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Biology

Un gasoducto que utiliza la electroporación bilateral en Utero para interrogar influencias genéticas en el comportamiento de los roedores

doi: 10.3791/61350 Published: May 21, 2020

Summary

El papel de los genes recientemente descubiertos asociados a la enfermedad en la patogénesis de los trastornos neuropsiquiátricos sigue siendo oscuro. Una técnica bilateral modificada de electroporación de útero permite la transferencia de genes en grandes poblaciones de neuronas y el examen de los efectos causales de los cambios de expresión génica en el comportamiento social.

Abstract

A medida que estudios de asociación en todo el genoma arrojan luz sobre los fundamentos genéticos heterogéneos de muchas enfermedades neurológicas, aumenta la necesidad de estudiar la contribución de genes específicos al desarrollo cerebral y la función. Confiar en modelos de ratón para estudiar el papel de manipulaciones genéticas específicas no siempre es factible, ya que las líneas transgénicas de ratón son bastante costosas y muchos genes nuevos asociados a enfermedades aún no tienen líneas genéticas disponibles comercialmente. Además, puede tomar años de desarrollo y validación para crear una línea de ratón. En la electroporación del útero ofrece un método relativamente rápido y fácil de manipular la expresión génica de una manera específica de tipo celular in vivo que sólo requiere desarrollar un plásmido de ADN para lograr una manipulación genética particular. La electroporación bilateral en el útero se puede utilizar para dirigirse a grandes poblaciones de neuronas piramidales de corteza frontal. La combinación de este método de transferencia de genes con enfoques conductuales permite estudiar los efectos de las manipulaciones genéticas en función de las redes de corteza prefrontal y el comportamiento social de ratones juveniles y adultos.

Introduction

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Los estudios de asociación en todo el genoma (GWAS) han impulsado el descubrimiento de nuevos genes candidatos que están asociados con patologías cerebrales1,2,3,4. Estos estudios han sido particularmente beneficiosos para entender trastornos neuropsiquiátricos devastadores como la esquizofrenia (SCZ), donde la investigación de genes novedosos ha servido como punto de partida para nuevas líneas de investigación e intervención terapéutica5,6. Los genes que albergan el riesgo de SCZ muestran expresión sesgada en la corteza prefrontal (PFC) durante el desarrollo prenatal y postnatal temprano, una región implicada en la patología de varios trastornos neuropsiquiátricos7. Además, los modelos de ratón de trastornos psiquiátricos presentan actividad anormal en las redes PFC6,8,9. Estos resultados sugieren que los genes asociados a SZC podrían desempeñar un papel en el cableado del desarrollo de esta región. Se requiere una investigación adicional utilizando modelos animales para entender la contribución de estos genes candidatos al establecimiento de conexiones en el PFC y para determinar si estos genes tienen un papel causal en la patogénesis de los trastornos neuropsiquiátricos. Las técnicas de manipulación genética en ratones que permiten el estudio de cambios de expresión génica en circuitos neuronales específicos durante el desarrollo prenatal y posnatal temprano son un método prometedor para entender los mecanismos moleculares que vinculan los cambios de expresión génica con la disfunción de la PFC.

Las líneas genéticas de ratón ofrecen un método para estudiar el impacto de genes particulares en el desarrollo y la función cerebral. Sin embargo, confiar en ratones transgénicos puede ser limitador ya que no siempre hay líneas disponibles comercialmente para examinar los efectos de genes específicos en el desarrollo de circuitos neuronales. Además, puede ser extremadamente costoso y lento desarrollar líneas de ratón personalizadas. El uso de estrategias de manipulación genética interseccional que combinan ratones transgénicos con enfoques virales ha revolucionado la comprensión del cerebro10,11,12. A pesar de muchos progresos, las estrategias virales vienen con ciertas limitaciones dependiendo del tipo de vector viral, incluyendo límites en la capacidad de envasado que pueden restringir la expresión viral13 y la toxicidad celular asociada con la expresión viral14. Además, en la mayoría de las condiciones experimentales, la expresión génica robusta utilizando el virus asociado a adeno (AAVs) requiere aproximadamente 2 a 4 semanas15,haciendo que las estrategias virales rutinarias sean inviables para manipular genes durante el desarrollo postnatal temprano.

En la electroporación del útero (IUE) es un enfoque alternativo que permite una transferencia de genes rápida y barata16,17 que, cuando se combina con etiquetado fluorescente y enfoques farmacogenéticos u optogenéticos, proporciona una potente plataforma para diseccionar la función de los circuitos neuronales. Además, con el desarrollo de genes de edición del genoma CRISPR-Cas9 se pueden sobreexprimir o alterar con precisión a través de derribo específico de tipo celular o eliminación de genes específicos o a través de la modulación de promotores18,19. Los enfoques de manipulación génica que utilizan IUE son especialmente ventajosos cuando el efecto de los genes en los circuitos neuronales debe probarse durante las estrechas ventanas de desarrollo20. IUE es una técnica versátil y la sobreexpresión se puede lograr fácilmente insertando un gen en un vector de expresión bajo un promotor específico. El control adicional de la expresión génica puede lograrse impulsando la expresión utilizando promotores de diferentes fortalezas o utilizando promotores inducibles capaces de controlar temporalmente la expresión génica21,22. Además, IUE permite la focalización de células dentro de capas corticales específicas, tipos de células y regiones cerebrales, que no siempre es factible utilizando otros enfoques5,17. Los recientes avances en la configuración de la IUE basados en el uso de tres electrodos, que genera una distribución de campo eléctrico más eficiente, han ampliado el repertorio funcional de este método y han permitido a los científicos dirigirse a nuevos tipos de células y aumentar la eficiencia, precisión y número de células que pueden ser dirigidasa 23,24. Esta técnica se utilizó recientemente para determinar el papel causal del componente complementario 4A (C4A), un gen vinculado a SCZ, en función PFC y cognición temprana5.

Aquí se presenta una canalización experimental que combina enfoques de transferencia de genes para dirigirse a grandes poblaciones de neuronas excitatorias en la corteza frontal, incluyendo el PFC, con paradigmas conductuales que no sólo permite el estudio de los cambios celulares y a nivel de circuito, sino que también permite monitorear el comportamiento a lo largo del desarrollo posnatal temprano y la edad adulta. El primero descrito es un método para transfectar bilateralmente grandes poblaciones de neuronas piramidales de capa (L) 2/3 en regiones corticales frontales. A continuación, se describen las tareas para asescribir el comportamiento social en ratones juveniles y adultos. Los recuentos de celdas se pueden obtener al finalizar las tareas de comportamiento para cuantificar la extensión y la ubicación de la transfección celular. Además, el número de células transfectadas se puede correlacionar con datos de comportamiento para determinar si un mayor número de células transfectadas conduce a mayores perturbaciones en el comportamiento.

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Protocol

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Todos los protocolos experimentales se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices de los Institutos Nacionales de Salud (NIH) para la investigación animal y fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Boston.

1. Preparación de soluciones de ADN

  1. Comprar un plásmido comercial o subclone un gen de interés en plásmido con promotor deseado. Aquí se utilizó un plásmido que contiene EGFP bajo el promotor cag (pCAG-EGFP).
    NOTA: Determine el promotor deseado en función del nivel de expresión necesario. En general, los plásmidos bajo el promotor cag se pueden utilizar para lograr altos niveles del transgénero, mientras que los promotores específicos de tipo celular (por ejemplo, sinapsis para las neuronas) tienden a ser menos activos. El experimentador debe determinar empíricamente los niveles de expresión adecuados para cada plásmido.
  2. Transforme las bacterias y haga crecer las poblaciones en medios bacterianos con el antibiótico adecuado.
    1. Retire las células competentes (células DH5α) de -80 °C y descongele el hielo durante 20 min.
    2. Mezclar 100 pg -100 ng del ADN plásmido con 30 μL de células competentes. Incubar la mezcla sobre hielo durante 20 min.
    3. Realice un choque térmico incubando en un baño de agua de 42 °C durante 45 s y luego devolviendo el tubo de vuelta al hielo durante 2 minutos.
    4. Añadir 200 - 1.000 μL de medios LB a las células competentes transformadas y crecer durante 45 minutos a 37 °C en una incubadora de temblores.
    5. Placa 200 μL de las células transformadas en una placa de agar LB que contiene el antibiótico adecuado e incubar la placa durante la noche a 37 °C.
    6. Al día siguiente, incuba una colonia bacteriana en 200 ml de caldo LB con el antibiótico apropiado a 37 °C en una incubadora temblorosa durante la noche.
  3. Purifique el ADN plásmido con un kit maxiprep.
    1. Siga las instrucciones proporcionadas en el kit maxiprep obtenido. Para el paso de elución, no eleduja el ADN en el búfer de elución. En su lugar, el ADN elíptico utilizando 200 μL de agua estéril de 1x PBS o de grado molecular.
    2. Asegúrese de que la concentración final del ADN sea superior a 1 μg/μL. Si el plásmido que contiene el gen de interés no contiene un gen reportero, también prepare un plásmido para co-transfectar con una molécula reportera, como la proteína fluorescente verde (GFP), para permitir la visualización de células transfectadas.
  4. Preparar la solución de ADN para la cirugía diluyendo el ADN plásmido en 1x PBS a 1 μg/μL concentración final de cada plásmido. Añadir tinte verde rápido a la solución de ADN a una concentración final del 0,1%. Para inyecciones bilaterales, preparar 60 μL de solución por presa (para aproximadamente 10 cachorros).
    NOTA: Si el plásmido no contiene un gen reportero, co-electroporate con GFP. Las tasas de co-electroporación suelen ser del 95% o más. En nuestras manos, la eficiencia de la transfección no se vio afectada por la co-transfección. Todos los plásmidos electroporados deben diluirse a 1 μg/μL.

2. Ordenar o criar ratones preñados embarazadas

  1. Si ordena ratones preñados, ordene a los ratones que lleguen el día embrionario (E) 13 o antes para dar a las presas el tiempo adecuado para aclimatarse a la vivienda de los animales.  En este protocolo, los ratones de educación cd-1 se utilizan para todos los experimentos.
    NOTA: Ordenar con unos días de anticipación reducirá el estrés animal y conducirá a una mayor tasa de supervivencia de los cachorros.
  2. Si cría ratones preñados, empareje ratones hembra con un macho durante la noche, una vez a la semana. Compruebe la presencia de un tapón vaginal a la mañana siguiente (E0.5). Determine el embarazo monitoreando el peso de los ratones hembra.
    NOTA: Diferentes cepas del ratón tienen diferentes aumentos de peso durante el embarazo, así que determina el aumento de peso típico para la cepa del ratón utilizada.
  3. Ya sea ordenando o criando a los ratones, para reducir el estrés de las presas, coloque una almohadilla de anidación y una casa de ratones en la jaula. Reducir el estrés puede ayudar a aumentar la tasa de supervivencia de los cachorros.

3. Diseño y montaje de tres electrodos de punta

  1. Utilice láminas de titanio de grado 2 con un espesor de 0,063 como material de stock para contactos de electrodos.
  2. Utilizando técnicas de mecanizado estándar o herramientas manuales de precisión, fabrica electrodos con las siguientes dimensiones: 20 mm x 5 mm con punta redondeada y respaldo ranurado. Retire los bordes ásperos o las rebabas con papel de lija de grano fino.
  3. Para conectar los contactos del electrodo, envuelva el cable de cobre trenzado de 22 G alrededor de las ranuras del electrodo y asegure mediante soldadura. Proteja esta articulación con tubos termorretráctiles.
  4. A continuación, conecte el electrodo conectado a fórceps autoclavables y no conductores utilizando un tubo de reducción de calor adicional para hacer los dos electrodos negativos. Conecte el electrodo positivo único a un material autoclavable y no conductor (como un mango de cepillo de dientes con la cabeza recortada). Coloque el extremo abierto del cable con un tapón de plátano estándar.

4. Preparación para la cirugía

  1. Lleve las presas embarazadas al área de cirugía al menos 30 minutos antes de la cirugía para permitir la reducción de los niveles de estrés después del transporte desde la instalación animal.
  2. Esterilizar todo el sitio de cirugía usando toallitas germicidas esterilizantes y luego 70% etanol. Cambie los guantes antes de comenzar la cirugía.
  3. Esterilizar las herramientas autoclavadas en un esterilizador de cuentas de vidrio.
  4. Transfiera estéril 1x PBS (aproximadamente 50 ml por presa) a tubos cónicos de 50 ml y colóquelo en un bastidor de tubos en el baño de agua calentado a 38-40 °C. Compruebe la temperatura estéril salina con un termómetro.
  5. Encienda la bomba de circulación de calefacción de agua para que se caliente a 37 °C antes del inicio de la cirugía. Esto mantendrá la temperatura corporal del ratón durante la cirugía.
  6. Encienda el inyector de presión y el electroporador y asegúrese de que funcione correctamente antes de la cirugía.
  7. Gire brevemente la solución de ADN plásmido (obtenida en el paso 1.4) en una centrífuga de mesa y colóquela sobre hielo.
  8. Tire de pipetas de vidrio en un tirador de pipeta para que la punta de la pipeta de vidrio tirado es de aproximadamente 50 μm de diámetro.
  9. Llene la pipeta con 20-40 μL de solución de ADN (obtenida en el paso 1.4).
  10. Configure todos los elementos necesarios para la cirugía, incluyendo loción para la extracción de cabello, yodo, 70% etanol, intercambios de algodón, ungüento ocular, suturas, gasa, etc.
  11. Prepare una hoja de cirugía y rellene la información necesaria, como la identificación y el peso del ratón, la fecha de la cirugía, el nombre del cirujano, etc.

5. En cirugía de electroporación de útero

  1. Pesar el ratón antes de la cirugía y anotar esto en la hoja de cirugía.
  2. Anestesiar a un ratón embarazada (E16) por inhalación en una cámara de inducción con una mezcla de oxígeno-isoflurano del 4% (v/v). Una vez inducido el ratón, pasar a una inhalación de máscara y mantener el isoflurano en 1-1,5% (v/v) y controlar la respiración durante toda la cirugía. Compruebe que el ratón está completamente anestesiado, la frecuencia de respiración debe ser ~55-65 respiraciones por minuto.
  3. Administrar analgésicos preoperatorios: buprenorfina (3,25 mg/kg; SC) y meloxicam (1–5 mg/kg; SC) a un volumen máximo de 10-30 ml/kg.
  4. Use crema para la depilación o use cuidadosamente una maquinilla de afeitar para extraer el pelaje del abdomen. Esterilizar el abdomen frotando con povidone-yodo y 70% etanol y repetir esto al menos 3 veces. Crea un campo estéril alrededor del abdomen usando una gasa estéril, también se pueden usar draping estériles.
  5. Hacer una incisión en línea media (3-4 cm) en la piel abdominal, asegurándose de levantar la piel con fórceps para evitar cortar a través del músculo. A continuación, cortar a través del músculo, de nuevo teniendo cuidado de levantar el músculo para evitar el corte de órganos vitales.
  6. Tire cuidadosamente de los cuernos uterinos de la presa usando fórceps de anillo y colóquelos suavemente en el campo estéril, asegurándose de que el cuerno uterino esté apoyado con relleno y no esté tirando demasiado lejos de la presa. A partir de este momento, mantenga el cuerno uterino humedecido durante el resto de la cirugía con el PBS estéril 1x precalentado.
  7. Coloque un embrión con fórceps o dedos. Inserte cuidadosamente la pipeta de vidrio extraída en un ángulo de 45 grados con respecto al plano horizontal de la cabeza e insertada en el ventrículo lateral, que se puede identificar visualmente entre la línea media del cerebro y el ojo. Inyecte aproximadamente 2-3 μL en cada ventrículo lateral insertando la pipeta en uno y luego en el otro ventrículo (recomendado) o inyectando la solución de ADN en un ventrículo hasta que pase a ambos ventrículos laterales. El ventrículo ha sido atacado con éxito si una forma de media luna está presente después de la inyección.
    NOTA: La punta de la pipeta de vidrio podría romperse durante la cirugía. Si esto sucede, reemplace la pipeta de vidrio, asegurándose de que los cuernos uterinos se mantengan humedecidos mientras se prepara una nueva pipeta y se llena con la solución de ADN.
  8. Para transfectar las células bilateralmente en la corteza frontal, coloque los dos electrodos negativos en los lados de la cabeza de los embriones justo lateral y ligeramente caudal a los ventrículos laterales y coloque el electrodo positivo entre los ojos, justo delante del hocico en desarrollo.
  9. Asegúrese de que el embrión esté generosamente humedecido. Aplicar cuatro pulsos cuadrados (duración del pulso = duración de 50 ms, amplitud de pulso = 36 V, intervalo de interpulsión = 500 ms).
  10. Inyectar y electroporar todos los embriones, yendo uno por uno para que cada embrión se electropore inmediatamente después de la inyección de la solución de ADN. Una vez que todos los embriones hayan sido electroporados, vuelva a insertar cuidadosamente los cuernos uterinos en la cavidad abdominal. Durante este paso, cubra la cavidad abdominal en PBS estéril (1x) para ayudar a la colocación de cuernos uterinos.
  11. Llene la cavidad abdominal con PBS estéril de 1x para que no queden bolsas de aire después de que se complete el suturado. Sutura el músculo con suturas absorbibles y la piel con suturas no absorbibles de seda.
  12. Permita que la presa se recupere por completo en una cámara calentada durante al menos 1 h. En las próximas 48 h, compruebe las presas regularmente. A medida que la presa se recupera de la anestesia y recupera la conciencia, comenzará a moverse y batir.
  13. Administrar analgésicos postoperatorios si las presas están mostrando signos de dolor, como levantar sus cuerpos y respirar rápidamente. Sólo administrar si hay signos de dolor ya que las inyecciones de SC podrían estresar las presas, pero si se administran al grupo experimental también se administran al grupo de control, o viceversa.

6. Adiciones sobre el comportamiento social temprano en una tarea de interacción materna

NOTA: Este protocolo se adapta a las publicaciones anteriores5,25. Realice esta tarea después de que los ratones hayan nacido del día posnatal (P) 18-21.

  1. Comportamiento de perfeccionamiento materno en la tarea de interacción materna I (MI1).
    1. Asegúrese de que la ropa de cama enjaulada no se cambie en la semana anterior a la realición de la tarea.
    2. Obtenga o construya una arena de campo abierto (OF) que se pueda limpiar fácilmente (se recomienda acrílico) con las siguientes dimensiones: 50 x 50 x 30 cm (longitud-anchura-altura). Las condiciones de iluminación durante el rendimiento de los comportamientos pueden variar dependiendo de la pregunta experimental y pueden influir en los niveles de excitación y comportamiento similar a la ansiedad. Registre experimentos conductuales bajo una luz tenue (aproximadamente 20 lux) colocada sobre el centro de la arena.
    3. Durante dos días antes de las pruebas de comportamiento, aclimate la presa a la arena colocándola debajo de una taza de alambre de malla (como una taza de lápiz) en una esquina de la arena durante cinco minutos por día.
    4. El día de la prueba, que puede ser de P18-21, antes de que los ratones hayan sido destetados, limpie bien la arena con toallitas desinfectante y 70% etanol.
    5. Instala la arena con dos esquinas opuestas que contienen ropa de cama limpia y una esquina que contiene ropa de cama de nido sucia de la jaula de la casa del cachorro.
    6. Permita que cada cachorro explore la arena durante 3 minutos, colocando a cada cachorro en la esquina neutral y vacía al principio.
      NOTA: Graba el comportamiento con una cámara de vídeo a 30 fps. Limpie bien la arena entre cada cachorro y reemplace la ropa de cama fresca. Alterna qué esquina es la ropa de cama fresca versus nido como control para evitar la preferencia de la esquina debido a otras razones (es decir, ruido ambiental o luz). Si ejecuta varias camadas a través de la ventana de desarrollo P18-21, ejecute experimentos de comportamiento al mismo tiempo entre días. Asegúrese también de que durante un día determinado, los grupos de control y experimentales se ejecuten en paralelo.
  2. Interacción social materna en la tarea de interacción materna II (MI2)
    1. Realice esta tarea inmediatamente después de la tarea MI1.
    2. Configure la arena para que una esquina contenga una taza de malla de alambre vacía y la esquina opuesta contenga la presa debajo de una taza de alambre de malla. Si los ratones son capaces de mover la taza, pesar la taza hacia abajo con un peso que se puede pegar a la parte superior de la taza para evitar el movimiento. Ponga ropa de cama de nido sucia desde la jaula de casa en otra esquina.
    3. Ejecute la tarea MI2. Coloca al cachorro en la esquina vacía y registra el comportamiento durante cinco minutos a 30 fps, permitiendo que el cachorro explore. Corre cada cachorro por separado y limpia bien toda la arena y las tazas de malla de alambre entre cada cachorro.

7. Ensayo de la tarea de comportamiento social de los adultos

  1. Ejecute el comportamiento social de los adultos en los mismos ratones que se ejecutaron en la tarea MI1 y MI2 una vez que sean adultos (P60-P70 o más). Los datos recopilados aquí se realizaron en una cohorte separada.
  2. Manipule los ratones adultos durante 3 días consecutivos para permitir la habituación al experimentador. Asegúrese de que solo los experimentadores que se han familiarizado con los ratones ejecuten experimentos de comportamiento, lo ideal es que la misma persona ejecute todas las tareas.
  3. Habituar ratones a la arena OF durante 3 días durante 5 minutos cada día.
  4. Asesta el comportamiento en una nueva tarea de reconocimiento de objetos para medir la locomoción general y el interés en un objeto novedoso. Esto permitirá una interpretación más significativa del comportamiento social si los ratones tienen un déficit específico en las interacciones sociales.
    1. Coloca ratones en la arena durante 5 minutos con un objeto novedoso (pequeño juguete de plástico con superficies lisas y limpiables) en una esquina de la arena. Limpie bien la arena entre ratones con un 70% de etanol.
    2. Para el reconocimiento de objetos novedosos, coloque el "objeto novedoso" expuesto anteriormente, que ahora es familiar, en una esquina y coloque un nuevo objeto novedoso en la esquina opuesta. Para todas las tareas, cambie las esquinas entre pruebas como control.
    3. Para una interacción social novedosa, asegúrese de que los ratones novedosos son de edad, tensión y sexo-emparejado y se aclimatan a la taza de alambre de malla durante 2 días consecutivos durante 5 minutos cada día. Para cada prueba, coloque un ratón novedoso debajo de una taza de alambre de malla y en la esquina opuesta coloque una taza de alambre de malla vacía. Deje que los ratones exploren la arena durante 5 minutos mientras graban el comportamiento. Limpie bien la arena y las tazas de alambre de malla entre cada ensayo.

8. Análisis de datos de comportamiento

  1. Utilice DeepLabCut (https://github.com/AlexEMG/DeepLabCut) para realizar el seguimiento básico de piezas del cuerpo). Las notas detalladas sobre cómo instalar y usar DeepLabCut se pueden encontrar en su página de GitHub. También está disponible una biblioteca personalizada basada en Python 'dlc_utils' (https://github.com/balajisriram/dlc_utils) para un análisis posterior de los datos una vez completado el seguimiento básico de las partes del cuerpo. Puede encontrar más detalles sobre cómo usar esta biblioteca en la página de GitHub.
    1. Instale DeepLabCut mediante el proceso de instalación de anaconda. Instale una versión compatible con GUI solo para CPU de DeepLabCut, así como la versión habilitada para GPU para entrenar la red.
    2. Siga las instrucciones disponibles en el siguiente enlace para crear un proyecto de seguimiento de partes del cuerpo. Breifly, elija una muestra de fotogramas de su conjunto de datos y marque manualmente las partes relevantes del cuerpo en estos marcos muestreados. Entrene la red DeepLabCut para predecir las partes del cuerpo y comprobar que la red entrenada funciona correctamente.
      https://github.com/AlexEMG/DeepLabCut/blob/master/examples/Demo_yourowndata.ipynb
    3. Con el fin de rastrear la posición del cuerpo e identificar interacciones simples en un campo abierto, identificar el centroide del animal, la cabeza (definida operativamente como el punto medio entre las orejas), las orejas izquierda y derecha, así como el hocico y la base de la cola. Tener varias partes del cuerpo rastreadas permite la sustitución adecuada cuando faltan algunas partes del cuerpo en el marco debido a la oclusión.
    4. Además de las partes del cuerpo animal, realice un seguimiento de una variedad de puntos relacionados con el medio ambiente: como los bordes de las cajas de comportamiento. Estos permiten una estimación repetible de estos puntos en varias sesiones, incluso si la posición de la configuración del comportamiento cambia ligeramente en relación con la cámara entre sesiones.
    5. Después de realizar un seguimiento de las partes del cuerpo a partir de los datos de comportamiento, tiene cuidado de filtrar las ubicaciones de las partes del cuerpo predichas en función de la confianza asociada con la predicción en cada fotograma del vídeo. Las predicciones de baja confianza generalmente se asocian con partes del cuerpo ocluidas. Para tales predicciones, sustituya una parte del cuerpo determinada por otra (si dicha sustitución es apropiada) o utilice las ubicaciones de otras partes del cuerpo para predecir dónde es probable que esté la parte del cuerpo pertinente. Para la mayoría de las aplicaciones de campo abierto, el centroide del cuerpo de los roedores rara vez se ocluye y se puede predecir con alta precisión y precisión.
    6. Utilice la ubicación predicha del centroide, así como la ubicación de los puntos rastreados en el entorno para estimar una serie de características del comportamiento del animal. Por ejemplo, en los datos de campo abierto, el derivado del tiempo de la posición se puede utilizar para calcular la velocidad del animal.
  2. Para evitar sesgos, realice todos los experimentos "ciegos" con respecto al grupo experimental cuando sea posible, especialmente cuando hay algún elemento subjetivo en la evaluación de los resultados. Prueba del efecto de las diferencias sexuales en los principales resultados experimentales mediante la agrupación de datos en grupos masculinos y femeninos. Todas las pruebas estadísticas están diseñadas para probar un número igual de animales entre grupos.

9. Recuento de células post hoc para caracterizar el alcance de la transfección celular

  1. Determinar el número de células transfectadas por ratón ya que no todos los ratones tendrán transfección exitosa y habrá variación en el número de células transfectadas. Un método para lograr esto implica contar el número de neuronas transfectadas en secciones coronales alternas seguidas de una interpolación para estimar el número total de células transfectadas. Para ello, imagen y contar todas las demás secciones coronales (50 μm).
    1. Utilice perfusiones transcardiales con un 4% de PFA para reparar el tejido y luego diseccionar el cerebro. Después de la crioprotección, seccione el cerebro en secciones coronales a 50 μm.
    2. Para la corteza frontal, cuente las células dentro de +2.75 y + 1.35 mm de Bregma. Estas coordenadas contienen áreas corticales frontales e incluyen parte de la corteza somatosensorial (S1).  Utilizando este método, no se observaron células transfectadas en regiones corticales más caudales o áreas subcorticales.
    3. Asegúrese de denotar la izquierda desde el hemisferio derecho, como marcar un hemisferio con un agujero de aguja durante la sección, y contar las células bilateralmente. Utilice un software automatizado de recuento de celdas o cuente celdas manualmente, confirmando la presencia de un cuerpo celular utilizando DAPI.
  2. Una vez obtenidos los recuentos de celdas, establezca un umbral para la inclusión. Por ejemplo, solo incluya ratones electroporados bilateralmente en el análisis. Para un análisis posterior, correlacione el número de células transfectadas con respuestas conductuales para ver si hay una asociación. Esta técnica se dirigirá a múltiples áreas cerebrales, por lo que es necesario proporcionar información sobre qué regiones cerebrales han sido manipuladas genéticamente.
    NOTA: Es posible que la manipulación de ciertos genes podría alterar la migración neuronal, especificación y/o muerte. Asegúrese durante el recuento celular de que la anatomía cerebral se examina y cada neurona transfectada está dentro de la capa que supuestamente fue transfectada (es decir, L2/3). Las mediciones anatómicas brutas, como el grosor cortical, también se pueden cuantificar midiendo la distancia desde la pia hasta la L6 cortical.

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Representative Results

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Desarrollo e implementación exitosos de un electroporador hecho a medida y tres electrodos de punta.
Para los UIE, se construyó un electroporador personalizado barato basado en un diseño descrito previamente27 (Figura 1A y Figura 2). Se hizo un electrodo de tres puntas23,24 utilizando fórceps de plástico con 2 electrodos negativos unidos a las puntas de las puntas y el electrodo positivo se unió al extremo de un mango de cepillo de dientes (Figura 1B). El electroporador y el electrodo de tres puntas fueron probados para asegurar el correcto funcionamiento. IUE se realizó exponiendo los cuernos uterinos, inyectando ADN plásmido y electroporando cada embrión(Figura 1C). El electrodo de tres puntas se puede mantener bastante fácilmente en dos manos como se muestra(Figura 1B,derecha), utilizando las puntas para estabilizar la cabeza del embrión. L2/3 PFC somas piramidales y sus procesos fueron etiquetados con GFP a través de IUE, confirmando así el éxito del experimento de transferencia de genes.

Dirigirse a una gran población de neuronas bilateralmente en la corteza frontal de ratones.
El número total de células transfectadas y la distribución de neuronas transfectadas se pueden cuantificar tanto para ratones juveniles como adultos5. Utilizando este método bilateral de la IUE, alrededor de 4000-6000 L2/3 neuronas piramidales fueron transfectadas con el plásmido pCAG-GFP (Figura 3A). Además, la mayoría de estas células fueron localizadas a regiones corticales frontales incluyendo la corteza de asociación frontal, áreas de asociación motora, corteza prelimbica e infralimbica y la corteza cingulada orbital y anterior(Figura 3B). Un ejemplo representativo muestra la distribución rostral-caudal de las neuronas transfectadas en un ratón de control adulto (P60, Figura 3C)y la distribución entre hemisferios (Figura 3D). Esto confirma la capacidad de las UIE bilaterales para dirigirse y etiquetar genéticamente grandes poblaciones de neuronas piramidales L2/3 en la corteza frontal.

Comportamiento social en ratones juveniles y adultos.
La primera parte de la tarea de interacción materna puso a prueba la capacidad de controlar ratones transfectados P18 (IUE con plásmido pCAG-GFP) para encontrar ropa de cama nido (interacción materna 1 [MI1]). Esto pone a prueba las habilidades sensoriales de los ratones juveniles. Los ratones de control pasaron más tiempo explorando su ropa de cama nido que explorando ropa de cama fresca. Por lo tanto, lo que sugiere que, como era de esperar, estos ratones tienen intactas capacidades sensoriales y comportamiento exploratorio(Figura 4A y Figura 3B). La segunda parte de la tarea (MI2) aprovecha la tendencia de los ratones a estar motivados para interactuar y estar cerca de su madre. En esta tarea, los cachorros pasaban la mayor parte de su tiempo cerca de su madre mientras pasaban mucho menos tiempo explorando la taza vacía o la ropa de cama nido(Figura 4C,D). Estos resultados sugieren que los ratones de control de la IUE presentan un comportamiento normal de la polinización.

Los ratones de control adultos (P60) pasaron aproximadamente el 35% del tiempo explorando un objeto novedoso (tiempo total pasado en la arena = 5 min, Figura 5A,B). Cuando se les presentó un objeto novedoso y familiar, los ratones adultos pasaron más tiempo explorando el objeto novedoso, sugiriendo un interés intacto en la novedad(Figura 5C,D). En la tarea de sociabilidad, los ratones adultos de control pasaron cantidades similares de tiempo explorando un ratón nuevo y una taza vacía(Figura 5E,F). Este comportamiento se realizó automáticamente un seguimiento utilizando el software DeepLabCut26de libre disponibilidad. Los vídeos de ejemplo muestran el etiquetado exitoso de varios puntos en un ratón, incluidas las extremidades, centroide, cabeza y oídos (Vídeo 1). DeepLabCut se utilizó para determinar cuándo los ratones estaban criando examinando la longitud del cuerpo del ratón, ya que esta distancia se hace más corta cuando el ratón retroceda (Video 2).

Figure 1
Figura 1: En electroporación de útero utilizando un electroporador hecho a medida y un electrodo de tres puntas. (A) Imagen del electroporador personalizado (izquierda) y su panel frontal (derecha). 1: Indicador de potencia. 2: Interruptor de encendido. 3: Indicador de pulso. 4: Interruptor de modo de prueba.  5: Selector de voltaje. 6: Control de ancho de pulso. 7: Electrodo (+). 8: Disparador externo (TTL).  9: Electrodo (-). (B) Imagen del electrodo de tres puntas (izquierda) construido a medida y el método recomendado para sostener el electrodo de tres puntas durante la IUE (derecha). (C) Izquierda: Diagrama que representa la cirugía IUE realizada en presas E16. Derecha: imagen confocal representativa de 20X de IUE con GFP dirigida a L2/3 mPFC. Asterisco amarillo: L2/3 GFP+ neuronas. Barra de escala del panel izquierdo = 250 μm. Barra de escala del panel derecho = 75 μm. Cifras y datos adaptados de Comer et al., 20205. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Diagrama de circuito del electroporador hecho a medida. Un diagrama que representa el circuito de electroporador hecho a medida basado en los ejemplos descritos anteriormente27. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Dirigirse a grandes poblaciones de neuronas de corteza frontal L2/3 usando IUE. (A) Número total de células GFP+ en ratones de control juveniles. N = 15 ratones. B) Porcentaje de células GFP+ por área en ratones de control adultos. N = 22 ratones de control. (C) Secciones representativas que muestran la extensión de las células transfectadas en la corteza frontal. Las imágenes en los paneles izquierdos son áreas alejadas de los paneles derecho (cuadrado rojo). Corteza de asociación frontal: FRA. Corteza motora suplementaria: M2. Corteza prelimbiana: PL. Corteza infralimbiana: IL. Corteza cingulada anterior: ACC. Corteza orbitofrontal medial: MO. Corteza orbitofrontal ventral: VO. Corteza orbitofrontal lateral: LO. Corteza insular anterior: IA. Zona de corteza frontal 3: Fr3.  Corteza motora primaria: M1.  Corteza somatosensorial primaria: S1. Corteza piriforme: Pir. Núcleo olfativo anterior: AO. Caudate-putamen: Cpu. Números negros: Coordenadas Bregma. Barra de escala del panel izquierdo = 0,5 mm. Barra de escala del panel derecho = 1 mm. Media ± SEM. (D) Datos que muestran el número de células electroporadas en el hemisferio derecho frente a la izquierda dentro de cada ratón. Mostrando recuentos celulares no aislados de 14 ratones adultos electroporados con plásmido pCAG-GFP. Prueba en T emparejada. p = 0,4757.  Datos adaptados de Comer et al., 20205. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Evaluación de habilidades sensoriales, comportamiento exploratorio e interacciones sociales tempranas en ratones transfectados juveniles. (A) Ejemplo representativo de camino recorrido (rastro negro) por un cachorro de control P18 en la tarea MI1. Esquinas de ropa de cama fresca (fresca 1 y 2, rosa) y esquina de cama nido (verde). (B) Los cachorros de control pasaron más tiempo explorando la ropa de cama nido que la ropa de cama fresca en la tarea MI1. p < 0.001, ****p < 0.0001. Prueba de post de ANOVA y Sidak bidireccional. (C) Ejemplo representativo de camino recorrido (rastro negro) por un cachorro de control P18 en la tarea MI2.  Copa de presa (presa: azul), Taza vacía (taza vacía: amarillo), Esquina de cama Nest (nido: verde). (D) Los cachorros de control pasaron más tiempo interactuando con su presa que con la taza vacía o la ropa de cama nido. Prueba de post de ANOVA y Sidak bidireccional. p < 0.0001. N = 15 ratones de control. Cifras y datos adaptados de Comer et al., 20205. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Evaluación de las interacciones sociales en ratones transfectados adultos. (A) Ejemplo representativo de ruta recorrida (rastro negro) por el ratón adulto de control P60 en una nueva tarea de interacción de objetos. esquina rosa = ubicación del objeto novedoso. (B) Los ratones de control pasaron aproximadamente el 35% del tiempo explorando el objeto novedoso (5 minutos de tiempo total). Porcentaje de tiempo pasado en la esquina con objeto novedoso mostrado. (C) Ejemplos representativos de ruta recorrida (rastro negro) por un ratón adulto de control P60 en una nueva tarea de reconocimiento de objetos. esquina rosa: ubicación del objeto novedoso. esquina verde: ubicación de objeto familiar. (D) Los ratones de control pasaron más tiempo explorando el objeto novedoso que el objeto familiar. Índice de discriminación (DI) mostrado; DI = ((tiempo con objeto novedoso – tiempo con objeto familiar) / (tiempo con objeto novedoso + tiempo con objeto familiar)). (E) Ejemplos representativos de ruta recorrida (rastro negro) por el ratón adulto de control P60 en la tarea de sociabilidad. esquina rosa: ubicación del ratón novedoso debajo de la taza de alambre de malla. esquina verde: ubicación de la taza de alambre de malla vacía. (F) Los ratones de control pasaron en promedio el mismo tiempo explorando una taza vacía y una taza que contenía un ratón novedoso. El gráfico muestra DI ((tiempo con ratón novedoso – tiempo con taza vacía) / (tiempo con ratón novedoso + tiempo con taza vacía)). Dado que los ratones no estaban socialmente aislados antes de la tarea, el impulso de interactuar con un ratón novedoso podría haber disminuido. Sin embargo, todavía había exploración del ratón novedoso. N = 22 ratones de control. Cifras y datos adaptados de Comer et al., 20205. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Vídeo 1: Uso de DeepLabCut para realizar un seguimiento automático de la posición animal en las tareas de comportamiento. Un vídeo representativo de un ratón adulto en la tarea de interacción social que se ha etiquetado mediante DeepLabCut. Varias partes del ratón se pueden etiquetar como las extremidades y la cabeza. El uso del centroide es apropiado para rastrear la posición del animal, pero otros puntos se pueden utilizar para identificar comportamientos más complejos, como el aseo o la crianza. Haga clic aquí para ver este video. (Haga clic con el botón derecho para descargar.)

Vídeo 2: Uso de DeepLabCut para realizar un seguimiento automático de la cría en tareas de comportamiento. Un vídeo representativo de un ratón adulto en la tarea de interacción social que se ha etiquetado mediante DeepLabCut. La flecha roja muestra la longitud del ratón con la flecha apuntando hacia la cabeza del ratón. La longitud de la flecha se puede utilizar para determinar con el ratón se está criando, ya que la longitud del ratón, y la flecha, se hace más pequeña cuando el ratón se reta. Haga clic aquí para ver este video. (Haga clic con el botón derecho para descargar.)

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Discussion

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En este documento, se describe un oleoducto que combina la manipulación de nuevos genes de interés en grandes poblaciones de neuronas corticales frontales con ensayos conductuales en ratones. Además, esta canalización permite el estudio longitudinal del comportamiento en los mismos ratones tanto durante el desarrollo postnatal temprano como en la edad adulta. Esta técnica evita la necesidad de confiar en modelos genéticos animales que pueden ser costosos en términos de tiempo y gastos. La fuerza de este protocolo es que se puede utilizar para estudiar trastornos neurodesarrollo y neuropsiquiátricos para los que los GWAS recientes han descubierto nuevas asociaciones genéticas28,29. Aunque este método proporciona transfección específica de tipo celular de neuronas excitatorias, una limitación es que es menos factible dirigirse a otros tipos de células cerebrales como interneurones o células gliales. Sin embargo, múltiples estudios sugieren un enfoque modificado para dirigirse a otros tipos de células cerebrales30,31. Además, modificando la posición de los electrodos en relación con la cabeza del embrión y cambiando el tiempo de la IUE, otras regiones cerebrales pueden ser transfectadas bilateralmente incluyendo el hipocampo, amígdala, cerebelo, y los coréticos visuales, somatosensoriales y motores24,32. Además, diferentes capas corticales se pueden dirigir mediante la realización de IUE en diferentes etapas de desarrollo.

Aunque IUE puede tener una alta tasa de éxito, hay pasos críticos y solución de problemas del método que se requiere a veces. Es necesario que los plásmidos estén cuidadosamente diseñados y validados en líneas celulares. Al igual que con toda clonación, se debe tener cuidado de garantizar una expresión génica adecuada, como confirmar que la secuencia está en fotogramas. Además, debe confirmarse el efecto de la manipulación genética (por ejemplo, sobreexpresión o silenciamiento) teniendo en cuenta que los niveles de expresión podrían variar en el transcurso de la época de desarrollo del ratón y la fecha de desarrollo de la IUE. Mancha occidental y qPCR se pueden utilizar para determinar el alcance de la sobreexpresión genética5. Se recomienda co-electroporar un gen reportero, como GFP, en un plásmido separado, ya que las proteínas etiquetadas con GFP pueden plegarse mal o perder su función. Como alternativa, si no se utiliza un reportero, el experimentador puede utilizar la hibridación in situ, qPCR o mancha occidental para determinar los niveles de expresión del gen de interés5.

Si se han verificado plásmidos pero no hay animales que parezcan ser positivos para la transfección, revise a fondo todos los equipos, especialmente el electroporador, para garantizar el correcto funcionamiento. Al entregar pulsos de voltaje a embriones, los cuernos uterinos deben humedecer bien con solución salina calentada y los electrodos deben producir burbujas tras la generación del pulso de voltaje. Si no hay burbujas presentes cuando se entrega la tensión, es probable que haya un problema con el electroporador.  Alternativamente, es posible que el CDNA no se haya inyectado correctamente en el ventrículo. Cuando el cDNA se inyecta correctamente en el ventrículo lateral, el tinte verde rápido será visible en forma de media luna. Por último, la posición de los electrodos es importante. Si los electrodos se colocan ligeramente incorrectamente, es posible que las células no se transfecten en la región de interés. Por lo tanto, al comprobar si hay una transfección exitosa, guardar algunas secciones cerebrales más caudales para ver, si tal vez, la región cerebral equivocada fue transfectada. Una vez practicado este método, un cirujano experimentado puede esperar alcanzar una tasa de éxito de casi el 90%. Este protocolo se puede modificar para dirigirse a otras regiones cerebrales de interés. Por ejemplo, es posible dirigirse a la mayoría de las regiones corticales bilateralmente e incluso a ciertas regiones subcorticales, incluido el hipocampo23. También es posible reducir aún más los costes mediante la construcción de un electroporador personalizado, que se utilizó en los datos presentados aquí5,27.

Futuros estudios podrían hacer uso de este método para entender el papel de los candidatos a genes recién descubiertos en varias enfermedades neurológicas. La canalización presentada ofrece un ensayo relativamente rápido para probar los efectos de manipulaciones genéticas específicas en el desarrollo postnatal temprano y el comportamiento en la edad adulta. Los esfuerzos futuros que utilizan este método tienen el potencial de descubrir qué genes desempeñan un papel causal en ciertos trastornos cerebrales, incluyendo SCZ y trastorno del espectro autista.

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Disclosures

Los autores no declaran intereses competidores.

Acknowledgments

Agradecemos a Lisa Kretsge por comentarios críticos y edición del manuscrito. Agradecemos a todos los asistentes de investigación en el laboratorio Cruz-Martín que fueron invaluables en ayudar con perfusiones y recuento celular de cerebros conductuales. Agradecemos a Andrzej Cwetsch por su contribución en el diseño del electrodo tripolar, y a Todd Blute y al Núcleo de Imágenes de Biología de la Universidad de Boston por el uso del microscopio confocal. Este trabajo fue apoyado por una Beca de Investigación Joven NARSAD (AC-M, #27202), el Premio Brenton R. Lutz (ALC), el Premio I. Alden Macchi (ALC), la NSF NRT UtB: Neurophotonics National Research Fellowship (ALC, #DGE1633516) y el Boston University Undergraduate Research Opportunities Program (WWY). Los financiadores no tuvieron ningún papel en el diseño del estudio, la recopilación y el análisis de datos, la decisión de publicar o la preparación del manuscrito.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
13mm Silk Black Braided Suture Havel's SB77D Suture skin
Adson Forceps F.S.T. 11006-12 IUE
C270 Webcam Logitech N/A Record behavior
Electroporator Custom-built N/A See Figure 1 and 2 and Bullmann et al, 2015
EZ-500 Spin Column Plasmid DNA Maxi-preps Kit, 20preps Bio Basic Inc. BS466 Pladmid preparation
Fast Green FCF Sigma F7252-5G Dye for DNA solution
Fine scissors- sharp F.S.T. 14060-09 IUE
Fisherbrand Gauze Sponges Fisher Scientific 1376152 IUE
Gaymar Heating/Cooling Braintree TP-700 Heating Pad
Glass pipette puller Sutter Instrument, P-97 IUE
Glass pipettes Sutter Instrument, BF150-117-10 IUE
Hair Removal Lotion Nair N/A Hair removal
Hartman Hemostats F.S.T. 13002-10 IUE
Open field maze- homemade acrylic arena Custom-built N/A 50 × 50 × 30 cm length-width-height
pCAG-GFP Addgene 11150 Mammalian expression vector for expression of GFP
Picospritzer III Parker Hannifin N/A pressure injector
Retractor - 2 Pronged Blunt F.S.T. 17023-13 IUE
Ring forceps F.S.T. 11103-09 IUE
Sterilizer, dry bead Sigma Z378569 sterelize surgical tools
SUTURE, 3/0 PGA, FS-2, VIOLET FOR VET USE ONLY Havel's HJ398 Suture muscle
Water bath Cole-Parmer EW-12105-84 warming sterile saline

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References

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Un gasoducto que utiliza la electroporación bilateral en Utero para interrogar influencias genéticas en el comportamiento de los roedores
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Comer, A. L., Sriram, B., Yen, W. W., Cruz-Martín, A. A Pipeline using Bilateral In Utero Electroporation to Interrogate Genetic Influences on Rodent Behavior. J. Vis. Exp. (159), e61350, doi:10.3791/61350 (2020).More

Comer, A. L., Sriram, B., Yen, W. W., Cruz-Martín, A. A Pipeline using Bilateral In Utero Electroporation to Interrogate Genetic Influences on Rodent Behavior. J. Vis. Exp. (159), e61350, doi:10.3791/61350 (2020).

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