Summary
Этот протокол описывает хронический метод имплантации окна черепа, которые могут быть использованы для продольной визуализации нейроглио-сосудистых структур, взаимодействий и функции как в здоровых, так и в больных условиях. Он служит дополнительной альтернативой транскраниальному подходу к визуализации, который, хотя и часто предпочтительнее, обладает некоторыми критическими ограничениями.
Abstract
Центральная нервная система (ЦНС) регулируется сложным взаимодействием нейронных, глиальных, стромальных и сосудистых клеток, которые облегчают его надлежащую функцию. Хотя изучение этих клеток в изоляции in vitro или вместе ex vivo предоставляет полезную физиологическую информацию; в таких контекстах будут упущены основные особенности физиологии нервных клеток. Поэтому необходимо изучать нервные клетки в их родной среде in vivo. Протокол подробно здесь описывает повторяющиеся vivo двух-фотон изображения нервных клеток в коре грызунов в качестве инструмента для визуализации и изучения конкретных клеток в течение длительных периодов времени от часов до нескольких месяцев. Мы подробно описываем использование чрезвычайно стабильного сосуда мозга как грубой карты или флуоресцентно помеченных дендритов как тонкая карта избранных областей мозга, представляющих интерес. Используя эти карты в качестве визуального ключа, мы показываем, как нервные клетки могут быть точно перемещены для последующего повторяющихся изображений in vivo. Используя примеры in vivo изображений флуоресцентно-маркированных микроглии, нейронов и NG2- клеток, этот протокол демонстрирует способность этой техники, чтобы повторяющиеся визуализации клеточной динамики в том же месте мозга в течение длительных периодов времени, что может еще больше помочь в понимании структурных и функциональных реакций этих клеток в нормальной физиологии или после патологических оскорблений. При необходимости такой подход может быть связан с функциональной визуализацией нервных клеток, например, с визуализацией кальция. Этот подход является особенно мощным методом визуализации физического взаимодействия между различными типами клеток ЦНС in vivo, когда генетические модели мыши или конкретные красители с различными флуоресцентными тегами для обозначения клеток, представляющих интерес, доступны.
Introduction
Центральная нервная система (ЦНС) регулируется сложным взаимодействием взаимодействий между различными типами клеток-резидентов, включая нейроны, глию и клетки, связанные с сосудами. Традиционно, нервные клетки были изучены в изолированных, совместно культивируется1,2,3,4,,5 (in vitro) или вырезанной ткани мозга (ex vivo)6,7,8,9,10 контекстов.4 Тем не менее, необходимо дальнейшее понимание поведения нейронных клеток и взаимодействий в родной среде нетронутыми мозга in vivo. В этом протоколе мы описываем метод картирования регионов, представляющих интерес in vivo, и точно переохотвердем эти регионы в будущих сеансах визуализации для отслеживания сложных взаимодействий между различными типами клеток ЦНС в течение длительных периодов времени.
Развитие подходов к визуализации in vivo дало значительные выгоды для правильного понимания нервной функции11,,12,,13,,14,,15. В частности, эти подходы дают ряд преимуществ по сравнению с традиционными подходами in vitro и ex vivo. Во-первых, в vivo системы визуализации имеют физиологически соответствующие компоненты клеток и тканей, такие как сосуды с полным репертуаром клеточных взаимодействий, чтобы обеспечить полное понимание физиологии нейронной сети. Во-вторых, последние результаты показывают, что при удалении из их родной среды, некоторые нервные клетки (например, микроглии) теряют важные особенности их идентичности и, таким образом, физиологии16,17, которые могут быть сохранены в in vivo настройки. В-третьих, in vivo системы визуализации предоставляют возможность для стабильных продольных исследований от нескольких недель до нескольких месяцев для изучения ЦНС клеточного взаимодействия. Наконец, учитывая растущие данные о вкладах от периферической иммунной системы18,19 и микробиома20,21 в физиологии ЦНС, in vivo системы обеспечивают платформу для допроса таких вкладов и воздействия на клетки ЦНС. Таким образом, подходы, которые используют продольные in vivo изображения для изучения нейро-иммунной физиологии и взаимодействия в здоровых, раненых и больных состояний являются большим дополнением к традиционным подходам.
В этом протоколе мы описываем надежный подход к изображению различных типов клеток в головном мозге, включая микроглии, нейроны и клетки NG2в качестве примеров. Разработаны два подхода к визуализации нервных клеток in vivo: истонченный подход черепа и открытый череп с подходом к черепному окну. Хотя разбавленный череп подходы используются и предпочтительнее, потому что они преодолевают некоторые из недостатков открытого подхода черепа, таких как активация глиальных клеток, выше, чем физиологическая динамика позвоночника и использование противовоспалительных агентов22,23,24,,25, разбавленный череп подходы также показывают несколько критических недостатков. Во-первых, процедура истончения является очень деликатной процедурой, которую многие исследователи трудно усовершенствовать, особенно когда необходимо повторное утончение. Это так, потому что часто трудно для экспериментаторов, чтобы убедиться, что они истончили череп до глубины 20 мкм. Во-вторых, для адекватных сравнений между мышами, истончение должно быть идентичным и различные истончение успеха между изображений сессий или мышей может осложнить визуализацию нервных структур. В-третьих, при использовании для продольной визуализации, животные с истонченными черепами могут быть использованы только для ограниченного числа сеансов при повторном разжижении черепа. В-четвертых, так как некоторые из костной ткани все еще остается, ясность в глубине изображения может быть скомпрометирована от истонченного подхода черепа позволяет большой визуализации более поверхностным, но не так много с более глубокими регионами. В свете этого, более глубокие структуры мозга, такие как гиппокамп, не могут быть успешно изображены с истонченным подходом черепа. Эти соображения высовы воспитывают необходимость в альтернативных и взаимодополняющих подходах, которые могли бы преодолеть эти озабоченности.
Альтернатива истонченным подходом черепа, открытый подход к имплантации окна черепа использует процедуру, в которой череп заменяется оптически ясным стеклом. Это позволяет почти неограниченное количество сеансов визуализации. Кроме того, при замене черепа на стекло крышки, этот метод позволяет четкое окно просмотра флуоресцентно помечены клетки мозга в течение длительных периодов от нескольких часов до месяцев и, следовательно, могут быть использованы для изучения активности клеток и взаимодействий, которые имеют отношение к физиологии, старения и патологии.
В целом, мы подробно шаги, которые могут следовать, чтобы сделать имплантат хронических черепных окон через стереотаксисную краниотомию, что позволяет in vivo изображения областей мозга, представляющих интерес. Мы также описываем, как чрезвычайно стабильная сосуды мозга или флуоресцентно помеченные дендриты могут быть использованы для создания грубой или тонкой карты, соответственно, областей мозга, представляющих интерес. Этот подход может быть использован для повторного изображения в течение нескольких сессий. Важность этого метода, таким образом, заключается в его способности образ долгосрочных изменений или застой в элементах мозга, включая расположение, морфология, и взаимодействия различных клеточных типов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все шаги в соответствии с руководящими принципами, установленными и утвержденными Институциональным комитетом по уходу за животными и использованию Университета Вирджинии.
1. Подготовка мыши для имплантации окна черепа
ПРИМЕЧАНИЕ: Различные трансгенные линии мыши с флуоресцентными тегами подходят для визуализации.
- Используйте CX3CR1GFP / мышей26 для визуализации микроглии in vivo. Как правило, несовершеннолетние для молодых взрослых от 4 до 10 недель мышей, которые весят 17-25 г используются.
ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя, этот подход даже склонен к предварительно отлученных мышей, необходимость вернуть мышей в клетку с их матерями для кормления, может осложнить восстановление, если мать не принимает надлежащий уход за щенками после операции. Поэтому рекомендуется использовать мышей после отлучения от от отлучения. - Обезболивать мышь с помощью изофлурана (5% потока кислорода для индукции в течение 1 мин) в анестезируемой камере. Убедитесь, что мышь не показывает никаких движений или подергивания ответов на пальцы ног и / или хвост щипает. Возьмите мышь из камеры и на открытом воздухе тщательно брить волосы на голове между ушами примерно от уровня глаз до верхней части области шеи с помощью триммера волос.
ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация изофлоурана, используемого будет зависеть от размера индукционной камеры. Таким образом, для небольших камер, 3-4% изофлуран может быть использован для эффективного индуцирования анестезии в то время как большие камеры потребует до 5%. - Переместите мышь на стереотаксическую операцию станции носа конус для анестезии (1,5-2% для поддержания для операции), стабилизировать голову с помощью ушных полос, и поддерживать мышь на грелку, чтобы сохранить температуру тела теплой.
- Любить оба глаза с мазью для глаз. Введите 100 мл 0,25% баупивикаина (для обеспечения местной анальгезии мыши, которая будет длиться 8-12 ч) и 100 мл 4 мг/мл дексаметазона (для уменьшения воспаления, которое может возникнуть в результате хирургической процедуры) подкожно на месте разреза. Разрешить мыши сидеть, по крайней мере 5 минут, прежде чем перейти к следующему шагу.
- Очистите бритую голову тремя чередующимися мазками бетадина и 70% алкоголя. Сделайте разрез средней линии кожи головы с помощью хирургического лезвия или ножниц, простирающихся от задней части черепа области между ушами до лобной области между глазами. Оставшаяся кожа разрезается, чтобы разоблачить череп.
- Очистите соединительной ткани, расположенные между кожей головы и лежащего в основе черепа с 3% перекиси водорода (H2O2) и локализовать область мозга, чтобы быть изображены с стереотаксическими координатами.
ПРИМЕЧАНИЕ: Существует часто некоторые кровотечения (шаг 1.5) от разреза на поверхности черепа. Это кровотечение обычно разрешается само по себе в течение 3-5 мин. Очистка с перекисью помогает. Предварительное лечение бупивакаина (шаг 1.4) также отмечается, чтобы ограничить количество кровотечения в течение этого времени.
2. Мышь черепного окна имплантации хирургии
- Просверлите круговое отверстие 4 мм в череп с помощью зубного сверла бит (0,7 мм кончика диаметром) и тщательно удалить эту часть черепа с помощью остроконечных щипцов. Для визуализации соматосенсорной коры 6-8-недельных мышей, найти центр краниотомии на -2,5 задней и 2,0 боковой брегмы. Во время бурения регулярно смочите череп стерильным солевым раствором и ватными тампонами, чтобы охладить мозг, очистить от костного мусора и смягчить кость черепа для возможного удаления.
ПРИМЕЧАНИЕ: Координаты краниотомии будут варьироваться в зависимости от региона интереса и возраста мышей. - После удаления черепа аккуратно поместите небольшой крышкой (размер #0 толщиной 0,1 и 0,02 мм), увлажненной солевым раствором в краниотомии. Высушите лишний солевой раствор с помощью стерильной салфетки.
- Используя остроконечный аппликатор (например, наконечник пипетки или остроконечный конец сломанной деревянной ватной палочки), нанесите на окно клей цианоакрилат и дайте ему прикрепиться к мозгу и черепу. Нанесите клей грунтовки на остальную часть черепа и вылечить его с отлечающим светом для 20-40 с. Подготовка хорошо вокруг окна с окончательным клеем и вылечить с отлечающим светом для 20-40 с.
- Клей небольшой головной пластины на череп на контралатеральной полушария краниотомии сначала с грунтовкой клей в качестве грунтовки, а затем с окончательным клеем. Лечить как с отлечающим светом для 20-40 с каждый.
ПРИМЕЧАНИЕ: Швы не нужны, если череп полностью покрыт клеем во время этой процедуры.
3. Послеоперационный уход
- Разрешить мыши проснуться в отсутствие анестезии (восстановление делается на грелку сокращает время восстановления) и вернуть его в свою домашнюю клетку, как только полностью проснулся. Введите одну подкожную дозу бупренорфина SR (0,5 мг/кг) в виде послеоперационной анальгезии, которая достаточна для 72 ч.
- Чтобы облегчить здоровое восстановление после операции, обеспечить мышь дополнительной мягкой пищи, которая может быть в виде регулярного твердого чау в воде, чтобы смягчить чау или пищу в виде геля.
ПРИМЕЧАНИЕ: Достаточно однократного обеспечения мягкой пищей сразу после операции. - Мониторинг мыши ежедневно для здоровья и надлежащего восстановления в течение первых 72 ч операции процедуры. После этого выполните визуализацию уже через 2 недели после операции по имплантации окон.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если все сделано хорошо, мыши хорошо восстановить показаны нормальные амбулаторное поведение, достаточное исследование клетки, хорошее увлажнение, стабильное увеличение веса и обширные взаимодействия с другими мышами в клетке и других предметов в клетке. Мыши, показывающие вялость, обезвоживание и более 10% потеря веса после операции усыпляются и удаляются из исследования.
4. Двухфонное отображение мозга для первоначального изображения
- Обезболивать мышь (Изофлуран, 5% индукции и 1,5% технического обслуживания). Стабилизировать голову с помощью винтов для крепления головной панели на двухфотном микроскопическом этапе, поддерживается на нагревательной пластине при 35 градусов по Цельсию. Введите интраперитонально 100 мл красителя кровеносных сосудов, таких как Rhodamine B (2 мг/мл).
ПРИМЕЧАНИЕ: Изображение также может быть сделано в бодрствующих мышей без анестезии. Тем не менее, последние исследования показывают, что анестезия влияет на динамику микроглиального эпиднадзора27,,28,,29 и что фиксация головы для двух фотон изображений у бодрствующих мышей увеличивает стресс даже во время хронической визуализации, по крайней мере 25 дней (см. Juczewski et al., 2020)30. - Очистите поверхность черепного окна осторожно, используя ватный тампон dabbed в 70% этанола. Положите несколько капель воды или солевого раствора на черепное окно и опустите объектив в раствор, так как целью является погружение объектива.
- Ручная нарисуйте грубую карту для обозначения основных ориентиров кровеносных сосудов в лабораторном блокноте, просматривая окуляр эпифлорестой. Используйте этот рисунок для определения конкретных областей во время двух фотон изображений. Кроме того, сфотографировать кровеносные сосуды либо через камеру, установленную на микроскоп или через ручную камеру или телефон.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эти рисованной изображения и фотографии, чтобы облегчить пересмотр же широкие области под микроскопом до двух фотон изображений. Это не точное отображение изображений. - Под двумя фотон изображения, собирать изображения флуоресцентных клеток и сосудов по мере необходимости. Тщательно подписы баку с соответствующими координатами для того чтобы обеспечить что точные зоны можно revisited для затем изображений. Соберите несколько полей зрения в этом первоначальном сеансе визуализации, например, приобретите изображения z-stack каждые 1-2 мкм через объем ткани.
ПРИМЕЧАНИЕ: При сборе изображений двумя фотоном, ориентиры кровеносных сосудов используются для грубого картирования. Если требуется тонкое отображение, используются дендриты с маркировкой YFP из Thy1-YFP31 мышей.- Используйте эти рекомендуемые параметры для визуализации: длина волны 880-900 нм является оптимальной; для RFP и /или dsRed / Rhodamine возбуждение, 565 нм дихроическое зеркало с 525/50 нм (зеленый канал) и 620/60 нм (красный канал) фильтры выбросов используются; для разделения GFP и YFP используется дихроическое зеркало 509 нм с фильтрами выбросов 500/15 и 537/26 нм; мощность мозга поддерживается на уровне 25 мВт или ниже; Разрешение изображения составляет 1024 х 1024 пикселей, поле зрения, принятое с 25X 0.9 NA цели на 1,5X коэффициент зума 295,24 х 295,24 мкм.
- В конце изображения, принять мышь со сцены, дайте ему проснуться от анестезии и вернуться в свою домашнюю клетку до будущего сеанса изображений.
5. Двухфотная визуализация и переизмовка
- Для будущих последующих сеансов визуализации, которые могут быть от нескольких часов до месяцев после первоначальной сессии визуализации, анестезировать мышь (Isoflurane, 5% индукции и 1,5% обслуживания), крепление на двухфотографическом микроскопе, поддерживать на нагревательной пластине и повторно вводить 100 мл красителя кровеносных сосудов, таких как Rhodamine B (2 мг/мл).
- Откройте ранее полученные изображения в ImageJ и, используя эти изображения, а также заметки из предыдущей сессии, определите ранее изображенные области и тщательно переизображайте их.
- Повторите это до тех пор, пока окно изображения ясно или как важно для масштабов исследования.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Для визуализации микроглиальной динамики in vivo использовались двойные трансгенные CX3CR1GFP/:Thy1YFP мышей. Линия Thy1-YFP H используется в отличие от линии Thy1-GFP M, чтобы избежать перекрытия цветодержания микроглии (GFP) и нейронов (YFP). Альтернативные подходы могут использовать линию репортера, в которой микроглии помечены, например, tdTomato, а затем линия Thy1-GFP M может быть использована. Недостатком линии H является то, что YFP этикетки много нейронов и этикетка увеличивается с увеличением возраста (личное наблюдение). Линия M демонстрирует разреженную маркировку нейронов. Между 2 - 4 неделями операции по имплантации окон, за микроглиальной динамикой может последовать повторная визуализация. Большие кровеносные сосуды используются для локализации конкретных регионов, а затем YFP помечены дендриты используются для тонкого картирования областей мозга. При таком подходе, конкретные дендриты могут быть использованы в качестве стабильных ориентиров для тонкого картирования областей мозга(Рисунок 1, стрелки на рисунке 1b). В то время как дендриты стабильны, некоторые микроглии двигаться ежедневно (Рисунок 1c).
Кроме того, такого подхода достаточно для еженедельной продольной визуализации в долгосрочной перспективе. Таким образом, одиночные трансгенные мыши CX3CR1GFP/е были использованы для того чтобы последовать за microglia соединенными с интраперитонеальной инъекцией Rhodamine B для того чтобы маркировать сосуды во время каждой сессии изображения на up to 8 недели(рисунок 2). Кроме того, как обсуждалось выше, Thy1 мышей могут быть использованы для продольного тонкого отображения. Когда еженедельное изображение выполняется, сосуды, как отмечается, будет стабильно фиксированной, но микроглии можно рассматривать как динамические, как показано в трех конкретных областях, представляющих интерес (ROI, пунктирной круги) на рисунке 2. В верхней рентабельности инвестиций, микроглии начинают входить в рентабельность инвестиций на4-й неделе визуализации и продолжать в течение8-й недели изображений. В середине рентабельности инвестиций с бифуркированной сосуд, микроглиальная клетка возникает вокруг нижнего сосуда в3-й неделе, теряется на6-й неделе и еще одна микроглиа возникает на верхнем кровеносных сосудов в7-й неделе и поддерживается в8-й неделе. Наконец, в нижней рентабельности инвестиций, микроглиальной клетки в поддерживается через6-й недели и потеряли в7-й и8-й недели визуализации. Эти результаты указывают на динамические изменения в позиционной сети микроглиа в течение нескольких недель и месяцев.
Этот подход также может быть использован для исследования клеточной динамики после острой травмы или во время патологического развития заболевания. Одиночные трансгенные мыши CX3CR1GFP/З были использованы для того чтобы последовать за microglia соединенное с интраперитонеальной инъекцией Rhodamine B для того чтобы маркировать vasculature перед (данные не показаны) и следуя за строгими захватами индуцированными kainic кислотой(рисунок 3). После судорог, структура сосудистой кровати поддерживается без овертных возмущений(Рисунок 3a). Тем не менее, микроглиальная сотовая сеть и позиционный ландшафт преходяще изменены (некоторые клетки "получили", а другие "потеряны" в поле зрения) с большими изменениями в пределах 24-48 ч изъятий, которые восстанавливаются в нормальное русло на 72 ч(рисунок 3b), как мы ранее сообщали32.
Наконец, этот подход также может быть использован для исследования взаимодействия клеток и клеток или сравнения динамики между типами нейронных клеток. Двойные трансгенные CX3CR1GFP/:NG2dsRed/я мыши были использованы для отслеживания микроглии и NG2- клеток in vivo. Без маркировки сосудов, микроглии и NG2 клетки могут быть определены(Рисунок 4a). NG2 является протеогликаном, который маркирует как сосуды связанных перицитов и олигодендроцитов клеток-предшественников (OPCs)33,34. Перициты, как правило, имеют удлиненные процессы, которые следуют вдоль сосудистой стенки (предположительно отождествляется со стрелками на рисунке 4a) и OPCs обычно показывают большие тела клеток, которые проживают в мозге parenchyma от сосудов (предположительно отождествляется со стрелками на рисунке 4a). Чтобы адекватно различать перициты и ОПС, сосуды помечены родамином В. Более яркое цветоценка NG2-сосуд ассоциированных клеток (перициты, наконечники стрел) можно отличить от слабее флоресценции luminal Rhodamine, несмотря на аналогичные возбуждения двумя фотон изображения(Рисунок 4b,c). Ежедневная визуализация показывает, что перициты стабильно расположены, в то время как OPCs (звездочки на рисунке 4b)и микроглии (круги на рисунке 4b)являются динамическими в соответствии с предыдущими докладами32,35,36.
Рисунок 1: Ежедневная визуализация микроглии с использованием тонкого картирования с нейронными дендритами в двойных трансгенных CX3CR1GFP / q:Thy1YFP мышей. (a) Представитель двух-фотон изображение микроглии (зеленый) и дендритов (красный) из двойного трансгенного CX3CR1GFP / ::Thy1YFP мыши. (b-c), Ежедневные изображения коробочной области в (a) показаны неоднократно изображенные дендриты (стрелки в б) и дендриты с микроглией(c). В то время как дендритные структуры были позиционно стабильными, некоторые микроглии были отмечены, чтобы перелокировать от их первоначального положения в последующие дни. Такие клетки были идентифицированы с числом (1, 2 или 3). Накануне их позиция была отмечена белой звездочкой, а в последующий день их положение было отмечено желтой звездочкой. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: Долгосрочная еженедельная визуализация микроглии у мышей CX3CR1GFP/е в течение нескольких месяцев. (a-h), Представитель двух-фотон изображения микроглии (зеленый) из CX3CR1GFP / мышь во время повторного изображения с использованием остро помечены сосуды (красный, Rhodamine, 2 мг / м/м) в качестве грубой ориентир для отслеживания микроглиальной сети на срок до 8 недель. В течение периода визуализации сосуды были структурно стабильными. Три небольших региона с сосудами (разбитыми кругами) были выделены, чтобы указать движение микроглиальной соматы в (верхние два пунктирных круга) или из (нижнего круга) этих регионов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: Долгосрочная ежедневная визуализация микроглии у мышей CX3CR1GFP/е после судорог. (a-b),репрезентативные двухфотонные изображения во время ежедневной визуализации одного и того же поля зрения конкретной области мозга с микроглией (зеленой) и острой маркировкой сосудов (красный, родамин, 2 мг/мЛ, т.п.). Изображение начинается после индукции тяжелых припадков с использованием химиосудорожного агента, кайновой кислоты. Сосудистая структура была сохранена в качестве отдельных сосудистых сегментов (стрелки) могут быть определены во времени(a). Однако динамика микроглиальной сети была увеличена в течение первых двух дней после изъятий и возвращается к нормальному уровню на третий день(б). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: Ежедневная визуализация микроглии и NG2- клеток в CX3CR1GFP/ :NG2dsRed/й мышей. ( a )Репрезентативноедвухфотонное изображение микроглии (зеленых) и NG2и ячеек (красный) in vivo. Немаркированные сосуды не различают клетки NG2 (перициты, предположительно идентифицированные со наконечниками стрел) и NG2-клетки, не связанные с сосудами (клетки-предшественники олигодендроцитов или ОПС, предположительно идентифицированные со стрелками). (б) Представитель двух-фотон изображения микроглии (зеленый) и NG2й клетки (красный) в последовательных дней изображения с сосудами помечены родамин. Перициты (наконечники стрел) неподвижны, а ОПС динамичны (от белых до желтых звездочек). Микроглии также динамичны (круги: пунктирные круги представляют собой позицию без микроглии, а заполненный круг представляет собой позицию с соответствующей микроглией). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Появление in vivo двух-фотон изображений открыл возможности для изучения множества клеточных взаимодействий и динамики, которые происходят в здоровом мозге. Первоначальные исследования сосредоточены на использовании открытого черепа краниотомии подход к изображению нейрональных дендритов как острой, так и хронической визуализации37,38. Это также может быть использовано для выяснения нейроиммуна взаимодействий в головном мозге. Этот протокол описывает метод для надежного изображения флуоресцентно помеченных клеток (особенно микроглии, резидентов иммунной клетки мозга) в течение длительных периодов времени в краткосрочной или долгосрочной перспективе. Использование красителей помечены сосудистых и / или флуоресцентно помечены дендритов подробно для грубого или тонкого картирования мозговых областей, представляющих интерес, чтобы повторные, надежные изображения клеток. Хотя линия Thy1YFP предлагается для использования для тонкого картирования мозга, альтернативные подходы могут использовать другие методы или линии мыши для маркировки избранных нейронныхпопуляций,таких как в утробе электропорации39,40, ранние послеродовые инъекции AAV41 или использование TRAP мышей42. Кроме того, хотя корковая визуализация была в центре внимания этой дискуссии, этот подход может быть адаптирован для визуализации глубоких структур мозга в долгосрочной перспективе, а также43.
Для этого протокола операция на каждой мыши может быть завершена за 30-60 мин с начала анестезии до восстановления после анестезии. Во время операции череп тщательно удаляется и заменяется стерильным стекловолокном, которое имплантируется для длительной визуализации по крайней мере через две недели. Смертность крайне редка (менее 5%) в диких мышей, хотя мышей с проблемами свертывания крови, таких как P2Y12R нокаут мышей, показывают более высокую смертность и неудачи хирургии. У таких мышей, кровотечение может сохраняться в течение более длительных периодов времени и мыши могут умереть в течение первых 48 ч краниотомии предположительно из-за осложнений от внутреннего кровотечения. Мыши с имплантированных окон из этого протокола не были замечены, чтобы показать какие-либо признаки инфекции и протокол может быть надежно использован для создания прозрачных окон для долгосрочной визуализации у 50-80% мышей.
Альтернатива нынешнему подходу к хронической имплантации окон, тонкий подход черепа существует для визуализации клеток мозга в неповрежденном мозге неоднократно. Несколько исследований подчеркнули значение и даже приоритет выбора тонкого черепа подход над окном имплантации подход22,23,24,25. Обещание такого подхода не следует игнорировать, как, когда сделано правильно, он противодействует несколько заметных ограничений или недостатков нынешнего подхода, включая отсутствие активации глиальных клеток, низкая текучесть шипов, которая является более физиологической, и отсутствие необходимости в использовании противовоспалительных средств, которые также могут повлиять на физиологию мозга. При выборе подхода к конкретным вопросам исследований эти серьезные ограничения должны быть рассмотрены, прежде чем выбрать подход, подробно описанный в настоящем протоколе.
Однако привлекательность такого подхода четырехкратна. Во-первых, подход к имплантации в черепное окно привлекателен из-за простоты мастерства этой процедуры по отношению к тонкой процедуре черепа. Соответствующее истончение черепа не всегда может быть освоенное экспериментаторами, и если не сделано хорошо, может привести к глиальной активации, ограничивающей его привлекательность. Во-вторых, этот подход к имплантации окна черепа дает мощную глубину ясности структур мозга, как мозг изображен через оптически ясное окно. Окно, доступное для визуализации, также обычно намного больше, чем окно, используемое в тонком подходе черепа, позволяющее получить доступ к большему объему тканей для анализа. В-третьих, как и ясность глубины, этот подход обеспечивает единообразной четкости через окно, так как стекло крышки равномерно тонкий и ясный. Это облегчает сравнение между сеансами и между животными. Для тонкой техники черепа требуется специальная экспертиза, чтобы обеспечить даже ясность по всему окну во время повторных сеансов и между животными. Наконец, этот подход обеспечивает большую гибкость в частоте визуализации от часов, до дней до недель, месяцев и даже лет. Для тонкого подхода черепа, максимум пять повторов было предложено24.
Будущих применений этого подхода много. Во-первых, приложения могут включать выяснение новых нейро-глио-сосудистых взаимодействий в головном мозге как в нормальной физиологии, так и в патологии. Во-вторых, хотя клетки-резиденты обсуждаются в этой процедуре, подход может быть использован для изучения динамики и взаимодействия проникновения иммунных клеток, как это происходит, например, во время острой травмы, хронической инфекции мозга, и / или нейродегенеративных состояний до тех пор, как мыши с соответствующими флуоресцентно помечены клетки доступны. Наконец, этот подход обсуждался главным образом в контексте структурных исследований клеток мозга. Однако, с появлением функциональных изображений,например,с использованием кальция44,45,46 или напряжения методы визуализации47,48, этот подход может быть использован для функциональной визуализации с течением времени в области здравоохранения и болезней.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Мы благодарим сотрудников лаборатории Eyo за обсуждение идей, представленных в этой рукописи. Мы благодарим д-ра Джастина Rustenhoven из лаборатории Кипнис в Университете Вирджинии за подарок NG2DsRed мышей33. Эта работа поддерживается за счет финансирования из Национального института неврологических расстройств и инсульта Национального института здравоохранения в U.B.E (K22 NS104392).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Coverglass (3mm) | Warner Instruments | 64-0726 | |
| Cyanoacrylate glue (Krazy Glue) | Amazon | https://www.amazon.com/Krazy-Glue-Original-Purpose-Instant/dp/B07GSF31WZ/ref=sr_1_2?keywords=krazy+glue&qid=1583856837&s=pet-supplies&sr=8-2 | |
| Demi Ultra LED Curing Light System | Dental Health Products, Inc | 910860-1 | |
| Dental Drill | Osada: www.osadausa.edu | EXL-M40 | |
| Drill Bit | Fine Science Tools | #19008-07 | |
| Eye Ointment | Henry Schien | 1338333 | |
| iBond Total Etch (Primer glue) | Chase Dental Supply (Heraeus Kulzer) | 66040094 | |
| Rhodamine B | Millipore Sigma | 81-88-9 (R6626) | |
| Tetris Evoflow glue (Final glue) | Top Dent (Ivoclar Vivadent) | #595956 | |
| Wahl Brav Mini+ | Amazon | https://www.amazon.com/Wahl-Professional-Animal-BravMini-41590-0438/dp/B00IN24ILE/ref=asc_df_B00IN24ILE/?tag=hyprod-20&linkCode=df0&hvadid=167141013968&hvpos=&hvnetw=g&hvrand=12368793083893626704&hvpone=&hvptwo=&hvqmt=&hvdev=c&hvdvcmdl=&hvlocint=&hvlocphy=9008337&hvtargid=pla-332197544154&psc=1 |
References
- Engle, S. J., Blaha, L., Kleiman, R. J. Best Practices for Translational Disease Modeling Using Human iPSC-Derived Neurons. Neuron. 100 (4), 783-797 (2018).
- Osaki, T., Shin, Y., Sivathanu, V., Campisi, M., Kamm, R. D. In Vitro Microfluidic Models for Neurodegenerative Disorders. Advanced Healthcare Materials. 7 (2), (2018).
- Croushore, C. A., Sweedler, J. V. Microfluidic systems for studying neurotransmitters and neurotransmission. Lab Chip. 13 (9), 1666-1676 (2013).
- Wu, V. W., Schwartz, J. P. Cell culture models for reactive gliosis: new perspectives. J Neuroscience Research. 51 (6), 675-681 (1998).
- Abbott, N. J. Astrocyte-endothelial interactions and blood-brain barrier permeability. Journal of Anatomy. 200 (6), 629-638 (2002).
- Humpel, C. Organotypic brain slice cultures: A review. Neuroscience. 305, 86-98 (2015).
- Pena, F. Organotypic cultures as tool to test long-term effects of chemicals on the nervous system. Current Medicinal Chemistry. 17 (10), 987-1001 (2010).
- Humpel, C.
- Heine, C., Franke, H. Organotypic slice co-culture systems to study axon regeneration in the dopaminergic system ex vivo. Methods in Molecular Biology. 1162, 97-111 (2014).
- Croft, C. L., Futch, H. S., Moore, B. D., Golde, T. E. Organotypic brain slice cultures to model neurodegenerative proteinopathies. Molecualar Neurodegeneration. 14 (1), 45 (2019).
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
- Kerr, J. N., Denk, W.
- Akassoglou, K., et al. In Vivo Imaging of CNS Injury and Disease. Journal of Neuroscience. 37 (45), 10808-10816 (2017).
- Tran, C. H., Gordon, G. R. Astrocyte and microvascular imaging in awake animals using two-photon microscopy. Microcirculation. 22 (3), 219-227 (2015).
- Tvrdik, P., Kalani, M. Y. S. In Vivo Imaging of Microglial Calcium Signaling in Brain Inflammation and Injury. International Journal of Molecular Sciences. 18 (11), 2366 (2017).
- Bennett, F. C., et al. A Combination of Ontogeny and CNS Environment Establishes Microglial Identity. Neuron. 98 (6), 1170-1183 (2018).
- Bohlen, C. J., et al. Diverse Requirements for Microglial Survival, Specification, and Function Revealed by Defined-Medium Cultures. Neuron. 94 (4), 759-773 (2017).
- Mueller, K. L., Hines, P. J., Travis, J.
- Kipnis, J., Filiano, A. J. Neuroimmunology in 2017: The central nervous system: privileged by immune connections. Nature Reviews Immunology. 18 (2), 83-84 (2018).
- Moloney, R. D., Desbonnet, L., Clarke, G., Dinan, T. G., Cryan, J. F. The microbiome: stress, health and disease. Mammalian Genome. 25 (1-2), 49-74 (2014).
- Skonieczna-Zydecka, K., Marlicz, W., Misera, A., Koulaouzidis, A., Loniewski, I. Microbiome-The Missing Link in the Gut-Brain Axis: Focus on Its Role in Gastrointestinal and Mental Health. Journal of Clinical Medicine. 7 (12), 521 (2018).
- Xu, H. T., Pan, F., Yang, G., Gan, W. B. Choice of cranial window type for in vivo imaging affects dendritic spine turnover in the cortex. Nature Neuroscience. 10 (5), 549-551 (2007).
- Pan, F., Gan, W. B. Two-photon imaging of dendritic spine development in the mouse cortex. Developmental Neurobiology. 68 (6), 771-778 (2008).
- Yang, G., Pan, F., Parkhurst, C. N., Grutzendler, J., Gan, W. B. Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice. Nature Protocols. 5 (2), 201-208 (2010).
- Grutzendler, J., Yang, G., Pan, F., Parkhurst, C. N., Gan, W. B. Transcranial two-photon imaging of the living mouse brain. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (9), (2011).
- Jung, S., et al. Analysis of fractalkine receptor CX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion. Molecular Cell Biology. 20 (11), 4106-4114 (2000).
- Liu, Y. U., et al. Neuronal network activity controls microglial process surveillance in awake mice via norepinephrine signaling. Nature Neuroscience. 22 (11), 1771-1781 (2019).
- Stowell, R. D., et al. Noradrenergic signaling in the wakeful state inhibits microglial surveillance and synaptic plasticity in the mouse visual cortex. Nature Neuroscience. 22 (11), 1782-1792 (2019).
- Sun, W., et al. In vivo Two-Photon Imaging of Anesthesia-Specific Alterations in Microglial Surveillance and Photodamage-Directed Motility in Mouse Cortex. Frontiers in Neuroscience. 13, 421 (2019).
- Juczewski, K., Koussa, J., Kesner, A., Lee, J., Lovinger, D. Stress and behavioral correlates in the head-fixed method. bioRxiv. , (2020).
- Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).
- Eyo, U. B., et al. P2Y12R-Dependent Translocation Mechanisms Gate the Changing Microglial Landscape. Cell Reports. 23 (4), 959-966 (2018).
- Nishiyama, A., Komitova, M., Suzuki, R., Zhu, X. Polydendrocytes (NG2 cells): multifunctional cells with lineage plasticity. Nature Review Neurosciences. 10 (1), 9-22 (2009).
- Zhu, X., Bergles, D. E., Nishiyama, A. NG2 cells generate both oligodendrocytes and gray matter astrocytes. Development. 135 (1), 145-157 (2008).
- Hughes, E. G., Kang, S. H., Fukaya, M., Bergles, D. E. Oligodendrocyte progenitors balance growth with self-repulsion to achieve homeostasis in the adult brain. Nature Neuroscience. 16 (6), 668-676 (2013).
- Berthiaume, A. A., et al. Dynamic Remodeling of Pericytes In Vivo Maintains Capillary Coverage in the Adult Mouse Brain. Cell Reports. 22 (1), 8-16 (2018).
- Trachtenberg, J. T., et al. Long-term in vivo imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex. Nature. 420 (6917), 788-794 (2002).
- Holtmaat, A. J., et al. Transient and persistent dendritic spines in the neocortex in vivo. Neuron. 45 (2), 279-291 (2005).
- Wang, C., Mei, L.
- Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection. Journal of Visualized Experiments. (54), e3024 (2011).
- Chakrabarty, P., et al. Capsid serotype and timing of injection determines AAV transduction in the neonatal mice brain. PLoS One. 8 (6), 67680 (2013).
- Guenthner, C. J., Miyamichi, K., Yang, H. H., Heller, H. C., Luo, L. Permanent genetic access to transiently active neurons via TRAP: targeted recombination in active populations. Neuron. 78 (5), 773-784 (2013).
- Pilz, G. A., et al. Live imaging of neurogenesis in the adult mouse hippocampus. Science. 359 (6376), 658-662 (2018).
- Wu, J., et al. Kilohertz two-photon fluorescence microscopy imaging of neural activity in vivo. Nature Methods. 17 (3), 287-290 (2020).
- Yang, W., Yuste, R. In vivo imaging of neural activity. Nature Methods. 14 (4), 349-359 (2017).
- Hannan, S., et al. In vivo imaging of deep neural activity from the cortical surface during hippocampal epileptiform events in the rat brain using electrical impedance tomography. Neuroimage. 209, 116525 (2020).
- Kulkarni, R. U., et al. In Vivo Two-Photon Voltage Imaging with Sulfonated Rhodamine Dyes. ACS Central Science. 4 (10), 1371-1378 (2018).
- Chamberland, S., et al. Fast two-photon imaging of subcellular voltage dynamics in neuronal tissue with genetically encoded indicators. Elife. 6, (2017).
