Summary
प्रोटोकॉल विभिन्न प्रजातियों से संभावित β 2-माइक्रोग्लोबुलिन (β 2 मीटर)प्रतिस्थापनके माध्यम से स्थिर प्रमुख हिस्टोकंपनिबिलिटी कॉम्प्लेक्स (एमएचसी) कक्षा1प्राप्त करने के लिए प्रयोगात्मक तरीकों का वर्णन करता है। एमएचसी की संरचनात्मक तुलना की जांच की गई, जो2मीटर β के मुताबिक़ और विषमता से स्थिर थी।
Abstract
प्रमुख हिस्टोकंपनि कॉम्प्लेक्स (एमएचसी) संक्रामक रोग और ट्यूमर के विकास के खिलाफ एंटीजन पेप्टाइड प्रस्तुति और टी सेल प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। विभिन्न प्रजातियों से विषम β2-माइक्रोग्लोबुलिन (β 2 मीटर)प्रतिस्थापनके साथ जटिल हाइब्रिड एमएचसी I को विट्रो में स्थिर किया जा सकता है। यह स्तनधारियों के MHC I का अध्ययन करने का एक व्यवहार्य साधन है, जब2मीटर β मुताबिक़ उपलब्ध नहीं है। इस बीच, यह संकेत दिया जाता है कि स्तनधारी β 2 मीटरप्रतिस्थापनपेप्टाइड प्रस्तुति को काफी प्रभावित नहीं करता है। हालांकि,2-माइक्रोग्लोबुलिन (β2मीटर) के विषम β के साथ जटिल हाइब्रिड एमएचसी I के लिए कार्यप्रणाली और प्रौद्योगिकी के बारे में सीमित सारांश है। इसके साथ ही, एमएचसी I अध्ययन में विषम β 2 मीटरप्रतिस्थापनकी व्यवहार्यता का मूल्यांकन करने के तरीके प्रस्तुत किए गए हैं। इन तरीकों में अभिव्यक्ति निर्माण की तैयारी शामिल है; समावेशन निकायों का शुद्धिकरण और एमएचसी परिसर का पुनर्मुगुना; प्रोटीन थर्मोस्थेबिलिटी का निर्धारण; क्रिस्टल स्क्रीनिंग और संरचना दृढ़ संकल्प। यह अध्ययन कार्य और MHC I की संरचना को समझने के लिए एक सिफारिश प्रदान करता है, और संक्रामक रोग और ट्यूमर इम्यूनोथेरेपी के दौरान टी सेल प्रतिक्रिया मूल्यांकन के लिए भी महत्वपूर्ण है ।
Introduction
प्रमुख हिस्टोकंपनिटी कॉम्प्लेक्स (एमएचसी) सभी कशेरुकी में मौजूद है और जीन का एक सेट है जो संक्रामक रोगजनकों के लिए सेल-मध्यस्थता प्रतिरक्षा निर्धारित करता है। MHC वर्ग मैं इस तरह के वायरल वायरस संक्रमण पर उत्पादित घटकों के रूप में अंतर्जात पेप्टाइड्स, प्रस्तुत करता है, टी सेल रिसेप्टर्स (TCR) सीडी 8+ टी कोशिकाओं की सतह पर सेलुलर प्रतिरक्षा मध्यस्थता और प्रतिरक्षा विनियमन1में भाग लेने के लिए । पेप्टाइड्स के लिए बाध्यकारी MHC I का एक संरचनात्मक अध्ययन एमएचसी I अणुओं द्वारा पेप्टाइड बाध्यकारी रूपांकनों और प्रस्तुति सुविधाओं के बारे में जानकारी प्रदान करता है, जो सीडी 8+ टी सेल प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं और वैक्सीन विकास के मूल्यांकन में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है ।
चूंकि Bjorkman एट अल2द्वारा MHC I आणविक के पहले क्रिस्टलीकरण और संरचनात्मक दृढ़ संकल्प के बाद से, MHC I अणुओं के क्रिस्टल संरचना विश्लेषण ने इस समझ को बहुत बढ़ावा दिया है कि पेप्टाइड्स एमएचसी आई अणुओं को कैसे बांधते हैं, और भारी चेन और पेप्टाइड्स के साथ प्रकाश श्रृंखलाओं की बातचीत को समझने में मदद करता है। अनुवर्ती अध्ययनों की एक श्रृंखला ने संकेत दिया कि हालांकि प्रकाश श्रृंखला को एन्कोडिंग जीन एमएचसी से जुड़ा नहीं है, लेकिन प्रकाश श्रृंखला एमएचसी I अणुओं3,4की असेंबली के लिए एक महत्वपूर्ण प्रोटीन है। यह कई सतहों पर MHC वर्ग मैं अणुओं के तीन डोमेन के साथ बातचीत करता है । जब प्रकाश श्रृंखला अनुपस्थित होती है, तो MHC श्रेणी के अणुओं को एंटीजन-पेश करने वाली कोशिकाओं की सतह पर सही ढंग से व्यक्त नहीं किया जा सकता है और वे अपने प्रतिरक्षा कार्यों को लागू करने के लिए टीसीआर के साथ बातचीत नहीं कर सकते हैं ।
MHC I एक भारी श्रृंखला (एच चेन) और प्रकाश श्रृंखला (यानी, β2-माइक्रोग्लोबुलिन (β2मीटर) शामिल है, और एक उपयुक्त पेप्टाइड 5 के लिए बाध्यकारी के माध्यम से इकट्ठा कियाजाताहै। एच चेन के एक्सट्रासेलुलर सेगमेंट में α1, α2 और α3 डोमेन6होते हैं। α1 और α2 डोमेन पेप्टाइड बाध्यकारी नाली (PBG) बनाते हैं। β2मीटर श्रृंखला एमएचसी I में असेंबली कॉम्प्लेक्स की एक संरचनात्मक उपइका के रूप में कार्य करती है, जो परिसर की संरचना को स्थिर करती है, और एमएचसी आई एच चेन फोल्डिंग7,8,9के लिए एक आणविक चैपरवन है। अध्ययनों की एक श्रृंखला से पता चला है कि एमएचसी आई एच चेन विभिन्न स्तनधारियों जैसे बल्ले (किरोप्टेरा) (Ptal-N *01:01)10,रीसस मकाक (वानरों) (Mamu-बी * 17)11 (मामू-ए *01)12 (मामू-ए * 02)13,माउस (मूंतथिया) (एच-2केडी)14,1 5,कुत्ता (मांसाहारी) (DLA-88 *50801)16,पशु (Artiodactyla) (BoLA-A11)17 और घोड़े (Periss (Eqca-N *00602 और Eqca-N *00601)18 विषम β 2 मीटर(तालिका 1)के साथ गठबंधन कर सकते हैं । इन संकर अणुओं का उपयोग अक्सर संरचनात्मक और कार्यात्मक अध्ययनों में किया जाता है। हालांकि,2मीटर के विषम β के साथ हाइब्रिड एमएचसी I के कार्यात्मक और संरचनात्मक अध्ययन की कार्यप्रणाली अभी तक संक्षेप में नहीं है। इस बीच, विभिन्न टैक्सा के बीच2मीटर β इंटरचेंज्ड के लिए संरचनात्मक आधार अस्पष्ट रहता है ।
इसके साथ ही, एमएचसी आई एक्सप्रेशन, रिवलनिंग, क्रिस्टलाइजेशन, क्रिस्टल डेटा कलेक्शन और स्ट्रक्चर वाजुलेशन की प्रक्रिया संक्षेप में होती है । इसके अलावा, विभिन्न प्रजातियों से β 2 मीटर के संभावित प्रतिस्थापन का विश्लेषणएमएचसीकी संरचनात्मक संरचना की तुलना के माध्यम से किया जाता है जो2मीटर β अनुरूप और विषमता से स्थिर होता है। ये तरीके आगे MHC I संरचनात्मक अध्ययन और सीडी 8+ टी सेल प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया कैंसर और संक्रामक रोग में मूल्यांकन के लिए उपयोगी हो जाएगा ।
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Protocol
1. अभिव्यक्ति निर्माण की तैयारी
- एनसीबीआई डाटाबेस से चमगादड़ से MHC वर्ग I जीन (भविष्यवाणी जीन सहित) के दृश्यों को पुनः प्राप्त करें ।
- इम्यूनो बहुरूपता डाटाबेस (आईपीडी) (www.ebi.ac.uk/ipd/mhc) और यूनिप्रोट डेटाबेस (www.uniprot.org) से उच्च स्तनपायी MHC I भारी श्रृंखला दृश्यों को पुनः प्राप्त करें।
- घुलनशील एमएचसी परिसरों को प्राप्त करने के लिए, साइटोसोलिक और ट्रांसमेम्ब्रेन क्षेत्रों को हटाने के लिए दृश्यों को म्यूटेग्न करें।
- चमगादड़ Ptal-N * 01:01 (GenBank नहीं) के ectodomains encoding जीन क्लोन । KT98792919)(अवशेष 1-277) और बल्लेबाजी β2मीटर (GenBank नहीं । XP_006920478.1) (अवशेष 1-98) पीईटी-28ए वैक्टर (नोवाजेन, बीजिंग, चीन) में क्रमशः ।
- एक संशोधित pET-28a वेक्टर के NcoI और EcoR1 साइटों के बीच अनुकूलित (एस्चेरिचिया कोलाईके लिए) दृश्यों को डालें।
- मानव β2मीटर अभिव्यक्ति प्लाज्मिड का निर्माण जैसा कि पहले20वर्णित है ।
2. पेप्टाइड संश्लेषण
- पेप्टाइड्स भविष्यवाणी
- जैसा कि पहले10वर्णित है, पेप्टाइड्स के लिए स्क्रीन करने के लिए जो Ptal-N * 01:01 से बांध सकता है, बल्ले से संबंधित वायरस hendra वायरस (HeV) के प्रोटीन निकायों का उपयोग कर उंमीदवार पेप्टाइड्स की भविष्यवाणी । ऑनलाइन सर्वर से संरचनात्मक मॉडल के आधार पर उच्च आत्मीयता पेप्टाइड प्राप्त करने के लिए, NetMHCpan 4.0 सर्वर (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCpan/)21 और रोसेटा फ्लेक्सपेपडॉक22 चयनित पेप्टाइड अंश में संभावित बाध्यकारी की भविष्यवाणी की। इसके अलावा, बिमास सहित अन्य सॉफ्टवेयर और डेटाबेस, प्रतिरक्षा एपिटोप डाटाबेस (आईईडीबी), नेटसीटीएल 1.2 और SYFPEITHI का भी उपयोग किया जा सकता है, उन सभी ने पेप्टाइड-एमएचसी श्रेणी I बाइंडिंग एफ़िनिटी, एंटीजन प्रोसेसिंग (टीएपी) परिवहन दक्षता से जुड़े ट्रांसपोर्टर, प्रोटेस्टोमल सी-टर्मिनल क्लीवेज और पेप्टाइड-एचएलए श्रेणी के अणुओं के आधे समय की भविष्यवाणी को अपने readouts में एकीकृत किया जा सकता है।
- उच्च बाध्यकारी पेप्टाइड्स की भविष्यवाणी करने के लिए, नेटएमएचसीपन और रोसेटा फ्लेक्सपेडॉक सर्वर दोनों का उपयोग करें।
नोट: दुर्भाग्य से, न तो उत्पादित भविष्यवाणियों प्रयोगात्मक डेटा मिलान किया । इससे यह संकेत मिल सकता है कि वर्तमान एमएचसी बाध्यकारी पेप्टाइड भविष्यवाणियां चमगादड़ जैसे गैर-मानव और गैर-माउस स्तनधारियों के लिए उपयुक्त नहीं थीं, जिनमें पेप्टाइड बाध्यकारी का एक अलग तरीका हो सकता है । इसलिए, हमें उच्च आत्मीयता पेप्टाइड्स प्राप्त करने के लिए व्यापक विश्लेषण के लिए विभिन्न भविष्यवाणी सॉफ्टवेयर और प्रायोगिक परिणामों को संयोजित करने की आवश्यकता है।
- पेप्टाइड्स तैयारी और संरक्षण
- कस्टम पेप्टाइड्स पैदा करने के बजाय, विशेष सेवा प्रदाताओं का उपयोग करें। पेप्टाइड भविष्यवाणी उपकरणों के बाद व्यावसायिक रूप से सभी पेप्टाइड्स खरीदें, जिनमें उच्च बाध्यकारी स्कोर होता है। एचपीएलसी और मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा पेप्टाइड शुद्धता और 95% होना निर्धारित किया गया था।
- सभी खरीदे गए पेप्टाइड्स को −80 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीज-सूखे पाउडर के रूप में स्टोर करें और उपयोग से पहले डाइमेथिल सल्फॉक्साइड (डीएमएसओ) में भंग करें।
3. समावेशन निकायों का शुद्धिकरण
- ई. कोलाई का परिवर्तन
- बैट MHC I Ptal-N * 01:01 H श्रृंखला, या मानव β2मीटर या बैट β 2 मीटर में 100 μLBL21(DE3) ई. कोलाईयुक्त प्लाज्मिड के 10 एनजी बदलें । 30 मिनट तक बर्फ में नहाएं।
- 90 एस के लिए 42 डिग्री सेल्सियस पर हीट शॉक, इसके बाद 2 मिनट तक बर्फ में स्नान किया।
- lysogeny शोरबा के ८०० μL जोड़ें (पौंड: खमीर निकालने, ट्राइप्टोन और NaCl; सामग्री की मेजदेखें) ३.१.२ कदम और 20 मिनट के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक कमाल के मंच पर २०० घूर्णन (आरपीएम) पर हिला ।
- इसी एंटीबायोटिक प्रतिरोध (एम्पिसिलिन: 100 एनजी/एमएल) युक्त प्लेट में बैक्टीरियल सस्पेंशन के 100 माइक्रोन लागू करें, जो पिछले निर्माणों के समान हैं।
- टीका संस्कृतियों
- एंटीबायोटिक माध्यम (ampicillin: १०० एनजी/एमएल) और संस्कृति के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर पौंड के 3 ml में एक एकल हाल ही में बदल जीवाणु क्लोन उठाओ, जबकि एक कमाल के मंच पर २०० आरपीएम पर मिलाते हुए बैक्टीरिया को सक्रिय करने के लिए । संस्कृतियों को देर रात में टीका लगाया जा सकता है, अगली सुबह प्रेरण के लिए तैयार होना चाहिए।
- एक रात पहले, एंटीबायोटिक माध्यम (एम्पिसिलिन: 100 एनजी/एमएल) के साथ एलबी के 50 मिलील में सक्रिय बैक्टीरियल स्टॉक के 500 माइक्रोन को स्थानांतरित करें और 200 आरपीएम पर मिलाते हुए रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। अगले टीका तैयार करते समय सुविधा के लिए, अगले तैयारी की आवश्यकता होने तक −80 डिग्री सेल्सियस पर 1 एमएल एलिकोट्स (40% ग्लाइसरोल के 500 माइक्रोन के साथ संस्कृति के 500 माइक्रोन) में शेष सक्रिय बैक्टीरियल स्टॉक को फ्रीज करें।
- बड़ी मात्रा में पुनर्संयोजन प्रोटीन उत्पन्न करने के लिए, बैक्टीरियल तैयारी को एंटीबायोटिक माध्यम (एम्पिसिलिन: 100 एनजी/एमएल) के साथ 1:100 के अनुपात में एलबी के 2 एल में स्थानांतरित करें, 200 आरपीएम पर मिलाते हुए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। संस्कृति जब तक 600 एनएम पर 0.6 का एक अवशोषण प्राप्त किया जाता है। प्रोटीन अभिव्यक्ति के प्रेरण के लिए फ्लास्क में 1 एमएमएम आइसोप्रोपिल-1-थिओ-β-डी-गैलेक्टोइरानोसाइड (आईपीटीजी) (विभिन्न एमएचसी के लिए आईपीटीजी की एकाग्रता भिन्न होती है, ज्यादातर 0.1 mm-1 mM के बीच) जोड़ें।
- हार्वेस्ट बैक्टीरिया
- बैक्टीरिया को 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए 5000 x ग्राम पर सेंट्रलाइज बोतलों और सेंट्रलाइज में स्थानांतरित करें। अब से सभी कदम 4 डिग्री सेल्सियस पर किया जाना चाहिए।
- फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) के 60 एमएल में बैक्टीरिया को फिर से रीसुस्ल करें और अल्ट्रासोनिक सेल बाधित द्वारा व्यक्त रिकॉम्बिनेंट प्रोटीन को मुक्त करें।
नोट: सामान्य तौर पर, हम इस मशीन पर सेट कार्यक्रम अल्ट्रासोनिक 6S, अंतराल 12S, 300 डब्ल्यू, 99 बार है).
- समावेशन निकायों की शुद्धि
- 30 मिनट के लिए 12,000 x ग्राम पर सोनिकेटेड बैक्टीरियल सस्पेंशन को सेंट्रलाइज करें। सुपरनैट को त्यागें और गोली को वाशिंग बफर (0.5% ट्राइटन-100, 50 एमएम ट्रिस पीएच 8.0, 300 mM NaCl, 10 mM EDTA, 10 mM DTT) की उचित मात्रा में फिर से खर्च करें। इस प्रक्रिया को एक बार और दोहराएं।
- 10-20 मिनट के लिए 12,000 x ग्राम पर सेंट्रलाइज। सुपरनैट को त्यागें और पुनर्संपन्न बफर (50 एमएम ट्रिस पीएच 8.0, 100 एमएमएम एनएसीएल, 10 एमएम ईडीटीए, 10 एमएम डीटीटी) में समावेशन निकायों को फिर से खर्च करें। समावेशन निकायों की शुद्धता का परीक्षण करने के लिए एसडीएस-पेज के लिए 20 माइक्रोन नमूना (पुनर्संपियन बफर में शामिल किए गए निकाय) निकालें।
- 10-20 मिनट के लिए 12,000 एक्स ग्राम पर शेष तैयारी को सेंट्रलाइज करें। सुपरनेट को त्याग दें। शामिल किए गए निकायों वाले गोली का वजन करें और विघटन बफर (6 एम गुआ-एचसीएल, 10% ग्लिसरीन, 50 एमएम ट्रिस पीएच 8.0, 100 mm NaCl, 10 mM EDTA) को 30 मिलीग्राम/एमएल की अंतिम एकाग्रता में जोड़ें। 4 डिग्री सेल्सियस पर एक चुंबकीय उभारकर का उपयोग करके धीरे-धीरे हिलाएं जब तक कि विघटन बफर में समावेशन निकाय भंग न हो जाएं।
- 10-20 मिनट के लिए सेंट्रलाइज 12,000 एक्स ग्राम। समावेशन निकायों को −20 डिग्री सेल्सियस या −80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
नोट: समावेश निकायों के शुद्धिकरण के साथ आगे बढ़ने से पहले, पुष्टि करें कि पुनर्संयोजन प्रोटीन की प्रेरण और अभिव्यक्ति सफल रही। प्रोटीन जेल पर प्रत्येक संस्कृति (आईपीटीजी प्रेरण से पहले और बाद में लिया गया) से नमूने चलाएं; 15% एसडीएस-पेज (एसडीएस-पेज केंद्रित गम: एच2ओ, 30% एक्रिलमाइड, 1 एम ट्रिस-एचसीएल पीएच 6.8, 10% एसडीएस, 10% एपीएस और TEMED; एसडीएस-पेज सेपरेशन जेल: एच2ओ, 30% एक्रिलैमाइड, 1.5 एम ट्रिस-एचसीएल पीएच 8.8, 10% एसडी, 10% एपीएस और टेमीडी; β2मीटर के लिए सामग्री की तालिका देखें, एच श्रृंखला के लिए 10% एसडीएस-पेज।
4. एमएचसी परिसर की रीफोल्डिंग
नोट: समावेशन निकायों की दक्षता प्राप्त प्रोटीन की उपज को प्रभावित करेगी। तह बहुलीकरण के साथ प्रतिस्पर्धा करता है, इसलिए आम तौर पर यह स्वीकार किया जाता है कि कम प्रोटीन सांद्रता पर पुनर्गुनारण सबसे सफल तरीका है। इस पेपर में इन्क्लूजन बॉडीज कंसंट्रेशन 30 एमजी/एमएल है ।
- रिपल्डिंग बफर तैयार करें।
- प्रोटीन के आधार पर रिवलन बफर की संरचना को अलग करें। उदाहरण के लिए, पीएच, आयनिक ताकत, रेडॉक्स की स्थिति और लिगामेंट्स की उपस्थिति पुनर्मुस्लन परिणामों को प्रभावित करेगी। सबसे आम 50-500 mM की NaCl एकाग्रता के साथ एक तटस्थ पीएच पर Tris या HEPES आधारित बफ़र्स का उपयोग करने के लिए है, लेकिन यह भी लक्ष्य प्रोटीन पर निर्भर करता है । निम्नलिखित इस लेख में उपयोग किया जाने वाला रिवलनिंग बफर फॉर्मूला है।
- 100 एमएम ट्रिस-एचसीएल पीएच 8.0, 400 एमएम एल-आर्जिनिन, 2 एमएम ईडीटीए-2एनए के साथ फोल्डिंग बफर तैयार करें।
- बफर को 250-300 एमएल फ्लास्क में 4 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा करें, और फिर 5 एमएम कम ग्लूटाथिएक (जीएसएच) और 0.5 एमएम ऑक्सीडाइज्ड ग्लूटाथिएक (जीएसएसजी) जोड़ें। समावेशन निकायों और पेप्टाइड्स को जोड़ने से पहले 10-20 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर एक चुंबकीय उभारकर का उपयोग करके धीरे-धीरे हिलाएं।
- एमएचसी एच चेन और β2मीटर का इंजेक्शन और कमजोर पड़ना
नोट: जिस तापमान पर पुनर्मुर्णीकरण किया जाता है, वह भिन्न हो सकता है, हालांकि आम तौर पर, एकत्रीकरण को कम करने के लिए, 4 डिग्री सेल्सियस सबसे अच्छा है। हम प्रोटीन को फिर से दोगुना करने के लिए कमजोर पड़ने का उपयोग करते हैं।- 1 एमएल सिरिंज से सुई का उपयोग करके, क्रमशः दो रिवलन बफ़र्स (1 लीटर प्रत्येक) में2मीटर समावेश निकायों या2मीटर समावेशन निकायों के 1 एमएल इंजेक्ट करें। तेजी से और कुशल कमजोर पड़ने को प्राप्त करने के लिए सख्ती से घूर्णन सरगर्मी रॉड के पास इंजेक्ट करें। β2मीटर अपेक्षाकृत आसान है और एच श्रृंखला के अभाव में भी स्थिर रहता है।
- β2मीटर को रिवलन समाधान में भंग करने के बाद, डीएमएसओ में पेप्टाइड्स (5 मिलीग्राम/एमएल) को भंग करें और जल्दी से 200 माइक्रोन को रिवलनिंग समाधान में इंजेक्ट करें। एच चेन जोड़ने से पहले 10-20 मिनट के लिए धीरे-धीरे हिलाएं।
- 2 मीटर के लिए ऊपर वर्णित एकही प्रक्रिया β साथ एच चेन इंजेक्ट करें। एच श्रृंखला बहुत अस्थिर है; इसलिए, इंजेक्शन का क्रम काफी महत्वपूर्ण है। एच चेन इन्ल इन्लूजन बॉडी के 3 एमएल को क्रमशः 2 मीटर या2मीटर के साथ दो अलग-अलग रिफोल्डिंग बफ़र्स(1लीटर प्रत्येक) में इंजेक्ट करें। प्रोटीन की पूरी मात्रा के एकल अनुप्रयोग के बजाय छोटे aliquots के लगातार इंजेक्शन refolded MHC की उपज बढ़ जाती है । 8-10 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर आगे बढ़ने के लिए पुनर्गुनाल्डिंग की अनुमति दें।
- पुन: मुड़ा हुआ प्रोटीन की एकाग्रता
- रिवलन प्रोटीन की एकाग्रता के लिए 10 केडीए एमएमसीओ झिल्ली के साथ एक दबाव वाले कक्ष में अल्ट्राफिल्ट्रेशन का उपयोग करें। यह विधि सुविधाजनक है और बफर एक्सचेंज के साथ जोड़ा जा सकता है। चैंबर में एक्सचेंज बफर (20 एमएम ट्रिस-एचसीएल, 50 mM NaCl पीएच 8.0) जोड़ें और 30-50 एमएल की अंतिम मात्रा में ध्यान केंद्रित करें।
- एक अपकेंद्रित्र ट्यूब के लिए रिवलन समाधान स्थानांतरित करें, 15 मिनट के लिए 15 मिनट के लिए 12,000 x g पर 4 डिग्री सेल्सियस पर स्पिन करने के लिए उपजी को हटाने के लिए।
- ध्यान से सुपरनेट स्थानांतरित करें और ~ 1 एमएल की अंतिम मात्रा में आगे ध्यान केंद्रित करें।
- 10-20 मिनट के लिए 12,000 xग्राम पर सेंट्रलाइज। सुपरनेट को बाँझ ट्यूब में स्थानांतरित करें और 10/300 जीएल आकार-अपवर्जन कॉलम का उपयोग करके प्रोटीन को शुद्ध करें।
- चोटी पर नमूने ले लीजिए और एसडीएस-पेज (15% पॉलीएक्रेलैमाइड जेल) का उपयोग करके उनका विश्लेषण करें।
- MHC परिसर चोटी ले लीजिए और 15 मिलीग्राम/एमएल की एक अंतिम एकाग्रता के लिए ध्यान केंद्रित ।
- क्रिस्टलीकरण के लिए परिसर को 7.5 मिलीग्राम/एमएल और 15 मिलीग्राम/एमएल तक पतला करें।
5. क्रिस्टलीकरण, डेटा संग्रह, और प्रसंस्करण
- बैठे ड्रॉप वाष्प प्रसार तकनीक का उपयोग कर जटिल एमएचसी और पेप्टाइड का क्रिस्टलीकरण करें।
- वाणिज्यिक क्रिस्टल किट के साथ Ptal-N * 01:01/पेप्टाइड परिसरों स्क्रीन (जैसे, क्रिस्टल स्क्रीन किट I/II, इंडेक्स स्क्रीन किट, PEGIon किट I/II, और PEGRx किट) ।
- परिणामी समाधान को सील करें और 4 या 18 डिग्री सेल्सियस पर जलाशय समाधान के 100 माइक्रोन के खिलाफ बराबरी करें।
- 3 दिन, 1 सप्ताह, 2 सप्ताह, 1 महीने, 3 महीने और 6 महीने के लिए संस्कृति में क्रिस्टल वृद्धि का निरीक्षण करें। क्रिस्टल प्लेट में प्रत्येक बूंद क्रिस्टल है देखने के लिए एक माइक्रोस्कोप का प्रयोग करें।
नोट: Ptal-N * 01:01/HeV1(b.2मीटर) क्रिस्टल ०.२ एम NaCl, ०.१ एम बीआईएस-Tris (पीएच ५.५), और 25% (w/v) पॉलीथीन ग्लाइकोल ३,३५० में ७.५ मिलीग्राम/एमएमएल की एकाग्रता पर मनाया गया । Ptal-N *01:01/HeV1 (hο2मीटर) क्रिस्टल 0.1 एम HEPES, पीएच 7.0, 2% w/v पॉलीथीन ग्लाइकोल 3,350 में 7.5 मिलीग्राम/एमएल की एकाग्रता पर देखा गया। - क्रायोजेनिक सुरक्षा के लिए, क्रिस्टल को 20% ग्लाइस्रोल वाले भंडारण समाधान में स्थानांतरित करें और फिर 100 के गैसीय नाइट्रोजन स्ट्रीम में तेजी से ठंडा करें।
- शंघाई सिंक्रोट्रॉन विकिरण सुविधा (शंघाई, चीन) के बीमलाइन BL19U से एक्स-रे विवर्तन डेटा एकत्र करें।
6. संरचना निर्धारण और विश्लेषण
- उच्च-रिज़ॉल्यूशन संरचनात्मक डेटा के साथ, डेंज़ो प्रोग्राम और एचकेएल2000 सॉफ्टवेयर पैकेज (https://hkl-xray.com/)23का उपयोग करके संग्रह की ताकत को संसाधित और स्केल करें।
- प्रोटीन डेटा बैंक (पीडीबी) में एक बेहतर प्रारंभिक मॉडल चुनने के बाद, CCP424 (http://www.ccp4.ac.uk/) में कार्यक्रम Phaser MR के साथ आणविक प्रतिस्थापन का उपयोग कर संरचनाओं का निर्धारण करें । उपयोग किया गया मॉडल प्रोटीन डेटा बैंक (पीडीबी) कोड 5F1I के साथ संरचना निर्देशांक था।
- प्रारंभिक संयुक्त शोधन के लिए परिष्कृत एक्स-रे मॉडल का उपयोग करें। अकेले एक्स-रे और संयुक्त न्यूट्रॉन और एक्स-रे शोधन के लिए क्रमशः फेनिक्स रिफाइन और संयुक्त मोड का उपयोग करें।
- शोधन के हर दौर के बाद, कूट 25 (https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/) में फो − एफसी और 2Fo − एफसी सकारात्मक परमाणु घनत्व नक्शे के खिलाफ मॉडल को मैन्युअल रूप से देखें। यह पानी और कुछ डी परमाणुओं के उचित प्लेसमेंट की सुविधा प्रदान करता है। संरचनाओं के सभी आंकड़े PyMOL (http://www.pymol.org/) द्वारा बनाए गए थे।
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Representative Results
पिछले काम ने बताया कि हेव-व्युत्पन्न हेवी1 (DFANTFLP) पेप्टाइड को Ptal-N * 01:0110, 19द्वारा प्रस्तुत किया गया था। इसकेसाथ, 2 मीटर (bο 2 मीटर) और विषम मानव β β 2 मीटर (hο2मीटर) (चित्रा 1C, 1D) के साथ समरूप बल्ले के साथ Ptal-N * 01:01 के लिए इस पेप्टाइडकी बाध्यकारी क्षमता का मूल्यांकन किया गया था। उच्च संकल्प वाले क्रिस्टल क्रमशः(चित्रा 1ई, 1F)का गठन किया गया था। एक क्रिस्टल Ptal-N * 01:01/HeV1 परिसर से बना है, जो bο 2 मीटर के साथ renaturation के माध्यम सेगठनकिया गया था, और संकल्प २.३१ Å है । एक क्रिस्टल Ptal-N * 01:01/HeV1 परिसर से बना है, जो hο 2 मीटर के साथ renaturation के माध्यम सेगठनकिया गया था, और संकल्प १.६ Å है । Ptal-N *01:01/HeV1 परिसर सफलतापूर्वक दोनों bο 2 मीटर और hο2मीटर(चित्रा 1C, 1D)के साथ renaturation के माध्यम से गठन किया गया था । इस संदर्भ में, हमने दिखाया कि Ptal-N * 01:01/HeV1 परिसर β2मीटर(चित्रा 1A)और एच-2Kडी की उपस्थिति के बिना नहीं बनाया गया था जो एच2मीटर(चित्रा 1B)के माध्यम से सही ढंग से गुना होता है।
इसके बाद Ptal-N * 01:01/HeV1/bο2मीटर और Ptal-N * 01:01:01/HeV1/hο 2 m कीसंरचनाओंका विश्लेषण किया गया । Ptal-N * 01:01/HeV1/bο2मीटर संरचना में, अवशेष R3, H31, Q34, D53, W60, b63 केY63पीबीजी और अवशेषों Q8, Y10, R12, N24, Y28, N98, N99 एच श्रृंखला के α3 डोमेन के लिए बाध्य के नीचे के माध्यम से एच श्रृंखला अवशेषों के लिए बाध्य । Ptal-N * 01:01/HeV1/bο2मीटर परिसर के समान, Ptal-N * 01:01/HeV1/hο2मीटर संरचना में, संरक्षित अवशेषों H31, D53, W60, h12 मीटर के Y63 जो bο2मीटर के अनुरूप है, PBG केनीचेके साथ संपर्क किया और अवशेषों Q8, Y10, R12, N24 जोb 1 00मीटर के अनुरूप α3 डोमेन(चित्रा 2A, 2B)के लिए बाध्य ।
समग्र संरचनाओं में Ptal-N * 01:01/HeV1/bο2मीटर और Ptal-N * 01:01/HeV1/hο2मीटर, एच चेन (α1α2 PBG बनाने) के अवशेषों के औसत रूट-मीन-स्क्वायर विचलन (आरएमएसडी) सभी सी α परमाणु सुपरपोजिशन(चित्रा 3 ए)के तहत 0.248 था। इस निष्कर्ष से संकेत मिला कि इन दोनों परिसरों में कोई अंतर नहीं है । विभिन्न β2मीटर के साथ परिसरों में समान पेप्टाइड्स की संरचनाओं की तुलना की गई थी। पेप्टाइड संरेखण की संरचना से पता चला है कि इन दोनों परिसरों में हेवी 1 पेप्टाइड्स की संरचना काफी समान थी(चित्रा 3B)। इसके अलावा, एच-2डीबी द्वारा प्रस्तुत जीपी33 (KAVYNFATM) की संरचनाएं और माउस के साथ2मीटर (mο2मीटर) या एच2मीटर के β जटिल गठबंधन किए गए थे। एच-2डीबी के α1α2 PBG का आरएमएसडी 0.283 था और इन दोनों संरचनाओं में पेप्टाइड्स की समग्र संरचनाएं भी समान थीं(चित्रा 3सी, 3 डी)। इन आंकड़ों से पता चलता है कि β2मीटरप्रतिस्थापनके बीच 2 मीटर और2मीटर, और mο2मीटर और hο2मीटर प्रस्तुत पेप्टाइड्स की संरचना को प्रभावित नहीं करते हैं।
अनुक्रम संरेखण से पता चला है कि विभिन्न प्रजातियों से β2मीटर के अमीनो एसिड अत्यधिकसंरक्षित (चित्रा 4)हैं । विभिन्न प्रजातियों से2मीटर β के विश्लेषण के बाद पता चला है कि β2मीटर के अमीनो एसिड के अधिकांश जो एमएचसी I की एच श्रृंखला के साथ हाइड्रोजन बांड बना रहे थे(चित्रा 4, तालिका 2) संरक्षितथे । इस बीच, विविध अवशेषों को भी स्तनधारियों में इसी तरह के रासायनिक गुणों के साथ अमीनो एसिड थे । हालांकि, एमएचसी की एच श्रृंखला के लिए2मीटर β में शामिल प्रमुख अवशेषों ने मुर्गियों, मछली और उभयचर(चित्रा 4)में बहुरूपता दिखाई।
तालिका 1: विभिन्न स्तनधारी2मीटर β विषमता के साथ गठबंधन करते हैं। कृपया इस टेबल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।
तालिका 2: विभिन्न प्रजातियों के एमएचसी I में विषम β2मीटर और भारी श्रृंखला के बीच हाइड्रोजन बांड बातचीत। कृपया इस टेबल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 1: घुलनशील और पुन: मुड़ा हुआ Ptal-N * 01:01/HeV1 जटिल प्रोटीन और विकृति विश्लेषण के लिए इस्तेमाल क्रिस्टल की तस्वीरें की शुद्धि । एम केडीए में आणविक वजन मार्कर है। पी 1 समुच्चय है। पी2 एमएचसी कॉम्प्लेक्स है। P3 β2मीटर है (ए)Ptal-N * 01:01/HeV1 परिसर β2मीटर की उपस्थिति के बिना नहीं बनाया गया था ।(बी)एच-2Kडी परिसर के साथ renaturation के माध्यम सेगठनकिया गया था 2 मीटर(C)Ptal-N *01:01/HeV1 परिसर बी2m के साथ renaturation के माध्यम से गठन किया गया था । प्रोफ़ाइल 75.0, 44.0, और 13.7 केडीए के आणविक द्रव्यमान मानकों की अनुमानित स्थिति के साथ चिह्नित है। (घ)Ptal-N *01:01/HeV1 परिसर कागठन 2मीटर के साथ रेनेट्यूशन के माध्यम से किया गया था ।(ई)क्रिस्टल Ptal-N * 01:01/HeV1 परिसर से बना है, जो b2मीटर के साथ renaturation के माध्यम से गठन किया गया था । काला तीर एक्स-रे विवर्तन के दौरान डेटा एकत्र करने के लिए उपयोग किए जाने वाले क्रिस्टल का प्रतिनिधित्व करता है। (F)क्रिस्टल Ptal-N * 01:01/HeV1 परिसर से बना है जो hο 2 मीटर के साथ renaturation के माध्यम सेगठनकिया गया था । काला तीर एक्स-रे विवर्तन के दौरान डेटा एकत्र करने के लिए उपयोग किए जाने वाले क्रिस्टल का प्रतिनिधित्व करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 2: हाइब्रिड MHC I परिसरों में β2मीटर और भारी श्रृंखला के बीच हाइड्रोजन संबंध। (ए)Ptal-N * 01:01/b 2 m/HeV1 और(B)Ptal-N *01:01/h2 m/HeV1 MHC परिसरों में β2मीटर और एच चेन के बीच हाइड्रोजन संबंध । हाइड्रोजन बॉन्ड इंटरैक्शन का प्रतिनिधित्व एक काले बिंदीदार रेखा द्वारा किया जाता है। वर्ग में तेजी से बढ़ी क्षेत्र का प्रतिनिधित्व करता है और इसी रंग के बक्से में सही करने के लिए दिखाया गया है । लाल प्रतिनिधित्व करता है कि2मीटर β मुताबिक़ और2मीटर β विषम एच चेन के साथ हाइड्रोजन बांड बनाने के लिए एक ही अमीनो एसिड का उपयोग करते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 3: एमएचसी परिसर की इसी तरह की संरचना और हाइब्रिड एमएचसी I परिसरों में एंटीजेनिक पेप्टाइड्स। (A)Ptal-N * 01:01:01/bο2मीटर (ग्रीन) और Ptal-N * 01:01/hο 2 मीटर (ग्रे) केα1α2डोमेन की अधिष्ठान । (ख)प्रत्येक Ptal-N *01:01 अणु के α1α2 डोमेन के अधिदक्षेणता के साथ HeV1 पेप्टाइड का अधिदक्षेणता । HeV1 पेप्टाइड को Ptal-N * 01:01/bο2मीटर में गुलाबी और Ptal-N * 01:01/hο2मीटर में पीले रंग के रूप में दर्शाया गया है ।(ग)एच-2डीबी/माउस β 2 मीटर (एमडब्ल्यू2मीटर) (हरा) औरएच-2डीबी /एच-2 मीटर (ग्रे) केα1α2डोमेन का अधिरंपोषण । (घ)प्रत्येक एच-2डीबी अणु के α1α2 डोमेन के अधिगतस्थिति के साथ gp33 पेप्टाइड का अधिदशन । पेप्टाइड gp33 एच-2डीबी/mο 2 मीटर में नीले रंग के रूप में और एच-2डीबी में गुलाबी के रूप में/hο2मीटर का प्रतिनिधित्व किया है कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 4: अन्य प्रजातियों के β2मीटर के साथ hο2मीटर की संरचना आधारित अनुक्रम संरेखण। काले तीर β-किस्में निरूपित करते हैं। लाल रंग में हाइलाइट किए गए अवशेषों को पूरी तरह से संरक्षित किया जाता है, और नीले बक्से में अवशेष अत्यधिक होते हैं (>80%) संरक्षित। पीले त्रिकोण β2मीटर और एच चेन के बीच बातचीत के लिए प्रमुख अमीनो एसिड का प्रतिनिधित्व करते हैं। यह अनुक्रम संरेखण क्लूस्टल एक्स32 और ईएसप्रिप्ट33का उपयोग करके उत्पन्न किया गया था । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
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Discussion
विभिन्न टैक्सा से विषम तांतग्रस्तता के माध्यम से एक हाइब्रिड प्रोटीन परिसर का निर्माण कार्यात्मक और संरचनात्मक जांच के लिए एक आम रणनीति है जब समरूप परिसर उपलब्ध नहीं है, जैसे कि एमएचसी I और उसके लिगामेंट्स में। हालांकि, कार्यप्रणाली और प्रौद्योगिकी के बारे में सीमित सारांश है। इसके साथ ही, बैट MHC I, Ptal-N * 01:01 की संरचना, bο2मीटर या hο2मीटर द्वारा स्थिर विश्लेषण किया गया था । β2मीटर के प्रमुख अमीनो एसिड को बल्ला और मानव के बीच संरक्षित पाया गया । आगे के विश्लेषण पर,एमएचसीकी एच श्रृंखला के लिए β 2 मीटर बाध्यकारी में शामिल प्रमुख अवशेषों को स्तनधारियों में संरक्षित पाया गया लेकिन मुर्गियों, मछली और उभयचरों में बहुरूपी । इन आंकड़ों से पता चलता है कि विषम β 2 मीटरप्रतिस्थापनएक व्यवहार्य साधन है जिसके द्वारा स्तनधारियों के MHC I का अध्ययन करना है । हालांकि, स्तनधारियों और पक्षियों, मछली या उभयचर के बीच प्रतिस्थापन संभव नहीं हो सकता है ।
संरचनात्मक अध्ययन एमएचसी I अणुओं द्वारा पेप्टाइड प्रस्तुति के आणविक तंत्र को समझने में निर्णायक भूमिका निभाते हैं। 2 मीटर प्रतिस्थापन β 2मीटरप्रतिस्थापनका उपयोग आमतौर पर एमएचसी I संरचनात्मक अध्ययन14, 16,17,18,26,27,28में कियाजाताहै । पिछले काम से पता चला है कि गोजातीय MHC I, N * 01801 में, मुरीन β2मीटर और गोजातीय β2मीटर एन * 01801 एच चेन17के α1α2 डोमेन के लिए बाध्यकारी के दौरान इसी तरह व्यवहार किया । इसके साथ ही, एमएचसी I की एक ही एच श्रृंखला द्वारा प्रस्तुत एक पेप्टाइड की संरचना का विश्लेषण किया गया था लेकिन2मीटर β अलग-अलग था। इन आंकड़ों से पता चलता है कि पेप्टाइड की संरचनाएं क्रॉस-टैक्सा β2मीटर द्वारा स्थिर होने पर समान होती हैं, इस प्रकार यह दर्शाता है कि 2 मीटरप्रतिस्थापनβ विषमताएं पेप्टाइड प्रस्तुति को प्रभावित नहीं करती हैं।
एमएचसी द्वारा प्रस्तुत एंटीजेन पेप्टाइड्स I टीसीआर द्वारा टी सेल एक्टिवेशन29में मध्यस्थता करने के लिए मान्यता प्राप्त हैं। वायरल संक्रमण के दौरान, एंटीजन-विशिष्ट टी सेल प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं का मूल्यांकन वायरल संक्रमणों की समझ और मेजबान प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं में काफी सुधार करेगा। पेप्टाइड-एमएचसी टेट्रामर टी सेल प्रतिक्रियाओं का मूल्यांकन करने के लिए एक महत्वपूर्ण तकनीक है; यह एमएचसी मोनोमर अणु को टेट्रामेराइज करने, इसकी आत्मीयता में सुधार करने और टी कोशिकाओं पर कई टीसीआरएस के साथ गठबंधन करने की तकनीक है। टेट्रामर्स का व्यापक रूप से अनुसंधान और नैदानिक निदान14,29,30में उपयोग किया जाता है । हाल ही में, टीसीआर-इंजीनियर टी कोशिकाएं (टीसीआर-टी) घातक ट्यूमर31के उपचार में अपनी संभावित प्रभावकारिता के लिए ट्यूमर इम्यूनोथेरेपी में एक गर्म विषय बन गई हैं। MHC I टेट्रामर धुंधला विशिष्ट टीसीआर को कैंसर से संबंधित एंटीजन पेप्टाइड्स के लिए बाध्यकारी स्क्रीनिंग के लिए एक महत्वपूर्ण तरीका हैजो 29MHC I अणुओं द्वारा प्रस्तुत किया गया है । इसलिए टीसीआर स्क्रीनिंग में एमएचसी आई टेट्रामर तैयारी अहम भूमिका निभाती है। एमएचसी आई एच चेन के बाइंडिंग के अलावा,β 2मीटर टी सेल सतह पर सीडी 8 को भी बांधता है, जिससे एमएचसी आई टेट्रामर स्टेनिंग द्वारा टीसीआर स्क्रीनिंग के दौरान गैर-विशिष्ट धुंधला हो सकता है। 2 मीटरप्रतिस्थापनβ विषम रूप से एमएचसी आई टेट्रामर के इस गैर-विशिष्ट बाध्यकारी को कम कर सकता है।
हालांकि, प्रोटोकॉल की कुछ सीमाएं हैं। सबसे पहले, हालांकि ई. कोलाई पुनर्संयोजन प्रोटीन के लिए प्रमुख अभिव्यक्ति मेजबान बना हुआ है, कई पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधनों का प्रदर्शन नहीं किया जा सकता है और व्यक्त प्रोटीन उत्पाद अघुलनशील समावेश निकायों के रूप में । फिर, स्तनधारी β2मीटर के साथ कुछ गैर-स्तनधारी β 2 मीटर के समानप्रतिस्थापनके कारण, यह ज्ञात नहीं है कि गैर-स्तनपायी β2मीटर को उनके MHC संरचना की सहायता और स्थिर करने के लिए2मीटर β विषम द्वारा प्रतिस्थापित किया जा सकता है या नहीं। प्रोटोकॉल में, हमने नेटएमएचसीपन और रोसेटा फ्लेक्सपेडॉक सर्वर दोनों का उपयोग करके अपने आजमाए गए विश्लेषणों पर एक विवरण शामिल किया है। दुर्भाग्य से, न तो उत्पादित भविष्यवाणियों प्रयोगात्मक डेटा मिलान किया । इससे यह संकेत मिल सकता है कि वर्तमान एमएचसी बाध्यकारी पेप्टाइड भविष्यवाणियां चमगादड़ जैसे गैर-मानव और गैर-माउस स्तनधारियों के लिए उपयुक्त नहीं थीं, जिनमें पेप्टाइड बाध्यकारी का एक अलग तरीका हो सकता है । इसलिए, हमें उच्च आत्मीयता पेप्टाइड्स प्राप्त करने के लिए व्यापक विश्लेषण के लिए विभिन्न भविष्यवाणी सॉफ्टवेयर और प्रायोगिक परिणामों को संयोजित करने की आवश्यकता है।
यहां वर्णित प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदम यह है कि एमएचसी को सही ढंग से पुनः प्राप्त किया जा सकता है । उच्च पुनर्मुल्डिंग दक्षता के साथ एमएचसी परिसर प्राप्त करना बहुत महत्वपूर्ण है। इसलिए, उपयुक्त पेप्टाइड्स का चयन करने और समावेशन निकायों की शुद्धता बढ़ाने पर ध्यान देना महत्वपूर्ण है।
अंत में, यहां MHC I अभिव्यक्ति, पुनर्मुल्डिंग, क्रिस्टलीकरण, क्रिस्टल डेटा संग्रह और संरचना निर्धारण के लिए एक प्रोटोकॉल संक्षेप है । इसके अलावा, एमएचसी I अध्ययन में 2 मीटरप्रतिस्थापनβ विषमता की व्यवहार्यता का विश्लेषण किया गया। यह अध्ययन संरचनात्मक और कार्यात्मक अध्ययनों में MHC I को समझने के लिए एक ठोस संदर्भ प्रदान करता है। इसके अलावा, संक्रामक रोग और ट्यूमर इम्यूनोथेरेपी के दौरान टी सेल प्रतिक्रियाओं के मूल्यांकन के लिए भी ये डेटा महत्वपूर्ण हैं।
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Disclosures
लेखकों के पास घोषणा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
इस अध्ययन को फार्मास्यूटिकल बायोटेक्नोलॉजी, नान-जिंग विश्वविद्यालय, चीन (ग्रांट नं) की राज्य प्रमुख प्रयोगशाला के खुले कोष द्वारा समर्थित किया गया था । KF-GN-201905), चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (अनुदान ८१९७१५०१) । विलियम जे लियू को एनएसएफसी (८१८२२०४०) और बीजिंग न्यू-स्टार प्लान ऑफ साइंस एंड टेक्नोलॉजी (Z181100006218080) के उत्कृष्ट युवा वैज्ञानिक कार्यक्रम द्वारा समर्थित किया गया है ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 kDa MMCO membrane | Merck millipore | PLGC07610 | |
| 30% Acrylamide | LABLEAD | A3291-500ml*5 | |
| 5×Protein SDS Loading | Novoprotein | PM099-01A | |
| AMICON ULTRA-15 15ML-10 KDa cutoff | Merck millipore | UFC901096 | |
| Ampicillin | Inalco | 1758-9314 | |
| APS | Sigma | A3678-100G | |
| BL21(DE3) strain | TIANGEN | CB105-02 | |
| DMSO | MP | 219605580 | Wear suitable gloves and eye/face protection. In case of contact with eyes, rinse immediately with plenty of water and seek medical advice. |
| DTT | Solarbio | D1070 | Gloves and goggles should be worn and operated in a ventilated kitchen. In case of contact with eyes, rinse immediately with plenty of water and seek medical advice. |
| EDTA-2Na | KeyGEN BioTECH | KGT515500 | |
| Glycerin | HUSHI | 10010618 | |
| GSH | Amresco | 0399-250G | |
| GSSG | Amresco | 0524-100G | |
| Guanidine hydrochloride | Amresco | E424-5KG | |
| hβ2m | our lab | Zhang, S. et al. Structural basis of cross-allele presentation by HLA-A*0301 and HLA-A*1101 revealed by two HIV-derived peptide complexes. Mol Immunol. 49 (1-2), 395-401, (2011). | |
| IPTG | Inalco | 1758-1400 | |
| L-Arginine Hydrochloride | Amresco | 0877-5KG | |
| NaCl | Solarbio | S8210 | |
| Protein Marker | Fermentas | 26614 | |
| SDS | Boao Rui Jing | A112130 | |
| Superdex Increase 200 10/300 GL | GE Healthcare | 28990944 | |
| TEMED | Thermo | 17919 | Gloves and goggles should be worn and operated in a ventilated kitchen. |
| Tris-HCl | Amresco | 0497-5KG | |
| Triton X-100 | Bioruler | RH30056-100mL | |
| Tryptone | Oxoid | LP0042 | |
| Yeast extract | Oxoid | LP0021 |
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