يصف هذا البروتوكول إجراءات التلقيح المجهري لأجنة Culex quinquefasciatus التي تم تحسينها للعمل مع أدوات تحرير الجينات CRISPR/Cas9. يمكن لهذه التقنية أن تولد بكفاءة طفرات جرثومية محددة الموقع وقابلة للوراثة يمكن استخدامها لبناء تقنيات جينية في ناقلات الأمراض هذه غير الم مدروسة.
Culex quinquefasciatus هو ناقل لمجموعة متنوعة من الأمراض المنقولة بالنواقل مثل ملاريا الطيور وفيروس غرب النيل (WNV) والتهاب الدماغ الياباني والتهاب الدماغ الشرقي والشعيرات اللمفاوية والتهاب الدماغ سانت لويس. وتجدر الإشارة إلى أن ملاريا الطيور لعبت دورا رئيسيا في انقراض العديد من أنواع الطيور الجزرية المستوطنة، في حين أصبح فيروس نقص الطيور من الأمراض الهامة المنقولة بالنواقل في الولايات المتحدة. للحصول على مزيد من البصيرة في بيولوجيا C. quinquefasciatus وتوسيع مجموعة أدوات التحكم الجيني الخاصة بهم ، نحتاج إلى تطوير طرق أكثر كفاءة وبأسعار معقولة لهندسة الجينوم في هذا النوع. ومع ذلك ، فإن بعض الصفات البيولوجية الفريدة من نوعها للبعوض Culex ، ولا سيما طوافات البيض الخاصة بهم ، جعلت من الصعب إجراء إجراءات التلقيح الدقيق المطلوبة لهندسة الجينوم. ولمعالجة هذه التحديات، قمنا بتطوير بروتوكول محسن للجينات الدقيقة يركز على تخفيف العقبات التقنية المرتبطة بالخصائص الفريدة للبعوض Culex. توضح هذه الإجراءات الطرق المثلى لجمع البيض وفصل طوافة البيض وإجراءات المناولة الأخرى الضرورية للتكميل المجهري الناجح في C. quinquefasciatus. وعندما تقترن هذه الإجراءات بتكنولوجيا تحرير الجينوم CRISPR/Cas9، فإنها تسمح لنا بتحقيق طفرات جرثومية محددة الموقع وفعالة وقابلة للوراثة، وهي طفرات مطلوبة لإجراء هندسة الجينوم المتقدمة وتطوير تكنولوجيات التحكم الجيني في هذا ناقلات الأمراض الهامة، ولكن غير المفحودة حاليا.
C. quinquefasciatus، المعروف باسم البعوض المنزل الجنوبي ، هو ناقل المختصة من مسببات الأمراض العديدة بما في ذلك فيروس غرب النيل (WNV) ، والتهاب الدماغ الياباني ، والتهاب الدماغ سانت لويس ، والتهاب الدماغ الخيول الشرقية. على وجه الخصوص، منذ اكتشافه لأول مرة في نيويورك في عام 1999 ، أصبح WNV مرضا رئيسيا ينتقل عن طريق النواقل في جميع أنحاء الولايات المتحدة القارية (الولايات المتحدة) مع أكثر من 50،000 حالة بشرية تم الإبلاغ عنها مما أدى إلى حوالي 2300 حالة وفاة بين عامي 1999 و 20181 بالإضافة إلى أكثر من 4500 حالة إعتدال تم الإبلاغ عنها بين عامي 2008-20192. وبالإضافة إلى ذلك، تأثر ما لا يقل عن 23 نوعا من الطيور الموجودة في أمريكا الشمالية بعدوى WNV مع ما لا يقل عن 12 نوعا مصنفة على أنها غير قابلة للاسترداد نتيجة لWNV3. ويرجع تأثير WNV على البشر والخيول وتجمعات الطيور إلى سلوك التغذية الانتهازية لناقلاتها. عادة ، الطيور هي المضيف الرئيسي لWNV ، والبشر والخيول هي المضيفين العرضية أو مسدودة. بعض مسببات الأمراض المتجهة بواسطة C. quinquefasciatus تصيب الطيور فقط مثل طفيلي ملاريا الطيور ، بقايا البلازموديوم. في هاواي، C. quinquefasciatus هو ناقل رئيسي للملاريا الطيور وتسبب في انقراض العديد من أنواع الطيور المحلية4،5.
لمكافحة الأمراض التي تنتقل عن طريق C. quinquefasciatus، استخدم الباحثون ووكالات مكافحة ناقلات الأمراض أدوات مكافحة البعوض المنشأة بشكل شائع مثل تطبيق المبيدات الحشرية6، ومع ذلك ، فإن هذه الطرق مكلفة ، وليست خاصة بالأنواع ، ولها فعالية محدودة حيث أن مقاومة المبيدات الحشرية عالية في العديد من مجموعات C. quinquefasciatus 6و7و8و9. تقنيات مكافحة أخرى، مثل استراتيجيات السيطرة على السكان المستندة إلى وولباشياوقد وضعت في السنوات الأخيرة10،11، ولكن تكاليف اللياقة البدنية المرتبطة عدوى وولباشيا تحد من جدوى هذا النهج لهذا المتجه12. وهناك أيضا أساليب المكافحة الجينية التي تم تطويرها في أنواع البعوض الأخرى مثل Aedes aegypti13،14، Anopheles gambiae15 و Anopheles stephensi16، بما في ذلك تطوير البعوض المقاوم للأمراض17،18،19، والتي يمكن تطويرها أيضا ل C. quinquefasciatus إذا كانت أدوات هندسة الجينوم المطلوبة هي وضعت لهذا النوع. ومع ذلك ، فإن بيولوجيا C. quinquefasciatus تختلف اختلافا كبيرا عن ناقلات البعوض الأخرى Aedes و Anopheles مما جعل تطوير تقنيات جينية مماثلة أمرا صعبا في هذا الناقل. مع ظهور تقنيات هندسة الجينوم المستندة إلى CRISPR ، أصبحت هندسة الجينوم الدقيقة تافهة بشكل متزايد وبأسعار معقولة وقابلة للتكيف ، وبالتالي أدت إلى تطوير أدوات جينية جديدة في مجموعة واسعة من الأنواع.
لتوليد الطفرات مع التكنولوجيات القائمة على CRISPR، يتم تقسيم خليط من البروتين Cas9 والجيش الملكي النيبالي دليل الاصطناعية (sgRNA)، مكملة لloci المطلوب، في الأجنة مرحلة ما قبل blastoderm. منذ C. quinquefasciatus الإناث وضع بيضها في مجموعات تعلق في هيكل طوف العائمة (الشكل 1)، بدلا من البيض الفردية ovipositing، سمة من سمات البعوض Aedes و Anopheles، والاحتراقات الدقيقة الجنين معقدة على نحو متزايد في هذا النوع. تظهر يرقات Culex أيضا من الجانب الأمامي لكل بيضة ، والتي هي على اتصال مع سطح الماء (الشكل 1) ، لذلك فإن معالجة اتجاه البيض مهمة في هذا النوع. هنا نصف بروتوكول مفصل مصممة للميكرونجيكشن من البروتين Cas9 وsgRNA في أجنة C. quinquefasciatus. وقد تم تصميم هذا البروتوكول لاستيعاب الصفات الفريدة لبيولوجيا Culex من أجل تحسين بقاء الجنين ومعدلات طفرة الجينوم من خلال خطوات معينة هي المفتاح لجمع البيض في الوقت المناسب وبقاء البيض.
ومع الجهود المبذولة مؤخرا لتوليد أدوات مصممة وراثيا لمكافحة ناقلات البعوض، هناك حاجة إلى وضع بروتوكولات للتجميل الدقيق للأجنة وتحسينها لناقلات أمراض البعوض الشائعة. على الرغم من أنه تم تطوير طرق للبعوض Aedes و Anopheles ، فقد تم استكشاف بروتوكول مصمم خصيصا ل Culex الحد الأدنى. بشكل عام يمكن تقسيم بروتوكولات حقن الأجنة البعوض إلى 3 خطوات عامة: 1) جمع الجنين وإعداده، 2) حقن الأجنة، و 3) استعادة ما بعد الحقن. من أجل توليد المسوخ بنجاح ، يجب تحسين جميع الخطوات الثلاث للأنواع المستهدفة. هذا البروتوكول المعدل للهندسة الدقيقة للأجنة خاص بهندسة الجينوم الناجحة للبعوض Culex.
تعظيم جمع الأجنة هو عنق الزجاجة المشتركة في بروتوكولات التلقيح الدقيق الجنين. من أجل زيادة عدد البيض الذي يتم جمعه في فترة قصيرة من الزمن ، تم تقييد البعوض من ركيزة oviposition لمدة 2-3 أيام بعد وجبة الدم. من المهم ملاحظة أن C. quinquefasciatus تميل إلى تفضيل مصادر دم الطيور بدلا من مصادر الثدييات أو تغذية الأغشية بدم الثدييات. ومع ذلك، يواجه العديد من الباحثين صعوبة في الحصول على مصدر موثوق به من الطيور الحية أو دم الطيور لتغذية الدم، لذلك يمكن تكييف المخزونات المختبرية لتتغذى على مصادر الدم الأكثر سهولة. ومن الأهمية بمكان أيضا استخدام المياه الغنية بالمغذيات للركيزة oviposition كما أنه يوفر العظة oviposition لC. quinquefasciatus ومعظم ناقلات Culex الأخرى. هناك العديد من الطرق لتوليد المياه الغنية بالمغذيات، والتي قد تحتاج إلى تحسين بين المختبرات لضمان وجود عدد مناسب من البيض المتاحة للميكروبيكشن. على سبيل المثال، في حين أن هذه الطريقة كانت الأكثر نجاحا مع براز الأرانب المخمرة في الماء deionized لمدة 5 أيام أو أكثر، والباحثين الآخرين لديهم المزيد من النجاح مع العشب أو الأسماك الغذاء كمصدر للمغذيات وبعض حتى مع الماء المقطر21.
نظرا لأن بعوض Culex يضع مجموعات من البيض في الطوافات ، فإن جمع البيض بسيط إلى حد ما. يمكن ببساطة جمع البيض عن طريق مغرفة الطوافة بأكملها مع فرشاة الطلاء. فصل البيض هو أكثر تعقيدا، ولكن من الضروري لحقن ناجحة. يمكن فصل البيض بعناية عن الطوافة عن طريق تطبيق ضغط نزولي لطيف بين البيض مع فرشاة الطلاء أو ملقط. مع بعض الممارسة ، تمكن العديد من المستخدمين بشكل موثوق من فصل بيض واحد عن طوافات البيض. بعد فصل كل بيضة ، يتم محاذاة البيض في نفس الاتجاه على شريط لاصق على الوجهين ، مما يحقق الاستقرار في البيض أثناء التلقيح الدقيق. يتم حقن البيض في النهاية الخلفية مدبب وإضافة زيت الهالوكربون يحافظ على رطوبة البيض أثناء التلاعب.
للحد من تلف الجنين أثناء الحقن المجهري، يجب أن تكون إبر الحقن ذات قوة مناسبة ومغلفة بزاوية مناسبة. الإبر الألومينوسيليكات مشطوف لمدة 10 ثوان في زاوية 50 درجة كان أفضل النتائج، ولكن البوروسيليكات والإبر الكوارتز قد تعمل أيضا، على الرغم من أنها قد تكون أقل دواما وأكثر تكلفة. بالإضافة إلى ذلك ، يسهل تغليف الإبر المناسب تدفقا أفضل لخلائط Cas9 و sgRNA ويخلق نقطة أكثر وضوحا لتسهيل الاختراق إلى الجنين. في كثير من الحالات، شطب هو أيضا وسيلة فعالة لإصلاح الإبر المسدودة بسرعة بدلا من قضاء الوقت والجهد لاستبدال الإبر المسدودة.
بعد الحقن، يجب أن يبقى البيض دون إزعاج لمدة 5 دقائق على الأقل مع إزالة زيت الهالوكربون بعد ذلك مباشرة عن طريق تنظيفه بلطف باستخدام فرشاة طلاء نظيفة. بعد إزالة زيت الهالوكربون ، يمكن وضع البيض المحقون في الماء للفقس ، والذي يحدث عادة في غضون 3 أيام بعد الحقن. مع الممارسة وأعداد كافية من البيض ، يمكن لهذا البروتوكول تحقيق طفرات جسدية وجراثيم متسقة في C. quinquefasciatus ومتعدد الاستخدامات بما يكفي بحيث يجب أن يكون قابلا للتكيف بسهولة مع بعوض Culex الآخر.
The authors have nothing to disclose.
وقد تم دعم هذا العمل جزئيا من قبل صناديق بدء UCSD الموجهة إلى O.S.A.
9 oz clear plastic pet cup | Karat | C-KC9 | Insect Rearing and Egg Collection |
Aluminosilicate glass capillary tubing 1mm(outside diameter) X 0.58mm (inner diameter) | Sutter Instruments | BF100-58-10 | Microinjection, borosilicate and quartz needles could also be used but we prefered aluminosilicate |
Blood | Colorado Serum Company | 31025 | The colony took multiple generations to adapt to this blood source. Other blood sources are likely just as appropriate. See protocol notes on blood source selection. |
Bugdorm | Bugdorm | 4F2222 | Insect Rearing Cage |
Cas9 Protein with NLS | PNABio | CP01 | Microinjection |
Compound Microscope | Olympus BX41 | Microinjection, for embryo injection | |
Diamond abrasive plate (0.7u to 2.0u tip sizes) | Sutter Instruments | 104E | Microinjection, to be used with beveler |
DNase/RNase-Free distilled Water | Invitrogen | 10977-015 | Microinjection |
Double-sided Tape | Scotch | B084NVQGXD | Microinjection, embryo alignment |
Femtojet 4x or 4i programmable microinjector | Eppendorf | Microinjection | |
Femtotips Microloader tips | Fisher Scientific | E5242956003 | Microinjection |
Filter Paper | Whatman | 1001-090 | Microinjection, embryo collection |
Fine-tip paintbrush | ZEM | 2595 | Microinjection, embryo alignment |
Halocarbon oil 27 | Sigma-Aldrich | H8773 | Microinjection, embryo alignment |
Halocarbon oil 700 | Sigma-Aldrich | H8898 | Microinjection, embryo alignment |
Hemotek | Hemotek | PS5 | Line Maintenance |
Microelectrode Beveler | Sutter Instruments | BV10 | Microinjection, needle beveling |
Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-1000 or P-2000 | Microinjection, needle pulling |
Microscope Slides | Fisherbrand | 12-550-A3 | Microinjection, embryo alignment |
Non-Drying Modeling Clay | Jovi | B0025Z71IM | Microinjection, needle storage |
Stereo Microscope | Olympus | SZ51 | Microinjection, for embryo alignment |
Sugar | Domino | 20% sugar solution for adult sugar source. | |
T7 Endonuclease I | NEB | M0302 | Preparation of microinjection materials |
TOPO TA Cloning Kit | ThermoFischer Scientific | K451020 | Preparation of microinjection materials |
Ultra-fine tip forceps | Fisher Scientific | 16-100-121 | Microinjection, embryo alignment |