Summary
Das Protokoll beschreibt experimentelle Methoden zur Erlangung stabiler Haupthistokompatibilitätskomplexe (MHC) Klasse I durch potenzielle β 2-Mikroglobulin(β2m) Substitutionen verschiedener Arten. Untersucht wurde der strukturelle Vergleich von MHC I, der durch homologe und heterologe β2m stabilisiert wurde.
Abstract
Der Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC) spielt eine zentrale Rolle bei der Darstellung von Antigenpeptid und T-Zell-Immunreaktionen gegen Infektionskrankheiten und Tumorentwicklung. Die hybride MHC I, komplexiert mit heterologen β 2-Mikroglobulin (β2m) Substitution verschiedener Arten kann in vitro stabilisiert werden. Dies ist ein praktikables Mittel, um MHC I von Säugetieren zu untersuchen, wenn die homologe β2m nicht verfügbar ist. In der Zwischenzeit wird darauf hingewiesen, dass Die β2m Substitution die Peptiddarstellung nicht signifikant beeinflusst. Allerdings gibt es eine begrenzte Zusammenfassung hinsichtlich der Methodik und der Technologie für den Hybrid MHC I, der mit heterologen β2-Mikroglobulin (β2m) komplexiert ist. Hierin werden Methoden zur Bewertung der Durchführbarkeit heterologer β2m Substitution in der MHC-I-Studie vorgestellt. Diese Methoden umfassen die Vorbereitung von Ausdruckskonstrukten. Reinigung von Inklusionskörpern und Umfaltung des MHC-Komplexes; Bestimmung der Protein-Thermostabilität; Kristallsiebung und Strukturbestimmung. Diese Studie bietet eine Empfehlung zum Verständnis der Funktion und Struktur von MHC I und ist auch wichtig für die Bewertung der T-Zell-Reaktion während der Infektionskrankheit und Tumorimmuntherapie.
Introduction
Der Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC) existiert in allen Wirbeltieren und ist eine Reihe von Genen, die die zellvermittelte Immunität gegen infektiöse Krankheitserreger bestimmen. MHC-Klasse I präsentiert endogene Peptide, wie virale Komponenten, die bei virus-Infektion produziert werden, T-Zellrezeptoren (TCR) auf der Oberfläche von CD8+ T-Zellen, um die zelluläre Immunität zu vermitteln und an der Immunregulation1teilzunehmen. Eine strukturelle Studie der Ankehrung von MHC I an Peptide liefert Informationen über Peptidbindungsmotive und Präsentationsmerkmale von MHC-I-Molekülen, die bei der Bewertung von CD8+ T-Zell-Immunantworten und der Impfstoffentwicklung eine entscheidende Rolle spielen.
Seit der ersten Kristallisation und strukturellen Bestimmung von MHC I molecular durch Bjorkman et al.2hat die Kristallstrukturanalyse von MHC I Molekülen das Verständnis der Bindung von Peptiden an MHC I Moleküle stark gefördert und hilft, die Wechselwirkung von Lichtketten mit schweren Ketten und Peptiden zu verstehen. Eine Reihe von Folgestudien zeigte, dass, obwohl die Gene, die die Lichtkette kodieren, nicht mit dem MHC verbunden sind, die Lichtkette ein Schlüsselprotein für die Montage von MHC I Molekülen3,4ist. Es interagiert mit den drei Domänen der MHC-Klasse I Moleküle auf mehreren Oberflächen. Wenn die Lichtkette fehlt, können MHC-Moleküle der Klasse I nicht korrekt auf der Oberfläche von antigenpräsentierenden Zellen exprimiert werden und können nicht mit TCR interagieren, um ihre immunologischen Funktionen auszuüben.
MHC I besteht aus einer schweren Kette (H-Kette) und einer Leichten Kette (d.h. β 2-Mikroglobulin (β2m)) und wird durch Bindung an ein geeignetes Peptid5montiert. Das extrazelluläre Segment der H-Kette besteht aus den Domänen6, 1, 2 und 3 . Die Domänen 1 und 2 bilden die Peptidbindungsnut (PBG). Die β2m Kette fungiert als strukturelle Untereinheit des Montagekomplexes in MHC I, stabilisiert die Konformation des Komplexes und ist ein molekulares Chaperon für MHC I H Kettenfaltung7,8,9. Eine Reihe von Studien haben gezeigt, dass MHC I H Ketten von verschiedenen Säugetieren wie Fledermaus (Chiroptera) (Ptal-N*01:01)10, rhesus makaken (Primaten) (Mamu-B*17)11 (Mamu-A*01)12 (Mamu-A*02)13, Maus (Rodentia) (H-2Kd)14,15, Hund (Carnivora) (DLA-88*50801)16, Rinder (Artiodactyla) (BoLA-A11)17 und Pferde (Perissodactyla) (Eqca-N*00602 und Eqca-N*00601)18 können mit heterologen β2m (Tabelle 1) kombinieren. Diese Hybridmoleküle werden häufig in strukturellen und funktionellen Studien verwendet. Die Methodik für die funktionelle und strukturelle Untersuchung des hybriden MHC I mit heterologen β2m ist jedoch noch nicht zusammengefasst. Unterdessen bleibt die strukturelle Grundlage für die ausgetauschte β2m zwischen verschiedenen Taxa unklar.
Hierin werden das Verfahren für MHC I Expression, Umfaltung, Kristallisation, Kristalldatenerfassung und Strukturbestimmung zusammengefasst. Darüber hinaus werden mögliche Substitutionen von β2m von verschiedenen Arten durch vergleicht die strukturelle Konformation von MHC I durch homologe und heterologe β2m stabilisiert. Diese Methoden werden für weitere MHC I Strukturstudie und CD8+ T-Zell-Immunantwort-Bewertung bei Krebs und Infektionskrankheiten hilfreich sein.
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Protocol
1. Vorbereitung von Ausdruckskonstrukten
- Rufen Sie die Sequenzen von MHC-Genen der Klasse I (einschließlich vorhergesagter Gene) von Fledermäusen aus der NCBI-Datenbank ab.
- Holen Sie höhere MHC I schwere Kettensequenzen aus der Immuno Polymorphism Database (IPD) (www.ebi.ac.uk/ipd/mhc) und der UniProt-Datenbank (www.uniprot.org) ab.
- Um lösliche MHC-Komplexe zu erhalten, mutagenisieren Sie die Sequenzen, um die zytosolischen und transmembranen Regionen zu entfernen.
- Klonen Sie die Gene, die die Ektodomains der Fledermaus Ptal-N*01:01 (GenBank-Nr. KT98792919) (Rückstände 1–277) und Fledermaus β2m (GenBank-Nr. XP_006920478.1) (Rückstände 1–98) in pET-28a-Vektoren (Novagen, Peking, China).
- Einfügen der optimierten (für Escherichia coli) Sequenzen wurden zwischen den NcoI- und EcoR1-Standorten eines modifizierten pET-28a-Vektors eingefügt.
- Konstruieren Sie menschliche β2m Expressionplasmide, wie zuvor beschrieben20.
2. Peptidsynthese
- Peptide-Vorhersage
- Wie bereits beschrieben10, auf Peptide zu überprüfen, die an Ptal-N*01:01 binden können, prognostizieren Kandidaten Peptide mit den Proteinkörpern der Fledermaus-bezogenen Viren Hendra-Virus (HeV). Um Peptide mit hoher Affinität basierend auf dem Strukturmodell vom Online-Server zu erhalten, prognostizierten NetMHCpan 4.0 Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCpan/)21 und Rosetta FlexPepDock22 eine potenzielle Bindung in der ausgewählten Peptidfraktion. Darüber hinaus können auch andere Software und Datenbanken wie BIMAS, die Immune Epitope Database (IEDB), NetCTL 1.2 und SYFPEITHI verwendet werden, die alle die Vorhersage der Peptid-MHC-Bindungsaffinität der Klasse I, den mit der Antigenverarbeitung (TAP) verbundenen Transporteffizienz, die proteasomale C-Terminalspaltung und die Halbzeit der Dissoziation von Peptid-HLA-Molekülen in ihren Auslesegraden integrieren.
- Um hochverbindliche Peptide vorherzusagen, verwenden Sie sowohl den NetMHCpan- als auch den Rosetta FlexPepDock-Server.
HINWEIS: Leider stimmten keine der erstellten Vorhersagen mit den experimentellen Daten überein. Dies kann darauf hindeuten, dass aktuelle MHC-bindende Peptidvorhersagen nicht für nicht-menschliche und nicht-Maus-Säugetiere wie Fledermäuse geeignet waren, die eine andere Art der Peptidbindung haben können. Daher müssen wir verschiedene Vorhersagesoftware und experimentelle Ergebnisse für eine umfassende Analyse kombinieren, um Peptide mit hoher Affinität zu erhalten.
- Peptide Vorbereitung und Konservierung
- Anstatt benutzerdefinierte Peptide zu generieren, verwenden Sie spezialisierte Dienstanbieter. Kaufen Sie alle Peptide kommerziell nach Peptid-Vorhersage-Tools, die eine höhere Bindungspunktzahl haben. Die Peptidreinheit wurde durch HPLC und Massenspektrometrie auf >95% festgelegt.
- Alle gekauften Peptide als gefriergetrocknetes Pulver bei 80 °C lagern und vor der Verwendung in Dimethylsulfoxid (DMSO) auflösen.
3. Reinigung von Inklusionseinrichtungen
- Transformation von E. coli
- Verwandeln Sie 10 ng Plasmid enthaltenden Fledermaus MHC I Ptal-N*01:01 H Kette, oder menschliche β2m oder Fledermaus β2m in 100 l BL21(DE3) E. coli. 30 min im Eis baden.
- Hitzeschock bei 42 °C für 90 s, anschließend 2 min im Eis baden.
- Fügen Sie 800 L Lysogeny-Brühe (LB: Hefeextrakt, Trypton und NaCl; siehe Materialtabelle) zu Schritt 3.1.2 hinzu und schütteln Sie bei 20 Minuten (U/min) auf einer Schaukelplattform bei 37 °C 20 min.
- Tragen Sie 100 l bakterielle Suspension auf die Platte auf, die die entsprechende Antibiotikaresistenz (Ampicillin: 100 ng/ml) enthält, die mit früheren Konstrukten identisch sind.
- Inokulatiuskulturen
- Wählen Sie einen einzigen kürzlich umgewandelten bakteriellen Klon in 3 ml LB mit Antibiotikum (Ampicillin: 100 ng/ml) und Kultur bei 37 °C, während sie bei 200 Umdrehungen pro Minute auf einer Schaukelplattform schütteln, um die Bakterien zu aktivieren. Kulturen können spät in der Nacht geimpft werden, um am nächsten Morgen zur Einführung bereit zu sein.
- Eine Nacht im Voraus 500 l des aktivierten Bakterienbestandes in 50 ml LB mit Antibiotikum (Ampicillin: 100 ng/ml) übertragen und über Nacht bei 37 °C inkubieren und bei 200 Umdrehungen pro Minute schütteln. Für die Bequemlichkeit bei der Vorbereitung der nächsten Inoculate, frieren Sie die verbleibenden aktivierten Bakterienbestände in 1 ml Aliquots (500 l Kultur mit 500 l von 40 % Glycerin) bei 80 °C ein, bis die nächste Zubereitung benötigt wird.
- Um große Mengen an rekombinantem Protein zu erzeugen, übertragen Sie die bakterielle Zubereitung in 2 L LB mit Antibiotikum (Ampicillin: 100 ng/ml) im Verhältnis 1:100, bei 37 °C inkubieren, während sie bei 200 Rprossen schütteln. Kultur bis eine Absorption von 0,6 bei 600 nm erreicht ist. Fügen Sie 1 mM Isopropyl-1-thio-β-D-Galactopyranosid (IPTG) (variieren Sie die Konzentration von IPTG für verschiedene MHCs, meist zwischen 0,1 mM-1 mM) in den Kolben zur Induktion der Proteinexpression.
- Erntebakterien
- Die Bakterien bei 5000 x g bei 5000 x g bei 4 °C auf Zentrifugenflaschen und Zentrifuge übertragen. Alle Schritte sollten ab sofort bei 4 °C durchgeführt werden.
- Setzen Sie die Bakterien in 60 ml Phosphatpuffer-Saline (PBS) aus und befreien Sie das exprimierte rekombinante Protein durch Ultraschallzellstörer.
HINWEIS: Im Allgemeinen ist das Programm, das wir auf dieser Maschine eingestellt haben, Ultraschall 6S, Intervall 12S, 300 W, 99 mal).
- Reinigung von Inklusionseinrichtungen
- Zentrifugieren Sie die beschallte bakterielle Suspension bei 12.000 x g für 30 min. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet in einem entsprechenden Waschpuffervolumen (0,5% Triton-100, 50 mM Tris pH 8,0, 300 mM NaCl, 10 mM EDTA, 10 mM DTT) wieder auf. Wiederholen Sie diesen Vorgang noch einmal.
- Zentrifuge bei 12.000 x g für 10–20 min. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie die Einschlusskörper im Resuspensionspuffer wieder aus (50 mM Tris pH 8.0, 100 mM NaCl, 10 mM EDTA, 10 mM DTT). Entfernen Sie eine 20-L-Probe (Einschlusskörper im Resuspensionspuffer) für SDS-PAGE, um die Reinheit von Einschlusskörpern zu testen.
- Zentrifugieren Sie die restliche Zubereitung bei 12.000 x g für 10–20 min. Entsorgen Sie den Überstand. Wiegen Sie das Pellet, das die Einschlusskörper enthält, und fügen Sie auflösungspuffer (6 M Gua-HCl, 10% Glycerin, 50 mM Tris pH 8.0, 100 mM NaCl, 10 mM EDTA) zu einer Endkonzentration von 30 mg/ml hinzu. Mit einem Magnetrührer bei 4 °C langsam umrühren, bis sich die Einschlusskörper im Auflösungspuffer auflösen.
- Zentrifuge 12.000 x g für 10–20 min. Entsorgen Sie die Ausscheidungen. Bewahren Sie die Einschlusskörper bei 20 °C oder 80 °C auf.
HINWEIS: Bestätigen Sie vor der Reinigung von Inklusionskörpern, dass die Induktion und Expression von rekombinantem Protein erfolgreich waren. Proben aus jeder Kultur (vor und nach der IPTG-Induktion) auf einem Proteingel ausführen; 15% SDS-PAGE (SDS-PAGE konzentriertes Kaugummi: H2O, 30% Acrylamid, 1 M Tris-HCl pH 6.8, 10% SDS, 10% APS und TEMED; SDS-PAGE Trenngel: H2O, 30% Acrylamid, 1,5 M Tris-HCl pH 8,8, 10% SDS, 10% APS und TEMED; siehe Materialtabelle ) für die β2m, 10% SDS-PAGE für die H-Kette.
4. Umfalten des MHC-Komplexes
HINWEIS: Die Effizienz der neu gefalteten Inklusionskörper wirkt sich auf die Ausbeute des erhaltenen Proteins aus. Falten konkurriert mit Polymerisation, so dass es allgemein anerkannt ist, dass das Umfalten bei niedrigen Proteinkonzentrationen die erfolgreichste Methode ist. In diesem Papier beträgt die Konzentration der Inklusionskörper 30 mg/ml.
- Vorbereiten des Umfaltungspuffers.
- Variieren Sie die Zusammensetzung des Umfaltungspuffers in Abhängigkeit vom Protein. Zum Beispiel, der pH-Wert, Ionenstärke, Redox-Bedingungen und das Vorhandensein von Liganden beeinflussen die Umfaltung Ergebnisse. Am häufigsten ist es, Tris- oder HEPES-basierte Puffer bei einem neutralen pH-Wert mit einer NaCl-Konzentration von 50-500 mM zu verwenden, aber dies hängt auch vom Zielprotein ab. Im Folgenden finden Sie die in diesem Artikel verwendete Formel für den Neufaltungspuffer.
- Bereiten Sie den Faltpuffer mit 100 mM Tris-HCl pH 8.0, 400 mM L-Arginin, 2 mM EDTA-2Na vor.
- Den Puffer in einem 250–300 ml-Kolben auf 4 °C abkühlen und dann 5 mM reduziertes Glutathion (GSH) und 0,5 mM oxidiertes Glutathion (GSSG) hinzufügen. Rühren Sie langsam mit einem magnetischen Rührer bei 4 °C für weitere 10–20 min, bevor Sie die Einschlusskörper und Peptide hinzufügen.
- Injektion und Verdünnung der MHC H Kette und β2m
HINWEIS: Die Temperatur, bei der das Umfalten durchgeführt wird, kann variieren, obwohl im Allgemeinen, um die Aggregation zu minimieren, 4 °C am besten ist. Wir verwenden Verdünnung, um die Proteine neu zu falten.- Mit einer Nadel aus einer 1 ml Spritze 1 mlh- 2m Einschlusskörper bzw. b2m Einschlusskörper in zwei Umfaltpuffer (jeweils 1 Liter) injizieren. In jizieren Sie in die Nähe der kräftig rotierenden Rührstange, um eine schnelle und effiziente Verdünnung zu erhalten. β2m verfaltet relativ einfach und bleibt auch ohne die H-Kette stabil.
- Nach dem β2m in Umfaltlösung gelöst, Peptide (5 mg/ml) in DMSO auflösen und schnell 200 l in die Umfaltlösung injizieren. Rühren Sie langsam für 10-20 min, bevor Sie die H-Kette hinzufügen.
- Injizieren Sie die H-Kette mit dem oben beschriebenen Verfahren für β2m. Die H-Kette ist sehr instabil; daher ist die Reihenfolge der Injektion sehr wichtig. In zwei verschiedene Umfaltpuffer (jeweils 1 Liter) mit jeweils2m bzw. 2 m)h-2m einspritzen. Die konsekutive Injektion kleiner Aliquots anstelle der einmaligen Anwendung der gesamten Proteinmenge erhöht die Ausbeute des umgeklappten MHC. Lassen Sie das Umfalten bei 4 °C für 8–10 h erfolgen.
- Konzentration des neu gefalteten Proteins
- Verwenden Sie die Ultrafiltration in einer Druckkammer mit 10 kDa MMCO Membran für die Konzentration der umklappbaren Proteine. Diese Methode ist praktisch und kann mit Pufferaustausch kombiniert werden. Austauschpuffer (20 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl pH 8.0) in die Kammer geben und auf ein Endvolumen von 30–50 ml konzentrieren.
- Die Umfaltlösung auf ein Zentrifugenrohr übertragen, bei 12.000 x g 15 min bei 4 °C drehen, um Ausscheidungen zu entfernen.
- Übertragen Sie den Überstand vorsichtig und konzentrieren Sie sich weiter auf ein Endvolumen von 1 ml.
- Zentrifuge bei 12.000 xg für 10–20 min. Übertragen Sie den Überstand in ein steriles Rohr und reinigen Sie die Proteine mit einer 10/300 GL-Größen-Ausschluss-Säule.
- Sammeln Sie die Proben an der Spitze und analysieren Sie sie mit SDS-PAGE (15% Polyacrylamid-Gel).
- Sammeln Sie den MHC-Komplex-Peak und konzentrieren Sie sich auf eine Endkonzentration von 15 mg/ml.
- Verdünnen Sie den Komplex zur Kristallisation auf 7,5 mg/ml und 15 mg/ml.
5. Kristallisation, Datenerhebung und -verarbeitung
- Kristallisation von komplexem MHC und Peptid mit der Sitztropfendampfdiffusionstechnik durchführen.
- Schirmen Sie die Ptal-N*01:01/Peptid-Komplexe mit kommerziellen Kristall-Kits (z. B. Crystal Screen Kit I/II, Index Screen Kit, PEGIon Kit I/II und das PEGRx-Kit).
- Versiegeln Sie die resultierende Lösung und gleichnden Sie gegen 100 l Reservoirlösung bei 4 oder 18 °C.
- Beobachten Sie das Kristallwachstum in der Kultur für 3 Tage, 1 Woche, 2 Wochen, 1 Monat, 3 Monate und 6 Monate. Verwenden Sie ein Mikroskop, um zu sehen, ob jeder Tropfen in der Kristallplatte Kristalle hat.
ANMERKUNG: Ptal-N*01:01/HeV1(bx2m) Kristalle wurden in 0,2 M NaCl, 0,1 M Bis-Tris (pH 5,5) und 25% (w/v) Polyethylenglykol 3.350 in einer Konzentration von 7,5 mg/ml beobachtet. Ptal-N*01:01/HeV1(h'2m) Kristalle wurden in 0,1 M HEPES, pH 7,0, 2% w/v Polyethylenglykol 3.350 in einer Konzentration von 7,5 mg/ml beobachtet. - Zum kryogenen Schutz die Kristalle in eine Speicherlösung mit 20 % Glycerin zu übertragen und dann in einem 100 K gasförmigen Stickstoffstrom schnell abkühlen.
- Sammeln Sie Röntgenbeugungsdaten aus der Beamline BL19U der Shanghai Synchrotronstrahlungsanlage (Shanghai, China).
6. Strukturbestimmung und Analysen
- Mit hochauflösenden Strukturdaten, Prozess und Skalierung die Stärke der Sammlung mit dem Denzo-Programm und dem HKL2000 Softwarepaket (https://hkl-xray.com/)23.
- Nach der Wahl eines besseren Ausgangsmodells in der Protein Data Bank (PDB) bestimmen Sie die Strukturen mittels molekularer Ersetzung mit dem Programm Phaser MR in CCP424 (http://www.ccp4.ac.uk/). Das verwendete Modell war die Strukturkoordinaten mit Protein Data Bank (PDB) Code 5F1I.
- Verwenden Sie das verfeinerte Röntgenmodell für die anfängliche Gelenkverfeinerung. Verwenden Sie Phenix Verfeinern allein und Gelenkmodi für die Röntgen-allein und die gemeinsame Neutronen- und Röntgenverfeinerung, beziehungsweise.
- Überprüfen Sie nach jeder Verfeinerungsrunde das Modell manuell mit Fo - Fc und 2Fo - Fc positive nukleare Dichte Karten in Coot25 (https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/). Dies erleichtert die richtige Platzierung von Gewässern und bestimmten D-Atomen. Alle Figuren der Strukturen wurden von PyMOL (http://www.pymol.org/ erstellt.
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Representative Results
Frühere Arbeiten berichteten, dass das HeV-abgeleitete HeV1 (DFANTFLP) Peptid von Ptal-N* 01:0110,19vorgestellt wurde. Dabei wurde die Bindungskapazität dieses Peptids an Ptal-N*01:01 mit homologe Fledermaus β2m (b 2m) und heterologen menschlichen β2m (h'2m) (Abbildung1C,1D)ausgewertet. Es wurden Kristalle mit höherer Auflösung gebildet (Abbildung 1E,1F). Aus dem Komplex Ptal-N*01:01/HeV1, der durch Renaturierung mit2m gebildet wurde, bildet sich ein Kristall, der 2 m beträgt und die Auflösung 2,31 ° beträgt. Aus dem Komplex Ptal-N*01:01/HeV1 bildet sich ein Kristall, der durch Renaturierung mit2m gebildet wurde und die Auflösung 1,6 ° beträgt. Der Komplex Ptal-N*01:01/HeV1 wurde erfolgreich durch Renaturierung mit b2m und 2mgebildet(Abbildung 1C,1D). In diesem Zusammenhang haben wir gezeigt, dass der Ptal-N*01:01/HeV1-Komplex nicht ohne β2m (Abbildung 1A) und des H-2Kd gebildet wurde, die sich korrekt durch den h-2m falten (Abbildung 1B).
Anschließend wurden die Strukturen von Ptal-N*01:01/HeV1/b'2m und Ptal-N*01:01/HeV1/h'2m analysiert. In der Ptal-N*01:01/HeV1/b'2m Struktur, Rückstände R3, H31, Q34, D53, W60, Y63 von b'2m an die H-Kette Rückstände gebunden durch boden der PBG und Rückstände Q8, Y10, R12, N24, Y28, N98, N99 gebunden an die H-Kette Rückstände durch den Boden der PBG und Rückstände Q8, Y10, R12, N24, Y28, N98, N99 gebunden an die H-Kette Rückstände durch den Boden der PBG und Rückstände Q8, Y10, R12, N24, Y28, N98, N99 gebunden an die Domäne 3 der H-Kette. Ähnlich wie der Komplex Ptal-N*01:01/HeV1/b'2m, in der Ptal-N*01:01/HeV1/h'2 m Struktur, konservierte Rückstände H31, D53, W60, Y63 vonh' 2m, die b'2m entsprechen, Kontakt mit dem Boden der PBG und konservierten Rückständen Q8, Y10, R12, N24, die b'2m entsprechen, die an die Domäne 3 gebunden sind (Abbildung 2A,2B).
In den Gesamtstrukturen Ptal-N*01:01/HeV1/b'2m und Ptal-N*01:01/HeV1/h'2m betrug die durchschnittliche Wurzel-Mittel-Quadrat-Abweichung (RMSD) der Rückstände 1–184 der H-Ketten (die die S12 PBG bilden) 0,248 unter allenC-α Atomüberlagerung (Abbildung 3A). Diese Feststellung deutete darauf hin, dass es keinen Unterschied zwischen diesen beiden Komplexen gab. Anschließend wurden die Konformationen der ähnlichen Peptide in den Komplexen mit unterschiedlichen β2m verglichen. Die Struktur der Peptidausrichtung zeigte, dass die Konformationen der HeV1-Peptide in diesen beiden Komplexen ziemlich ähnlich waren (Abbildung 3B). Darüber hinaus wurden die strukturen von gp33 (KAVYNFATM) von H-2Db dargestellt und mit maus β2m (m x2m) oder h2m komplexiert. Die RMSD der PBG von H-2Db betrug 0,283 und die Gesamtübereinstimmungen der Peptide in diesen beiden Strukturen waren ebenfalls ähnlich (Abbildung 3C,3D). Diese Daten deuten darauf hin, dass die β2m Substitution zwischen b2m und h2m und m2m und 2mdie Übereinstimmungen der dargestellten Peptide nicht beeinflussen.
Die Sequenzausrichtung zeigte, dass die Aminosäuren von β2m von verschiedenen Arten stark konserviert sind (Abbildung 4). Nach der Analyse der β2m von verschiedenen Arten zeigte sich, dass die meisten Aminosäuren von β2m, die die Wasserstoffbindungen mit der H-Kette von MHC I bildeten, konserviert wurden (Abbildung 4, Tabelle 2). Inzwischen waren die diversen Rückstände auch Aminosäuren mit ähnlichen chemischen Eigenschaften bei Säugetieren. Die wichtigsten Rückstände, die an β der Bindung von2m an die H-Kette von MHC I beteiligt waren, zeigten jedoch Polymorphismen bei Hühnern, Fischen und Amphibien (Abbildung 4).
Tabelle 1: Die verschiedenen Säugetiere verbinden sich mit heterologen β2m. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
Tabelle 2: Wasserstoffbindungswechselwirkungen zwischen heterologen β2m und schwerer Kette in MHC I verschiedener Arten. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
Abbildung 1: Reinigung der löslichen und umgeklappten Ptal-N*01:01/HeV1-Komplexproteine und Fotografien des Kristalls, der für die Beugungsanalyse verwendet wird. Der M ist Molekulargewichtsmarker in kDa. Das P1 ist das Aggregat. Der P2 ist der MHC-Komplex. Der P3 ist der β2m. (A) Ptal-N*01:01/HeV1 Komplex wurde nicht ohne die Anwesenheit von β2m gebildet. (B) H-2Kd Komplex wurde durch Renaturierung mit h '2m gebildet. (C) Ptal-N*01:01/HeV1 Komplex wurde durch Renaturierung mit b2m gebildet. Das Profil ist mit den ungefähren Positionen der Molekularmassenstandards 75,0, 44,0 und 13,7 kDa gekennzeichnet. (D) Ptal-N*01:01/ HeV1-Komplex entstand durch Renaturierung mit h'2m. (E) Der Kristall wird aus dem Ptal-N*01*01/HeV1-Komplex gebildet, der durch Renaturierung mit b2m gebildet wurde. Der schwarze Pfeil stellt den Kristall dar, der verwendet wird, um Daten während der Röntgenbeugung zu sammeln. (F) Der Kristall wird aus dem Ptal-N*01:01/HeV1-Komplex gebildet, der durch Renaturierung mit2m gebildet wurde. Der schwarze Pfeil stellt den Kristall dar, der verwendet wird, um Daten während der Röntgenbeugung zu sammeln. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Wasserstoffbindung zwischen β2m und schwerer Kette in hybriden MHC I-Komplexen. Wasserstoffbindung zwischen β2m und H-Kette in (A) Ptal-N*01:01/bx2m/HeV1 und (B) Ptal-N*01:01/h'2m/HeV1 MHC-Komplexe. Wasserstoffbindungswechselwirkungen werden durch eine schwarze gepunktete Linie dargestellt. Das Quadrat stellt die vergrößerte und rechts in den entsprechenden farbigen Kästchen angezeigte Fläche dar. Das Rot steht für die homologe β2m und die heterologen β2m verwenden dieselben Aminosäuren, um Wasserstoffbindungen mit der H-Kette zu bilden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Ähnliche Konformation des MHC-Komplexes und der antigenen Peptide in hybriden MHC-I-Komplexen. (A) Die Überlagerung von 1-2-Domänen von Ptal-N*01:01/b2m (grün) und Ptal-N*01:01/h2m (grau). (B) Die Überlagerung von HeV1-Peptid mit der Überlagerung der Domäne von 1 2, wobei jedes Ptal-N*01:01-Molekül zu finden ist. HeV1 Peptid ist als rosa in Ptal-N*01:01/b'2m und als gelb in Ptal-N*01:01/h'2m dargestellt. (C) Die Überlagerung von H-2Db /maus β2m (m'2m) (grün) und H-2Db /h'2m (grau). (D) Die Überlagerung von gp33-Peptid mit der Überlagerung der Domäne von 1 2, wobei jedes H-2D-b-Molekül zu finden ist. Peptid gp33 ist als blau in H-2Db /m'2m und als rosa in H-2Db /h'2m dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Strukturbasierte Sequenzausrichtung von 2mmit β2m anderer Arten. Die schwarzen Pfeile bezeichnen β.- Die rot hervorgehobenen Rückstände sind vollständig konserviert, und die Rückstände in blauen Boxen sind hoch (>80%) Konserviert. Die gelben Dreiecke stellen die wichtigsten Aminosäuren für die Wechselwirkung zwischen den β2m und H Ketten dar. Die Sequenzausrichtung wurde mit Clustal X32 und ESPript33generiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Der Aufbau eines Hybridproteinkomplexes durch heterologe Substitution aus verschiedenen Taxa ist eine gemeinsame Strategie für funktionelle und strukturelle Untersuchungen, wenn der homologe Komplex nicht verfügbar ist, wie z. B. im MHC I und seinen Liganden. Allerdings gibt es eine begrenzte Zusammenfassung in Bezug auf die Methodik und die Technologie. Dabei wurde die Struktur der Fledermaus MHC I, Ptal-N*01:01, stabilisiert durch b2m oder h2m, analysiert. Die wichtigsten Aminosäuren von β2m Bindung an Ptal-N* 01:01 wurden gefunden, um zwischen Fledermaus und Mensch konserviert werden. Bei der weiteren Analyse wurde festgestellt, dass der Hauptrückstand, der an β der Bindung von2m an die H-Kette von MHC I beteiligt war, bei Säugetieren konserviert wurde, bei Hühnern, Fischen und Amphibien jedoch polymorph. Diese Daten deuten darauf hin, dass heterologe β2m Substitution ein machbares Mittel zur Untersuchung des MHC I von Säugetieren ist. Eine Substitution zwischen Säugetieren und Vögeln, Fischen oder Amphibien ist jedoch möglicherweise nicht möglich.
Strukturstudien spielen eine zentrale Rolle beim Verständnis der molekularen Mechanismen der Peptidpräsentation durch MHC-I-Moleküle. Heterologe β2m Substitution wird häufig in MHC I Strukturstudien14,16,17,18,26,27,28verwendet. Frühere Arbeiten haben gezeigt, dass sich bei Rindern MHC I, N*01801, murinen β2m und Rinder β2m, während der Bindung an die Domänen der N*01801 H-Kette17ähnlich verhielt. Dabei wurde die Struktur eines einzelnen Peptids analysiert, das von der gleichen H-Kette von MHC I, aber unterschiedlichen β2m dargestellt wurde. Diese Daten zeigen, dass die Konformationen von Peptid ähnlich sind, wenn sie durch Cross-Taxa-β2m stabilisiert werden, was darauf hindeutet, dass heterologe β2m Substitution die Peptiddarstellung nicht beeinflusst.
Antigenpeptide, die von MHC I vorgestellt werden, werden von TCR erkannt, um die T-Zellaktivierung zu vermitteln29. Während der Virusinfektion wird die Bewertung von antigenspezifischen T-Zell-Immunantworten das Verständnis von Virusinfektionen und Wirtsimmunreaktionen erheblich verbessern. Das Peptid-MHC-Tetramer ist eine wichtige Technik zur Bewertung der T-Zell-Antworten; Es ist eine Technik, um das MHC-Monomermolekül zu tetramerisieren, seine Affinität zu verbessern und es mit mehreren TCRS auf T-Zellen zu kombinieren. Tetramere sind weit verbreitet in der Forschung und klinischen Diagnose14,29,30. Kürzlich sind TCR-entwickelte T-Zellen (TCR-T) ein heißes Thema in der Tumorimmuntherapie für ihre potenzielle Wirksamkeit bei der Behandlung von bösartigen Tumoren31geworden. MHC I TetramerFärbung ist eine entscheidende Methode zum Screening spezifischer TCR-Bindung an krebsbedingte Antigenpeptide, die von MHC I Molekülen29präsentiert werden. Daher spielt die MHC I Tetramerpräparation eine wichtige Rolle beim TCR-Screening. Neben der Bindung der MHC I H Kette bindet β2m auch an CD8 auf der T-Zelloberfläche, was zu einer unspezifischen Färbung während des TCR-Screenings durch MHC I Tetramerfärbung führen kann. Heterologe β2m Substitution können diese unspezifische Bindung des MHC I Tetramers verringern.
Es gibt jedoch einige Einschränkungen für das Protokoll. Erstens: Obwohl E. coli nach wie vor der vorherrschende Expressionswirt für rekombinante Proteine ist, können viele posttranslationale Modifikationen nicht durchgeführt werden, und die exprimierbaren Proteinprodukte bilden unlösliche Einschlusskörper. Aufgrund der ähnlichen Substitution einiger nicht-mammalian β2m durch Säugetiere β2m, ist nicht bekannt, ob Nicht-Säuger β2m durch heterologe β2m ersetzt werden können, um ihre MHC-Struktur zu unterstützen und zu stabilisieren. Im Protokoll haben wir eine Beschreibung unserer bewährten Analysen mit dem NetMHCpan- und Rosetta FlexPepDock-Server aufgenommen. Leider stimmten keine der beiden erstellten Vorhersagen mit den experimentellen Daten überein. Dies kann darauf hindeuten, dass aktuelle MHC-bindende Peptidvorhersagen nicht für nicht-menschliche und nicht-Maus-Säugetiere wie Fledermäuse geeignet waren, die eine andere Art der Peptidbindung haben können. Daher müssen wir verschiedene Vorhersagesoftware und experimentelle Ergebnisse für eine umfassende Analyse kombinieren, um Peptide mit hoher Affinität zu erhalten.
Im hier beschriebenen Protokoll besteht der schlüsselfertige Schritt darin, dass der MHC korrekt renaturiert werden kann. Es ist sehr wichtig, einen MHC-Komplex mit hoher Umfaltungseffizienz zu erhalten. Daher ist es wichtig, darauf zu achten, geeignete Peptide auszuwählen und die Reinheit von Inklusionskörpern zu erhöhen.
Zusammenfassend ist hierin ein Protokoll für MHC I Ausdruck, Umfaltung, Kristallisation, Kristalldatenerfassung und Strukturbestimmung zusammengefasst. Darüber hinaus wurde die Durchführbarkeit heterologer β2m Substitution in der MHC-I-Studie analysiert. Diese Studie bietet eine solide Referenz für das Verständnis von MHC I in Struktur- und Funktionsstudien. Darüber hinaus sind diese Daten auch für die Bewertung von T-Zell-Antworten während Der Infektionskrankheiten und Tumorimmuntherapie von Bedeutung.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu erklären.
Acknowledgments
Diese Studie wurde durch den offenen Fonds des staatlichen Schlüssellabors für pharmazeutische Biotechnologie, Nan-jing University, China (Grant-Nr. KF-GN-201905), die National Natural Science Foundation of China (Stipendien 81971501). William J. Liu wird vom Excellent Young Scientist Program der NSFC (81822040) und Beijing New-Star Plan of Science and Technology (Z181100006218080) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 kDa MMCO membrane | Merck millipore | PLGC07610 | |
| 30% Acrylamide | LABLEAD | A3291-500ml*5 | |
| 5×Protein SDS Loading | Novoprotein | PM099-01A | |
| AMICON ULTRA-15 15ML-10 KDa cutoff | Merck millipore | UFC901096 | |
| Ampicillin | Inalco | 1758-9314 | |
| APS | Sigma | A3678-100G | |
| BL21(DE3) strain | TIANGEN | CB105-02 | |
| DMSO | MP | 219605580 | Wear suitable gloves and eye/face protection. In case of contact with eyes, rinse immediately with plenty of water and seek medical advice. |
| DTT | Solarbio | D1070 | Gloves and goggles should be worn and operated in a ventilated kitchen. In case of contact with eyes, rinse immediately with plenty of water and seek medical advice. |
| EDTA-2Na | KeyGEN BioTECH | KGT515500 | |
| Glycerin | HUSHI | 10010618 | |
| GSH | Amresco | 0399-250G | |
| GSSG | Amresco | 0524-100G | |
| Guanidine hydrochloride | Amresco | E424-5KG | |
| hβ2m | our lab | Zhang, S. et al. Structural basis of cross-allele presentation by HLA-A*0301 and HLA-A*1101 revealed by two HIV-derived peptide complexes. Mol Immunol. 49 (1-2), 395-401, (2011). | |
| IPTG | Inalco | 1758-1400 | |
| L-Arginine Hydrochloride | Amresco | 0877-5KG | |
| NaCl | Solarbio | S8210 | |
| Protein Marker | Fermentas | 26614 | |
| SDS | Boao Rui Jing | A112130 | |
| Superdex Increase 200 10/300 GL | GE Healthcare | 28990944 | |
| TEMED | Thermo | 17919 | Gloves and goggles should be worn and operated in a ventilated kitchen. |
| Tris-HCl | Amresco | 0497-5KG | |
| Triton X-100 | Bioruler | RH30056-100mL | |
| Tryptone | Oxoid | LP0042 | |
| Yeast extract | Oxoid | LP0021 |
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