Denne protokollen beskriver en kronisk kranial vindu implantasjon teknikk som kan brukes til langsgående avbildning av nevro-glio-vaskulære strukturer, interaksjoner, og funksjon i både sunne og syke forhold. Det fungerer som et komplementært alternativ til den transkranielle bildetilnærmingen som, mens den ofte foretrakk, har noen kritiske begrensninger.
Sentralnervesystemet (CNS) reguleres av et komplekst samspill mellom nevronale, glial, stromal og vaskulære celler som letter riktig funksjon. Selv om det å studere disse cellene isolert in vitro eller sammen ex vivo gir nyttig fysiologisk informasjon; fremtredende trekk ved nevralcellefysiologi vil bli savnet i slike sammenhenger. Derfor er det behov for å studere nevrale celler i deres innfødte in vivo miljø. Protokollen som er beskrevet her beskriver repeterende in vivo to-foton av nevrale celler i gnagercortex som et verktøy for å visualisere og studere bestemte celler over lengre perioder fra timer til måneder. Vi beskriver i detalj bruken av den grovt stabile hjernevaskulaturen som et grovt kart eller fluorescerende merket dendritter som et fint kart over utvalgte hjerneområder av interesse. Ved hjelp av disse kartene som en visuell nøkkel, viser vi hvordan nevrale celler kan nøyaktig flyttes for etterfølgende repeterende in vivo-bildebehandling. Ved hjelp av eksempler på in vivo-avbildning av fluorescerende merket microglia, nevroner og NG2+ celler, viser denne protokollen evnen til denne teknikken for å tillate repeterende visualisering av cellulær dynamikk i samme hjerneplassering over lengre tidsperioder, som kan ytterligere bidra til å forstå de strukturelle og funksjonelle svarene til disse cellene i normal fysiologi eller følge patologiske fornærmelser. Der det er nødvendig, kan denne tilnærmingen kobles til funksjonell avbildning av nevrale celler, for eksempel med kalsiumavbildning. Denne tilnærmingen er spesielt en kraftig teknikk for å visualisere den fysiske interaksjonen mellom ulike celletyper av CNS in vivo når genetiske musemodeller eller spesifikke fargestoffer med distinkte fluorescerende koder for å merke cellene av interesse er tilgjengelige.
Sentralnervesystemet (CNS) styres av et komplekst samspill mellom ulike bosatte celletyper, inkludert nevroner, glia og fartøyrelaterte celler. Tradisjonelt ble nevrale celler studert i isolert, co-kultivert1,2,3,4,5 (in vitro) eller utskåret hjernevev (ex vivo)6,7,8,9,10 sammenhenger. Det er imidlertid behov for å ytterligere forstå nevralcelleatferd og interaksjoner i det innfødte miljøet til den intakte hjernen in vivo. I denne protokollen beskriver vi en metode for å kartlegge in vivo-områder av interesse og nøyaktig re-bilde disse områdene i fremtidige bildeøkter for å spore de komplekse interaksjonene mellom de ulike CNS-celletypene over lengre perioder.
Utviklingen av in vivo imaging tilnærminger har gitt betydelige gevinster for riktig forståelse av nevrale funksjon11,12,13,14,15. Spesielt gir disse tilnærmingene flere fordeler fremfor tradisjonelle in vitro- og ex vivo-tilnærminger. For det første har in vivo-bildesystemer fysiologisk relevante celle- og vevskomponenter som vaskulaturen med hele repertoaret av cellulære interaksjoner for å gi en fullstendig forståelse av nevrale nettverksfysiologi. For det andre tyder nylige funn på at når de fjernes fra sitt opprinnelige miljø, mister visse nevrale celler (som microglia) viktige egenskaper ved sin identitet og dermed fysiologi16,17 som kan bevares i in vivo-innstillingen. For det tredje gir in vivo-bildesystemer mulighet for stabile langsgående undersøkelser av uker til måneder til å studere CNS cellulære interaksjoner. Til slutt, gitt det økende beviset for bidrag fra det perifere immunsystemet18,,19 og mikrobiomet20,21 i CNS fysiologi, gir in vivo-systemer en plattform for å avhøre slike bidrag og effekter på CNS-celler. Dermed tilnærminger som bruker langsgående in vivo imaging å studere nevro-immun fysiologi og interaksjoner i friske, skadde, og syke tilstander er et flott komplementært tillegg til tradisjonelle tilnærminger.
I denne protokollen beskriver vi en pålitelig tilnærming til bilde forskjellige celletyper i hjernen, inkludert microglia, nevroner og NG2+ celler som eksempler. To tilnærminger for å visualisere nevrale celler in vivo er utviklet: den tynnede skallen tilnærming og den åpne skallen med en kranievindu tilnærming. Selv om tynnet skallen tilnærminger er i bruk og foretrekkes fordi de overvinne noen av ulempene ved den åpne skallen tilnærming som glial celle aktivering, høyere enn fysiologiske ryggraden dynamikk og bruk av anti-inflammatoriske midler22,23,24,25, tynnet skallen tilnærminger viser også noen kritiske ulemper. For det første er tynningsprosedyren en svært delikat prosedyre som mange forskere finner vanskelig å perfeksjonere, spesielt når re-tynning er nødvendig. Dette er tilfelle fordi det ofte er vanskelig for eksperimenterere å fastslå at de har tynnet skallen til en ~ 20 μm dybde. For det andre, for tilstrekkelige sammenligninger mellom mus, må tynning være identisk, og en rekke tynningssuksess mellom bildeøkter eller mus kan komplisere visualisering av nevrale strukturer. For det tredje, når de brukes til langsgående avbildning, kan dyr med tynnede hodeskaller bare brukes til et begrenset antall økter når re-tynning av skallen er ansatt. Forth, siden noen av beinvevet fortsatt gjenstår, kan klarhet i dybden av bildebehandling bli kompromittert fra den tynnede skallen tilnærming slik at for stor visualisering av mer overfladisk, men ikke så mye med dypere regioner. I lys av dette kan ikke dypere hjernestrukturer som hippocampus, med hell avbildet med den tynnede skallentilnærmingen. Disse hensynene øker behovet for alternative og komplementære tilnærminger som kan overvinne disse bekymringene.
Alternativ til den tynnet skallen tilnærming, den åpne skallen vindu implantasjon tilnærming bruker en prosedyre der skallen er erstattet med en optisk klart glass deksler. Dette gir mulighet for et nesten ubegrenset antall bildeøkter. Videre, gitt utskifting av skallen med glassdekslerslip, gir denne metoden et klart visningsvindu av fluorescerende merkede hjerneceller i omfattende perioder fra timer til måneder, og kan derfor brukes til å studere celleaktivitet og interaksjoner som er relevante for fysiologi, aldring og patologi.
Samlet sett beskriver vi trinn som kan følges for å gjøre implantat kroniske kraniale vinduer gjennom en stereotaxic kraniotomi som muliggjør in vivo-avbildning av hjerneområder av interesse. Vi beskriver også hvordan den brutto stabile hjernevaskulaturen eller de fluorescerende merkede dendrittene kan brukes til å generere et grovt eller fint kart, henholdsvis av hjernens interesseområder. Denne tilnærmingen kan deretter brukes til gjentatt bildebehandling over flere økter. Betydningen av denne teknikken ligger derfor i sin evne til å avbilde de langsiktige endringene eller stasis i hjerneelementer, inkludert arrangement, morfologi og interaksjoner av de forskjellige cellulære typene.
Bruk av in vivo to-foton imaging har åpnet muligheter til å utforske overflod av cellulære interaksjoner og dynamikk som oppstår i den sunne hjernen. Innledende studier fokusert på å bruke den åpne skallen craniotomy tilnærming til bilde nevronale dendritter av både akutt og kronisk imaging37,38. Dette kan også brukes til å belyse nevroimmune interaksjoner i hjernen. Denne protokollen beskriver en metode for pålitelig avbildning av fluorescerende merk…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker medlemmer av Eyo-laboratoriet for å diskutere ideene som presenteres i dette manuskriptet. Vi takker Dr. Justin Rustenhoven fra Kipnis Lab ved University of Virginia for gaven til NG2DsRed mus33. Dette arbeidet støttes av finansiering fra National Institute of Neurological Disorders and Stroke of the National Institute of Health til U.B.E (K22 NS104392).
Coverglass (3mm) | Warner Instruments | 64-0726 | |
Cyanoacrylate glue (Krazy Glue) | Amazon | https://www.amazon.com/Krazy-Glue-Original-Purpose-Instant/dp/B07GSF31WZ/ref=sr_1_2?keywords=krazy+glue&qid=1583856837&s=pet-supplies&sr=8-2 | |
Demi Ultra LED Curing Light System | Dental Health Products, Inc | 910860-1 | |
Dental Drill | Osada: www.osadausa.edu | EXL-M40 | |
Drill Bit | Fine Science Tools | #19008-07 | |
Eye Ointment | Henry Schien | 1338333 | |
iBond Total Etch (Primer glue) | Chase Dental Supply (Heraeus Kulzer) | 66040094 | |
Rhodamine B | Millipore Sigma | 81-88-9 (R6626) | |
Tetris Evoflow glue (Final glue) | Top Dent (Ivoclar Vivadent) | #595956 | |
Wahl Brav Mini+ | Amazon | https://www.amazon.com/Wahl-Professional-Animal-BravMini-41590-0438/dp/B00IN24ILE/ref=asc_df_B00IN24ILE/?tag=hyprod-20&linkCode=df0&hvadid=167141013968&hvpos=&hvnetw=g&hvrand=12368793083893626704&hvpone=&hvptwo=&hvqmt=&hvdev=c&hvdvcmdl=&hvlocint=&hvlocphy=9008337&hvtargid=pla-332197544154&psc=1 |