Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

צינור באמצעות אלקטרופורציה דו-צדדית ברחם כדי לחקור השפעות גנטיות על התנהגות מכרסמים

doi: 10.3791/61350 Published: May 21, 2020

Summary

התפקיד של גנים הקשורים למחלות שהתגלו לאחרונה בפתוגנזה של הפרעות נוירופסיכיאטריות נשאר מעורפל. דו-צדדי שונה בטכניקת אלקטרופורציה ברחם מאפשר העברת גנים באוכלוסיות גדולות של נוירונים ובחינת ההשפעות הסיבתיות של שינויים בביטוי גנים על ההתנהגות החברתית.

Abstract

כמו מחקרי עמותה הגנום כולו לשפוך אור על היסודות הגנטיים הטרוגניים של מחלות נוירולוגיות רבות, הצורך לחקור את תרומתם של גנים ספציפיים להתפתחות המוח ותפקוד עולה. הסתמכות על מודלים של עכבר כדי ללמוד את התפקיד של מניפולציות גנטיות ספציפיות לא תמיד ריאלי מאז קווי עכבר מהונדסים הם יקרים למדי גנים רבים הקשורים למחלות חדשניות עדיין אין קווים גנטיים זמינים מסחרית. בנוסף, ייתכן שידרשו שנים של פיתוח ואימות כדי ליצור קו עכבר. ב electroporation הרחם מציע שיטה מהירה יחסית וקלה לתפעל ביטוי גנים באופן ספציפי סוג התא vivo כי רק דורש פיתוח פלסמיד DNA כדי להשיג מניפולציה גנטית מסוימת. ניתן להשתמש באל-דו-צדדי באלקטרופורציה של הרחם כדי למקד אוכלוסיות גדולות של נוירונים פירמידליים בקליפת המוח הקדמית. שילוב שיטת העברת גנים זו עם גישות התנהגותיות מאפשר לחקור את ההשפעות של מניפולציות גנטיות על תפקודן של רשתות קליפת המוח הקדם-מצחית ועל ההתנהגות החברתית של עכברים צעירים ומבוגרים.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

מחקרי עמותה גנומית (GWAS) הובילו לגילוי גנים מועמדים חדשניים הקשורים לפתולוגיות במוח1,2,3,4. מחקרים אלה היו מועילים במיוחד בהבנת הפרעות נוירופסיכיאטריות הרסניות כגון סכיזופרניה (SCZ), שם חקירת גנים חדשניים שימשה כנקודת השקה עבור קווים חדשים של מחקר והתערבות טיפולית5,6. גנים המעניקים סיכון ל- SCZ מראים ביטוי מוטה בקליפת המוח הקדם-מצחית (PFC) במהלך התפתחות טרום לידתית ותחילת הלידה, אזור מעורב בפתולוגיה של מספר הפרעות נוירופסיכיאטריות7. בנוסף, מודלים של עכבר של הפרעות פסיכיאטריות להפגין פעילות חריגה ברשתות PFC6,8,9. תוצאות אלה מצביעות על כך שגנים הקשורים ל- SZC עשויים לשחק תפקיד בחיווט ההתפתחותי של אזור זה. חקירה נוספת באמצעות מודלים של בעלי חיים נדרשת כדי להבין את תרומתם של גנים מועמדים אלה להקמת קשרים ב- PFC ולקבוע אם לגנים אלה יש תפקיד סיבתי בפתוגנזה של הפרעות נוירופסיכיאטריות. טכניקות מניפולציה גנטית בעכברים המאפשרות חקר שינויים בביטוי גנים במעגלים עצביים ספציפיים במהלך התפתחות טרום לידתית ותחילת הלידה הן שיטה מבטיחה להבנת המנגנונים המולקולריים המקשרים בין שינויים בביטוי הגנים לתפקוד לקוי של PFC.

קווי עכבר גנטיים מציעים שיטה לחקור את ההשפעה של גנים מסוימים על התפתחות המוח ותפקודו. עם זאת, הסתמכות על עכברים מהונדסים יכולה להיות מגבילה שכן לא תמיד יש קווים זמינים מסחרית כדי לבחון את ההשפעות של גנים ספציפיים על פיתוח מעגלים עצביים. יתר על כן, זה יכול להיות יקר מאוד זמן רב לפתח קווי עכבר מותאמים אישית. השימוש באסטרטגיות מניפולציה גנטית מצטלבות המשלבות עכברים מהונדסים עם גישות ויראליות חולל מהפכה בהבנת המוח10,11,12. למרות התקדמות רבה, אסטרטגיות ויראליות מגיעות עם מגבלות מסוימות בהתאם לסוג הווקטור הנגיפי, כולל מגבלות ביכולת האריזה שיכולות להגביל ביטוי ויראלי13 ורעילות תאים הקשורים לביטוי ויראלי14. יתר על כן, ברוב התנאים הניסיוניים, ביטוי גנים חזק באמצעות וירוס הקשורים אדנו (AAVs) דורש כ 2 עד 4 שבועות15, מה שהופך אסטרטגיות ויראליות שגרתיות בלתי אפשרי לתפעל גנים במהלך התפתחות מוקדמת לאחר הלידה.

ב electroporation הרחם (IUE) היא גישה חלופית המאפשרת העברת גנים מהירה וזולה16,17 כי, בשילוב עם תיוג פלואורסצנטי וגישות פרמקוגנטיות או אופטוגנטיות, מספק פלטפורמה רבת עוצמה לנתח את הפונקציה של מעגלים עצביים. בנוסף, עם התפתחות הגנום CRISPR-Cas9 עריכת גנים ניתן להגזים או לשנות במדויק באמצעות סוג התא ספציפי להפיל או לדפוק מתוך גנים ספציפיים או באמצעות אפנון של מקדמים18,19. גישות מניפולציה גנים באמצעות IUE הם יתרון במיוחד כאשר ההשפעה של גנים על מעגלים עצביים צריך להיבדק במהלך חלונות התפתחותיים צרים20. IUE היא טכניקה רב-תכליתית וניתן להשיג בקלות ביטוי יתר על-ידי החדרת גן לווקטור ביטוי תחת מקדם ספציפי. שליטה נוספת של ביטוי גנים יכולה להיות מושגת על ידי הנעת ביטוי באמצעות מקדמים של עוצמות שונות או באמצעות מקדמים בלתי ניתנים להכלה המסוגלים לשלוט זמנית ביטוי גנים21,22. בנוסף, IUE מאפשר מיקוד של תאים בתוך שכבות קליפת המוח ספציפיות, סוגי תאים ואזורי מוח, אשר לא תמיד ריאלי באמצעות גישות אחרות5,17. ההתקדמות האחרונה בתצורת IUE המבוססת על שימוש בשלוש אלקטרודות, המייצרת התפלגות יעילה יותר של שדה חשמלי, הרחיבה את הרפרטואר הפונקציונלי של שיטה זו ואיפשרה למדענים למקד סוגי תאים חדשים ולהגדיל את היעילות, הדיוק ומספר התאים שניתן להתמקד בהם23,24. טכניקה זו שימשה לאחרונה כדי לקבוע את התפקיד הסיבתי של רכיב משלים 4A (C4A), גן המקושר SCZ, בפונקציה PFC וקוגניציה מוקדמת5.

להלן צינור ניסיוני המשלב גישות להעברת גנים כדי למקד אוכלוסיות גדולות של נוירונים מעוררים בקליפת המוח הקדמית, כולל ה- PFC, עם פרדיגמות התנהגותיות שלא רק מאפשרות לימוד שינויים ברמת התא והמעגל, אלא גם מאפשרות ניטור התנהגות לאורך ההתפתחות המוקדמת לאחר הלידה והבגרות. הראשון שתואר הוא שיטה ל transfect דו צדדי אוכלוסיות גדולות של שכבות (L) 2/3 נוירונים פירמידליים באזורים קליפת המוח הקדמית. לאחר מכן, משימות כדי לתחקר התנהגות חברתית בעכברים צעירים ומבוגרים מתוארים. ספירת תאים ניתן להשיג עם השלמת משימות התנהגותיות כדי לכמת את היקף ומיקום של transfection התא. יתר על כן, מספר התאים transfected יכול להיות בקורלציה עם נתונים התנהגותיים כדי לקבוע אם מספר גדול יותר של תאים transfected מוביל הפרעות גדולות יותר בהתנהגות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

כל הפרוטוקולים הניסיוניים נערכו על פי הנחיות המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) למחקר בבעלי חיים ואושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת בוסטון (IACUC).

1. הכנת פתרון DNA

  1. לרכוש פלסמיד מסחרי או subclone גן של עניין לתוך פלסמיד עם האמרגן הרצוי. כאן נעשה שימוש בפלסמיד המכיל EGFP תחת מקדם CAG (pCAG-EGFP).
    הערה: קבע את האמרגן הרצוי בהתבסס על רמת הביטוי הדרושה. באופן כללי, פלסמידים תחת מקדם CAG יכול לשמש כדי להשיג רמות גבוהות של transgene ואילו יחצנים ספציפיים סוג התא (למשל, סינפסין עבור נוירונים) נוטים להיות פחות פעילים. על הנסיין לקבוע באופן אמפירי את רמות הביטוי המתאימות לכל פלסמיד.
  2. להפוך חיידקים ולגדל מניות במדיה חיידקית עם אנטיביוטיקה המתאימה.
    1. הסר תאים מוסמכים (תאי DH5α) מ -80 מעלות צלזיוס והפשר על קרח במשך 20 דקות.
    2. מערבבים 100 pg-100 ng של DNA פלסמיד עם 30 μL של תאים מוסמכים. דגירה את התערובת על קרח במשך 20 דקות.
    3. בצע הלם חום על ידי דגירה באמבט מים 42 מעלות צלזיוס במשך 45 s ולאחר מכן להחזיר את הצינור בחזרה לקרח במשך 2 דקות.
    4. הוסף 200 - 1,000 μL של מדיה LB לתאים המוסמכים שעברו המרה ולגדול במשך 45 דקות ב 37 מעלות צלזיוס על אינקובטור רועד.
    5. צלחת 200 μL של התאים שהפכו לצלחת אגר LB המכילה את האנטיביוטיקה המתאימה להדגיר את הצלחת לילה ב 37 מעלות צלזיוס.
    6. למחרת, דגירה מושבת חיידקים אחת ב 200 מ"ל של מרק LB עם אנטיביוטיקה המתאימה ב 37 מעלות צלזיוס על אינקובטור רועד לילה.
  3. לטהר את ה-DNA פלסמיד באמצעות ערכת maxiprep.
    1. בצע את ההוראות המופיעות בערכת maxiprep שהתקבלה. לשלב elution, לא לשים DNA לתוך מאגר elution. במקום זאת, דנ"א elute באמצעות או 200 μL של סטרילי 1x PBS או מים ברמה מולקולרית.
    2. ודא כי הריכוז הסופי של ה- DNA גדול מ 1 מיקרוגרם / μL. אם הפלסמיד המכיל את גן העניין אינו מכיל גן כתב, אז גם להכין פלסמיד כדי להחדיר יחד עם מולקולת כתב, כגון חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP), כדי לאפשר הדמיה של תאים transfected.
  4. הכן פתרון DNA לניתוח על ידי דילול ה- DNA פלסמיד לתוך 1x PBS ל 1 מיקרוגרם / μL הריכוז הסופי של כל פלסמיד. מוסיפים צבע ירוק מהיר לתמיסת הדנ"א לריכוז סופי של 0.1%. עבור זריקות דו צדדיות, להכין 60 μL של פתרון לכל סכר (עבור כ 10 גורים).
    הערה: אם פלסמיד אינו מכיל גן כתב, שיתוף electroporate עם GFP. שיעורי האלקטרופורציה המשותפת הם בדרך כלל 95% ומעלה. בידינו, יעילות ההחלקה לא הושפעה מהתעברות משותפת. כל פלסמידים electroporated צריך להיות מדולל ל 1 מיקרוגרם / μL.

2. הזמנה או רבייה של עכברים מתוזמן בהריון

  1. אם אתם מזמינים עכברים בהריון מתוזמן, הזמינו עכברים להגיע ביום העוברי (ה) 13 או מוקדם יותר כדי לאפשר לסכרים זמן מתאים להסתגל לדיור בעלי חיים.  בפרוטוקול זה, עכברים גזעיים CD-1 משמשים לכל הניסויים.
    הערה: הזמנה של כמה ימים מראש תפחית את הלחץ של בעלי החיים ותוביל לשיעור הישרדות גבוה יותר של הגורים.
  2. אם הרבייה עכברים מתוזמן בהריון, זוג עכברים נקבה עם זכר לילה, פעם בשבוע. בדוק אם יש תקע נרתיקי בבוקר שלמחרת (E0.5). לקבוע הריון על ידי ניטור המשקל של העכברים הנשיים.
    הערה: זנים שונים של העכבר יש עליות משקל שונות במהלך ההריון, כדי לקבוע עלייה במשקל טיפוסי עבור זן העכבר בשימוש.
  3. בין אם מזמינים או מגדלים את העכברים, כדי להפחית את הלחץ של הסכרים, מניחים כרית קינון ובית עכבר בכלוב. הפחתת מתח יכולה לעזור להגדיל את שיעור ההישרדות של הגורים.

3. תכנון והרכבה של שלוש אלקטרודות שיניים

  1. השתמש יריעות טיטניום כיתה 2 עם עובי של 0.063 ב כחומר מלאי עבור מגעי אלקטרודה.
  2. באמצעות טכניקות עיבוד שבבי סטנדרטיות או כלי יד מדויקים, הפוך אלקטרודות עם הממדים הבאים: 20 מ"מ x 5 מ"מ עם קצה מעוגל וגרוב בחזרה. הסר קצוות מחוספסים או burrs באמצעות נייר זכוכית חצץ עדין.
  3. כדי לחבר את מגעי האלקטרודה, לעטוף 22 G חוט נחושת תקוע סביב החריצים של האלקטרודה ומאובטח על ידי הלחמה. הגן על המפרק הזה באמצעות צינורות כיווץ חום.
  4. לאחר מכן, חבר את האלקטרודה המחוברת למלקחיים אוטומטיים ולא מוליכים באמצעות צינורות כיווץ חום נוספים כדי להפוך את שתי האלקטרודות השליליות. חבר את האלקטרודה החיובית היחידה לחומר אוטומטי ולא מוליך (כגון ידית מברשת שיניים עם ראש מנוסר). התאם את הקצה הפתוח של החוט עם תקע בננה סטנדרטי.

4. הכנה לניתוח

  1. להביא סכרים בהריון לאזור הניתוח לפחות 30 דקות לפני הניתוח כדי לאפשר את הירידה ברמות הלחץ לאחר הובלה ממתקן בעלי החיים.
  2. לעקר את כל אתר הניתוח באמצעות מגבונים germicidal מעקר ולאחר מכן 70% אתנול. החלף כפפות לפני תחילת הניתוח.
  3. לעקר כלים autoclaved בסטריליזציה חרוזי זכוכית.
  4. מעבירים סטרילי 1x PBS (כ 50 מ"ל לסכר) ל 50 מ"ל צינורות חרוט ומניחים במתלה צינור באמבט המים מחומם ל 38-40 מעלות צלזיוס. בדוק את טמפרטורת מלוחים סטרילית עם מדחום.
  5. הפעל את משאבת זרימת חימום המים, כך שהוא מחומם ל 37 מעלות צלזיוס לפני תחילת הניתוח. זה ישמור על טמפרטורת הגוף של העכבר למשך הניתוח.
  6. הפעל את מזרק הלחץ ואת electroporator ולהבטיח תפקוד תקין לפני הניתוח.
  7. בקצרה לסובב את פתרון DNA פלסמיד (הושג בשלב 1.4) על צנטריפוגה שולחן ומניחים אותו על קרח.
  8. משוך פיפטות זכוכית על מושך פיפטה כך קצה פיפטה זכוכית משך הוא כ 50 מיקרומטר קוטר.
  9. מילוי פיפטה עם 20-40 μL של פתרון DNA (הושג בשלב 1.4).
  10. הגדר את כל הפריטים הדרושים לניתוח כולל קרם להסרת שיער, יוד, 70% אתנול, החלפת כותנה, משחת עיניים, תפרים, גזה וכו '.
  11. הכן גיליון ניתוח ומלא את המידע הדרוש, כגון מזהה עכבר ומשקל, תאריך ניתוח, שם מנתח וכו '.

5. בניתוח אלקטרופורציה ברחם

  1. שקל את העכבר לפני הניתוח ושים לב לזה על גיליון הניתוח.
  2. הרדמה עכבר בהריון (E16) על ידי שאיפה בתא אינדוקציה עם 4% (v / v) תערובת חמצן-isoflurane. לאחר העכבר כבר המושרה, לעבור שאיפת מסכה ולשמור isoflurane ב 1-1.5% (v / v) ולפקח על הנשימה לאורך כל הניתוח. בדוק כי העכבר מורדם לחלוטין, קצב הנשימה צריך להיות ~ 55-65 נשימות לדקה.
  3. ניהול משככי כאבים לפני הניתוח: בופרנורפין (3.25 מ"ג/ק"ג; SC) ומלוקסיקאם (1-5 מ"ג/ק"ג; SC) בנפח מרבי של 10-30 מ"ל/ק"ג.
  4. השתמש קרם להסרת שיער או בזהירות להשתמש סכין גילוח כדי להסיר את הפרווה מהבטן. לעקר את הבטן על ידי טבילה עם povidone-יוד ו 70% אתנול ולחזור על זה לפחות 3 פעמים. צור שדה סטרילי סביב הבטן באמצעות גזה סטרילית, וילונות סטריליים יכולים לשמש גם.
  5. בצע חתך קו האמצע (3-4 ס"מ) בעור הבטן, להיות בטוח להרים את העור עם מלקחיים, כדי למנוע חיתוך דרך השריר. ואז לחתוך דרך השריר, שוב דואג להרים את השריר כדי למנוע חיתוך איברים חיוניים.
  6. מוציאים בזהירות את קרני הרחם מהסכר באמצעות מלקחיים טבעתיים ומניחים אותן בעדינות על השדה הסטרילי, מוודאים שקרן הרחם נתמכת בריפוד ואינה מושכת רחוק מדי מהסכר. מנקודה זו ואילך, לשמור על קרן הרחם לחה לאורך כל הניתוח עם PBS סטרילי מראש מחומם 1x.
  7. מקם עובר באמצעות מלקחיים או אצבעות. בזהירות להכניס את פיפטה זכוכית משך בזווית של 45 מעלות ביחס למישור האופקי של הראש מוכנס לתוך החדר לרוחב, אשר ניתן לזהות חזותית בין קו האמצע של המוח לבין העין. להזריק על 2-3 μL לתוך כל החדר לרוחב על ידי החדרת פיפטה לתוך אחד ולאחר מכן את החדר השני (מומלץ) או על ידי הזרקת פתרון ה-DNA לתוך החדר אחד עד שהוא עובר לשני החדרים לרוחב. החדר כבר ממוקד בהצלחה אם צורת חצי סהר קיים לאחר הזרקה.
    הערה: קצה פיפטה זכוכית יכול לשבור במהלך הניתוח. אם זה קורה, להחליף את פיפטה זכוכית, להבטיח כי קרני הרחם נשמרים לחים בעוד פיפטה חדשה מוכנה ומלאה בתמיסת ה- DNA.
  8. כדי להחדיר תאים דו-צדדיים בקליפת המוח הקדמית, מקמו את שתי האלקטרודות השליליות בצידי העוברים בראש רק לרוחב ומעט קאודלי לחדרים הצדדיים וממקמים את האלקטרודה החיובית בין העיניים, ממש מול האף המתפתח.
  9. ודא שהעובר לח בנדיבות. החל ארבעה פולסים מרובעים (משך הדופק = 50 ms משך, משרעת הדופק = 36 V, מרווח interpulse = 500 אלפיות השנייה).
  10. להזריק ו electroporate כל העוברים, הולך אחד אחד, כך שכל עובר הוא electroporated מיד לאחר הזרקת פתרון ה-DNA. לאחר כל העוברים כבר electroporated, בזהירות להכניס את קרני הרחם בחזרה לתוך חלל הבטן. במהלך שלב זה, מעיל חלל הבטן PBS סטרילי (1x) כדי לסייע מיקום קרן הרחם.
  11. מלאו את חלל הבטן ב-1x PBS סטרילי, כך שלא יישארו כיסי אוויר לאחר השלמת התפירה. לתפור את השריר עם תפרים נספגים ואת העור עם תפרים שאינם נספגים משי.
  12. אפשר לסכר להתאושש באופן מלא בתא מחומם למשך שעה לפחות. ב 48 שעות הבאות, לבדוק את הסכרים באופן קבוע. כשהסכר יחלים מההרדמה ויחזור להכרה, הוא יתחיל לזוז ולהציץ.
  13. נהל משככי כאבים לאחר הניתוח אם סכרים מראים סימנים של כאב, כגון כדור גופם למעלה ונשימה מהירה. רק לנהל אם יש סימנים של כאב מאז זריקות SC יכול להדגיש את הסכרים, אבל אם מנוהל לקבוצת הניסוי גם לנהל את קבוצת הביקורת, או להיפך.

6. הסתערות על התנהגות חברתית מוקדמת במשימת אינטראקציה אימהית

הערה: פרוטוקול זה מותאם מפרסומיםקודמים 5,25. בצע משימה זו לאחר עכברים נולדו מיום לאחר הלידה (P) 18-21.

  1. התנהגות ביות אימהית במשימת האינטראקציה האימהית I (MI1).
    1. ודא כי מצעי הכלוב לא ישתנו בשבוע שלפני ביצוע המשימה.
    2. השג או בנה זירת שדה פתוח (OF) שניתן לנקות בקלות (אקריליק מומלץ) עם הממדים הבאים: 50 x 50 x 30 ס"מ (רוחב-רוחב-גובה). תנאי תאורה במהלך ביצוע התנהגויות יכולים להשתנות בהתאם לשאלה ניסיונית ויכולים להשפיע על רמות של התנהגות דמוית עוררות וחרדה. הקלט ניסויים התנהגותיים תחת אור עמום (כ-20 לוקס) הממוקם מעל מרכז הזירה.
    3. במשך יומיים לפני בדיקת ההתנהגות, התאקלם בסכר לזירה על ידי הנחתו מתחת לתיל רשת (כגון עיפרון) בפינת הזירה במשך חמש דקות ביום.
    4. ביום הבדיקה, אשר יכול להיות מ P18-21, לפני עכברים נגמלו, לנקות את הזירה ביסודיות עם מגבונים חיטוי 70% אתנול.
    5. הקימו את הזירה עם שתי פינות מנוגדות, שתיהן מכילות מצעים נקיים ופינה אחת המכילה מצעי קן מלוכלכים מכלוב הבית של הגור.
    6. אפשר לכל גור לחקור את הזירה במשך 3 דקות, הצבת כל גור בפינה ניטרלית, ריקה בהתחלה.
      הערה: רשום את אופן הפעולה באמצעות מצלמת וידאו במהירות של 30 fps. לנקות ביסודיות את הזירה בין כל גור ולהחליף את המצעים הטריים. החלף איזו פינה היא מצעים טריים לעומת קינים כפקד כדי למנוע העדפה פינתית מסיבות אחרות (כלומר, רעשי סביבה או אור). אם מפעילים מספר פסולת לאורך החלון ההתפתחותי P18-21, הפעל ניסויים התנהגותיים בו-זמנית בין ימים. כמו כן, ודא כי במהלך יום נתון, קבוצות בקרה וניסיון מופעלות במקביל.
  2. אינטראקציה חברתית אימהית במשימת האינטראקציה האימהית II (MI2)
    1. בצע משימה זו מיד לאחר משימת MI1.
    2. הקימו את הזירה כך שפינה אחת תכיל רשת תיל ריקה והפינה היריבה מכילה את הסכר מתחת לתיל רשת. אם עכברים מסוגלים להזיז את הגביע, לשקול את הכיפה למטה עם משקל שניתן להדביק לחלק העליון של הכור כדי למנוע תנועה. שים מצעי קן מלוכלכים מכלוב ביתי בפינה אחרת.
    3. הפעל את משימת ה- MI2. מקם את הגור בפינה הריקה ובצע אופן פעולה של הקלטה למשך חמש דקות ב- 30 fps, דבר המאפשר לגור לחקור. הפעל כל גור בנפרד ביסודיות לנקות את הזירה כולה ואת כוסות רשת תיל בין כל גור.

7. ביצוע משימת התנהגות חברתית למבוגרים

  1. הפעל התנהגות חברתית של מבוגרים באותם עכברים שהופעלו במשימת MI1 ו- MI2 ברגע שהם מבוגרים (P60-P70 ומעלה). הנתונים שנאספו כאן נעשו בקבוצה נפרדת.
  2. טפל בעכברים הבוגרים במשך 3 ימים רצופים כדי לאפשר מגורים לנסיין. ודא שרק ניסויים שהכירו את העכברים עורכים ניסויי התנהגות, באופן אידיאלי, שאותו אדם יפעיל את כל המשימות.
  3. הרגל עכברים לזירת OF במשך 3 ימים במשך 5 דקות בכל יום.
  4. התנהגות מבחנים במשימה חדשנית לזיהוי אובייקטים כדי למדוד תנועה כללית ועניין באובייקט חדשני. זה יאפשר פרשנות משמעותית יותר של התנהגות חברתית אם לעכברים יש גירעון מסוים באינטראקציות חברתיות.
    1. מניחים עכברים בזירה במשך 5 דקות עם חפץ חדשני (צעצוע פלסטיק קטן עם משטחים חלקים ונקיים) בפינה אחת של הזירה. לנקות את הזירה ביסודיות בין עכברים עם 70% אתנול.
    2. לזיהוי אובייקטים חדשניים, הניחו את 'האובייקט החדש' שנחשף בעבר, המוכר כיום, בפינה אחת והניחו חפץ חדש בפינה הנגדית. עבור כל המשימות, העבר את הפינות בין גירסאות ניסיון כפקד.
    3. עבור אינטראקציה חברתית חדשנית, ודא כי העכברים הרומן הם גיל, מתח ומין תואם והם התאקלמו תיל רשת במשך 2 ימים רצופים במשך 5 דקות בכל יום. עבור כל משפט, מניחים עכבר רומן מתחת לתיל רשת ובפינה הנגדית מניחים תיל רשת ריקה. תן לעכברים לחקור את הזירה במשך 5 דקות תוך כדי הקלטת התנהגות. נקה את הזירה ואת כוסות תיל רשת ביסודיות בין כל משפט.

8. ניתוח נתונים התנהגותיים

  1. השתמש DeepLabCut (https://github.com/AlexEMG/DeepLabCut) כדי לבצע מעקב חלקי גוף בסיסי). הערות מפורטות על איך להתקין ולהשתמש DeepLabCut ניתן למצוא בדף GitHub שלה. כמו כן זמין ספריה מותאמת אישית המבוססת על פיתון 'dlc_utils' (https://github.com/balajisriram/dlc_utils) לניתוח נוסף של הנתונים לאחר השלמת המעקב הבסיסי אחר חלקי גוף. פרטים נוספים על אופן השימוש בספריה זו ניתן למצוא בדף GitHub.
    1. התקן DeepLabCut באמצעות תהליך ההתקנה אנקונדה. התקן גירסת CPU בלבד בעלת יכולת ממשק משתמש גרפי של DeepLabCut וכן את הגירסה המותאמת למעבד הגרפי להכשרת הרשת.
    2. בצע את ההוראות הזמינות בקישור שלהלן כדי ליצור פרוייקט למעקב אחר חלקי גוף. בריפי, בחר דוגמה של מסגרות מערכת הנתונים שלך וסמן ידנית את חלקי הגוף הרלוונטיים במסגרות אלה שנדגמו. לאמן את הרשת DeepLabCut לחזות את חלקי הגוף ולוודא כי הרשת מאומנת מבצעת כראוי.
      https://github.com/AlexEMG/DeepLabCut/blob/master/examples/Demo_yourowndata.ipynb
    3. לצורך מעקב אחר מיקום הגוף וזיהוי אינטראקציות פשוטות בשדה פתוח, זהה את מרכז החיה, את הראש (המוגדר מבחינה מבצעית כנקודת האמצע בין האוזניים), את האוזניים השמאלית והימנית, כמו גם את האף ואת בסיס הזנב. לאחר מספר חלקי גוף במעקב מאפשר את ההחלפה המתאימה כאשר חלקים מסוימים בגוף חסרים במסגרת עקב חסימה.
    4. מלבד חלקי גוף של בעלי חיים, עקוב אחר מגוון נקודות הקשורות לסביבה: כגון הקצוות של תיבות התנהגות. אלה מאפשרים הערכה חוזרת של נקודות כאלה על פני הפעלות מרובות - גם אם המיקום של ההתקנה ההתנהגותית משתנה מעט ביחס למצלמה בין המפגשים.
    5. לאחר מעקב אחר חלקי הגוף מנתוני ההתנהגות, הקפיד לסנן את מיקומי חלקי הגוף החזויים בהתבסס על הביטחון המשויך לחיזוי בכל פריים של הסרטון. תחזיות ביטחון נמוך קשורות בדרך כלל עם חלקי גוף occluded. עבור תחזיות כאלה, להחליף חלק גוף נתון עם אחר (אם החלפה כזו מתאימה) או להשתמש במיקומים של חלקי גוף אחרים כדי לחזות היכן חלק הגוף הרלוונטי עשוי להיות. עבור רוב יישומי השדה הפתוח, מרכז הגוף של המכרסמים הוא רק לעתים נדירות occluded וניתן לחזות עם דיוק גבוה ודיוק.
    6. השתמש במיקום החזוי של centroid, כמו גם את המיקום של נקודות במעקב בסביבה כדי להעריך מספר תכונות של התנהגות החיה. לדוגמה, בנתוני השדה הפתוח, ניתן להשתמש בנגזרת הזמן של המיקום כדי לחשב את מהירות החיה.
  2. כדי למנוע הטיה, לבצע את כל הניסויים "עיוור" ביחס לקבוצת הניסוי כאשר הדבר אפשרי, במיוחד כאשר יש אלמנט סובייקטיבי בהערכת התוצאות. בדוק את ההשפעה של הבדלי מין על התוצאות הניסיוניות העיקריות על ידי איגום נתונים לקבוצות זכר ונקבה. כל הבדיקות הסטטיסטיות נועדו לבחון מספר שווה של בעלי חיים בין קבוצות.

9. לאחר ספירת תאים הוק כדי לאפיין את היקף transfection התא

  1. קבע את מספר התאים המוחצנים לכל עכבר מכיוון שלא כל העכברים יקבלו הדבקה מוצלחת ויהיה שינוי במספר התאים החודרים. שיטה אחת להשגת זה כרוכה בספירת מספר הנוירונים החודרים בקטעי קורונה מתחלפים ואחריו אינטרפולציה כדי להעריך את המספר הכולל של תאים שנדבקו. בשביל זה, תמונה ולספור כל קטע coronal אחר (50 מיקרומטר).
    1. השתמש perfusions transcardial עם 4% PFA כדי לתקן רקמה ולאחר מכן לנתח את המוח. לאחר cryoprotection, קטע את המוח בחלקי coronal ב 50 מיקרומטר.
    2. עבור קליפת המוח הקדמית, לספור תאים בתוך +2.75 ו + 1.35 מ"מ מ Bregma. קואורדינטות אלה מכילות אזורים קליפתיים קדמיים וכוללות חלק מקליפת המוח הסומטו-סנטורית (S1).  בשיטה זו, לא נצפו תאים שנדבקו באזורים קליפתיים קאודלים יותר או באזורים תת-קליפתיים.
    3. הקפד לציין את השמאלי מחצי הכדור הימני, כגון סימון חצי כדור אחד עם חור מחט במהלך חתך, ולספור תאים דו-צדדית. השתמש בתוכנה אוטומטית לספירת תאים או ספירת תאים באופן ידני, המאשרת את נוכחותו של גוף תא באמצעות DAPI.
  2. לאחר ספירת תאים מתקבלים, להגדיר סף להכללה. לדוגמה, כוללים רק עכברים שעברו אלקטרופופורה דו-צדדית בניתוח. לצורך ניתוח נוסף, לתאם את מספר התאים transfected עם תגובות התנהגותיות כדי לראות אם יש שיוך. טכניקה זו תתמקד באזורי מוח מרובים, ולכן יש צורך לספק מידע על אילו אזורי מוח עברו מניפולציה גנטית.
    הערה: ייתכן כי מניפולציה של גנים מסוימים יכולה לשנות הגירה עצבית, מפרט ו/או מוות. ודא במהלך ספירת תאים כי האנטומיה במוח נבדקת וכל נוירון חתוך נמצא בתוך השכבה שלכאורה נחתכה (כלומר L2/3). מדידות אנטומיות ברוטו כגון עובי קליפת המוח ניתן לכמת גם על ידי מדידת המרחק מן הפיה כדי L6 קליפת המוח.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

פיתוח ויישום מוצלחים של אלקטרופורטור שנבנה בהתאמה אישית ושלושה שיניים- אלקטרודה.
עבור IUEs, אלקטרופורטור זול שנבנה בהתאמה אישית נבנה על בסיס עיצוב שתואר קודם לכן27 (איור 1A ואיור 2). אלקטרודה בעלת שלושה שיניים נוצרה23,24 באמצעות מלקחיים מפלסטיק עם 2 אלקטרודות שליליות המחוברות לקצה השיניים והאלקטרודה החיובית חוברה לקצה ידית מברשת שיניים (איור 1B). האלקטרופורטור ושלוש אלקטרודות השיניים נבדקו כדי להבטיח תפקוד תקין. IUE בוצע על ידי חשיפת קרני הרחם, הזרקת דנ"א פלסמיד ואלקטרופוראט לכל עובר (איור 1C). ניתן להחזיק את שלושת האלקטרודה בקלות בשתי ידיים כפי שמוצג(איור 1B,מימין), תוך שימוש בשיניים כדי לייצב את ראשו של העובר. L2/3 PFC סומות פירמידליות והתהליכים שלהם תויגו עם GFP באמצעות IUE, ובכך מאשרים את ההצלחה של ניסוי העברת הגנים.

מיקוד אוכלוסייה גדולה של נוירונים דו צדדית בקליפת המוח הקדמית של עכברים.
המספר הכולל של תאים שנדבקו ואת ההתפלגות של נוירונים transfected ניתן לכמת עבור עכברים צעירים ומבוגריםכאחד 5. בשיטת IUE דו-צדדית זו, כ-4000-6000 L2/3 נוירונים פירמידליים הודבקו באמצעות פלסמיד pCAG-GFP(איור 3A). בנוסף, רוב התאים הללו היו מקומיים לאזורים קליפתיים חזיתיים, כולל קליפת המוח של האסוציאציה הקדמית, אזורי שיוך מוטורי, קליפת המוח הקדם-לימבית והבלתי-פראלימבית וקליפת המוח cingulate מסלולית וקדמית (איור 3B). דוגמה מייצגת מציגה את ההתפלגות הרוזטרלית-קאודלית של נוירונים שהוצלבו בעכבר בקרה למבוגרים (P60, איור 3C)ואת ההתפלגות בין ההמיספרות (איור 3D). זה מאשר את היכולת של IUEs דו-צדדיים למקד ולתייג גנטית אוכלוסיות גדולות של נוירונים פירמידליים L2/3 בקליפת המוח הקדמית.

התנהגות חברתית בעכברים צעירים ומבוגרים.
החלק הראשון של משימת האינטראקציה האימהית בדק את היכולת של עכברים P18 שליטה (IUE עם pCAG-GFP plasmid) כדי למצוא מצעים בקן (אינטראקציה אימהית 1 [MI1]). זה בוחן את היכולות החישה של העכברים הצעירים. עכברי בקרה בילו יותר זמן בחקר מצעי הקן שלהם מאשר לחקור מצעים טריים. לפיכך, מה שמרמז כי, כצפוי, לעכברים אלה יש יכולות חישה והתנהגות גישוש שלמות (איור 4A ואיור 3B). החלק השני של המשימה (MI2) מנצל את הנטייה של עכברים להיות מוטיבציה לקיים אינטראקציה עם ולהיות ליד אמם. במשימה זו, גורים בילו את רוב זמנם ליד אמם, בעודם מבלים פחות זמן באופן משמעותי בחקר הכיפה הריקה או מצעי הקן(איור 4C,D). תוצאות אלה מצביעות על כך שעכברי בקרה של IUE מפגינים התנהגות ביות תקינה.

עכברי בקרה למבוגרים (P60) בילו כ-35% מהזמן בחקר אובייקט חדשני (הזמן הכולל שבילה בזירה = 5 דקות, איור 5A,B). כאשר הוצג בפניהם חפץ חדשני ומוכר, עכברים בוגרים בילו זמן רב יותר בחקר האובייקט החדשני, דבר המצביע על עניין שלם בחידוש (איור 5C,D). במשימת חברותיות, עכברים בוגרים בקרו במשך זמן דומה בחקר עכבר חדשני וגביע ריק(איור 5E,F). אופן פעולה זה היה במעקב אוטומטי באמצעות התוכנה DeepLabCut זמין בחופשיות26. קטעי וידאו לדוגמה מראים תיוג מוצלח של נקודות שונות על העכבר, כולל הגפיים, centroid, הראש והאוזניים (וידאו 1). DeepLabCut שימש כדי לקבוע מתי עכברים גדלו על ידי בחינת אורך הגוף של העכבר, שכן מרחק זה הופך להיות קצר יותר כאשר העכבר מתרומם (וידאו 2).

Figure 1
איור 1: באלקטרופורציה של הרחם באמצעות אלקטרופורטור שנבנה בהתאמה אישית ואלקטרודה בעלת שלושה שיניים. (A)תמונה של האלקטרופורטור שנבנה בהתאמה אישית (משמאל) והלוח הקדמי שלו (מימין). 1: מחוון הספק. 2: מתג הפעלה. 3: מחוון דופק. 4: מתג מצב בדיקה.  5: בורר מתח. 6: בקרת רוחב פולס. 7: אלקטרודה (+). 8: גורם מפעיל חיצוני (TTL).  9: אלקטרודה (-). (B)תמונה של אלקטרודה בעלת שלושה שיניים שנבנתה בהתאמה אישית (משמאל) והשיטה המומלצת להחזיק את שלושת האלקטרודה השיניים במהלך ה- IUE (מימין). (C) משמאל: דיאגרמה המתארת ניתוח IUE שבוצע בסכרי E16. מימין: תמונה קונפוקלית מייצגת 20X של IUE עם GFP המיועדת ל- L2/3 mPFC. כוכבית צהובה: L2/3 GFP + נוירונים. סרגל קנה מידה של פאנל שמאלי = 250 מיקרומטר. פס קנה מידה של לוח ימני = 75 מיקרומטר. נתונים ונתונים מותאמים מ- Comer et al., 20205. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: דיאגרמת מעגלים של האלקטרופורטור בהזמנה אישית. דיאגרמה המתארת את מעגל האלקטרופורטור המותאם אישית המבוסס עלדוגמאות שתוארוקודם לכן 27 . לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: מיקוד אוכלוסיות גדולות של נוירונים בקליפת המוח הקדמית L2/3 באמצעות IUE. (A) המספר הכולל של תאי GFP+ בעכברי בקרה לנוער. N = 15 עכברים. (B) אחוז תאי GFP+ לכל אזור בעכברי בקרה למבוגרים. N = 22 עכברי בקרה. (ג)סעיפים מייצגים המציגים את היקף הרוזטרו-קאודל של תאים שעברו חוצה מוח בקליפת המוח הקדמית. תמונות בחלוניות שמאליות הן אזורים מוגדלים מהחלוניות הימניות (ריבוע אדום). קליפת המוח של האסוציאציה הקדמית: FrA. קליפת המוח המוטורית המשלימה: M2. קליפת המוח הקדם-לימבית: PL. קליפת המוח האינפרלימבית: IL. קליפת המוח הקדמית: ACC. קליפת המוח האורביטופרונלית המדיאלית: MO. קליפת המוח האורביטופרונלית הגחונית: VO. קליפת המוח האורביטופרונלית לרוחב: LO. קליפת המוח האינסולרית הקדמית: בינה מלאכותית. אזור קליפת המוח הקדמית 3: Fr3.  קליפת המוח המוטורית העיקרית: M1.  קליפת המוח הסומטוסנסורית העיקרית: S1. קליפת המוח הפיריפורם: פיר. גרעין חוש הריח האלטריורי: AO. קאודט-פוטאמן: מעבד. מספרים שחורים: קואורדינטות ברגמה. פס קנה מידה של לוח שמאלי = 0.5 מ"מ. פס קנה מידה של לוח ימני = 1 מ"מ. ממוצע ± SEM. (D) נתונים המראים את מספר התאים electroporated על האונה הימנית לעומת השמאלית בתוך כל עכבר. מראה ספירת תאים לא מבודדת מ-14 עכברים בוגרים עם פלסמיד pCAG-GFP. מבחן t מזווג. p = 0.4757.  נתונים מותאמים מ- Comer et al., 20205. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: הערכת יכולות sensorimotor, התנהגות חקרנית ואינטראקציות חברתיות מוקדמות בעכברים שעברו חוצה גיל הרך. (A) דוגמה מייצגת של נתיב שנסע (מעקב שחור) על-ידי גור פקדים P18 במשימת MI1. פינות מצעים טריות (טריות 1 ו -2, ורוד) ופינת מצעים בקן (ירוק). (B)גורי בקרה בילו זמן רב יותר בחקר מצעי הקן מאשר המצעים הטריים במשימת MI1. p < 0.001, ****p < 0.0001. מבחן פוסט דו כיווני של ANOVA וסידק. (C) דוגמה מייצגת של נתיב שנסע (מעקב שחור) על-ידי גור פקדים P18 במשימת MI2.  הסכר (סכר: כחול), ריקה (כוס ריקה: צהוב), פינת מצעים לקנן (קן: ירוק). (ד)גורי בקרה בילו יותר זמן באינטראקציה עם הסכר שלהם מאשר עם הכיפה הריקה או מצעי הקן. מבחן פוסט דו כיווני של ANOVA וסידק. p < 0.0001. N = 15 עכברי בקרה. נתונים ונתונים מותאמים מ- Comer et al., 20205. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: הערכת אינטראקציות חברתיות בעכברים בוגרים. (A) דוגמה מייצגת של נתיב נסע (מעקב שחור) על ידי P60 לשלוט בעכבר מבוגר במשימה אינטראקציה אובייקט הרומן. פינה ורודה = מיקום של אובייקט חדשני. (B)עכברי בקרה בילו כ -35% מהזמן בחקירת האובייקט החדש (5 דקות זמן כולל). אחוז הזמן המושקע בפינה עם אובייקט חדשני מוצג. (C) דוגמאות מייצגות של נתיב נסע (עקבות שחורות) על ידי עכבר P60 שליטה למבוגרים במשימה חדשה זיהוי אובייקט. פינה ורודה: מיקום של אובייקט חדשני. פינה ירוקה: מיקום של אובייקט מוכר. (ד)עכברי בקרה בילו זמן רב יותר בחקר האובייקט החדשני מאשר האובייקט המוכר. מדד האפליה (DI) מוצג; DI = ((זמן עם אובייקט הרומן – זמן עם אובייקט מוכר) / (זמן עם אובייקט הרומן + זמן עם אובייקט מוכר)). (E) דוגמאות מייצגות של נתיב נסע (מעקב שחור) על ידי P60 לשלוט בעכבר מבוגר במשימת חברותיות. פינה ורודה: מיקום של עכבר רומן תחת תיל רשת. פינה ירוקה: מיקום של תיל רשת ריקה. (ו)עכברי בקרה בילו בממוצע זמן שווה לחקור ריקה וגביע המכיל עכבר רומן. גרף מראה DI ((זמן עם עכבר הרומן – זמן עם ריקה) / (זמן עם עכבר הרומן + זמן עם ריקה)). מכיוון שעכברים לא היו מבודדים חברתית לפני המשימה, ייתכן שהדחף לאינטראקציה עם עכבר חדשני פחת. עם זאת, עדיין הייתה חקירה של העכבר הרומן. N = 22 עכברי בקרה. נתונים ונתונים מותאמים מ- Comer et al., 20205. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

וידאו 1: שימוש ב- DeepLabCut כדי לעקוב באופן אוטומטי אחר מיקום בעלי חיים במשימות התנהגותיות. סרטון מייצג של עכבר בוגר במשימת האינטראקציה החברתית שסומן באמצעות DeepLabCut. חלקים שונים של העכבר ניתן לתייג כגון הגפיים והראש. שימוש centroid מתאים לעקוב אחר המיקום של החיה אבל נקודות אחרות ניתן להשתמש כדי לזהות התנהגויות מורכבות יותר, כגון טיפוח או גידול. אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון וידאו זה. (לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני כדי להוריד).

וידאו 2: שימוש ב- DeepLabCut כדי לעקוב באופן אוטומטי אחר גידול במשימות התנהגותיות. סרטון מייצג של עכבר בוגר במשימת האינטראקציה החברתית שסומן באמצעות DeepLabCut. החץ האדום מציג את אורך העכבר כאשר החץ מצביע לכיוון ראש העכבר. ניתן להשתמש באורך החץ כדי לקבוע עם העכבר הוא גידול, שכן אורך העכבר, ואת החץ, הופך קטן יותר כאשר העכבר מאחור. אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון וידאו זה. (לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני כדי להוריד).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

בזאת, צינור מתואר המשלב מניפולציה של גנים חדשים של עניין באוכלוסיות גדולות של נוירונים קליפת המוח הקדמית עם מבחנים התנהגותיים בעכברים. יתר על כן, צינור זה מאפשר מחקר אורך של התנהגות באותם עכברים הן במהלך התפתחות מוקדמת לאחר הלידה והן בבגרות. טכניקה זו עוקפת את הצורך להסתמך על מודלים גנטיים של בעלי חיים שיכולים להיות יקרים מבחינת זמן והוצאות. כוחו של פרוטוקול זה הוא שניתן להשתמש בו כדי ללמוד הפרעות נוירו-התפתחותיות ונוירופסיכיאטריות שעבורן GWAS האחרונים גילו אסוציאציות גנטיות חדשניות28,29. למרות ששיטה זו מספקת transfection ספציפי מסוג התא של נוירונים סינאפסות, מגבלה אחת היא שזה פחות ריאלי למקד סוגים אחרים של תאי המוח כגון interneurons או תאי גליה. עם זאת, מחקרים רבים מראים גישה שונה כדי למקד סוגים אחרים של תאי המוח30,31. בנוסף, על ידי שינוי המיקום של האלקטרודות ביחס לראשו של העובר ושינוי התזמון של IUE, אזורים אחרים במוח יכולים להיות transfected דו צדדית כולל ההיפוקמפוס, אמיגדלה, המוח הקטן, ואת חזותי, somatosensory ו קליפות מוטוריות24,32. בנוסף, שכבות קליפת המוח שונות יכולות להיות ממוקדות על ידי ביצוע IUE בשלבים התפתחותיים שונים.

למרות ש- IUE יכול להיות בעל שיעור הצלחה גבוה, ישנם שלבים קריטיים ופתרון בעיות של השיטה הנדרשת לעתים. יש צורך כי פלסמידים מתוכננים בקפידה ומאומתים בקווי תא. כמו עם כל שיבוט, יש לנקוט זהירות כדי להבטיח ביטוי גנים נאותים כגון אישור הרצף הוא במסגרת. בנוסף, יש לאשר את ההשפעה של מניפולציה בגנים (למשל, הפשטת יתר או השתקה) תוך התחשבות בכך שרמות הביטוי עשויות להשתנות לאורך מהלך הזמן ההתפתחותי של העכבר והתאריך ההתפתחותי של IUE. כתמים מערביים ו qPCR ניתן להשתמש כדי לקבוע את היקף של overexpression גנטי5. מומלץ לאלקטרופורט משותף גן כתב, כגון GFP, בפלסמיד נפרד מאז חלבונים מתויגים עם GFP יכול להיות מקופל שלא כהלכה או לאבד את תפקידם. לחלופין, אם לא נעשה שימוש בעיתונאי הניסוי יכול להשתמש בהכלאה במקום, qPCR או כתם מערבי כדי לקבוע את רמות הביטוי של גן העניין5.

אם פלסמידים אומתו אך אין בעלי חיים שנראים חיוביים עבור transfection, ביסודיות לבדוק את כל הציוד, במיוחד electroporator, כדי להבטיח תפקוד תקין. בעת אספקת פולסים מתח לעוברים, קרני הרחם צריך להיות לח היטב עם מלוחים מחוממים האלקטרודות צריך לייצר בועות על הדור של פעימת המתח. אם אין בועות כאשר המתח מועבר, סביר להניח שיש בעיה עם electroporator.  לחלופין, cDNA לא יכול להיות מוזרק כראוי לתוך החדר. כאשר cDNA מוזרק כראוי לתוך החדר לרוחב, צבע ירוק מהיר יהיה גלוי בצורה של חצי סהר. לבסוף, המיקום של האלקטרודות חשוב. אם האלקטרודות ממוקמות מעט לא נכון, ייתכן שהתאים לא יודבקו באזור העניין. לכן, כאשר בודקים את ההחלקה המוצלחת, שמרו עוד כמה מקטעי מוח קאודל כדי לראות, אם אולי, את אזור המוח הלא נכון. לאחר שיטה זו כבר התאמן, מנתח מנוסה יכול לצפות להשיג שיעור הצלחה של כמעט 90%. פרוטוקול זה ניתן לשנות כדי למקד אזורי מוח אחרים של עניין. לדוגמה, ניתן למקד את רוב האזורים הקליפתיים באופן דו-צדדי ואפילו אזורים תת-קליפתיים מסוימים, כולל ההיפוקמפוס23 . ניתן גם לצמצם עוד יותר את העלויות על ידי בניית electroporator מותאם אישית, אשר שימש בנתונים שהוצגו כאן5,27.

מחקרים עתידיים יכולים לעשות שימוש בשיטה זו כדי להבין את תפקידם של מועמדים לגנים שהתגלו לאחרונה במחלות נוירולוגיות שונות. הצינור המוצג מציע בדיקה מהירה יחסית כדי לבדוק את ההשפעות של מניפולציות גנטיות ספציפיות על התפתחות והתנהגות מוקדמת לאחר הלידה לבגרות. למאמצים עתידיים בשיטה זו יש פוטנציאל לגלות אילו גנים ממלאים תפקיד סיבתי בהפרעות מוחיות מסוימות, כולל SCZ והפרעת ספקטרום האוטיזם.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים שאין אינטרסים מתחרים.

Acknowledgments

אנו מודים לליסה קרצ'ג' על משוב ביקורתי ועריכה לכתב היד. אנו מודים לכל עוזרי המחקר במעבדת קרוז-מרטין שלא יסולא בפז בסיוע עם חליטות וספירת תאים של מוחות התנהגות. אנו מודים לאנדריי קווטש על התשומות על עיצוב האלקטרודה המשולשת, וטוד בלוטה וליבת ההדמיה הביולוגית של אוניברסיטת בוסטון על השימוש במיקרוסקופ הקונפוקלי. עבודה זו נתמכה על ידי מענק החוקר הצעיר NARSAD (AC-M, #27202), פרס ברנטון ר. לוץ (ALC), פרס I. אלדן מאצ'י (ALC), NSF NRT UtB: מלגת המחקר הלאומית לנוירופוטונים (ALC, #DGE1633516) ותוכנית הזדמנויות מחקר לתואר ראשון באוניברסיטת בוסטון (WWY). למממנים לא היה כל תפקיד בעיצוב המחקר, איסוף וניתוח הנתונים, ההחלטה לפרסם או הכנת כתב היד.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
13mm Silk Black Braided Suture Havel's SB77D Suture skin
Adson Forceps F.S.T. 11006-12 IUE
C270 Webcam Logitech N/A Record behavior
Electroporator Custom-built N/A See Figure 1 and 2 and Bullmann et al, 2015
EZ-500 Spin Column Plasmid DNA Maxi-preps Kit, 20preps Bio Basic Inc. BS466 Pladmid preparation
Fast Green FCF Sigma F7252-5G Dye for DNA solution
Fine scissors- sharp F.S.T. 14060-09 IUE
Fisherbrand Gauze Sponges Fisher Scientific 1376152 IUE
Gaymar Heating/Cooling Braintree TP-700 Heating Pad
Glass pipette puller Sutter Instrument, P-97 IUE
Glass pipettes Sutter Instrument, BF150-117-10 IUE
Hair Removal Lotion Nair N/A Hair removal
Hartman Hemostats F.S.T. 13002-10 IUE
Open field maze- homemade acrylic arena Custom-built N/A 50 × 50 × 30 cm length-width-height
pCAG-GFP Addgene 11150 Mammalian expression vector for expression of GFP
Picospritzer III Parker Hannifin N/A pressure injector
Retractor - 2 Pronged Blunt F.S.T. 17023-13 IUE
Ring forceps F.S.T. 11103-09 IUE
Sterilizer, dry bead Sigma Z378569 sterelize surgical tools
SUTURE, 3/0 PGA, FS-2, VIOLET FOR VET USE ONLY Havel's HJ398 Suture muscle
Water bath Cole-Parmer EW-12105-84 warming sterile saline

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Yang, Y., et al. Genetic association and meta-analysis of a schizophrenia GWAS variant rs10489202 in East Asian populations. Translational Psychiatry. 8, (1), 144 (2018).
  2. Schizophrenia Working Group of the Psychiatric Genomics Consortium. Biological insights from 108 schizophrenia-associated genetic loci. Nature. 511, (7510), 421-427 (2014).
  3. Howard, D. M., et al. Genome-wide meta-analysis of depression identifies 102 independent variants and highlights the importance of the prefrontal brain regions. Nature Neuroscience. 22, (3), 343-352 (2019).
  4. Grove, J., et al. Identification of common genetic risk variants for autism spectrum disorder. Nature Genetics. 51, (3), 431-444 (2019).
  5. Comer, A. L., et al. Increased expression of schizophrenia-associated gene C4 leads to hypoconnectivity of prefrontal cortex and reduced social interaction. PLoS Biology. 18, (1), 3000604 (2020).
  6. Chini, M., et al. Resolving and Rescuing Developmental Miswiring in a Mouse Model of Cognitive Impairment. Neuron. 105, (1), 60-74 (2020).
  7. Clifton, N. E., et al. Dynamic expression of genes associated with schizophrenia and bipolar disorder across development. Translational Psychiatry. 9, (1), 74 (2019).
  8. Oberlander, V. C., Xu, X., Chini, M., Hanganu-Opatz, I. L. Developmental dysfunction of prefrontal-hippocampal networks in mouse models of mental illness. European Journal of Neurosciences. 50, (6), 3072-3084 (2019).
  9. Batista-Brito, R., et al. Developmental Dysfunction of VIP Interneurons Impairs Cortical Circuits. Neuron. 95, (4), 884-895 (2017).
  10. Luo, L., Callaway, E. M., Svoboda, K. Genetic Dissection of Neural Circuits: A Decade of Progress. Neuron. 98, (2), 256-281 (2018).
  11. DeNardo, L., Luo, L. Genetic strategies to access activated neurons. Current Opinion in Neurobiology. 45, 121-129 (2017).
  12. Huang, Z. J., Zeng, H. Genetic approaches to neural circuits in the mouse. Annual Reviews in Neurosciences. 36, 183-215 (2013).
  13. Wu, Z., Yang, H., Colosi, P. Effect of genome size on AAV vector packaging. Molecular Therapy. 18, (1), 80-86 (2010).
  14. Callaway, E. M., Luo, L. Monosynaptic Circuit Tracing with Glycoprotein-Deleted Rabies Viruses. Journal of Neurosciences. 35, (24), 8979-8985 (2015).
  15. Cruz-Martín, A., et al. A dedicated circuit links direction-selective retinal ganglion cells to the primary visual cortex. Nature. 507, (7492), 358-361 (2014).
  16. Saito, T. In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system. Nature Protocols. 1, (3), 1552-1558 (2006).
  17. Cruz-Martín, A., Crespo, M., Portera-Cailliau, C. Delayed stabilization of dendritic spines in fragile X mice. Journal of Neurosciences. 30, (23), 7793-7803 (2010).
  18. Zhang, J. H., Adikaram, P., Pandey, M., Genis, A., Simonds, W. F. Optimization of genome editing through CRISPR-Cas9 engineering. Bioengineered. 7, (3), 166-174 (2016).
  19. Strecker, J., et al. RNA-guided DNA insertion with CRISPR-associated transposases. Science. 365, (6448), 48-53 (2019).
  20. Cruz-Martín, A., Crespo, M., Portera-Cailliau, C. Glutamate induces the elongation of early dendritic protrusions via mGluRs in wild type mice, but not in fragile X mice. PLoS One. 7, (2), 32446 (2012).
  21. LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex. Cerebral Cortex. 19, Suppl 1 120-125 (2009).
  22. Kolk, S. M., de Mooij-Malsen, A. J., Martens, G. J. Spatiotemporal Molecular Approach of in utero Electroporation to Functionally Decipher Endophenotypes in Neurodevelopmental Disorders. Frontiers in Molecular Neurosciences. 4, 37 (2011).
  23. Szczurkowska, J., et al. Targeted in vivo genetic manipulation of the mouse or rat brain by in utero electroporation with a triple-electrode probe. Nature Protocols. 11, (3), 399-412 (2016).
  24. dal Maschio, M., et al. High-performance and site-directed in utero electroporation by a triple-electrode probe. Nature Communications. 3, 960 (2012).
  25. Zhan, Y., et al. Deficient neuron-microglia signaling results in impaired functional brain connectivity and social behavior. Nature Neurosciences. 17, (3), 400-406 (2014).
  26. Mathis, A., et al. DeepLabCut: markerless pose estimation of user-defined body parts with deep learning. Nature Neurosciences. 21, (9), 1281-1289 (2018).
  27. Bullmann, T., Arendt, T., Frey, U., Hanashima, C. A transportable, inexpensive electroporator for in utero electroporation. Development Growth and Differentiation. 57, (5), 369-377 (2015).
  28. Li, Z., et al. Genome-wide association analysis identifies 30 new susceptibility loci for schizophrenia. Nature Genetics. 49, (11), 1576-1583 (2017).
  29. Ripke, S., et al. Genome-wide association analysis identifies 13 new risk loci for schizophrenia. Nature Genetics. 45, (10), 1150-1159 (2013).
  30. De Marco Garcia, N. V., Fishell, G. Subtype-selective electroporation of cortical interneurons. Journal of Visualized Experiment. (90), e51518 (2014).
  31. Borrell, V., Yoshimura, Y., Callaway, E. M. Targeted gene delivery to telencephalic inhibitory neurons by directional in utero electroporation. Journal of Neuroscience Methods. 143, (2), 151-158 (2005).
  32. Soma, M., et al. Development of the mouse amygdala as revealed by enhanced green fluorescent protein gene transfer by means of in utero electroporation. Journal of Comparative Neurology. 513, (1), 113-128 (2009).
צינור באמצעות אלקטרופורציה דו-צדדית ברחם כדי לחקור השפעות גנטיות על התנהגות מכרסמים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Comer, A. L., Sriram, B., Yen, W. W., Cruz-Martín, A. A Pipeline using Bilateral In Utero Electroporation to Interrogate Genetic Influences on Rodent Behavior. J. Vis. Exp. (159), e61350, doi:10.3791/61350 (2020).More

Comer, A. L., Sriram, B., Yen, W. W., Cruz-Martín, A. A Pipeline using Bilateral In Utero Electroporation to Interrogate Genetic Influences on Rodent Behavior. J. Vis. Exp. (159), e61350, doi:10.3791/61350 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter