato la scoperta di nuovi geni candidati associati a patologiecerebrali 1,2,3,4. Questi studi sono stati particolarmente utili nella comprensione di devastanti disturbi neuropsichiatrici come la schizofrenia (SCZ), dove l'indagine di nuovi geni è servita come punto di partenza per nuove linee di ricerca e intervento terapeutico5,6. I geni che ospitano il rischio per la SCZ mostrano un'espressione distorta nella corteccia prefrontale (PFC) durante lo sviluppo postnatale prenatale e precoce, una regione implicata nella patologia di diversi disturbi neuropsichiatrici7. Inoltre, i modelli di topo dei disturbi psichiatrici mostrano attività anomala nellereti PFC 6,8,9. Questi risultati suggeriscono che i geni associati alla SZC potrebbero svolgere un ruolo nel cablaggio dello sviluppo di questa regione. Ulteriori indagini utilizzando modelli animali sono necessarie per comprendere il contributo di questi geni candidati alla creazione di connessioni nel PFC e per determinare se questi geni hanno un ruolo causale nella patogenesi dei disturbi neuropsichiatrici. Le tecniche di manipolazione genetica nei topi che consentono lo studio dei cambiamenti di espressione genica su specifici circuiti neuronali durante lo sviluppo postnatale prenatale e precoce sono un metodo promettente per comprendere i meccanismi molecolari che collegano i cambiamenti di espressione genica alla disfunzione PFC.
Le linee genetiche del topo offrono un metodo per studiare l'impatto di particolari geni sullo sviluppo e sulla funzione cerebrale. Tuttavia, affidarsi a topi transgenici può essere limitante poiché non ci sono sempre linee disponibili in commercio per esaminare gli effetti di specifici geni sullo sviluppo di circuiti neurali. Inoltre, può essere estremamente costoso e dispendioso in termini di tempo sviluppare linee di mouse personalizzate. L'uso di strategie di manipolazione genetica intersezionale che combinano topi transgenici con approcci virali harivoluzionato la comprensione del cervello 10,11,12. Nonostante molti progressi, le strategie virali hanno alcune limitazioni a seconda del tipo di vettore virale, inclusi limiti nella capacità di confezionamento che possono limitarel'espressione virale 13 e la tossicità cellulare associata all'espressionevirale 14. Inoltre, nella maggior parte delle condizioni sperimentali, l'espressione genica robusta che utilizza virus adeno-associato (AAV) richiede circa 2-4 settimane15, rendendo le strategie virali di routine irrealizzabili per manipolare i geni durante lo sviluppo postnatale precoce.
In utero l'elettroporazione (IUE) è un approccio alternativo che consente un rapido ed economico trasferimento genico16,17 che, se abbinato all'etichettatura fluorescente e agli approcci farmacogenetici o optogenetici, fornisce una potente piattaforma per sezionare la funzione dei circuiti neuronali. Inoltre, con lo sviluppo di geni di editing del genoma CRISPR-Cas9 possono essere sovraespressi o alterati con precisione attraverso il knock-down specifico di tipo cellulare o il knock-out di geni specifici o attraverso lamodulazione dei promotori 18,19. Gli approcci di manipolazione genica che utilizzano iUE sono particolarmente vantaggiosi quando l'effetto dei geni sui circuiti neuronali deve essere testato durante le strette finestre disviluppo 20. IUE è una tecnica versatile e l'iperespressione può essere facilmente realizzata inserendo un gene in un vettore di espressione sotto uno specifico promotore. Un ulteriore controllo dell'espressione genica può essere ottenuto guidando l'espressione utilizzando promotori di diversi punti di forza o utilizzando promotori inducibili in grado di controllare temporaneamentel'espressione genica 21,22. Inoltre, IUE consente il targeting di cellule all'interno di specifici strati corticali, tipi di cellule e regioni cerebrali, il che non è sempre fattibileutilizzando altri approcci 5,17. Recenti progressi nella configurazione IUE basati sull'uso di tre elettrodi, che generano una distribuzione del campo elettrico più efficiente, hanno ampliato il repertorio funzionale di questo metodo e permesso agli scienziati di indirizzare nuovi tipi di cellule e aumentare l'efficienza, la precisione e il numero di cellule che possono essere prese dimira 23,24. Questa tecnica è stata recentemente utilizzata per determinare il ruolo causale della componente complementare 4A (C4A), un gene legato alla SCZ, nella funzione PFC e nella cognizioneprecoce 5.
Qui è presentata una pipeline sperimentale che combina approcci di trasferimento genico per colpire grandi popolazioni di neuroni eccitatori nella corteccia frontale, incluso il PFC, con paradigmi comportamentali che non solo consentono lo studio dei cambiamenti cellulari e a livello di circuito, ma consentono anche di monitorare il comportamento durante lo sviluppo postnatale precoce e l'età adulta. Il primo descritto è un metodo per trasfetto bilateralmente grandi popolazioni di neuroni piramidali di livello (L) 2/3 nelle regioni corticali frontali. Successivamente, vengono delineati i compiti per saggiare il comportamento sociale nei topi giovani e adulti. Il conteggio delle cellule può essere ottenuto al completamento delle attività comportamentali per quantificare l'estensione e la posizione della trasfezione cellulare. Inoltre, il numero di cellule trasfette può essere correlato con i dati comportamentali per determinare se un maggior numero di cellule trasfette porta a maggiori perturbazioni nel comportamento.
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Protocol
Tutti i protocolli sperimentali sono stati condotti secondo le linee guida del National Institutes of Health (NIH) per la ricerca sugli animali e sono stati approvati dal Boston University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).
1. Preparazione della soluzione di DNA
- Acquista un plasmide commerciale o un subclone un gene di interesse nel plasmide con il promotore desiderato. Qui è stato utilizzato un plasmide contenente EGFP sotto il promotore CAG (pCAG-EGFP).
NOTA: determinare il promotore desiderato in base al livello di espressione necessario. In generale, i plasmidi sotto il promotore CAG possono essere utilizzati per raggiungere alti livelli del transgene mentre i promotori specifici del tipo cellulare (ad esempio, la sinapsina per i neuroni) tendono ad essere meno attivi. Lo sperimentatore deve determinare empiricamente i livelli di espressione appropriati per ogni plasmide. - Trasforma i batteri e coltiva le scorte in mezzi batterici con l'antibiotico appropriato.
- Rimuovere le cellule competenti (cellule DH5α) da -80 °C e scongelarsi sul ghiaccio per 20 minuti.
- Mescolare 100 pg -100 ng del DNA plasmide con 30 μL di cellule competenti. Incubare la miscela sul ghiaccio per 20 minuti.
- Eseguire lo shock termico incubando in un bagno d'acqua a 42 °C per 45 s e quindi restituendo il tubo al ghiaccio per 2 minuti.
- Aggiungere 200 - 1.000 μL di supporti LB alle cellule competenti trasformate e crescere per 45 minuti a 37 °C su un'incubatrice di scuotimento.
- Piastra 200 μL delle cellule trasformate in una piastra di agar LB contenente l'antibiotico appropriato e incubare la piastra durante la notte a 37 °C.
- Il giorno dopo, incubare una colonia batterica in 200 mL di brodo LB con l'antibiotico appropriato a 37 °C su un'incubatrice tremante durante la notte.
- Purificare il DNA plasmide usando un kit maxiprep.
- Seguire le istruzioni fornite nel kit maxiprep ottenuto. Per la fase di eluizione, non eludere il DNA nel tampone di eluizione. Invece, eluta il DNA usando 200 μL di 1x PBS sterile o acqua di grado molecolare.
- Assicurarsi che la concentrazione finale del DNA sia maggiore di 1 μg/μL. Se il plasmide contenente il gene di interesse non contiene un gene reporter, allora prepara anche un plasmide per co-trasfetto con una molecola reporter, come la proteina fluorescente verde (GFP), per consentire la visualizzazione delle cellule trasfette.
- Preparare la soluzione di DNA per l'intervento diluire il DNA plasmide in 1x PBS a 1 μg/μL di concentrazione finale di ogni plasmide. Aggiungere colorante verde veloce alla soluzione di DNA a una concentrazione finale dello 0,1%. Per le iniezioni bilaterali, preparare 60 μL di soluzione per diga (per circa 10 cuccioli).
NOTA: Se il plasmide non contiene un gene reporter, co-elettroporato con GFP. I tassi di co-elettroporazione sono in genere del 95% o più. Nelle nostre mani, l'efficienza della trasfezione non è stata influenzata dalla co-trasfezione. Tutti i plasmidi elettroporati devono essere diluiti a 1 μg/μL.
2. Ordinare o allevare topi gravidi a tempo
- Se si ordinano topi gravidi a tempo, ordinare ai topi di arrivare il giorno embrionale (E) 13 o prima per consentire alle dighe un tempo adeguato per acclimatarsi all'alloggiamento degli animali. In questo protocollo, i topi outbred CD-1 vengono utilizzati per tutti gli esperimenti.
NOTA: Ordinare con qualche giorno di anticipo ridurrà lo stress animale e porterà a un tasso di sopravvivenza più elevato dei cuccioli. - Se si riproducono topi gravidi a tempo, accoppiare topi femmine con un maschio durante la notte, una volta alla settimana. Verificare la presenza di una spina vaginale la mattina seguente (E0.5). Determinare la gravidanza monitorando il peso delle topi femmine.
NOTA: Diversi ceppi di topo hanno diversi aumenti di peso durante la gravidanza, quindi determinare il tipico aumento di peso per lo sforzo del topo utilizzato. - Che si tratti di ordinare o allevare i topi, per ridurre lo stress delle dighe, posizionare un cuscinetto di nidificazione e una casa per topi nella gabbia. Ridurre lo stress può aiutare ad aumentare il tasso di sopravvivenza dei cuccioli.
3. Progettazione e montaggio di tre elettrodi a tre prong
- Utilizzare fogli di titanio di grado 2 con uno spessore di 0,063 in come materiale di serie per i contatti degli elettrodi.
- Utilizzando tecniche di lavorazione standard o utensili a mano di precisione, realizzare elettrodi con le seguenti dimensioni: 20 mm x 5 mm con punta arrotondata e schiena scanalata. Rimuovere eventuali bordi ruvidi o bave utilizzando carta vetrata a grana fine.
- Per cablare i contatti dell'elettrodo, avvolgere il filo di rame incagliato da 22 G intorno alle scanalature dell'elettrodo e fissare mediante saldatura. Proteggere questo giunto utilizzando tubi termoretraibile.
- Quindi, attaccare l'elettrodo collegato a forcep autoclavabili e non conduttive utilizzando un tubo termoretraibile aggiuntivo per realizzare i due elettrodi negativi. Attaccare il singolo elettrodo positivo a un materiale autoclavabile e non conduttivo (ad esempio una maniglia dello spazzolino con una testa seghe). Montare l'estremità aperta del filo con una spina di banana standard.
4. Preparazione per l'intervento chirurgico
- Portare le dighe gravide nell'area dell'intervento almeno 30 minuti prima dell'intervento chirurgico per consentire la riduzione dei livelli di stress dopo il trasporto dalla struttura animale.
- Sterilizzare l'intero sito di chirurgia utilizzando salviette germicide sterilizzanti e quindi il 70% di etanolo. Cambiare i guanti prima di iniziare l'intervento chirurgico.
- Sterilizzare gli utensili autoclavati in uno sterilizzatore di perline di vetro.
- Trasferire il PBS sterile da 1x (circa 50 mL per diga) a tubi conici da 50 ml e posizionarlo in un rack di tubi nel bagno d'acqua riscaldato a 38-40 °C. Controllare la temperatura salina sterile con un termometro.
- Accendere la pompa di circolazione del riscaldamento dell'acqua in modo che sia riscaldata a 37 °C prima dell'inizio dell'intervento chirurgico. Ciò manterrà la temperatura corporea del topo per tutta la durata dell'intervento chirurgico.
- Accendere l'iniettore di pressione e l'elettroporatore e garantire il corretto funzionamento prima dell'intervento chirurgico.
- Ruotare brevemente la soluzione di DNA plasmide (ottenuta nella fase 1.4) su una centrifuga da tavolo e posizionarla sul ghiaccio.
- Tirare pipette di vetro su un estrattore di pipetta in modo che la punta della pipetta di vetro tirato abbia un diametro di circa 50 μm.
- Riempire la pipetta con 20-40 μL di soluzione di DNA (ottenuta nella fase 1.4).
- Impostare tutti gli elementi necessari per la chirurgia tra cui lozione per la rimozione dei capelli, iodio, etanolo al 70%, scambi di cotone, unguento per gli occhi, suture, garza, ecc.
- Preparare un foglio di intervento chirurgico e compilare le informazioni necessarie, come ID mouse e peso, data dell'intervento chirurgico, nome del chirurgo, ecc.
5. In utero chirurgia elettroporazione
- Pesare il mouse prima dell'intervento chirurgico e notare questo sul foglio dell'intervento chirurgico.
- Anestetizzare un topo incinta (E16) per inalazione in una camera di induzione con miscela 4% (v/v) ossigeno-isoflurane. Una volta che il topo è stato indotto, passare a un'inalazione di maschere e mantenere l'isoflurane all'1-1,5% (v / v) e monitorare la respirazione durante l'intervento chirurgico. Controllare che il mouse sia completamente anestetizzato, la frequenza del respiro dovrebbe essere di ~ 55-65 respiri al minuto.
- Somministrare analgesici preoperatori: buprenorfina (3,25 mg/kg; SC) e meloxicam (1–5 mg/kg; SC) ad un volume massimo di 10-30 ml/kg.
- Utilizzare la crema per la depilazione o utilizzare con cura un rasoio per rimuovere la pelliccia dall'addome. Sterilizzare l'addome tamponando con povidone-iodio e 70% di etanolo e ripeterlo almeno 3 volte. Creare un campo sterile intorno all'addome utilizzando una garza sterile, è anche possibile utilizzare drappeggi sterili.
- Fai un'incisione della linea mediana (3-4 cm) nella pelle addominale, assicurandoti di sollevare la pelle con le flessione per evitare di tagliare il muscolo. Quindi tagliare il muscolo, facendo di nuovo attenzione a sollevare il muscolo per evitare di tagliare gli organi vitali.
- Estrarre con cura le corna uterine dalla diga usando le forcep ad anello e posizionarle delicatamente sul campo sterile, assicurandosi che il corno uterino sia supportato con imbottitura e non tiri troppo lontano dalla diga. Da questo punto in su, mantenere il corno uterino inumidito per tutto il resto dell'intervento chirurgico con il 1x PBS sterile pre-riscaldato.
- Posizionare un embrione utilizzando forcep o dita. Inserire con cura la pipetta di vetro tirato con un angolo di 45 gradi rispetto al piano orizzontale della testa e inserita nel ventricolo laterale, che può essere identificato visivamente tra la linea mediana del cervello e l'occhio. Iniettare circa 2-3 μL in ogni ventricolo laterale inserendo la pipetta in uno e poi nell'altro ventricolo (raccomandato) o iniettando la soluzione di DNA in un ventricolo fino a passare in entrambi i ventricoli laterale. Il ventricolo è stato preso di mira con successo se una forma a mezzaluna è presente dopo l'iniezione.
NOTA: La punta della pipetta di vetro potrebbe rompersi durante l'intervento chirurgico. In questo caso, sostituire la pipetta di vetro, assicurando che le corna uterine siano mantenute inumidite mentre una nuova pipetta viene preparata e riempita con la soluzione di DNA. - Per trasfetto le cellule bilateralmente nella corteccia frontale, posizionare i due elettrodi negativi sui lati degli embrioni testa appena laterale e leggermente caudale ai ventricoli laterali e posizionare l'elettrodo positivo tra gli occhi, proprio di fronte al muso in via di sviluppo.
- Assicurarsi che l'embrione sia generosamente inumidito. Applicare quattro impulsi quadrati (durata dell'impulso = durata di 50 ms, ampiezza dell'impulso = 36 V, intervallo interpulso = 500 ms).
- Iniettare ed elettroporare tutti gli embrioni, andando uno per uno in modo che ogni embrione sia elettroporato immediatamente dopo l'iniezione della soluzione di DNA. Una volta che tutti gli embrioni sono stati elettroporati, inserire con cura le corna uterine nella cavità addominale. Durante questo passaggio, rivestire la cavità addominale in PBS sterile (1x) per aiutare il posizionamento del corno uterino.
- Riempire la cavità addominale con 1x PBS sterile in modo che non rimangano sacche d'aria dopo il completamento della sutura. Suturare il muscolo con suture assorbibili e la pelle con suture non assorbibili in seta.
- Lasciare che la diga si riprenda completamente in una camera riscaldata per almeno 1 h. Nelle prossime 48 ore, controllare regolarmente le dighe. Mentre la diga si riprende dall'anestesia e riprende conoscenza, inizierà a muoversi e fischiare.
- Somministrare analgesici post-operatori se le dighe mostrano segni di dolore, come ballare i loro corpi e respirare rapidamente. Somministrare solo se ci sono segni di dolore poiché le iniezioni SC potrebbero stressare le dighe, ma se somministrate al gruppo sperimentale somministrano anche al gruppo di controllo, o viceversa.
6. Saggiare il comportamento sociale precoce in un compito di interazione materna
NOTA: Questo protocollo è adattato dalle precedenti pubblicazioni5,25. Eseguire questo compito dopo che i topi sono nati dal giorno postnatale (P) 18-21.
- Comportamento di homing materno nel compito di interazione materna I (MI1).
- Assicurarsi che la biancheria da letto a gabbia non venga modificata nella settimana prima che l'attività venga eseguita.
- Ottenere o costruire un'arena a campo aperto (OF) che può essere facilmente pulita (si consiglia l'acrilico) con le seguenti dimensioni: 50 x 50 x 30 cm (lunghezza-larghezza-altezza). Le condizioni di illuminazione durante le prestazioni dei comportamenti possono variare a seconda della domanda sperimentale e possono influenzare i livelli di eccitazione e comportamento simile all'ansia. Registra esperimenti comportamentali sotto una luce fioca (circa 20 lux) posizionata sopra il centro dell'arena.
- Per due giorni prima del test del comportamento, acclimatare la diga all'arena posizionandolo sotto una tazza di filo di rete (come una tazza di matita) in un angolo dell'arena per cinque minuti al giorno.
- Il giorno del test, che può essere da P18-21, prima che i topi siano stati svezzati, pulire accuratamente l'arena con salviette igienizzante e 70% di etanolo.
- Imposta l'arena con due angoli opposti contenenti sia biancheria da letto pulita che un angolo contenente biancheria da letto sporca del nido dalla gabbia di casa del cucciolo.
- Consenti a ogni cucciolo di esplorare l'arena per 3 minuti, posizionando ogni cucciolo nell'angolo neutro e vuoto all'inizio.
NOTA: registra il comportamento con una videocamera a 30 fps. Pulire accuratamente l'arena tra ogni cucciolo e sostituire la biancheria da letto fresca. Alternare quale angolo è la biancheria da letto fresca rispetto al nido come controllo per evitare la preferenza d'angolo per altri motivi (ad esempio, rumore ambientale o luce). Se si eseguono più cucciolate attraverso la finestra di sviluppo P18-21, eseguire esperimenti comportamentali contemporaneamente tra un giorno e l'altro. Assicurarsi inoltre che durante un dato giorno, i gruppi di controllo e sperimentali vengano eseguiti in parallelo.
- Interazione sociale materna nel compito di interazione materna II (MI2)
- Eseguire questa attività immediatamente dopo l'attività MI1.
- Impostare l'arena in modo che un angolo contenga una tazza di rete metallica vuota e l'angolo opposto contenga la diga sotto una tazza di filo di rete. Se i topi sono in grado di spostare la tazza, pesare la tazza con un peso che può essere registrato nella parte superiore della tazza per evitare il movimento. Metti la biancheria da letto sporca del nido dalla gabbia domestica in un altro angolo.
- Eseguire l'attività MI2. Metti il cucciolo nell'angolo vuoto e registra il comportamento per cinque minuti a 30 fps, permettendo al cucciolo di esplorare. Esegui ogni cucciolo separatamente e pulisci accuratamente l'intera arena e le coppe di rete metallica tra ogni cucciolo.
7. Saggiare il compito di comportamento sociale degli adulti
- Esegui un comportamento sociale per adulti negli stessi topi che sono stati eseguiti nell'attività MI1 e MI2 una volta che sono adulti (P60-P70 o più). I dati raccolti qui sono stati fatti in una coorte separata.
- Maneggiare i topi adulti per 3 giorni consecutivi per consentire l'assuezione allo sperimentatore. Assicurarsi che solo gli sperimentatori che sono stati familiarizzati ai topi edi esperimenti di comportamento, idealmente fare in modo che la stessa persona volva tutte le attività.
- Abituare i topi all'arena OF per 3 giorni per 5 minuti ogni giorno.
- Comportamento del saggio in un nuovo compito di riconoscimento degli oggetti per misurare la locomozione generale e l'interesse per un nuovo oggetto. Ciò consentirà un'interpretazione più significativa del comportamento sociale se i topi hanno un deficit specifico nelle interazioni sociali.
- Posiziona i topi nell'arena per 5 minuti con un nuovo oggetto (piccolo giocattolo di plastica con superfici lisce e pulibili) in un angolo dell'arena. Pulire accuratamente l'arena tra topi con il 70% di etanolo.
- Per il riconoscimento di oggetti nuovi, posizionare l'"oggetto romanzo" precedentemente esposto, che ora è familiare, in un angolo e posizionare un nuovo oggetto nuovo nell'angolo opposto. Per tutte le attività, cambiare gli angoli tra le prove come controllo.
- Per una nuova interazione sociale, assicurati che i nuovi topi siano invecchiati, affaticati e abbinati al sesso e siano acclimatati alla tazza di filo di rete per 2 giorni consecutivi per 5 minuti ogni giorno. Per ogni prova, posizionare un nuovo topo sotto una tazza di filo di rete e nell'angolo opposto posizionare una tazza di filo a rete vuota. Lascia che i topi esplorino l'arena per 5 minuti durante la registrazione del comportamento. Pulire accuratamente l'arena e le coppe di filo di rete tra ogni prova.
8. Analisi dei dati comportamentali
- Utilizzare DeepLabCut (https://github.com/AlexEMG/DeepLabCut) per eseguire il rilevamento delle parti del corpo di base). Note dettagliate su come installare e utilizzare DeepLabCut sono disponibili nella sua pagina GitHub. È disponibile anche una libreria personalizzata basata su python "dlc_utils" (https://github.com/balajisriram/dlc_utils) per un'ulteriore analisi dei dati dopo il completamento del tracciamento delle parti del corpo di base. Maggiori dettagli su come usare questa libreria sono disponibili nella pagina GitHub.
- Installare DeepLabCut utilizzando il processo di installazione di Anaconda. Installare una versione solo CPU di DeepLabCut compatibile con GUI e la versione abilitata per la GPU per il training della rete.
- Seguire le istruzioni disponibili nel collegamento seguente per creare un progetto per il monitoraggio delle parti del corpo. Breifly, scegli un campione di fotogrammi dal tuo set di dati e contrassegna manualmente le parti del corpo pertinenti in questi fotogrammi campionati. Addestrare la rete DeepLabCut per prevedere le parti del corpo e verificare che la rete addestrata funzioni correttamente.
https://github.com/AlexEMG/DeepLabCut/blob/master/examples/Demo_yourowndata.ipynb - Ai fini del tracciamento della posizione del corpo e dell'identificazione di semplici interazioni in un campo aperto, identificare il baricentro dell'animale, la testa (definita operativamente come il punto centrale tra le orecchie), le orecchie sinistra e destra, nonché il muso e la base della coda. Avere più parti del corpo tracciate consente la sostituzione appropriata quando alcune parti del corpo mancano nel telaio a causa dell'occlusione.
- Oltre alle parti del corpo animale, tenere traccia di una varietà di punti relativi all'ambiente: come i bordi delle scatole di comportamento. Questi consentono una stima ripetibile di tali punti in più sessioni, anche se la posizione della configurazione comportamentale cambia leggermente rispetto alla fotocamera tra una sessione e l'altra.
- Dopo aver tracciato le parti del corpo dai dati di comportamento, fare attenzione a filtrare le posizioni previste della parte del corpo in base alla confidenza associata alla previsione su ogni fotogramma del video. Le previsioni di bassa confidenza sono solitamente associate a parti del corpo occluse. Per tali previsioni, sostituire una determinata parte del corpo con un'altra (se tale sostituzione è appropriata) o utilizzare le posizioni di altre parti del corpo per prevedere dove è probabile che si trova la parte corporea pertinente. Per la maggior parte delle applicazioni a campo aperto, il baricentro del corpo dei roditori è raramente occluso e può essere previsto con alta precisione e precisione.
- Utilizzare la posizione prevista del baricentro e la posizione dei punti tracciati nell'ambiente per stimare una serie di caratteristiche del comportamento dell'animale. Ad esempio, nei dati del campo aperto, la derivata del tempo della posizione può essere utilizzata per calcolare la velocità dell'animale.
- Per evitare distorsioni, eseguire tutti gli esperimenti "ciechi" rispetto al gruppo sperimentale quando possibile, in particolare quando vi è un elemento soggettivo nella valutazione dei risultati. Test per l'effetto delle differenze di sesso sui principali risultati sperimentali mediante la messa in comune dei dati in gruppi maschili e femminili. Tutti i test statistici sono progettati per testare un numero uguale di animali tra gruppi.
9. Conteggio delle celle post hoc per caratterizzare l'estensione della trasfezione cellulare
- Determinare il numero di cellule trasfette per topo poiché non tutti i topi avranno una trasfezione riuscita e ci saranno variazioni nel numero di cellule trasfette. Un metodo per raggiungere questo obiettivo consiste nel contare il numero di neuroni trasfettati in sezioni coronali alternate seguite da un'interpolazione per stimare il numero totale di cellule trasfette. Per questo, immagine e contare ogni altra sezione coronale (50 μm).
- Utilizzare perfusioni trascardiali con 4% di PFA per fissare i tessuti e quindi sezionare il cervello. Dopo la crioprotezione, sessò il cervello in sezioni coronali a 50 μm.
- Per la corteccia frontale, contare le cellule entro +2,75 e + 1,35 mm da Bregma. Queste coordinate contengono aree corticali frontali e includono parte della corteccia somatosensoriale (S1). Utilizzando questo metodo, non sono state osservate cellule trasfette in regioni corticali più caudali o aree subcorticali.
- Assicurati di indicare la sinistra dall'emisfero destro, come contrassegnare un emisfero con un foro dell'ago durante la sessatura e contare le cellule bilateralmente. Utilizzare un software di conteggio automatico delle celle o contare manualmente le celle, confermando la presenza di un corpo cellulare utilizzando DAPI.
- Una volta ottenuti i conteggi delle celle, impostare una soglia per l'inclusione. Ad esempio, includere solo topi che sono elettroporati bilateralmente nell'analisi. Per ulteriori analisi, correlare il numero di cellule trasfette con risposte comportamentali per vedere se esiste un'associazione. Questa tecnica si rivolgerà a più aree cerebrali, quindi è necessario fornire informazioni su quali regioni cerebrali sono state geneticamente manipolate.
NOTA: È possibile che la manipolazione di determinati geni possa alterare la migrazione neuronale, le specifiche e /o la morte. Assicurarsi durante il conteggio cellulare che l'anatomia cerebrale sia esaminata e che ogni neurone trasfetto si trova all'interno dello strato che è stato presumibilmente trasfetto (cioè L2/3). Misure anatomiche lorde come lo spessore corticale possono anche essere quantificate misurando la distanza dalla pia alla corticalE L6.
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Representative Results
Sviluppo e implementazione di successo di un elettroporatore su misura e di tre elettrodi a prong.
Per le IUE, è stato costruito un elettroporatore su misura economico basato su un progetto27 descritto in precedenza (Figura 1A e Figura 2). Un elettrodo a tre punte èstato realizzato 23,24 utilizzando pini di plastica con 2 elettrodi negativi attaccati alle punte delle punte e l'elettrodo positivo è stato attaccato all'estremità di una maniglia dello spazzolino da denti(Figura 1B). L'elettroporatore e tre elettrodi prong sono stati testati per garantire il corretto funzionamento. L'IUE è stato eseguito esponendo le corna uterine, iniettando DNA plasmide ed elettroporando ogni embrione (Figura 1C). L'elettrodo a tre prong può essere tenuto abbastanza facilmente in due mani come mostrato(Figura 1B,destra), usando le sporgenze per stabilizzare la testa dell'embrione. I somi piramidali L2/3 PFC e i loro processi sono stati etichettati con GFP tramite IUE, confermando così il successo dell'esperimento di trasferimento genico.
Prendendo di mira una grande popolazione di neuroni bilateralmente nella corteccia frontale dei topi.
Il numero totale di cellule trasfette e la distribuzione dei neuroni trasfettati possono essere quantificati sia per i topi giovani che per i topiadulti 5. Utilizzando questo metodo bilaterale IUE, circa 4000-6000 neuroni piramidali L2/3 sono stati trasfettato con il plasmide pCAG-GFP (Figura 3A). Inoltre, la maggior parte di queste cellule erano localizzate in regioni corticali frontali, tra cui la corteccia di associazione frontale, le aree di associazione motoria, la corteccia prelimbica e infralimbica e la corteccia cingolata orbitale e anteriore (Figura 3B). Un esempio rappresentativo mostra la distribuzione rostrale-caudale dei neuroni trasfettati in un topo di controllo adulto (P60, Figura 3C) e la distribuzione tra emisferi (Figura 3D). Ciò conferma la capacità delle IMPRESE bilaterali di colpire e etichettare geneticamente grandi popolazioni di neuroni piramidali L2/3 nella corteccia frontale.
Comportamento sociale nei topi giovani e adulti.
La prima parte del compito di interazione materna ha testato la capacità dei topi trasfetati P18 di controllo (IUE con plasmide pCAG-GFP) di trovare lettiera nido (interazione materna 1 [MI1]). Questo testa le capacità sensorimotorie dei topi giovani. I topi di controllo hanno trascorso più tempo ad esplorare la loro biancheria da letto del nido che ad esplorare la biancheria da letto fresca. Pertanto, suggerendo che, come previsto, questi topi hanno capacità sensorimotorie intatte e comportamento esplorativo (Figura 4A e Figura 3B). La seconda parte del compito (MI2) sfrutta la tendenza dei topi ad essere motivati a interagire ed essere vicini alla madre. In questo compito, i cuccioli hanno trascorso la maggior parte del loro tempo vicino alla madre mentre trascorrevano molto meno tempo ad esplorare la tazza vuota o la biancheria da letto del nido (Figura 4C,D). Questi risultati suggeriscono che i topi di controllo IUE mostrano un normale comportamento di homing.
I topi di controllo per adulti (P60) hanno trascorso circa il 35% del tempo esplorando un nuovo oggetto (tempo totale trascorso nell'arena = 5 minuti, Figura 5A,B). Quando sono stati presentati con un oggetto nuovo e familiare, i topi adulti hanno trascorso più tempo ad esplorare il nuovo oggetto, suggerendo un interesse intatto per la novità(Figura 5C,D). Nel compito di socialità, controllare i topi adulti ha trascorso quantità simili di tempo esplorando un nuovo topo e una tazza vuota (Figura 5E,F). Questo comportamento è stato monitorato automaticamente utilizzando il software DeepLabCut26 liberamente disponibile. I video di esempio mostrano l'etichettatura riuscita di vari punti su un mouse, inclusi gli arti, il baricentro, la testa e le orecchie (Video 1). DeepLabCut è stato utilizzato per determinare quando i topi stavano allevando esaminando la lunghezza del corpo del mouse, poiché questa distanza diventa più breve quando il mouse si rilava (Video 2).
Figura 1: In utero elettroporazione utilizzando un elettroporatore su misura e un elettrodo a tre prong. (A) Immagine dell'elettroporatore costruito su misura (a sinistra) e del suo pannello frontale (a destra). 1: Indicatore di potenza. 2: Interruttore di alimentazione. 3: Indicatore di impulso. 4: Interruttore in modalità test. 5: Selettore di tensione. 6: Controllo della larghezza dell'impulso. 7: Elettrodo (+). 8: Trigger esterno (TTL). 9: Elettrodo (-). (B) Immagine dell'elettrodo a tre pini costruito su misura (a sinistra) e del metodo consigliato per trattenere i tre elettrodi a prong durante l'IUE (a destra). (C) A sinistra: Diagramma raffigurante l'intervento chirurgico IUE eseguito in dighe E16. A destra: immagine confocale rappresentativa 20X di IUE con GFP destinata a L2/3 mPFC. Asterisco giallo: L2/3 GFP+ neuroni. Barra di scala del pannello sinistro = 250 μm. Barra di scala del pannello destro = 75 μm. Dati e dati adattati da Comer et al., 20205. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Diagramma a circuito dell'elettroporatore su misura. Diagramma che illustra il circuito elettroporatore su misura basato sugli esempi27 descritti in precedenza. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Targeting di grandi popolazioni di neuroni corteccia frontale L2/3 utilizzando IUE. (A) Numero totale di cellule GFP+ nei topi di controllo giovanile. N = 15 topi. (B) Percentuale di cellule GFP+ per area nei topi di controllo adulti. N = 22 topi di controllo. (C) Sezioni rappresentative che mostrano l'estensione rostro-caudale delle cellule trasfette nella corteccia frontale. Le immagini nei pannelli di sinistra sono aree ingrandite dai pannelli destro (quadrato rosso). Corteccia associativa frontale: FrA. Corteccia motoria supplementare: M2. Corteccia prelimbica: PL. Corteccia infralimbica: IL. Corteccia cingolata anteriore: ACC. Corteccia orbitofrontale mediale: MO. Corteccia orbitofrontale ventrale: VO. Corteccia orbitofrontale laterale: LO. Corteccia insulare anteriore: IA. Zona corteccia frontale 3: Fr3. Corteccia motoria primaria: M1. Corteccia somatosensoriale primaria: S1. Corteccia piriforme: Pir. Nucleo olfattivo anteriore: AO. Caudate-putamen: Cpu. Numeri neri: coordinate di Bregma. Barra di scala del pannello sinistro = 0,5 mm. Barra di scala del pannello destro = 1 mm±. Mostrando il numero di cellule non interpolate da 14 topi adulti elettroporati con plasmide pCAG-GFP. Test t accoppiato. p = 0,4757. Dati adattati da Comer et al., 20205. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Valutazione delle capacità sensorimotorie, del comportamento esplorativo e delle prime interazioni sociali nei topi trasfetati giovanili. (A) Esempio rappresentativo di percorso percorso (traccia nera) da un cucciolo di controllo P18 nell'attività MI1. Angoli di biancheria da letto freschi (freschi 1 e 2, rosa) e angolo biancheria da letto nido (verde). (B) I cuccioli di controllo hanno trascorso più tempo ad esplorare la biancheria da letto del nido rispetto alla biancheria da letto fresca nell'attività MI1. p < 0,001, ****p < 0,0001. Test post a due via ANOVA e Sidak. (C) Esempio rappresentativo di percorso percorso (traccia nera) da un cucciolo di controllo P18 nell'attività MI2. Coppa della diga (diga: blu), tazza vuota (tazza vuota: giallo), angolo biancheria da letto nido (nido: verde). (D) I cuccioli di controllo hanno trascorso più tempo a interagire con la loro diga che con la tazza vuota o la biancheria da letto del nido. Test post a due via ANOVA e Sidak. p < 0,0001. N = 15 topi di controllo. Dati e dati adattati da Comer et al., 20205. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Valutazione delle interazioni sociali nei topi transfette adulti. (A) L'esempio rappresentativo di percorso percorso (traccia nera) da P60 controlla il mouse adulto nell'attività di interazione di nuovi oggetti. angolo rosa = posizione del nuovo oggetto. (B) I topi di controllo hanno trascorso circa il 35% del tempo ad esplorare il nuovo oggetto (5 minuti di tempo totale). Percentuale di tempo trascorso in angolo con l'oggetto nuovo mostrato. (C) Esempi rappresentativi di percorso percorso (traccia nera) da un mouse adulto di controllo P60 in un'attività di riconoscimento di nuovi oggetti. angolo rosa: posizione del nuovo oggetto. angolo verde: posizione dell'oggetto familiare. (D) I topi di controllo hanno trascorso più tempo ad esplorare il nuovo oggetto rispetto all'oggetto familiare. Indice di discriminazione (DI) indicato; DI = ((tempo con oggetto nuovo - tempo con oggetto familiare) / (tempo con oggetto nuovo + tempo con oggetto familiare)). (E) Esempi rappresentativi di percorso percorso (traccia nera) da P60 controllano il mouse adulto nel compito di socialità. angolo rosa: posizione del nuovo topo sotto la tazza di filo a rete. angolo verde: posizione della tazza di filo a rete vuota. (F) I topi di controllo hanno trascorso in media lo stesso tempo esplorando una tazza vuota e una tazza contenente un nuovo topo. Il grafico mostra DI ((tempo con topo nuovo - tempo con tazza vuota) / (tempo con topo nuovo + tempo con tazza vuota)). Poiché i topi non erano socialmente isolati prima del compito, la spinta a interagire con un nuovo topo potrebbe essere diminuita. Tuttavia, c'era ancora esplorazione del novel topo. N = 22 topi di controllo. Dati e dati adattati da Comer et al., 20205. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Video 1: Utilizzo di DeepLabCut per tenere traccia automaticamente della posizione degli animali nelle attività comportamentali. Un video rappresentativo di un mouse adulto nell'attività di interazione sociale che è stata etichettata utilizzando DeepLabCut. Varie parti del mouse possono essere etichettate come gli arti e la testa. L'uso del baricentro è appropriato per tracciare la posizione dell'animale, ma altri punti possono essere utilizzati per identificare comportamenti più complessi, come la toelettatura o l'allevamento. Clicca qui per vedere questo video. (Fare clic con il pulsante destro del mouse per scaricare).
Video 2: Utilizzo di DeepLabCut per tenere traccia automaticamente dell'allevamento nelle attività comportamentali. Un video rappresentativo di un mouse adulto nell'attività di interazione sociale che è stata etichettata utilizzando DeepLabCut. La freccia rossa mostra la lunghezza del mouse con la freccia rivolta verso la testa del mouse. La lunghezza della freccia può essere utilizzata per determinare con il mouse è l'allevamento, poiché la lunghezza del mouse e la freccia diventano più piccole quando il mouse si riarrena. Clicca qui per vedere questo video. (Fare clic con il pulsante destro del mouse per scaricare).
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Discussion
Qui viene descritta una pipeline che combina la manipolazione di nuovi geni di interesse in grandi popolazioni di neuroni corticali frontali con saggi comportamentali nei topi. Inoltre, questa pipeline consente lo studio longitudinale del comportamento negli stessi topi sia durante lo sviluppo postnatale precoce che in età adulta. Questa tecnica ignora la necessità di fare affidamento su modelli genetici di animali che possono essere costosi in termini di tempo e spese. Il punto di forza di questo protocollo è che può essere utilizzato per studiare disturbi neurosviluppo e neuropsichiatrici per i quali recenti GWAS hanno scoperto nuove associazioni genetiche28,29. Sebbene questo metodo fornisca una trasfezione specifica di tipo cellulare dei neuroni eccitatori, una limitazione è che è meno fattibile prendere di mira altri tipi di cellule cerebrali come internaurioni o cellule gliali. Tuttavia, diversi studi suggeriscono un approccio modificato per colpire altri tipi di cellulecerebrali 30,31. Inoltre, modificando la posizione degli elettrodi rispetto alla testa dell'embrione e cambiando i tempi dell'IUE, altre regioni cerebrali possono essere trasfette bilateralmente tra cui l'ippocampo, l'amigdala, il cervelletto e le cortici visive, somatosensoriali emotorie 24,32. Inoltre, diversi livelli corticali possono essere presi di mira eseguendo IUE in diverse fasi di sviluppo.
Sebbene IUE possa avere un alto tasso di successo, a volte sono necessari passaggi critici e la risoluzione dei problemi del metodo. È necessario che i plasmidi siano accuratamente progettati e convalidati nelle linee cellulari. Come per tutte le clonazioni, occorre fare attenzione a garantire una corretta espressione genica, ad esempio confermando che la sequenza è nel fotogramma. Inoltre, l'effetto della manipolazione genica (ad esempio, sovraespressione o silenziamento) dovrebbe essere confermato tenendo conto del fatto che i livelli di espressione potrebbero variare nel corso del tempo di sviluppo del topo e della data di sviluppo dell'IUE. Western blot e qPCR possono essere utilizzati per determinare l'estensione della sovraespressione genetica5. Si raccomanda di co-elettroporare un gene reporter, come la GFP, in un plasmide separato poiché le proteine taggate con GFP possono essere piegate male o perdere la loro funzione. In alternativa, se un reporter non viene utilizzato, lo sperimentatore può utilizzare l'ibridazione in situ, qPCR o western blot per determinare i livelli di espressione del gene di interesse5.
Se i plasmidi sono stati verificati ma non ci sono animali che sembrano positivi per la trasfezione, controllare accuratamente tutte le apparecchiature, in particolare l'elettroporatore, per garantire il corretto funzionamento. Quando si erogano impulsi di tensione agli embrioni, le corna uterine devono essere inumidite bene con salina riscaldata e gli elettrodi dovrebbero produrre bolle al momento della generazione dell'impulso di tensione. Se non sono presenti bolle quando la tensione viene erogata, è probabile che ci sia un problema con l'elettroporatore. In alternativa, il cDNA potrebbe non essere stato iniettato correttamente nel ventricolo. Quando il cDNA viene iniettato correttamente nel ventricolo laterale, il colorante verde veloce sarà visibile a forma di mezzaluna. Infine, la posizione degli elettrodi è importante. Se gli elettrodi sono posizionati leggermente in modo errato, le cellule potrebbero non essere trasfette nella regione di interesse. Pertanto, quando si verifica la presenza di una trasfezione riuscita, salvare alcune sezioni cerebrali caudali in più per vedere, se forse, la regione cerebrale sbagliata è stata trasfettata. Una volta praticato questo metodo, un chirurgo esperto può aspettarsi di raggiungere un tasso di successo di quasi il 90%. Questo protocollo può essere modificato per colpire altre regioni cerebrali di interesse. Ad esempio, è possibile indirizzare la maggior parte delle regioni corticali a livello bilaterale e persino alcune regioni subcorticali, tra cui l'ippocampo23 . È anche possibile ridurre ulteriormente i costi costruendo un elettroporatore personalizzato, che è stato utilizzato nei dati quipresentati 5,27.
Studi futuri potrebbero utilizzare questo metodo per comprendere il ruolo dei candidati geniali appena scoperti in varie malattie neurologiche. La pipeline presentata offre un saggio relativamente veloce per testare gli effetti di specifiche manipolazioni genetiche sullo sviluppo postnatale precoce e sul comportamento nell'età adulta. Gli sforzi futuri che utilizzano questo metodo hanno il potenziale per scoprire quali geni svolgono un ruolo causale in alcuni disturbi cerebrali, tra cui la SCZ e il disturbo dello spettro autistico.
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Disclosures
Gli autori non dichiarano interessi concorrenti.
Acknowledgments
Ringraziamo Lisa Kretsge per il feedback critico e la modifica del manoscritto. Ringraziamo tutti gli assistenti di ricerca del laboratorio Cruz-Martín che sono stati preziosi nell'aiutare con le perfusioni e il conteggio cellulare dei cervelli comportamentali. Ringraziamo Andrzej Cwetsch per l'input nella progettazione dell'elettrodo tripolare, e Todd Blute e il Boston University Biology Imaging Core per l'uso del microscopio confocale. Questo lavoro è stato supportato da un NARSAD Young Investigator Grant (AC-M, #27202), dal Brenton R. Lutz Award (ALC), dall'I. Alden Macchi Award (ALC), dal NSF NRT UtB: Neurophotonics National Research Fellowship (ALC, #DGE1633516) e dal Boston University Undergraduate Research Opportunities Program (WWY). I finanziatori non hanno avuto alcun ruolo nella progettazione dello studio, nella raccolta e nell'analisi dei dati, nella decisione di pubblicare o preparare il manoscritto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 13mm Silk Black Braided Suture | Havel's | SB77D | Suture skin |
| Adson Forceps | F.S.T. | 11006-12 | IUE |
| C270 Webcam | Logitech | N/A | Record behavior |
| Electroporator | Custom-built | N/A | See Figure 1 and 2 and Bullmann et al, 2015 |
| EZ-500 Spin Column Plasmid DNA Maxi-preps Kit, 20preps | Bio Basic Inc. | BS466 | Pladmid preparation |
| Fast Green FCF | Sigma | F7252-5G | Dye for DNA solution |
| Fine scissors- sharp | F.S.T. | 14060-09 | IUE |
| Fisherbrand Gauze Sponges | Fisher Scientific | 1376152 | IUE |
| Gaymar Heating/Cooling | Braintree | TP-700 | Heating Pad |
| Glass pipette puller | Sutter Instrument, | P-97 | IUE |
| Glass pipettes | Sutter Instrument, | BF150-117-10 | IUE |
| Hair Removal Lotion | Nair | N/A | Hair removal |
| Hartman Hemostats | F.S.T. | 13002-10 | IUE |
| Open field maze- homemade acrylic arena | Custom-built | N/A | 50 × 50 × 30 cm length-width-height |
| pCAG-GFP | Addgene | 11150 | Mammalian expression vector for expression of GFP |
| Picospritzer III | Parker Hannifin | N/A | pressure injector |
| Retractor - 2 Pronged Blunt | F.S.T. | 17023-13 | IUE |
| Ring forceps | F.S.T. | 11103-09 | IUE |
| Sterilizer, dry bead | Sigma | Z378569 | sterelize surgical tools |
| SUTURE, 3/0 PGA, FS-2, VIOLET FOR VET USE ONLY | Havel's | HJ398 | Suture muscle |
| Water bath | Cole-Parmer | EW-12105-84 | warming sterile saline |
References
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