Protokollet beskriver experimentella metoder för att erhålla stabila stora histocompatibility komplexa (MHC) klass I genom potentiella β2-mikroglobulin(β2m) substitutioner från olika arter. Den strukturella jämförelsen av MHC jag stabiliseras av homologa och heterologa β2m undersöktes.
Det stora histokompatibilitet komplexa (MHC) spelar en central roll i antigen peptid presentation och T cell immun svar mot infektionssjukdomar och tumör utveckling. Hybrid MHC I komplex med heterologa β2-mikroglobulin(β2m) ersättning från olika arter kan stabiliseras in vitro. Detta är ett genomförbart sätt att studera MHC I av däggdjur, när den homologa β2m inte är tillgänglig. Samtidigt anges att däggdjurs β2m substitution inte signifikant påverkar peptidpresentationen. Det finns dock begränsad summering av metoden och tekniken för hybrid MHC I komplex med heterologt β2-mikroglobulin (β2m). Häri presenteras metoder för att utvärdera genomförbarheten av β2m substitution i MHC I studie. Dessa metoder inkluderar förberedelse av uttryckskonstruktioner; Rening av inklusionsorgan och omdubblning av MHC-komplexet. Bestämning av proteintermostabilitet. kristallscreening och strukturbestämning. Denna studie ger en rekommendation för att förstå funktion och struktur av MHC I, och är också signifikant för T-cells svar utvärdering under infektionssjukdomar och tumör immunterapi.
Det stora histokompatibilitetskomplexet (MHC) finns i alla ryggradsdjur och är en uppsättning gener som bestämmer den cellmedierade immuniteten mot infektiösa patogener. MHC klass I presenterar endogena peptider, såsom viruskomponenter som produceras vid virusinfektion, till T-cellsreceptorer (TCR) på ytan av CD8+ T-celler för att medla cellulär immunitet och delta i immunreglering1. En strukturell studie av MHC I som binder till peptider ger information om peptidbindningsmotiv och presentationsfunktioner av MHC I-molekyler, som spelar viktiga roller vid utvärdering av CD8+ T-cellsimmunsvar och vaccinutveckling.
Sedan den första kristalliseringen och strukturella bestämningen av MHC I molekylär av Björkman et al.2, kristallstrukturanalysen av MHC I molekyler har kraftigt främjat förståelsen av hur peptider binder till MHC I molekyler, och hjälper till att förstå interaktionen mellan lätta kedjor med tunga kedjor och peptider. En serie uppföljande studier visade att även om generna som kodar för ljuskedjan inte är associerade med MHC, är ljuskedjan ett nyckelprotein för montering av MHCI-molekyler 3,4. Det interagerar med de tre domänerna i MHC klass I molekyler på flera ytor. När ljuskedjan är frånvarande kan MHC-molekyler av klass I inte uttryckas korrekt på ytan av antigen-presenterande celler och kan inte interagera med TCR för att utöva sina immunologiska funktioner.
MHC I består av en tung kedja (H-kedja) och ljuskedja (dvs. β2-mikroglobulin(β2m)) och monteras genom bindning till en lämplig peptid5. Det extracellulära segmentet i H-kedjan består av α1-, α2- och α3-domäner6. Domänerna α1 och α2 bildar peptidbindningsspåret (PBG). Den β 2 mkedjanfungerar som en strukturell underavdelning av monteringskomplexet i MHC I, stabiliserar konformationen av komplexet och är ett molekylärt förkläde för MHC I H-kedjevikning7,8,9. En serie studier har visat att MHC I H kedjor från olika däggdjur såsom fladdermus (Chiroptera) (Ptal-N *01:01)10, rhesus makaker (Primater) (Mamu-B*17)11 (Mamu-A*01)12 (Mamu-A*02)13, mus (Rodentia) (H-2Kd) 14,1415, hund (Carnivora) (DLA-88*50801)16, nötkreatur (Artiodactyla) (BoLA-A11)17 och häst (Peris (Eqca-N*00602 och Eqca-N*00601)18 kan kombineras med heterologt β2m(tabell 1). Dessa hybridmolekyler används ofta i strukturella och funktionella studier. Metoden för funktionell och strukturell studie av hybrid MHC I med heterologa β2m är dock ännu inte sammanfattad. Samtidigt är den strukturella grunden för den utbytta β2m mellan olika taxa fortfarande oklar.
Häri sammanfattas proceduren för MHC I uttryck, om dukning, kristallisering, kristall data insamling och struktur bestämning. Dessutom analyseras potentiella substitutioner av β2m från olika arter genom att jämföra den strukturella konformationen av MHC I stabiliseras av homologa och heterologa β2m. Dessa metoder kommer att vara till hjälp för ytterligare MHC I strukturstudie och CD8+ T cell immunsvar utvärdering i cancer och infektionssjukdomar.
Byggandet av ett hybridproteinkomplex genom heterolog substitution från olika taxa är en gemensam strategi för funktionella och strukturella undersökningar när det homologa komplexet inte är tillgängligt, till exempel i MHC I och dess ligands. Det finns dock begränsad summering av metoden och tekniken. Herein, strukturen av fladdermus MHC I, Ptal-N * 01: 01, stabiliseras av bβ2m eller hβ2m analyserades. De viktigaste aminosyrorna i β2m bindning till Ptal-N *01:01 konstaterades …
The authors have nothing to disclose.
Denna studie stöddes av den öppna fonden för det statliga nyckellaboratoriet för farmaceutisk bioteknik, Nan-jing University, Kina (Anslag nr. KF-GN-201905), Kinas nationella naturvetenskapliga stiftelse (bidrag 81971501). William J. Liu stöds av NSFC:s utmärkta unga vetenskapsprogram (81822040) och Beijing New-star Plan of Science and Technology (Z181100006218080).
10 kDa MMCO membrane | Merck millipore | PLGC07610 | |
30% Acrylamide | LABLEAD | A3291-500ml*5 | |
5×Protein SDS Loading | Novoprotein | PM099-01A | |
AMICON ULTRA-15 15ML-10 KDa cutoff | Merck millipore | UFC901096 | |
Ampicillin | Inalco | 1758-9314 | |
APS | Sigma | A3678-100G | |
BL21(DE3) strain | TIANGEN | CB105-02 | |
DMSO | MP | 219605580 | Wear suitable gloves and eye/face protection. In case of contact with eyes, rinse immediately with plenty of water and seek medical advice. |
DTT | Solarbio | D1070 | Gloves and goggles should be worn and operated in a ventilated kitchen. In case of contact with eyes, rinse immediately with plenty of water and seek medical advice. |
EDTA-2Na | KeyGEN BioTECH | KGT515500 | |
Glycerin | HUSHI | 10010618 | |
GSH | Amresco | 0399-250G | |
GSSG | Amresco | 0524-100G | |
Guanidine hydrochloride | Amresco | E424-5KG | |
hβ2m | our lab | Zhang, S. et al. Structural basis of cross-allele presentation by HLA-A*0301 and HLA-A*1101 revealed by two HIV-derived peptide complexes. Mol Immunol. 49 (1-2), 395-401, (2011). | |
IPTG | Inalco | 1758-1400 | |
L-Arginine Hydrochloride | Amresco | 0877-5KG | |
NaCl | Solarbio | S8210 | |
Protein Marker | Fermentas | 26614 | |
SDS | Boao Rui Jing | A112130 | |
Superdex Increase 200 10/300 GL | GE Healthcare | 28990944 | |
TEMED | Thermo | 17919 | Gloves and goggles should be worn and operated in a ventilated kitchen. |
Tris-HCl | Amresco | 0497-5KG | |
Triton X-100 | Bioruler | RH30056-100mL | |
Tryptone | Oxoid | LP0042 | |
Yeast extract | Oxoid | LP0021 |