该协议描述了 Culex五角星胚胎的 微注射程序,这些胚胎通过CRISPR/Cas9基因编辑工具进行优化。该技术可以有效地生成特定地点、遗传的生殖系突变,可用于在这种研究不足的疾病载体中构建遗传技术。
Culex 五角星 是多种病媒传播疾病的载体,如禽流感、西尼罗河病毒 (WNV)、日本脑炎、东马脑炎、淋巴丝虫病和圣路易斯脑炎。值得注意的是,禽流感在众多特有岛屿鸟类物种的灭绝中发挥了重要作用,而WNV已成为美国重要的病媒传播疾病。为了进一步深入了解 C.五角星 生物学,并扩大其基因控制工具箱,我们需要开发更有效和负担得起的方法,在这个物种的基因组工程。然而 ,Culex 蚊子特有的一些生物特征,特别是它们的卵筏,使得基因组工程所需的微注射程序变得困难。为了应对这些挑战,我们开发了一个优化的胚胎微注射方案,重点是缓解与 Culex 蚊子的独特特性相关的技术障碍。这些程序演示了鸡蛋收集、蛋筏分离和其他处理程序的优化方法,这些方法对于 C.五角星 的显微注射是必不可少的。当与CRISPR/Cas9基因组编辑技术相结合时,这些程序使我们能够实现特定地点、高效和遗传性生殖系突变,这些突变是执行高级基因组工程和开发这一重要但目前研究不足的疾病载体的遗传控制技术所必需的。
C. 五角星,俗称南方家蚊,是多种病原体的合格载体,包括西尼罗河病毒(WNV)、日本脑炎、圣路易斯脑炎和东方马脑炎。特别是,自1999年在纽约首次发现WNV以来,WNV已成为美国大陆(美国)的主要病媒传播疾病,1999年至2018年间,超过50,000例人类病例报告,导致约2,300人死亡,2008-2019年间报告了4,500多例马匹病例。此外,在北美发现的至少23种鸟类受到WNV感染的影响,至少有12种被归类为无法恢复的物种,由于WNV3。WNV对人类、马匹和鸟类种群的影响是由于其载体的机会性喂养行为造成的。通常,鸟类是WNV的主要宿主,人类和马匹是偶然的或死胡同的宿主。一些病原体由C.五角星病媒,只感染鸟类,如禽流感寄生虫,疟原虫。在夏威夷,C.五角星是禽流感的主要传播媒介,并导致许多本地鸟类物种4,5的灭绝。
为了控制由C.五角星传播的疾病,研究人员和病媒控制机构已经使用了常见的蚊虫种群控制工具,如杀虫剂应用6,但是,这些方法成本高昂,不针对物种,而且效果有限,因为许多C.五角星种群的抗杀虫能力很高,6、7、8、9。其他控制技术,如基于沃尔巴契亚的人口控制策略近年来已经开发了10,11,但与沃尔巴契亚感染相关的健身成本限制了这种方法的可行性,为这个载体12。其他蚊子物种,如伊蚊13号、14号、阿诺菲斯甘比亚15号和阿诺菲斯·斯蒂芬西16号,也都开发了基于遗传的控制方法,包括开发抗病原体蚊子17、18、19,如果必要的基因组工程工具是的话,这些方法也可以为C.quinquefasciatus开发 为这个物种开发。然而,C.五角星生物学与其他伊蚊和阿诺菲勒斯蚊子病媒有很大的不同,这使得这种病媒中类似遗传技术的发展变得困难。随着基于CRISPR的基因组工程技术的出现,精确的基因组工程变得越来越琐碎、经济、适应能力强,从而导致各种物种中新颖的遗传工具的发展。
为了利用CRISPR技术产生突变,Cas9蛋白质和合成导引RNA(sgRNA)的混合物被微注入到爆炸前阶段胚胎中。由于 C.五角星 雌性在漂浮的木筏结构(图1)中分组产卵,而不是卵巢个体卵子, 即伊蚊 和 阿诺菲斯 蚊子的特征,胚胎微注射在这个物种中变得越来越复杂。 Culex 幼虫也从每个卵子的前侧出现,这是与水面接触(图1),所以鸡蛋定向后操作在这个物种中很重要。在这里,我们描述了一个详细的协议,旨在将Cas9蛋白质和sgRNA微注射到 C.五角星 胚胎中。该协议旨在适应 Culex 生物学特有的特征,以便通过某些步骤提高胚胎存活率和基因组突变率,这些步骤是及时采集卵子和卵子存活的关键。
最近,为了生产用于蚊媒控制的基因工程工具,有必要为常见的蚊子病媒开发和优化胚胎微注射方案。虽然已经为 伊蚊 和 阿诺菲勒斯 蚊子开发了方法,但专门为 Culex 设计的协议已经很少被探索。一般蚊子胚胎注射方案可分为3个一般步骤:1)胚胎采集和制备,2)胚胎注射,3)注射后恢复。为了成功生成突变体,必须针对目标物种优化所有三个步骤。这个经过修改的胚胎微注射方案是 库莱克斯 蚊子基因组工程成功的专用方案。
最大化胚胎收集是胚胎微注射协议中常见的瓶颈。为了在短时间内增加收集的卵子数量,蚊子在血餐后2-3天内被限制在卵小板上。需要注意的是,与哺乳动物血源或用哺乳动物血液喂养的膜相比,C.五角星倾向于选择鸟类血源。然而,许多研究人员很难获得可靠的活禽或禽类血液来源供血液喂养,因此实验室库存可以适应以更容易获得的血液来源为食。使用富含营养的水作为卵小板也至关重要,因为它为C. 五角星和大多数其他Culex载体提供卵液提示。有许多方法可以产生富含营养的水,可能需要在实验室之间进行优化,以确保有适当数量的鸡蛋可用于微注射。例如,虽然这种方法最成功,兔粪在去离子水中发酵5天或更长的时间,但其他研究人员更成功地将草或鱼食作为营养来源,有些甚至用蒸馏水21。
由于 Culex 蚊子在木筏上产卵,收集卵子相当简单。鸡蛋只需用画笔铲起整个木筏即可收集。鸡蛋分离更为复杂,但对成功注射至关重要。鸡蛋可以通过用画笔或钳子在鸡蛋之间施加温和的向下压力,小心地从木筏上分离出来。通过一些实践,多个用户能够可靠地将单个鸡蛋从蛋筏中分离出来。分离每个鸡蛋后,鸡蛋在双面胶带上以相同的方向对齐,在微喷射过程中稳定鸡蛋。鸡蛋被注射到锥形的后端,添加光环碳油使鸡蛋在操作过程中保持湿润。
为了限制微注射过程中的胚胎损伤,注射针头需要具有适当的强度,并以适当的角度斜面。氧化铝针以50°角斜面10秒,效果最佳,但氧化硅酸盐和石英针可能也有效,即使它们可能不太耐用,成本更高。此外,适当的针斜面有助于更好的Cas9和sgRNA混合物的流动,并创造一个更尖锐的点,更容易渗透到胚胎。在许多情况下,斜面也是快速修复堵塞针头的有效方法,而不是花费时间和精力来更换堵塞的针头。
注射后,鸡蛋应保持至少5分钟的不受干扰,然后用干净的画笔轻轻刷掉光环碳油。去除卤化碳油后,注射的卵子可以放入水中孵化,通常在注射后3天内发生。通过实践和充足的卵子数量,该协议可以在 C.五角星 中实现一致的体细胞和生殖系突变,并且具有足够的多功能性,因此它应该能够很容易地适应其他 Culex 蚊子。
The authors have nothing to disclose.
这项工作得到了UCSD启动基金的一部分支持,这些基金被引导到O.S.A.
9 oz clear plastic pet cup | Karat | C-KC9 | Insect Rearing and Egg Collection |
Aluminosilicate glass capillary tubing 1mm(outside diameter) X 0.58mm (inner diameter) | Sutter Instruments | BF100-58-10 | Microinjection, borosilicate and quartz needles could also be used but we prefered aluminosilicate |
Blood | Colorado Serum Company | 31025 | The colony took multiple generations to adapt to this blood source. Other blood sources are likely just as appropriate. See protocol notes on blood source selection. |
Bugdorm | Bugdorm | 4F2222 | Insect Rearing Cage |
Cas9 Protein with NLS | PNABio | CP01 | Microinjection |
Compound Microscope | Olympus BX41 | Microinjection, for embryo injection | |
Diamond abrasive plate (0.7u to 2.0u tip sizes) | Sutter Instruments | 104E | Microinjection, to be used with beveler |
DNase/RNase-Free distilled Water | Invitrogen | 10977-015 | Microinjection |
Double-sided Tape | Scotch | B084NVQGXD | Microinjection, embryo alignment |
Femtojet 4x or 4i programmable microinjector | Eppendorf | Microinjection | |
Femtotips Microloader tips | Fisher Scientific | E5242956003 | Microinjection |
Filter Paper | Whatman | 1001-090 | Microinjection, embryo collection |
Fine-tip paintbrush | ZEM | 2595 | Microinjection, embryo alignment |
Halocarbon oil 27 | Sigma-Aldrich | H8773 | Microinjection, embryo alignment |
Halocarbon oil 700 | Sigma-Aldrich | H8898 | Microinjection, embryo alignment |
Hemotek | Hemotek | PS5 | Line Maintenance |
Microelectrode Beveler | Sutter Instruments | BV10 | Microinjection, needle beveling |
Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-1000 or P-2000 | Microinjection, needle pulling |
Microscope Slides | Fisherbrand | 12-550-A3 | Microinjection, embryo alignment |
Non-Drying Modeling Clay | Jovi | B0025Z71IM | Microinjection, needle storage |
Stereo Microscope | Olympus | SZ51 | Microinjection, for embryo alignment |
Sugar | Domino | 20% sugar solution for adult sugar source. | |
T7 Endonuclease I | NEB | M0302 | Preparation of microinjection materials |
TOPO TA Cloning Kit | ThermoFischer Scientific | K451020 | Preparation of microinjection materials |
Ultra-fine tip forceps | Fisher Scientific | 16-100-121 | Microinjection, embryo alignment |