Detta protokoll beskriver mikroinjektionsförfaranden för Culex quinquefasciatus embryon som är optimerade för att fungera med CRISPR / Cas9 genredigeringsverktyg. Denna teknik kan effektivt generera platsspecifika, ärftliga, könsceller mutationer som kan användas för att bygga genetisk teknik i denna understudied sjukdom vektor.
Culex quinquefasciatus är en vektor av ett varierat utbud av vektorburna sjukdomar som fågel malaria, West Nile virus (WNV), japansk encefalit, östra hästencefalit, lymfatisk filariasis och Saint Louis encefalit. Noterbart är att fågel malaria har spelat en viktig roll i utrotningen av många endemiska öfågelarter, medan WNV har blivit en viktig vektorburen sjukdom i USA. För att få ytterligare insikt i C. quinquefasciatus biologi och utöka deras verktygslåda för genetisk kontroll måste vi utveckla effektivare och billigare metoder för genomteknik i denna art. Vissa biologiska egenskaper som är unika för Culex myggor, särskilt deras äggflottar, har dock gjort det svårt att utföra mikroinjektionsförfaranden som krävs för genomteknik. För att möta dessa utmaningar har vi utvecklat ett optimerat embryomikroinjektionsprotokoll som fokuserar på att mildra de tekniska hindren i samband med de unika egenskaperna hos Culex myggor. Dessa förfaranden visar optimerade metoder för ägg insamling, ägg flotte separation och andra hantering förfaranden som är väsentliga för framgångsrika microinjection i C. quinquefasciatus. I kombination med CRISPR/Cas9 genomredigeringsteknik, gör dessa procedurer det möjligt för oss att uppnå platsspecifika, effektiva och ärftliga könsceller mutationer, som krävs för att utföra avancerad genomteknik och utveckla genkontrollteknik i denna viktiga, men för närvarande understudied, sjukdom vektor.
C. quinquefasciatus, allmänt känd som den södra husmyggan, är en kompetent vektor av många patogener inklusive West Nile virus (WNV), japansk encefalit, Saint Louis encefalit och östra hästencefalit. Särskilt sedan det först upptäcktes i New York 1999 har WNV blivit en stor vektorburen sjukdom i hela kontinentala USA (USA) med över 50 000 rapporterade mänskliga fall som resulterar i cirka 2 300 dödsfall mellan 1999 och 20181 samt över 4 500 rapporterade hästfall mellan 2008-20192. Dessutom har minst 23 fågelarter som finns i Nordamerika påverkats av WNV-infektioner med minst 12 arter som klassificerats som oåterkalleliga till följd av WNV3. WNV: s inverkan på mänskliga, häst- och fågelpopulationer beror på vektorns opportunistiska utfodringsbeteende. Vanligtvis är fåglar de primära värdarna för WNV, och människor och hästar är tillfälliga eller återvändsgrändvärdar. Vissa patogener vektorerade av C. quinquefasciatus infekterar endast fåglar som fågel malariaparasiten, Plasmodium relictum. På Hawaii är C. quinquefasciatus en huvudvektor för fågel malaria och har orsakat utrotning av många inhemska fågelarter4,5.
För att kontrollera sjukdomar som överförs av C. quinquefasciatushar forskare och vektorkontrollbyråer använt allmänt etablerade myggpopulationskontrollverktyg som insekticidapplikation6, men dessa metoder är kostsamma, inte artspecifika och har begränsad effektivitet eftersom resistensen mot insekticider är hög hos många C. quinquefasciatuspopulationer 6,7,8,9. Andra kontrolltekniker, såsom Wolbachia-baseradebefolkningskontrollstrategier har utvecklats under de senasteåren 10,11, men fitnesskostnaderna i samband med Wolbachia-infektion begränsar genomförbarheten av detta tillvägagångssätt för denna vektor12. Det finns också genbaserade kontrollmetoder som har utvecklats hos andra myggarter som Aedes aegypti13,14, Anopheles gambiae15 och Anopheles stephensi16, inklusive utveckling av patogenresistenta myggor17,18,19, som också kan utvecklas för C. quinquefasciatus om de rekvirerade genomteknikverktygen är utvecklats för denna art. C. quinquefasciatus biologi skiljer sig dock mycket från andra Aedes och Anopheles myggvektorer som har gjort utvecklingen av liknande genetisk teknik svår i denna vektor. Med tillkomsten av CRISPR-baserad genomteknik har exakt genomteknik blivit alltmer trivial, prisvärd och anpassningsbar och har därför lett till utveckling av nya genetiska verktyg i en mängd olika arter.
För att generera mutationer med CRISPR-baserad teknik, en blandning av Cas9 protein och syntetisk guide RNA (sgRNA), som kompletterar önskad lokus, mikroin injiceras i embryon före blastodermstadiet. Eftersom C. quinquefasciatus honor lägger sina ägg i grupper som är fästa i en flytande flottstruktur (Figur 1), i motsats till ovipositing enskilda ägg, en egenskap hos Aedes och Anopheles myggor, embryo mikroinjektioner blir alltmer komplicerade i denna art. Culex larver kommer också ut från den främre sidan av varje ägg, som är i kontakt med vattenytan (Figur 1), så äggorientering efter manipulering är viktigt i denna art. Här beskriver vi ett detaljerat protokoll utformat för mikroinjektion av Cas9 protein och sgRNA i C. quinquefasciatus embryon. Detta protokoll har utformats för att tillgodose egenskaper som är unika för Culex biologi för att förbättra embryoöverlevnaden och genommutationshastigheterna genom vissa steg som är viktiga för kort äggsamling och äggöverlevnad.
Med de senaste ansträngningarna för att generera genetiskt konstruerade verktyg för myggvektorkontroll finns det ett behov av att utveckla och optimera embryomikroinjektionsprotokoll för vanliga myggsjukdomsvektorer. Även om metoder har utvecklats för Aedes och Anopheles myggor, har ett protokoll speciellt utformat för Culex undersökts minimalt. I allmänhet kan myggembryoninjektionsprotokoll delas in i 3 allmänna steg: 1) embryosamling och beredning, 2) embryoinjektion och 3) återhämtning efter injektion. För att framgångsrikt generera mutanter måste alla tre stegen optimeras för målarten. Detta modifierade protokoll för embryomikroinjektion är specifikt för framgångsrik genomteknik av Culex myggor.
Att maximera embryosamlingen är en vanlig flaskhals i embryomikroinjektionsprotokollen. För att öka antalet ägg som samlats in på kort tid begränsades myggor från ett ovipositionssubstrat i 2-3 dagar efter blodmjöl. Det är viktigt att notera att C. quinquefasciatus tenderar att föredra fågelblodkällor i motsats till däggdjurskällor eller membranmatning med däggdjursblod. Många forskare har dock svårt att förvärva en pålitlig källa till levande fågel eller fågelblod för blodmatning, så laboratorielager kan anpassas för att mata på mer tillgängliga blodkällor. Det är också viktigt att använda näringsrikt vatten för ovipositionssubstratet eftersom det ger ovipositionssignaler för C. quinquefasciatus och de flesta andra Culex-vektorer. Det finns många metoder för att generera näringsrikt vatten, som kan behöva optimeras mellan laboratorier för att säkerställa att ett lämpligt antal ägg finns tillgängliga för mikroinjektion. Till exempel, medan denna metod var den mest framgångsrika med kaninavföring fermenterad i avjoniserat vatten i 5 eller fler dagar, har andra forskare större framgång med gräs eller fiskmat som näringskälla och vissa även med destillerat vatten21.
Eftersom Culex myggor lägger grupper av ägg i flottar är insamling av ägg ganska enkelt. Ägg kan helt enkelt samlas in genom att skopa hela flotten med en pensel. Äggseparation är mer komplicerat, men viktigt för framgångsrik injektion. Ägg kan försiktigt separeras från flotten genom att applicera försiktigt nedåttryck mellan ägg med pensel eller tång. Med viss praxis kunde flera användare på ett tillförlitligt sätt separera enstaka ägg från äggflottar. Efter att ha separerat varje ägg justeras äggen i samma riktning på dubbelsidig klibbig tejp, vilket stabiliserar äggen under mikroinjektion. Ägg injiceras i den avsmalnande bakre änden och tillsats av halokarbonolja håller äggen fuktiga under manipulering.
För att begränsa embryoskadorna vid mikroinjektion måste injektionsnålarna vara av lämplig styrka och avfasas i lämplig vinkel. Aluminosilikatnålar som fasades i 10 sekunder i 50° vinkel hade de bästa resultaten, men borosilikat- och kvartsnålar kan också fungera, även om de kan vara mindre hållbara och dyrare. Dessutom underlättar korrekt nålfasning bättre flöde av Cas9- och sgRNA-blandningarna och skapar en skarpare punkt för enklare penetration i embryot. I många fall är avfasning också ett effektivt sätt att snabbt fixa igensatta nålar istället för att spendera tid och ansträngning för att ersätta igensatta nålar.
Efter injektionen ska äggen förbli ostörda i minst 5 minuter och halokarbonoljan avlägsnas omedelbart efteråt genom att försiktigt borsta bort den med en ren pensel. Efter avlägsnande av halokarbonoljan kan de injicerade äggen placeras i vatten för kläckning, vilket vanligtvis inträffar inom 3 dagar efter injektionen. Med övning och tillräckligt antal ägg kan detta protokoll uppnå konsekventa somatiska och könsceller mutationer i C. quinquefasciatus och är tillräckligt mångsidigt för att det enkelt ska kunna anpassas till andra Culex myggor.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes delvis av UCSD-startfonder riktade till O.S.A.
9 oz clear plastic pet cup | Karat | C-KC9 | Insect Rearing and Egg Collection |
Aluminosilicate glass capillary tubing 1mm(outside diameter) X 0.58mm (inner diameter) | Sutter Instruments | BF100-58-10 | Microinjection, borosilicate and quartz needles could also be used but we prefered aluminosilicate |
Blood | Colorado Serum Company | 31025 | The colony took multiple generations to adapt to this blood source. Other blood sources are likely just as appropriate. See protocol notes on blood source selection. |
Bugdorm | Bugdorm | 4F2222 | Insect Rearing Cage |
Cas9 Protein with NLS | PNABio | CP01 | Microinjection |
Compound Microscope | Olympus BX41 | Microinjection, for embryo injection | |
Diamond abrasive plate (0.7u to 2.0u tip sizes) | Sutter Instruments | 104E | Microinjection, to be used with beveler |
DNase/RNase-Free distilled Water | Invitrogen | 10977-015 | Microinjection |
Double-sided Tape | Scotch | B084NVQGXD | Microinjection, embryo alignment |
Femtojet 4x or 4i programmable microinjector | Eppendorf | Microinjection | |
Femtotips Microloader tips | Fisher Scientific | E5242956003 | Microinjection |
Filter Paper | Whatman | 1001-090 | Microinjection, embryo collection |
Fine-tip paintbrush | ZEM | 2595 | Microinjection, embryo alignment |
Halocarbon oil 27 | Sigma-Aldrich | H8773 | Microinjection, embryo alignment |
Halocarbon oil 700 | Sigma-Aldrich | H8898 | Microinjection, embryo alignment |
Hemotek | Hemotek | PS5 | Line Maintenance |
Microelectrode Beveler | Sutter Instruments | BV10 | Microinjection, needle beveling |
Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-1000 or P-2000 | Microinjection, needle pulling |
Microscope Slides | Fisherbrand | 12-550-A3 | Microinjection, embryo alignment |
Non-Drying Modeling Clay | Jovi | B0025Z71IM | Microinjection, needle storage |
Stereo Microscope | Olympus | SZ51 | Microinjection, for embryo alignment |
Sugar | Domino | 20% sugar solution for adult sugar source. | |
T7 Endonuclease I | NEB | M0302 | Preparation of microinjection materials |
TOPO TA Cloning Kit | ThermoFischer Scientific | K451020 | Preparation of microinjection materials |
Ultra-fine tip forceps | Fisher Scientific | 16-100-121 | Microinjection, embryo alignment |