Denne protokollen beskriver mikroinjeksjonsprosedyrer for Culex quinquefasciatus embryoer som er optimalisert for å fungere med CRISPR / Cas9 genredigeringsverktøy. Denne teknikken kan effektivt generere stedsspesifikke, arvelige, bakteriemutasjoner som kan brukes til å bygge genetiske teknologier i denne undervurderte sykdomsvektoren.
Culex quinquefasciatus er en vektor av et mangfoldig utvalg av vektorbårne sykdommer som fugle malaria, West Nile virus (WNV), japansk encefalitt, østlig heste encefalitt, lymfatisk filariasis og Saint Louis encefalitt. Spesielt har fugle malaria spilt en viktig rolle i utryddelsen av mange endemiske øyfuglarter, mens WNV har blitt en viktig vektorbåren sykdom i USA. For å få ytterligere innsikt i C. quinquefasciatus biologi og utvide deres genetiske kontrollverktøykasse, må vi utvikle mer effektive og rimelige metoder for genomteknikk i denne arten. Imidlertid har noen biologiske egenskaper som er unike for Culex mygg, spesielt deres eggflåter, gjort det vanskelig å utføre mikroinjeksjonsprosedyrer som kreves for genomteknikk. For å løse disse utfordringene har vi utviklet en optimalisert embryomikroinjeksjonsprotokoll som fokuserer på å redusere de tekniske hindringene knyttet til de unike egenskapene til Culex mygg. Disse prosedyrene viser optimaliserte metoder for eggsamling, eggflåteseparasjon og andre håndteringsprosedyrer som er avgjørende for vellykket mikroinjeksjon i C. quinquefasciatus. Når de kombineres med CRISPR/Cas9 genomredigeringsteknologi, tillater disse prosedyrene oss å oppnå stedsspesifikke, effektive og arvelige bakteriemutasjoner, som kreves for å utføre avansert genomteknikk og utvikle genetiske kontrollteknologier i denne viktige, men for tiden undervurderte, sykdomsvektoren.
C. quinquefasciatus, kjent som det sørlige huset mygg, er en kompetent vektor av mange patogener, inkludert West Nile virus (WNV), japansk encefalitt, Saint Louis encefalitt og østlig heste encefalitt. Spesielt siden det først ble oppdaget i New York i 1999, har WNV blitt en stor vektorbåren sykdom i hele det kontinentale USA (USA) med over 50.000 rapporterte menneskelige tilfeller som resulterte i rundt 2.300 dødsfall mellom 1999 og 20181 samt over 4.500 rapporterte hestetilfeller mellom 2008-2019. I tillegg har minst 23 fuglearter funnet i Nord-Amerika blitt påvirket av WNV-infeksjoner med minst 12 arter klassifisert som uopprettelige som følge av WNV3. Virkningen av WNV på menneskelige, heste- og fuglepopulasjoner skyldes den opportunistiske fôringsadferden til vektorene. Vanligvis er fugler de primære vertene for WNV, og mennesker og hester er tilfeldige eller blindveis verter. Noen patogener vektorisert av C. quinquefasciatus smitter bare fugler som fugle malariaparasitten, Plasmodium reliktum. På Hawaii er C. quinquefasciatus en hovedvektor av fugle malaria og har forårsaket utryddelse av mange innfødte fuglearter4,5.
For å kontrollere sykdommer som overføres av C. quinquefasciatus, forskere og vektorkontrollbyråer har brukt ofte etablerte myggpopulasjonskontrollverktøy som insektmiddelapplikasjon6, men disse metodene er kostbare, ikke artsspesifikke, og har begrenset effektivitet da motstanden mot insektmidler er høy i mange C. quinquefasciatuspopulasjoner 6,7,8,9. Andre kontrollteknikker, for eksempel Wolbachia-basertebefolkningskontrollstrategier, er utviklet de siste årene10,11, men treningskostnadene forbundet med Wolbachia-infeksjon begrenser muligheten for denne tilnærmingen for dennevektoren 12. Det er også genetisk baserte kontrollmetoder som er utviklet i andre myggarter som Aedes aegypti13,14, Anopheles gambiae15 og Anopheles stephensi16, inkludert utviklingen av patogenresistente mygg17,18,19, som også kan utvikles for C. quinquefasciatus hvis de nødvendige genomteknikkene er utviklet for denne arten. Imidlertid skiller C. quinquefasciatus biologi seg sterkt fra andre Aedes og Anopheles myggvektorer som har gjort utviklingen av lignende genetiske teknologier vanskelig i denne vektoren. Med fremveksten av CRISPR-baserte genomteknologier har presis genomteknikk blitt stadig mer triviell, rimelig og tilpasningsdyktig og har følgelig ført til utvikling av nye genetiske verktøy i et bredt spekter av arter.
For å generere mutasjoner med CRISPR-baserte teknologier, blir en blanding av Cas9 protein og syntetisk guide RNA (sgRNA), komplementær til ønsket loci, mikroinjisert i pre-blastoderm stadium embryoer. Siden C. quinquefasciatus kvinner legger eggene sine i grupper festet i en flytende flåtestruktur (figur 1), i motsetning til ovipositing individuelle egg, blir et trekk av Aedes og Anopheles mygg, embryomikroinjeksjoner stadig mer komplisert i denne arten. Culex larver kommer også ut av den fremre siden av hvert egg, som er i kontakt med vannoverflaten (figur 1), så eggorienteringspostmanipulering er viktig i denne arten. Her beskriver vi en detaljert protokoll designet for mikroinjeksjon av Cas9 protein og sgRNA i C. quinquefasciatus embryoer. Denne protokollen er designet for å imøtekomme egenskaper som er unike for Culex biologi for å forbedre embryooverlevelse og genommutasjonsrater gjennom visse trinn som er nøkkelen for rettidig eggsamling og eggoverlevelse.
Med nylig innsats for å generere genetisk konstruerte verktøy for myggvektorkontroll, er det behov for å utvikle og optimalisere embryomikroinjeksjonsprotokoller for vanlige myggsykdomsvektorer. Selv om metoder er utviklet for Aedes og Anopheles mygg, har en protokoll designet spesielt for Culex blitt minimalt utforsket. Generelt mygg embryo injeksjon protokoller kan deles inn i 3 generelle trinn: 1) embryo samling og forberedelse, 2) embryo injeksjon, og 3) post-injeksjon utvinning. For å kunne generere mutanter, må alle tre trinnene optimaliseres for målartene. Denne modifiserte protokollen for embryomikroinjeksjon er spesifikk for vellykket genomteknikk av Culex mygg.
Maksimering av embryosamling er en vanlig flaskehals i embryomikroinjeksjonsprotokoller. For å øke antall egg samlet på kort tid, ble mygg begrenset fra et oviposisjonssubstrat i 2-3 dager etter blodmel. Det er viktig å merke seg at C. quinquefasciatus har en tendens til å foretrekke fugleblodkilder i motsetning til pattedyrkilder eller membranfôring med pattedyrblod. Imidlertid har mange forskere problemer med å skaffe seg en pålitelig kilde til levende avians eller fugleblod for blodfôring, slik at laboratoriebestandene kan tilpasses for å mate på mer tilgjengelige blodkilder. Det er også avgjørende å bruke næringsrikt vann til oviposisjonssubstratet, da det gir oviposisjonssignaler for C. quinquefasciatus og de fleste andre Culex-vektorer. Det er mange metoder for å generere næringsrikt vann, som kanskje må optimaliseres mellom laboratorier for å sikre at et passende antall egg er tilgjengelige for mikroinjeksjon. For eksempel, mens denne metoden var den mest vellykkede med kanin avføring gjæret i deionisert vann i 5 eller flere dager, har andre forskere mer suksess med gress eller fiskemat som næringskilde og noen til og med med destillert vann21.
Siden Culex mygg legger grupper av egg i flåter, er det ganske enkelt å samle egg. Egg kan ganske enkelt samles ved å øse hele flåten med en pensel. Eggseparasjon er mer komplisert, men viktig for vellykket injeksjon. Egg kan forsiktig skilles fra flåten ved å påføre forsiktig nedadgående trykk mellom egg med pensel eller tang. Med litt praksis var flere brukere pålitelig i stand til å skille enkeltegg fra eggflåter. Etter å ha separert hvert egg, er eggene justert i samme orientering på dobbeltsidig klebrig tape, som stabiliserer eggene under mikroinjeksjon. Egg injiseres i den koniske bakre enden, og tilsetningen av halokarbonolje holder eggene fuktige under manipulering.
For å begrense embryoskader under mikroinjeksjon, må injeksjonsnåler være av passende styrke og skråstilles i en passende vinkel. Aluminosilicate nåler skråstilt i 10 sekunder i en 50 ° vinkel hadde de beste resultatene, men borosilikat og kvarts nåler kan også fungere, selv om de kan være mindre holdbare og dyrere. I tillegg letter riktig nåleutvikling bedre flyt av Cas9- og sgRNA-blandingene og skaper et skarpere punkt for enklere penetrasjon i embryoet. I mange tilfeller er skråkant også en effektiv måte å raskt fikse tilstoppede nåler i stedet for å bruke tid og krefter på å erstatte tilstoppede nåler.
Etter injeksjon skal eggene forbli uforstyrret i minst 5 minutter med halokarbonoljen fjernet umiddelbart etterpå ved å forsiktig børste den bort med en ren pensel. Etter fjerning av halokarbonoljen kan de injiserte eggene plasseres i vann for å klekkes, som vanligvis oppstår innen 3 dager etter injeksjon. Med praksis og tilstrekkelig antall egg kan denne protokollen oppnå konsistente somatiske og bakteriede mutasjoner i C. quinquefasciatus og er allsidig nok til at den lett kan tilpasses andre Culex mygg.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble delvis støttet av UCSD-oppstartsmidler rettet mot O.S.A.
9 oz clear plastic pet cup | Karat | C-KC9 | Insect Rearing and Egg Collection |
Aluminosilicate glass capillary tubing 1mm(outside diameter) X 0.58mm (inner diameter) | Sutter Instruments | BF100-58-10 | Microinjection, borosilicate and quartz needles could also be used but we prefered aluminosilicate |
Blood | Colorado Serum Company | 31025 | The colony took multiple generations to adapt to this blood source. Other blood sources are likely just as appropriate. See protocol notes on blood source selection. |
Bugdorm | Bugdorm | 4F2222 | Insect Rearing Cage |
Cas9 Protein with NLS | PNABio | CP01 | Microinjection |
Compound Microscope | Olympus BX41 | Microinjection, for embryo injection | |
Diamond abrasive plate (0.7u to 2.0u tip sizes) | Sutter Instruments | 104E | Microinjection, to be used with beveler |
DNase/RNase-Free distilled Water | Invitrogen | 10977-015 | Microinjection |
Double-sided Tape | Scotch | B084NVQGXD | Microinjection, embryo alignment |
Femtojet 4x or 4i programmable microinjector | Eppendorf | Microinjection | |
Femtotips Microloader tips | Fisher Scientific | E5242956003 | Microinjection |
Filter Paper | Whatman | 1001-090 | Microinjection, embryo collection |
Fine-tip paintbrush | ZEM | 2595 | Microinjection, embryo alignment |
Halocarbon oil 27 | Sigma-Aldrich | H8773 | Microinjection, embryo alignment |
Halocarbon oil 700 | Sigma-Aldrich | H8898 | Microinjection, embryo alignment |
Hemotek | Hemotek | PS5 | Line Maintenance |
Microelectrode Beveler | Sutter Instruments | BV10 | Microinjection, needle beveling |
Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-1000 or P-2000 | Microinjection, needle pulling |
Microscope Slides | Fisherbrand | 12-550-A3 | Microinjection, embryo alignment |
Non-Drying Modeling Clay | Jovi | B0025Z71IM | Microinjection, needle storage |
Stereo Microscope | Olympus | SZ51 | Microinjection, for embryo alignment |
Sugar | Domino | 20% sugar solution for adult sugar source. | |
T7 Endonuclease I | NEB | M0302 | Preparation of microinjection materials |
TOPO TA Cloning Kit | ThermoFischer Scientific | K451020 | Preparation of microinjection materials |
Ultra-fine tip forceps | Fisher Scientific | 16-100-121 | Microinjection, embryo alignment |