Summary
Здесь мы представляем простой подход с использованием конкретных средств культуры, что позволяет создание нейронов и астроцитов обогащенных культур, или нейрон-глии культур из эмбриональной коры, с высокой урожайностью и воспроизводимостью.
Abstract
Ишемический инсульт является клиническим состоянием, характеризующимся гипоперфузией тканей мозга, что приводит к лишению кислорода и глюкозы, а также последующей потере нейронов. Многочисленные данные свидетельствуют о том, что взаимодействие между глиальными и нейрональными клетками оказывает благотворное воздействие после ишемического события. Поэтому для изучения потенциальных защитных механизмов важно разработать модели, позволяющие изучать взаимодействия нейронов и глий в ишемической среде. В этом мы представляем простой подход к изоляции астроцитов и нейронов из эмбриональной коры крысы, и что с помощью конкретных средств культуры, позволяет создание нейронов или астроцитов обогащенных культур или нейронов-глии культур с высокой урожайностью и воспроизводимостью.
Для изучения перекрестного контакта между астроцитами и нейронами, мы предлагаем подход, основанный на системе совместной культуры, в которой нейроны, культурные в coverslips поддерживаются в контакте с монослой астроцитов, покрываемых в многовелл пластин. Две культуры поддерживаются отдельно небольшими парафиновых сферами. Такой подход позволяет независимые манипуляции и применение конкретных методов лечения для каждого типа клеток, что представляет собой преимущество во многих исследованиях.
Чтобы имитировать то, что происходит во время ишемического инсульта, культуры подвергаются кислорода и глюкозы протокола лишения. Этот протокол представляет собой полезный инструмент для изучения роли нейронно-глийских взаимодействий в ишемическом инсульте.
Introduction
По данным Всемирной организации здравоохранения, около 5,5 миллионов человек умирают каждый год от ишемического инсульта1. Это условие характеризуется прерыванием притока крови к определенной области мозга, что приводит к обратимой или необратимой потере в поставках кислорода и питательных веществ в ткани, что изменяет функцию тканей и приводит к митохондриальной дисфункции, дисрегуляции кальция, глутаматной акутотоксичности, воспалениюи потере клеток 2,3.
Помимо сосудистых клеток, в патофизиологии ишемического инсульта 4 участвуют нейрональные и глиальныеклетки. В частности, астроциты имеют важное значение для поддержания нейронов и в последнее время было показано, играют важную роль в ответ на ишемическоепоражение 5. Этот тип глиальных клеток выполняет функции структурной поддержки, защиты от окислительного стресса, синтеза нейротрансмиттеров, стабилизации клеточной связи, средипрочих 6. Наряду с нейронами, астроциты играют непосредственную роль в синаптической передаче, регулируя высвобождение молекул, таких как аденозинтрифосфат, гамма-аминомасляная кислота иглутамат 7. Часть травмы, вызванной ишемией, вызвана чрезмерным высвобождением глутамата и его накоплением в синаптической расщелине, что приводит к чрезмерной активации N-метил-D-аспаратных рецепторов, активируя вниз по течению сигнальные каскады, что в конечном итоге приводит к возбуждению8. Так как астроциты способны удалить глутамат из синаптической расщелины и преобразовать его в глутамин, они имеют решающее значение в защите от возбудимости, тем самым оказывая нейропротекторное воздействие на ишемию. Эти клетки также играют роль в ишемии индуцированной нейровоспламенения. После ишемического оскорбления активированные астроциты претерпевает морфологические изменения (гипертрофия), размножаются и показывают увеличение экспрессии глиального фибриллярного кислотного белка (GFAP). Они могут стать реактивными (астроглиоз), выпуская провоспалительные цитокины, такие как фактор некроза опухоли-α, интерлейкин-1 и интерлейкин-1 ", и производство свободных радикалов, в том числе оксида азота и супероксида, который, в свою очередь, можетвызвать нейронной смерти 9,10. В отличие от этого, реактивные астроциты могут также играть нейропротекторный эффект, так как они выпускают противовоспалительные цитокины, такие как преобразование фактора роста-β, который регулируется послеинсульта 11. Кроме того, они могут генерировать глиальный шрам, который может ограничить регенерацию тканей путем ингибирования прорастания аксонала; однако, этот глиальный шрам может изолировать место травмы от жизнеспособной ткани, тем самым предотвращая каскадную волну неконтролируемогоповреждения тканей 12,13.
Таким образом, необходимо создать модели, которые позволяют изучать взаимодействия нейронов и глии под ишемической травмой, чтобы найти терапевтические стратегии, которые ограничивают или обратить вспять последствия ишемической травмы. По сравнению с другими моделями, используемыми для изучения ишемической травмы, а именно in vivo модели 14,,15,,16,органотипическиекультуры 17,,18,,19 иострые ломтики мозга 20,,21,22 ,первичные клеточныекультуры менее сложны, что делает возможным изучение индивидуального вклада каждого типа клеток в патофизиологии ишемического инсульта и как каждый тип клеток реагирует на возможные цели. Как правило, для изучения взаимодействий между обогащенными нейронами культурами и обогащенными астроцитами культурами используются нейроны иглиальные клетки послеродового происхождения 23, 24,24, или послеродовые глиальные клетки и эмбриональныенейроны 25,26. В этом предлагается простой подход к созданию нейронов или астроцитов обогащенных культур и нейронов-глии культур из той же ткани. Эти первичные клетки получены из эмбриональной коры крысы, области, часто пострадавших отинсульта 27,28. Более того, диссоциация ткани осуществляется только механической процедурой. Таким образом, этот протокол позволяет изолировать клетки на той же стадии развития, быстрым и недорогим способом, и с высокой производительностью и воспроизводимостью.
Перекрестный разговор между астроцитами и нейронами может быть исследован с помощью системы совместной культуры, в которой нейроны, культурные в coverslips поддерживаются в контакте с монослой астроцитов, посеянных в многоувелицевых пластин. Малые парафиновые сферы могут быть использованы для обеспечения разделения двух клеточных культур. Такой подход позволяет самостоятельно манипулировать каждым типом ячейки, прежде чем они ввяжут. Например, можно заставить замолчать определенный ген в астроцитах и посмотреть, как он может повлиять на уязвимость нейронов или защиту от ишемического повреждения. Установленным методом индуцирования ишемических условий in vitro является лишение кислорода и глюкозы (OGD)3, который состоит в замене обычной атмосферы (95% воздуха и 5% CO2)аноксической атмосферой (95% N2 и 5% CO2),связанной с упущением глюкозы.
Описанный метод подходит для изучения взаимодействий между нейронами и астроцитами в контексте ишемического инсульта простым, быстрым, воспроизводимым и недорогим способом.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все животные, используемые были выведены в Научно-исследовательский центр здоровья CICS-UBI в соответствии с национальными этическими требованиями к исследованиям на животных и Европейской конвенцией о защите позвоночных животных, используемых в экспериментальных и других научных целях (Директива 2010/63/EU).
1. Крысиный эмбрион коры первичной клеточной культуры
- Культура средней подготовки
- Подготовка Neurobasal Medium (NBM), добавив следующие добавки: 2% B27, 0,5 мМ глутамин, 25 МК глутамат и 120 мкг / мл гентамицина. Гомогенизировать, настроить рН до 7,2 и стерилизовать среду с вакуумной фильтрации шаг, используя фильтр 0,22 мкм. Для культуры клеток нейрон-глии дополнить среду культуры клеток NBM 10% тепловой инактивированной сыворотки плода крупного рогатого скота (HI-FBS).
- Приготовьте минимальную основную среду среднего орла (MEM) со следующими добавками: карбонат водорода натрия 2,2 г/л, инсулин из бычьей поджелудочной железы 5 мг/л, D-глюкоза ангидро 3,4 г/л, пенициллин (12 U/mL) /стрептомицин (12 мкг/мл) и 10% HI-FBS. Гомогенизировать, настроить рН до 7,2 и стерилизовать среду с фильтрацией шаг.
- Подготовка материалов и оборудования
- Проколите терминарную часть пластикового микропайпета 1 мл из стороны в сторону, используя иглу определенного диаметра (0,5 мм для S; 0,6 мм для M; 0,8 мм для L) и запечатайте отверстие кончика с помощью пламени.
- Стерилизовать всю стеклянную посуду. На протяжении всего вскрытия хранить инструменты, используемые (например, ножницы, пинцет, скальпель) погружен в 70% этанола. Спрей материалов с 70% этанола перед входом в них в ламинарный поток камеры.
- Установите температуру водяной ванны до 37 градусов по Цельсию и поместите среду клеточной культуры в водяной бане перед началом процедуры.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для анализа иммуноцитохимии, поли-D-лизиновое покрытие должно быть выполнено в многоявкусных пластинах, содержащих крышки.
- Культура эмбриональной коры крыс
- Удалить эмбрионы крысы из самки крысы Wistar с 15-16 дней беременности (конец спаривания, которыйst должен длиться 24 ч, считается 1-й день эмбрионального развития). Для этого обезболивать самку кетамином (87,5 мг/кг) и ксилазином (12 мг/кг) и удалять эмбрионы. Затем усыпляйте самку крысы путем вывиха шейки матки, следуя стандартному протоколу.
- Поместите эмбрионы в стерильную трубку 50 мл, добавьте фосфатный буферный солевой раствор (PBS), пока он не покроет эмбрионы и быстро отведайте их в культурную комнату.
- Все еще внутри желточного мешка, поместите эмбрионы в чашку Петри, содержащую 25 мл холодного PBS. С помощью ножниц и пинцета, разорвать желточный мешок, удалить эмбрион и передать его в другую чашку Петри, содержащий также холодный PBS. PBS в чашке Петри должно быть достаточно, чтобы покрыть весь эмбрион.
ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны при открытии желточного мешка, чтобы избежать повреждения эмбриона. В 1.3.3 и 1.3.4 мы использовали чашки Петри диаметром 90 мм, помещенные поверх пакетов со льдом, покрытых абсорбентной бумагой, чтобы держать PBS при низкой температуре. - Для вскрытия эмбриона перенесите его в другую чашку Петри, содержащую 30 мл холодного PBS. Поместите эмбрион под рассечение микроскопа и обездвижить его с помощью пинцета. Сделайте первоначальный разрез параллельно коре, переходя от глазной полости к концу морды и будьте осторожны, чтобы не обезглавить животное.
- Аккуратно удалите кожу головы и оцепы с помощью пинцета, чтобы не повредить корковую ткань мозга. Сделайте следующий разрез, чтобы отделить кору. Перенесите корковую ткань в 15 мл трубки, содержащей 5 мл PBS с помощью пипетки Pasteur.
- Выполните механическое переваривание ткани головного мозга с помощью пластиковых наконечников 1 мл, подготовленных в 1.2.1. Тритурировать 10 раз с помощью обычной пипетки и повторить процесс с помощью пипеток с постепенно меньшими отверстиями (L, M и S), пока куски не развалились.
- После механического пищеварения центрифуга подвески на 400 х г в течение 3 мин. Откажитесь от супернатанта и ресс-во время осадка с соответствующей средой клеточной культуры, предварительно разогретой при 37 градусах Цельсия.
- Определите общее количество клеток, присутствующих в клеточной подвеске (плотность клеток) с помощью камеры Neubauer, сделайте соответствующие разбавления и пластины клеток. Начальная плотность клеток была определена на основе предыдущего исследования5.
- Для обогащенной нейронами культуры используйте 0,21 х 106 клеток/см2 в качестве начальной плотности клеток и поддерживайте клетки в среде культуры НБМ без HI-FBS.
- Для нейронно-глийных культур используют 0,14 х 106 клеток/см 2 в качестве начальнойплотности клеток и поддерживают клетки в среде культуры НБМ, дополненной 10% HI-FBS.
- Для астроцитов обогащенной культуры, используйте 0,26 х 106 клеток /см 2 в качестве первоначальной плотности клеток и поддерживать клетки в MEM дополняется, как указано ранее.
- Поместите клетки в инкубатор, установленный на уровне 37 градусов по Цельсию, 95% O2 и 5% CO2.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для более длительных периодов культуры, антимитотические, такие как 27 МК 5-фтор-2 "-дезиуридин с 68 МК уридин должны быть добавлены для подавления роста клеток.
2. Система совместной культуры
- Подготовка материалов
- Нагрейте парафин при температуре 150 градусов по Цельсию в отопительном блоке в течение примерно 7 минут. Держите при 150 градусов по Цельсию до окончания процедуры. Затем, с помощью стерильного стекла Pasteur диаметром 1 мм, добавьте небольшую каплю на стерилизованные и покрытые PDL крышки. Парафиновые сферы нерегулярны, но имеют диаметр около 2 мм. Сферы позволят отделить две культуры примерно на 1,25 мм.
- Поскольку парафин не является стерильным, поместите мультиуэлл с парафиновыми сферами под ультрафиолетовым излучением в течение 15 минут.
- Для создания со-культуры, передача крышки с парафиновых сфер с помощью пинцета ранее погружен в 70% этанола в течение 15 мин.
- Со-культура
- Когда две культуры будут готовы к использованию (т.е. после 7 дней в культуре в условиях, упомянутых в шаге 1.3.8), перенесите нейроны, посеянные в крышках с парафиновых сферами, в скважины, содержащие астроциты.
- 24 ч, прежде чем две культуры приведены в контакт, изменить культуру среды нейронов и астроцитов на НБМ дополняется, или нет, с HI-FBS, в зависимости от цели эксперимента.
- После размещения обоих типов клеток в контакте, подождите 8-12 ч, прежде чем начать различные стимулы и процедуры.
ПРИМЕЧАНИЕ: Схематическое представление системы совместной культуры показано на рисунке 1.
3. Лишение кислорода и глюкозы
- Культура Средняя подготовка
- Для экспериментов OGD используйте сбалансированное соляное решение Хэнка (HBSS). Подготовка среды HBSS со следующими реагентами: 1.26 mM CaCl2, 5.36 mM KCl, 0.44 mM KH2PO4, 0.49 mM MgCl2, 139.9 mM NaCl, 4.17 mM NaHCO3, 3.38 mM Na2HPO4. Гомогенизировать и настроить рН до 7,2. Стерилизовать среду путем фильтрации.
ПРИМЕЧАНИЕ: При необходимости дополните раствор HBSS глюкозой (HBSSglu), добавив 5,56 мМ глюкозы. Для культур, представленных OGD не дополняют HBSS среды с глюкозой (HBSSglu-).
- Для экспериментов OGD используйте сбалансированное соляное решение Хэнка (HBSS). Подготовка среды HBSS со следующими реагентами: 1.26 mM CaCl2, 5.36 mM KCl, 0.44 mM KH2PO4, 0.49 mM MgCl2, 139.9 mM NaCl, 4.17 mM NaHCO3, 3.38 mM Na2HPO4. Гомогенизировать и настроить рН до 7,2. Стерилизовать среду путем фильтрации.
- Процедура OGD
- Через 7 дней после посева клетки, удалить культуру среды и мыть два раза с HBSSglu-. После мытья добавить HBSSglu-клеточной культуры среды и место multiwell в гипоксии камеры.
- Печать гипоксии камеры и добавить газовую смесь, содержащую 95% N2/5% CO2 в течение 4 мин с потоком 20 л / мин, чтобы удалить кислород присутствует внутри камеры. После этого остановите поток и поместите гипоксию камеры в инкубаторе при 37 градусов по Цельсию на 4 ч или 6 ч, в зависимости от степени предполагаемой ишемии.
- После периода OGD, заменить HBSSglu-среды с соответствующей среде культуры для остальных процедур.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эксперимент OGD направлен на имитацию условий in vitro, которые клетки страдают во время ишемического события, поэтому важно удостоверить, что все средства массовой информации, используемые ранее удаляется.
4. Анализ иммуноцитохимии
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните анализ иммуноцитохимии, как описано ранее5.
- Короче говоря, чтобы охарактеризовать различные корковые культуры, инкубировать клетки на ночь при 4 градусов по Цельсию с кроликом анти-GFAP (1:2000) и мыши анти-микротрубулы связанных белка 2 (MAP2; 1:500); а затем 1 ч при комнатной температуре со следующими вторичными антителами: анти-кролик, спряженный с Alexa Fluor 546 и антимойка, спряженный с Alexa Fluor 488, оба в 1:1000 разбавления.
- Наклеить на ядра клеток инкубацию с помощью 2 МКМ Hoechst 33342 в течение 10 минут при комнатной температуре.
- Гора охватывает вспышки в флуоресценции монтажной среды и получить изображения на эпифлюоресценции микроскоп с 63x увеличение.
5. Статистический анализ
- Экспресс-данные в процентах от общего числа ячеек или в процентах от контроля и представлены как средняя стандартная погрешность ± среднего (SEM) по крайней мере 3 независимых экспериментов, выполненных в три раза.
- Выполните статистический анализ с помощью программного обеспечения (GraphPad Software Inc., Сан-Диего, Калифорния), используя неспареный тест студента. Результаты были признаны значительными, когда значения p lt; 0.05.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Чтобы охарактеризовать культуры, иммуноцитохимия для оценки количества клеток, которые выразили GFAP или MAP2, широко используемые маркеры астроцитов инейронов (рисунок 2), была выполнена в каждом типе корковой культуры. Этот анализ показал, что обогащенные астроцитами культуры представили 97% клеток, выражают GFAP(рисунок 2A). Что касается обогащенной нейронами культуры 78% клеток, выраженных MAP2, 4% клеток выразили GFAP, и 18% клеток были как GFAP и MAP2-отрицательный(рисунок 2B). По отношению к нейронно-глиальной корковой культуре, 49% клеток были MAP2-положительными, 31% были GFAP-положительными и 20% были отрицательными для обоих маркеров(рисунок 2C).
Через семь дней после установления корковой культуры культура нейронов-глий и обогащенная нейронами культура подвергались процедуре OGD в течение 4 ч или 6 ч. После этой процедуры количество MAP2 и GFAP-положительных клеток оценивалось иммуноцитохимией. В культуре нейрон-глии потеря MAP2-положительных клеток составила 30% и 60% после 4 ч и 6 ч OGD, соответственно(рисунок 3B),в то время как потеря GFAP-положительных клеток составила 9% и 17% после 4 ч и 6 ч OGD, соответственно (рисунок 3C). Что касается обогащенной нейронами культуры, было снижение на 41% и 64% в количестве MAP2-положительных клеток после 4 ч и 6 ч OGD, соответственно (Рисунок 3A). Кроме того, в нейрон-обогащенной культуры, было небольшое увеличение травмы расширение индуцированных 4 ч OGD по сравнению с нейрон-глиа культуры (Рисунок 3A).
Рисунок 1: Схематическое представление системы совместной культуры.
(A) Астроциты были посеяны в мультиуэлл, содержащий PDL покрытием coverslips и нейроны были посеяны в мультиуэлл с PDL покрытием coverslips, содержащие 3 парафиновых сфер. (B)Когда две культуры были готовы к использованию, нейроны в обложках с сферами были перенесены в скважины, содержащие астроциты. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Характеристика корковой культуры нейронов-глии, обогащенной нейронами корковой культуры и корковой культуры, обогащенной астроцитами.
Процент нейронов (MAP2-положительных клеток), процент астроцитов (GFAP-положительных клеток), и процент двойных отрицательных клеток (MAP2-отрицательных / GFAP-отрицательных клеток) на7-й день в культурев ( ) астроцитов обогащенной культуры (B) нейрон обогащенной культуры и (C) нейрон-глиа культуры и репрезентативные изображения, показывающие иммуностимуляторы для MAP2 (зеленый) и Общее количество клеток оценивалось путем количественной оценки ядер Hoechst 33342 с некинотической морфологией (голубой). Из-за низкого количества нейронов в корковой культуре, обогащенной астроцитами, репрезентативное изображение не показывает MAP2-положительное окрашивание. Данные представлены как среднее ± SEM 3 независимых экспериментов(A) и 6 независимых экспериментов(B, C), выполненных в три раза. Изображения были приобретены с целью 63x. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Оценка потери нейронов после периода OGD.
(A, B) Количество нейронов/поля (MAP2-положительных клеток) в культуре нейронов-глий и обогащенной нейронами культуры и (C)число астроцитов/поля (GFAP-положительные клетки) и репрезентативное изображение MAP2 (зеленый) и GFAP (красный) иммуностепенинг в нейронно-глиальной культуре. Общее количество клеток оценивалось путем количественной оценки ядер Hoechst 33342 с некинотической морфологией (голубой). Обогащенные нейронами и нейронами культуры были представлены кислороду и глюкозе (OGD) в течение 4 ч и 6 ч. Данные представлены как среднее ± по крайней мере 3 независимых экспериментов, выполненных в три раза. Общее количество клеток оценивалось путем количественной оценки ядер с маркировкой Hoechst 33342. 0,01, 0,01, 0,001 и 0,0001 OGD 0 ч (неоплаченный тест студента) Пожалуйста, t нажмите здесь, чтобы просмотреть более крупную версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Описанный здесь метод состоит из изоляции астроцитов и нейронов от эмбриональной корковой ткани крысы, что позволяет создать обогащенные нейронами или астроцитами культуры или культуры нейронной глии. Он был адаптирован из предыдущего исследования нашейгруппы 5, где корковые нейроны-глии и нейронов обогащенных эмбриональных культур изоляции были описаны и две культуры характеризуются. Используя эти культуры, Роке и др. обнаружили, что астроциты играют ключевую роль в реагировании на ишемические повреждения и предполагает, что связь между астроцитами и нейронами имеет важное значение для нейропротекторной5. В настоящем протоколе, в дополнение к подготовке нейронов-глии и обогащенных нейронами культур, мы также можем получить обогащенные астроцитами культуры, что позволяет нам изучать влияние ишемической среды на нейроны и астроциты, изолированные или вместе.
Анализ данных иммуноцитохимии показал, что 18% клеток в обогащенной нейронами культуре и 20% в культурах нейронов и глий были отрицательными как для MAP2, так и для GFAP. Эти клетки представили ядра с не-пикнотической морфологией. Учитывая, что культуры были подготовлены из эмбриональной ткани, часть клеток еще не может выразить нейронный маркер, нуждающихся в дальнейшем созревании. Это в соответствии с предыдущими исследованиями, указывающими, что выражение MAP2 увеличивается с нейронной зрелости и что число MAP2-положительных клеток увеличилось со временем в культуре и с возрастом эмбрионов на момент вскрытия29,30. Ранее мы показали, что в нейронно-глиальной культуре только 0,7% клеток были положительными для микроглиального маркера ионизированной молекулы адаптера, связывающей кальций 15. Хотя культурная среда, используемая в культурах нейрон-глии, имеет питательную поддержку, необходимую для роста глиальных клеток, количество микроглии в коре эмбрионов с 15-16 дней уменьшается и по мере сокращения времени культуры, рост этого типа клеток ограничен. То же самое относится и к обогащенным нейронами культурам, но в этом случае рост глиальных клеток еще более ограничен из-за отсутствия HI-FBS в среде культуры.
В дополнение к разрешению различных типов культур, которые будут получены из той же подготовки, протокол здесь описаны имеет другие преимущества. Одноклеточная подвеска получается просто механическим пищеварением, в отличие от других методов, которые используют как энзиматическое, так и механическое пищеварение24,,25,,31,,32; поэтому она быстрее и дешевле. Другим преимуществом является то, что этот протокол также может быть использован для подготовки клеток из других областей мозга, таких как гиппокамп или среднего мозга, что позволяет изучать патологии, затрагивающие различные области мозга. Кроме того, описанная альтернативная процедура, позволяющая создавать со-культуры, позволяет проводить анализ биохимических и морфологических изменений, происходящих в конкретных типах клеток, присутствующих в со-культуре, используя такие методы, как иммуноцитохимия. Общей моделью для создания со-культур являются трансвеллсистемы 24,,25,,33,,34. Вопреки тому, что происходит с системой совместной культуры с использованием небольших спейсеров, таких как парафиновые сферы, модели со-культуры трансвелла не позволяют выполнять иммуноцитохимию на обоих типах клеток, присутствующих в со-культуре. Кроме того, совместно культуры с использованием спейсеров, таких как парафиновые сферы, являются простыми и недорогими.
Подвергать нейрон-обогащенные или нейрон-glia культуры к OGD будет общей моделью in vitro для ишемии, тем не менее другие методы in vitro были использованы, namely химически и enzymatic методы или индукция excitotoxicityглутаматом 3,,35. По сравнению с другими методами, OGD позволяет моделирование двух фаз, которые происходят во время ишемического инсульта, а именно лишение кислорода и глюкозы и reperfusion, что является преимуществом, поскольку он имитирует то, что происходит в vivo. Кроме того, хотя химические и энзиматические методы могут быть полезны из-за его быстрой реакции и простоты применения, есть озабоченность по поводу отношения к патологическому состоянию in vivo, потому что химическая гипоксия приводит к более свободному радикальному поколению, чем аноксия, превосходя то, что наблюдается в vivo35. Что касается протокола OGD, мы заметили, что это приводит к потере нейронов и что расширение поражения может быть скорректирована путем изменения продолжительности периода OGD, для того, чтобы достичь экспериментальных требований. Различия, наблюдаемые в потере нейронов после периода OGD в обогащенных нейронами культурах и культурах нейронов-глии, могут быть обусловлены защитной ролью, которую играют астроциты, тем самым ослабляяя гибель нейронов.
Как и ожидалось, ogD повреждение астроцитов в нейронно-глиа культур был ниже на обоих 4 ч и 6 ч по сравнению с нейронами. Более высокая устойчивость астроцитов к ОГД объясняется несколькими аспектами. Они способны поддерживать уровни АТФ дольше, чем нейроны во время ишемии, и тяжелые ионные дисрегуляциипродолжается медленнее 36 : во-первых,потому, что нейроны имеют более высокую плотность ионных каналов и, следовательно, больший спрос на энергию для поддержания ионных градиентов; а во-вторых, потому что большинство гликогена хранится в головном мозге находится вастроцитов 36. Кроме того, астроциты выражают более низкие уровни ионотропных рецепторов глутамата, чем нейроны, и имеют лучшую ионическую буферику иантиоксидантную емкость 36. Эти атрибуты предположительно лежат в основе хорошо известной селективной потери нейронов над астроцитами36.
Что касается ограничений предлагаемого здесь протокола, то наиболее важным является то, что он основан на модели in vitro, в которой отсутствует сложность взаимодействий, происходящих в системе in vivo, что может привести к проблемам перевода в ситуацию in vivo. Тем не менее, он представляет преимущества, связанные с клеточными культурами, а именно простота, простота манипуляции, возможность предоставить основную подробную информацию о том, как определенная популяция клеток реагирует наопределенное оскорбление 3. В пробирке модели болезни являются менее трудоемкими и менее дорогостоящими в обслуживании, чем модели in vivo. В частности, для моделирования ишемического инсульта, модель in vitro также обладает преимуществом быть легче контролировать уровень глюкозы и кислорода по сравнению с in vivo альтернативы 34. Кроме того, мы также предлагаем использовать со-культуры, которые могут дать более высокий уровень сложности, что позволяет изучать взаимодействие между различными типами клеток, присутствующих в ткани.
Есть несколько важных шагов, которые требуют дополнительного внимания при выполнении протокола. В связи с потребностью в питании астроцитов, НБМ, используемый для получения нейронно-глийных культур, должен быть дополнен 10% HI-FBS-содержащих факторов роста, аминокислот и жирных кислот. Это добавок является то, что отличает нейрон-глиа культуры от нейронов обогащенной культуры. Для подготовки обогащенной астроцитами культуры следует использовать среду, лишенную добавок, необходимых для роста нейронов, таких как B27. В действующем протоколе средой избрания культуры, обогащенной астроцитами, был MEM. Также очень важно, чтобы потребности различных типов клеток были обеспечены при их контакте. Для этого может быть использована культурная среда, совместимая как со астроцитами, так и с нейронами, а именно с НБМ, дополненной B27 и HI-FBS. Что касается протокола OGD, основные важные шаги являются удаление всех O2 из камеры до начала периода OGD, и надлежащее мытье клеток с HBSS без глюкозы, с тем чтобы устранить все глюкозы, присутствующие в среде.
В заключение, здесь мы представляем модель in vitro для изучения ишемического инсульта, установленного простым, быстрым, недорогим и воспроизводимым способом. Кроме того, описанный метод также позволяет реализовать нейронов и астроцитов обогащенных первичных культур, но и нейрон-глиа культур, тем самым обеспечивая большую модель in vitro для моделирования нескольких заболеваний мозга, с более высоким уровнем сложности, чем увековеченные клеточные линии и чистые нейрональные или глиальные культуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.
Acknowledgments
Авторы признают финансовую поддержку фонда пара Циенсия электронной Tecnologia через проекты UIDB/00709/2020, POCI-01-0145-FEDER-029311 и стипендий SFRH/BD/135936/2018 в JP, по "Programa Operacional do Centro, Centro 2020" через проект CENTRO-01-0145-FEDER-000013 и финансирование PPBI-Португальской платформы биоимейминг через проект POCI-01-0145-FEDER-022122.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24 -well culture plates | Thermo Fischer Scientific | 142475 | |
| 95% N2/5% CO2 gas cylinder | ArLíquido | ||
| Anti-mouse conjugated to Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11001 | 1/1000 dilution; incubation period - 1 h at room temperature |
| Anti-rabbit conjugated to Alexa Fluor 546 | Invitrogen | A11010 | 1/1000 dilution; incubation period - 1 h at room temperature |
| B27 supplement (50x) | Gibco | 17504-044 | |
| Dako Fluorescence Mounting Medium | Dako | S3023 | |
| D-glucose anhydrous | Fisher Scientific | G/0450/60 | 3.4 g/L |
| Epifluorescence microscope | Zeiss | AxioObserver Z1x | 63x objective |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Biochrom | S0615 | 10% |
| Gentamicin | Sigma-Aldrich | G1272 | 120 µg/mL |
| Glutamate | Sigma-Aldrich | G8415 | 25µM |
| Glutamine | Sigma-Aldrich | G3126 | 0.5 mM |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H1399 | 2 µM; incubation period - 10 min at room temperature |
| Hypoxia incubation chamber | Stemcell Technologies | 27310 | Chamber used for OGD induction |
| Insulin from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | I5500 | 5 mg/L |
| Ketamine | Sigma-Aldrich | K-002 | 87.5 mg/Kg |
| Minimum Essential Medium Eagle medium | Sigma-Aldrich | M0268 | warm up to 37 °C before use |
| Mouse Anti-MAP2 | Santa Cruz Biotechnology | Sc-74421 | 1/500 dilution; incubation period overnight at 4 °C |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | warm up to 37 °C before use |
| Paraffin pastilles for histology | Sigma-Aldrich | 1.07164 | Solidification point 56-58°C |
| Paraformaldehyde | Sigma -Aldrich | P6148 | 4% in PBS |
| Penicilin/Streptomycin | Biochrom | A 2213 | penicillin (12U/mL) /streptomycin (12µg/mL) |
| Poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P1024 | |
| Rabbit Anti-GFAP | DAKO | Z0334 | 1/2000 dilution; incubation period overnight at 4 °C |
| Sodium hydrogen carbonate | Fisher Scientific | S/4240/60 | 2.2g/L |
| Xylazine | Sigma-Aldrich | X1126 | 12 mg/Kg |
References
- Donkor, E. S. Stroke in the 21(st) Century: A Snapshot of the Burden, Epidemiology, and Quality of Life. Stroke Research and Treatment. 2018, 3238165 (2018).
- Dirnagl, U., Iadecola, C., Moskowitz, M. A. Pathobiology of ischaemic stroke: an integrated view. Trends in Neurosciences. 22 (9), 391-397 (1999).
- Woodruff, T. M., et al. Pathophysiology, treatment, and animal and cellular models of human ischemic stroke. Molecular Neurodegeneration. 6 (1), 11 (2011).
- Berezowski, V., Fukuda, A. M., Cecchelli, R., Badaut, J. Endothelial cells and astrocytes: a concerto en duo in ischemic pathophysiology. International Journal of Cell Biology. 2012, 176287 (2012).
- Roque, C., Baltazar, G. Impact of Astrocytes on the Injury Induced by In vitro Ischemia. Cellular and Molecular Neurobiology. 37 (8), 1521-1528 (2017).
- Ransom, B. R., Ransom, C. B. Astrocytes: multitalented stars of the central nervous system. Methods in Molecular Biology. 814, 3-7 (2012).
- Halassa, M. M., Fellin, T., Haydon, P. G. The tripartite synapse: roles for gliotransmission in health and disease. Trends in Molecular Medicine. 13 (2), 54-63 (2007).
- Forder, J. P., Tymianski, M. Postsynaptic mechanisms of excitotoxicity: Involvement of postsynaptic density proteins, radicals, and oxidant molecules. Neuroscience. 158 (1), 293-300 (2009).
- Basic Kes, V., Simundic, A. M., Nikolac, N., Topic, E., Demarin, V. Pro-inflammatory and anti-inflammatory cytokines in acute ischemic stroke and their relation to early neurological deficit and stroke outcome. Clinical Biochemistry. 41 (16-17), 1330-1334 (2008).
- Gursoy-Ozdemir, Y., Can, A., Dalkara, T. Reperfusion-induced oxidative/nitrative injury to neurovascular unit after focal cerebral ischemia. Stroke. 35 (6), 1449-1453 (2004).
- Cekanaviciute, E., et al. Astrocytic transforming growth factor-beta signaling reduces subacute neuroinflammation after stroke in mice. Glia. 62 (8), 1227-1240 (2014).
- Huang, L., et al. Glial scar formation occurs in the human brain after ischemic stroke. International Journal of Medical Sciences. 11 (4), 344-348 (2014).
- Rodriguez-Grande, B., et al. The acute-phase protein PTX3 is an essential mediator of glial scar formation and resolution of brain edema after ischemic injury. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 34 (3), 480-488 (2014).
- Cheng, X., et al. Dynamic Alterations of Brain Injury, Functional Recovery, and Metabolites Profile after Cerebral Ischemia/Reperfusion in Rats Contributes to Potential Biomarkers. Journal of Molecular Neuroscience. 70 (5), 667-676 (2020).
- Wang, X., et al. Dual role of intrauterine immune challenge on neonatal and adult brain vulnerability to hypoxia-ischemia. Journal of Neuropathology & Experimental Neurology. 66 (6), 552-561 (2007).
- Panahpour, H., Farhoudi, M., Omidi, Y., Mahmoudi, J. An In vivo Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in a Rat Model of Ischemic Stroke. Journal of Visualized Experiments. (133), e57156 (2018).
- Laake, J. H., Haug, F. M., Wieloch, T., Ottersen, O. P. A simple in vitro model of ischemia based on hippocampal slice cultures and propidium iodide fluorescence. Brain Research Protocols. 4 (2), 173-184 (1999).
- Cimarosti, H., Kantamneni, S., Henley, J. M. Ischaemia differentially regulates GABA(B) receptor subunits in organotypic hippocampal slice cultures. Neuropharmacology. 56 (8), 1088-1096 (2009).
- Cho, S., et al. Spatiotemporal evidence of apoptosis-mediated ischemic injury in organotypic hippocampal slice cultures. Neurochemistry International. 45 (1), 117-127 (2004).
- Dong, W. Q., Schurr, A., Reid, K. H., Shields, C. B., West, C. A. The Rat Hippocampal Slice Preparation as an Invitro Model of Ischemia. Stroke. 19 (4), 498-502 (1988).
- Tamura, R., et al. Neuroprotective effects of adenosine deaminase in the striatum. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 36 (4), 709-720 (2016).
- Dennis, S. H., et al. Oxygen/Glucose Deprivation Induces a Reduction in Synaptic AMPA Receptors on Hippocampal CA3 Neurons Mediated by mGluR1 and Adenosine A(3) Receptors. Journal of Neuroscience. 31 (33), 11941-11952 (2011).
- Bar El, Y., Kanner, S., Barzilai, A., Hanein, Y. Activity changes in neuron-astrocyte networks in culture under the effect of norepinephrine. PLoS One. 13 (10), (2018).
- Kuszczyk, M. A., et al. Blocking the Interaction between Apolipoprotein E and A beta Reduces Intraneuronal Accumulation of A beta and Inhibits Synaptic Degeneration. American Journal of Pathology. 182 (5), 1750-1768 (2013).
- Skaper, S. D., Facci, L. Central Nervous System Neuron-Glia co-Culture Models and Application to Neuroprotective Agents. Methods in Molecular Biology. 1727, 63-80 (2018).
- Fang, A., et al. Effects of astrocyte on neuronal outgrowth in a layered 3D structure. BioMedical Engineering OnLine. 18 (1), 74 (2019).
- Fernando, G., Yamila, R., Cesar, G. J., Ramon, R. Neuroprotective Effects of neuroEPO Using an In vitro Model of Stroke. Behavioral Sciences. 8 (2), (2018).
- Zhao, L. R., Willing, A. Enhancing endogenous capacity to repair a stroke-damaged brain: An evolving field for stroke research. Progress in Neurobiology. 163, 5-26 (2018).
- Crandall, J. E., Jacobson, M., Kosik, K. S. Ontogenesis of microtubule-associated protein 2 (MAP2) in embryonic mouse cortex. Brain Research. 393 (1), 127-133 (1986).
- Chamak, B., Fellous, A., Glowinski, J., Prochiantz, A. MAP2 expression and neuritic outgrowth and branching are coregulated through region-specific neuro-astroglial interactions. Journal of Neuroscience. 7 (10), 3163-3170 (1987).
- Almeida, A., Medina, J. M. A rapid method for the isolation of metabolically active mitochondria from rat neurons and astrocytes in primary culture. Brain Research Protocols. 2 (3), 209-214 (1998).
- Bessa, A., et al. GPER: A new tool to protect dopaminergic neurons. Biochim Biophys Acta. 1852 (10), Pt A 2035-2041 (2015).
- De Simone, U., Caloni, F., Gribaldo, L., Coccini, T. Human Co-culture Model of Neurons and Astrocytes to Test Acute Cytotoxicity of Neurotoxic Compounds. International Journal of Toxicology. 36 (6), 463-477 (2017).
- Yang, L., Shah, K. K., Abbruscato, T. J. An in vitro model of ischemic stroke. Methods in Molecular Biology. 814, 451-466 (2012).
- Holloway, P. M., Gavins, F. N. Modeling Ischemic Stroke In Vitro: Status Quo and Future Perspectives. Stroke. 47 (2), 561-569 (2016).
- Rossi, D. J., Brady, J. D., Mohr, C. Astrocyte metabolism and signaling during brain ischemia. Nature Neuroscience. 10 (11), 1377-1386 (2007).
