Summary
Le protocole décrit les méthodes expérimentales pour obtenir stable majeur complexe d’histocompatibilité (MHC) classe I grâce à des substitutions potentielles de β2-microglobuline (β2m) de différentes espèces. La comparaison structurale du MHC I stabilisée par des dommages homologues et β2m ont été étudiées.
Abstract
Le principal complexe d’histocompatibilité (MHC) joue un rôle central dans la présentation du peptide antigène et les réponses immunitaires des cellules T contre les maladies infectieuses et le développement tumoral. Le MHC hybride I complexé d’une substitution β2microglobulines (β2m) de différentes espèces peut être stabilisé in vitro. Il s’agit d’un moyen réalisable d’étudier le MHC I des mammifères, lorsque le β2m n’est pas disponible. Pendant ce temps, il est indiqué que la substitution β2m n’affecte pas significativement la présentation du peptide. Cependant, il y a peu de résumé s’agissant de la méthodologie et de la technologie du MHC hybride I complexés avec des β heterologous2-microglobuline (β2m). Ci-après, des méthodes d’évaluation de la faisabilité d’une substitution β2m dans l’étude MHC I sont présentées. Ces méthodes comprennent la préparation de constructions d’expression; la purification des organismes d’inclusion et le refolding du complexe du CSM; détermination de la thermostabilité des protéines; le criblage en cristal et la détermination de la structure. Cette étude fournit une recommandation pour comprendre la fonction et la structure du MHC I, et est également significative pour l’évaluation de réponse de cellule T pendant la maladie infectieuse et l’immunothérapie de tumeur.
Introduction
Le principal complexe d’histocompatibilité (MHC) existe chez tous les vertébrés et est un ensemble de gènes qui détermine l’immunité à médiatté cellulaire contre les pathogènes infectieux. La classe I du MHC présente des peptides endogènes, tels que des composants viraux produits lors de l’infection virale, aux récepteurs des lymphocytes T (TCR) à la surface des lymphocytes CD8+ T pour jouer le rôle de médiateur de l’immunité cellulaire et participer à la régulationimmunitaire 1. Une étude structurale du MHC I liant aux peptides fournit des informations concernant les motifs de liaison peptidique et les caractéristiques de présentation par les molécules du MHC I, qui joue un rôle vital dans l’évaluation des réponses immunitaires deslymphocytes T CD8 + T et le développement du vaccin.
Depuis la première cristallisation et la détermination structurale du MHC I moléculaire par Bjorkman et coll.2, l’analyse de la structure cristalline des molécules du MHC I a grandement favorisé la compréhension de la façon dont les peptides se lient aux molécules du MHC I, et aide à comprendre l’interaction des chaînes légères avec les chaînes lourdes et les peptides. Une série d’études de suivi ont indiqué que bien que les gènes codant la chaîne lumineuse ne soient pas associés au MHC, la chaîne lumineuse est une protéine clé pour l’assemblage des molécules du MHC I3,4. Il interagit avec les trois domaines des molécules de classe I du MHC sur plusieurs surfaces. Lorsque la chaîne de lumière est absente, les molécules de classe I du MHC ne peuvent pas être correctement exprimées à la surface des cellules présentant des antigènes et ne peuvent pas interagir avec le TCR pour exercer leurs fonctions immunologiques.
Le MHC I est composé d’une chaîne lourde (chaîne H) et d’une chaîne légère (c.-à-d. β2microglobulines (β2m)), et est assemblé par liaison à un peptideapproprié 5. Le segment extracellulaire de la chaîne H se compose de domaines α1, α2 et α36. Les domaines α1 et α2 forment la rainure de liaison peptidique (PBG). La chaîne β2m agit comme une sous-unité structurelle du complexe d’assemblage du MHC I, stabilisant la conformation du complexe, et est un chaperon moléculaire pour le pliage de la chaîne MHC I H7,8,9. Une série d’études ont montré que le MHC I H s’enchaîne chez divers mammifères tels que la chauve-souris (Chiroptera) (Ptal-N*01:01)10, rhésus macaque (Primates) (Mamu-B *17)11 (Mamu-A*01)12 (Mamu-A*02)13, souris (Rodentia) (H-2Kd)14,15, chien (Carnivora) (DLA-88*50801)16, bovins (Artiodactyla) (BoLA-A11)17 et équidés (Periss eqca-N*00602 et Eqca-N*00601)18 peuvent se combiner avec des β heterologousde 2m (tableau 1). Ces molécules hybrides sont souvent utilisées dans des études structurelles et fonctionnelles. Cependant, la méthodologie pour l’étude fonctionnelle et structurale du MHC I hybride avec des β2m n’est pas encore résumée. Pendant ce temps, la base structurelle de l’βde 2m entre les différents taxons reste incertaine.
Dans ce cas, la procédure d’expression, de refolding, de cristallisation, de collecte de données cristallines et de détermination de la structure est résumée. En outre, les substitutions potentielles de β2m de différentes espèces sont analysées en comparant la conformation structurelle du MHC I stabilisée par des β homologues et héterologiques de2m. Ces méthodes seront utiles pour poursuivre l’étude structurale du MHC I et l’évaluation de la réponse immunitaire des lymphocytes T CD8+ T dans le cancer et les maladies infectieuses.
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Protocol
1. La préparation de l’expression construit
- Récupérer les séquences des gènes de classe I du MHC (y compris les gènes prévus) à partir des chauves-souris de la base de données NCBI.
- Récupérez des séquences de chaînes lourdes MHC I plus élevées à partir de la Base de données sur l’immunomorphisme (DPI) (www.ebi.ac.uk/ipd/mhc) et de la base de données UniProt (www.uniprot.org).
- Pour obtenir des complexes solubles de MHC, mutagenize les séquences pour enlever les régions cytosolic et transmembrane.
- Cloner les gènes codant les ectodomains de la chauve-souris Ptal-N*01:01 (GenBank no. KT98792919) (résidus 1-277) et chauve-souris β2m (GenBank no. XP_006920478.1) (résidus 1-98) dans les vecteurs pET-28a (Novagen, Beijing, Chine), respectivement.
- Insérer les séquences optimisées (pour Escherichia coli)ont été insérées entre les sites NcoI et EcoR1 d’un vecteur pET-28a modifié.
- Construire des βplasmidesd’expression de 2 m comme décrit précédemment20.
2. Synthèse peptidique
- Prédiction peptides
- Comme décrit précédemment10, pour dépister les peptides qui peuvent se lier à Ptal-N *01:01, prédire peptides candidats en utilisant les organes protéiques des virus liés aux chauves-souris virus hendra virus (HeV). Pour obtenir des peptides à haute affinité basés sur le modèle structurel du serveur en ligne, NetMHCpan 4.0 serveur (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCpan/)21 et Rosetta FlexPepDock22 prédit une liaison potentielle dans la fraction peptidique sélectionnée. En outre, d’autres logiciels et bases de données, y compris BIMAS, l’Immune Epitope Database (IEDB), NetCTL 1.2, et SYFPEITHI peuvent également être utilisés, tous intégrant la prédiction du peptide-MHC classe I affinité contraignante, transporteur associé à l’efficacité du transport antigène (TAP), protéasomal C-terminal clivage et la mi-temps de dissociation du peptide-HLA molécules de classe I dans leurs readouts.
- Pour prédire les peptides haute liaison, utilisez à la fois le serveur NetMHCpan et Rosetta FlexPepDock.
REMARQUE : Malheureusement, ni l’une ni l’autre des prédictions produites ne correspondaient aux données expérimentales. Cela peut indiquer que les prédictions actuelles du peptide liant le MHC ne convenaient pas aux mammifères non humains et non souris comme les chauves-souris, qui peuvent avoir une autre façon de se lier au peptide. Par conséquent, nous devons combiner divers logiciels de prédiction et des résultats expérimentaux pour une analyse complète afin d’obtenir des peptides d’affinité élevée.
- Préparation et conservation des peptides
- Plutôt que de générer des peptides personnalisés, utilisez des fournisseurs de services spécialisés. Achetez tous les peptides commercialement suivant les outils de prédiction peptidique, qui ont un score de liaison plus élevé. La pureté peptidique a été déterminée pour être >95% par HPLC et spectrométrie de masse.
- Conserver tous les peptides achetés sous forme de poudre lyophilisé à −80 °C et dissoudre dans du sulfoxyde de diméthyle (DMSO) avant utilisation.
3. Purification des organismes d’inclusion
- Transformation de E. coli
- Transformer 10 ng de plasmide contenant la chauve-souris MHC I Ptal-N*01:01 H chaîne, ou l’homme β2m ou chauve-souris β2m en 100 μL de BL21(DE3) E. coli. Baigner dans la glace pendant 30 min.
- Choc thermique à 42 °C pendant 90 s, suivi d’un bain dans la glace pendant 2 min.
- Ajouter 800 μL de bouillon de lysogène (LB : extrait de levure, tryptone et NaCl; voir la table des matériaux)à l’étape 3.1.2 et secouer à 200 rotations par minute (régime) sur une plate-forme de basculement à 37 °C pendant 20 min.
- Appliquer 100 μL de suspension bactérienne sur la plaque contenant la résistance aux antibiotiques correspondante (ampicilline : 100 ng/mL), qui sont identiques aux constructions précédentes.
- Cultures inoculculaires
- Choisissez un clone bactérien récemment transformé en 3 mL de LB avec milieu antibiotique (ampicilline : 100 ng/mL) et culture à 37 °C, tout en secouant à 200 rpm sur une plate-forme de basculement pour activer les bactéries. Les cultures peuvent être inoculées tard dans la nuit, pour être prêtes pour l’induction le lendemain matin.
- Une nuit à l’avance, transférer 500 μL du stock bactérien activé dans 50 mL de LB avec un milieu antibiotique (ampicilline : 100 ng/mL) et incuber pendant la nuit à 37 °C, en secouant à 200 rpm. Pour plus de commodité lors de la préparation de l’inoculate suivant, congeler le reste du stock bactérien activé en aliquots de 1 mL (500 μL de culture avec 500 μL de 40% de glycérol) à −80 °C jusqu’à ce que la prochaine préparation soit nécessaire.
- Pour générer de grandes quantités de protéines recombinantes, transférer la préparation bactérienne en 2 L de LB avec un milieu antibiotique (ampicilline: 100 ng/mL) à un rapport de 1:100, incuber à 37 °C tout en secouant à 200 rpm. Culture jusqu’à ce qu’une absorption de 0,6 à 600 nm soit atteinte. Ajouter 1 mM isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranoside (IPTG) (varier la concentration d’IPTG pour différents MHCs, la plupart du temps entre 0,1 mM-1 mM) à la fiole pour l’induction de l’expression des protéines.
- Bactéries de récolte
- Transférer les bactéries dans des bouteilles de centrifugeuses et une centrifugeuse à 5000 x g pendant 20 min à 4 °C. Toutes les étapes doivent désormais être effectuées à 4 °C.
- Resuspendez les bactéries dans 60 mL de saline tampon de phosphate (PBS) et libérez la protéine recombinante exprimée par perturbateur cellulaire ultrasonique.
NOTE: En général, le programme que nous avons mis sur cette machine est ultrasonique 6S, intervalle 12S, 300 W, 99 fois).
- Purification des organismes d’inclusion
- Centrifugeuse la suspension bactérienne sonique à 12.000 x g pendant 30 min. Jetez le supernatant et resuspendez la pastille dans un volume approprié de tampon de lavage (0,5% Triton-100, 50 mM Tris pH 8,0, 300 mM NaCl, 10 mM EDTA, 10 mM DTT). Répétez ce processus une fois de plus.
- Centrifugeuse à 12 000 x g pendant 10 à 20 min. Jetez le supernatant et resuspendez les corps d’inclusion dans le tampon de resuspension (50 mM Tris pH 8.0, 100 mM NaCl, 10 mM EDTA, 10 mM DTT). Supprimez un échantillon de 20 μL (organismes d’inclusion dans le tampon de resuspension) pour SDS-PAGE afin de tester la pureté des corps d’inclusion.
- Centrifugeuse le reste de la préparation à 12.000 x g pendant 10-20 min. Jeter le surnatant. Pesez la pastille contenant les corps d’inclusion et ajoutez le tampon de dissolution (6 M Gua-HCl, 10% glycérine, 50 mM Tris pH 8.0, 100 mM NaCl, 10 mM EDTA) à une concentration finale de 30 mg/mL. Remuer lentement à l’aide d’un agitateur magnétique à 4 °C jusqu’à ce que les corps d’inclusion soient dissous dans le tampon de dissolution.
- Centrifugeuse 12 000 x g pendant 10 à 20 min. Jeter les précipités. Conserver les corps d’inclusion à −20 °C ou −80 °C.
REMARQUE : Avant de procéder à la purification des organismes d’inclusion, confirmez que l’induction et l’expression des protéines recombinantes ont été couronnées de succès. Exécuter des échantillons de chaque culture (prélevés avant et après l’induction de l’IPTG) sur un gel protéique; 15 % SDS-PAGE (gomme concentrée SDS-PAGE : H2O, 30 % acrylamide, 1 M Tris-HCl pH 6,8, 10 % SDS, 10 % APS et TEMED; Gel de séparation SDS-PAGE : H2O, 30% acrylamide, 1,5 M Tris-HCl pH 8,8, 10% SDS, 10% APS et TEMED; voir la Table des Matériaux ) pour les β2m, 10% SDS-PAGE pour la chaîne H.
4. Refolding du complexe de MHC
REMARQUE : L’efficacité des corps d’inclusion refolded affectera le rendement des protéines obtenues. Le pliage est en concurrence avec la polymérisation, de sorte qu’il est généralement admis que le repliement à de faibles concentrations de protéines est la méthode la plus réussie. Dans cet article, la concentration des corps d’inclusion est de 30 mg/mL.
- Préparez le refolding buffer.
- Varier la composition du tampon de refolding en fonction de la protéine. Par exemple, le pH, la résistance ionique, les conditions de redox et la présence de ligands affecteront les résultats de refolding. Le plus commun est d’utiliser des tampons à base de Tris ou HEPES à un pH neutre avec une concentration de NaCl de 50-500 mM, mais cela dépend également de la protéine cible. Ce qui suit est la formule tampon de refolding utilisée dans cet article.
- Préparer le tampon pliant avec 100 mM Tris-HCl pH 8.0, 400 mM L-arginine, 2 mM EDTA-2Na.
- Refroidir le tampon à 4 °C dans un flacon de 250 à 300 mL, puis ajouter 5 mM de glutathion réduit (GSH) et 0,5 mM de glutathion oxydé (GSSG). Remuer lentement à l’aide d’un agitateur magnétique à 4 °C pendant encore 10 à 20 minutes avant d’ajouter les corps d’inclusion et les peptides.
- Injection et dilution de la chaîne MHC H et β2m
REMARQUE : La température à laquelle le refolding est effectué peut varier, bien que généralement, afin de minimiser l’agrégation, 4 °C est le meilleur. Nous utilisons la dilution pour déplier les protéines.- À l’aide d’une aiguille d’une seringue de 1 mL, injecter 1 mL de corps d’inclusion hβ2m ou des corps d’inclusion bβde 2m dans deux tampons de relecture (1 litre chacun), respectivement. Injecter près de la tige en remuant vigoureusement rotative pour obtenir une dilution rapide et efficace. β2m se refolds relativement facile et reste stable même en l’absence de la chaîne H.
- Après que le β2m a été dissous dans la solution de refolding, dissoudre des peptides (5 mg/mL) dans DMSO et injecter rapidement 200 μL dans la solution de refolding. Remuer lentement pendant 10-20 min avant d’ajouter la chaîne H.
- Injecter la chaîne H avec la même procédure décrite ci-dessus β2m. La chaîne H est très instable; par conséquent, l’ordre d’injection est très important. Injecter 3 mL de corps d’inclusion de la chaîne H dans deux tampons de refolding différents (1 litre chacun) avec hβ2m ou bβ2m, respectivement. L’injection consécutive de petits aliquots au lieu de l’application unique de la quantité entière de protéines augmente le rendement du MHC refolded. Laisser le refolding se dérouler à 4 °C pendant 8-10 h.
- Concentration de protéines refolded
- Utilisez l’ultrafiltration dans une chambre pressurisée avec une membrane MMCO de 10 kDa pour la concentration des protéines qui se déploient. Cette méthode est pratique et peut être combinée avec l’échange tampon. Ajouter le tampon d’échange (20 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl pH 8.0) à la chambre et se concentrer sur un volume final de 30-50 mL.
- Transférer la solution de refolding dans un tube de centrifugeuse, tourner à 12.000 x g pendant 15 min à 4 °C pour enlever les précipités.
- Transférer soigneusement le supernatant et se concentrer davantage sur un volume final d’environ 1 mL.
- Centrifugeuse à 12 000 xg pendant 10 à 20 min. Transférer le supernatant dans un tube stérile et purifier les protéines à l’aide d’une colonne d’exclusion de taille de 10/300 GL.
- Prélever les échantillons au sommet et les analyser à l’aide de SDS-PAGE (gel polyacrylamide à 15 %).
- Recueillir le pic complexe du MHC et se concentrer jusqu’à une concentration finale de 15 mg/mL.
- Diluer le complexe à 7,5 mg/mL et 15 mg/mL pour la cristallisation.
5. Cristallisation, collecte et traitement des données
- Effectuer la cristallisation du MHC et du peptide complexes à l’aide de la technique de diffusion de vapeur de goutte assise.
- Filtrez les complexes Ptal-N*01:01/peptide avec des kits de cristal commerciaux (p. ex., kit Crystal Screen I/II, kit index, kit PEGIon I/II et kit PEGRx).
- Sceller la solution qui en résulte et l’équilibrer contre 100 μL de solution de réservoir à 4 ou 18 °C.
- Observez la croissance cristalline de la culture pendant 3 jours, 1 semaine, 2 semaines, 1 mois, 3 mois et 6 mois. Utilisez un microscope pour voir si chaque goutte de cristal a des cristaux.
REMARQUE : Des cristaux Ptal-N*01:01/HeV1 (bβ2m) ont été observés dans 0,2 M NaCl, 0,1 M Bis-Tris (pH 5,5) et 25 % (w/v) polyéthylène glycol 3 350 à une concentration de 7,5 mg/mL. Ptal-N*01:01/HeV1 (hβ2m) cristaux ont été observés dans 0,1 M HEPES, pH 7,0, 2% w/v polyéthylène glycol 3350 à une concentration de 7,5 mg/mL. - Pour une protection cryogénique, transférer les cristaux dans une solution de stockage contenant 20% de glycérol, puis refroidir rapidement dans un flux d’azote gazeux de 100 K.
- Recueillir des données sur la diffraction des rayons X à partir de la ligne de faisceau BL19U de l’installation de rayonnement synchrotron de Shanghai (Shanghai, Chine).
6. Détermination et analyses de la structure
- Avec des données structurelles haute résolution, traiter et l’échelle de la force de la collection en utilisant le programme Denzo et le logiciel HKL2000 (https://hkl-xray.com/)23.
- Après avoir choisi un meilleur modèle initial dans la Banque de données protéiques (PDB), déterminer les structures utilisant le remplacement moléculaire avec le programme Phaser MR en CCP424 (http://www.ccp4.ac.uk/). Le modèle utilisé était les coordonnées de structure avec protein data bank (PDB) code 5F1I.
- Utilisez le modèle de rayons X raffiné pour le raffinement initial des articulations. Utilisez phenix affiner seul et les modes communs pour la radiographie seule et le neutron commun et le raffinement des rayons X, respectivement.
- Après chaque tour de raffinement, vérifiez manuellement le modèle par rapport à Fo − Fc et 2Fo − Fc cartes de densité nucléaire positive dans Coot25 (https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/). Cela facilite le bon placement des eaux et de certains atomes D. Toutes les figures des structures ont été créées par PyMOL (http://www.pymol.org/).
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Representative Results
Des travaux antérieurs ont rapporté que le peptide HeV1 (DFANTFLP) dérivé de HeV a été présenté par Ptal-N*01:0110,19. Dans ce cas, la capacité de liaison de ce peptide à Ptal-N*01:01 avec une chauve-souris homologue β2m (bβ2m) et une β humainehéterologeuse de2m(hβ2m) (figure1C,1D)a étéévaluée. Des cristaux à résolution plus élevée ont été formés, respectivement( Figure 1E,1F). Un cristal est formé à partir du complexe Ptal-N*01:01/HeV1, qui a été formé par renaturation avec bβ2m, et la résolution est de 2,31 Å. Un cristal est formé à partir du complexe Ptal-N*01:01/HeV1, qui a été formé par renaturation avec hβ2m, et la résolution est de 1,6 Å. Le complexe Ptal-N*01:01/HeV1 a été formé avec succès par renaturation avec bβ2m et hβ2m (figure 1C,1D). Dans ce contexte, nous avons montré que le complexe Ptal-N*01:01/HeV1 n’a pas été formé sans la présence de β2m (figure 1A) et du H-2Kd qui se plient correctement à travers le hβ2m (figure 1B).
Les structures de Ptal-N*01:01/HeV1/bβ2m et Ptal-N*01:01/HeV1/hβ2m ont ensuite été analysées. Dans la structure Ptal-N*01:01/HeV1/bβ2m, résidus R3, H31, Q34, D53, W60, Y63 de bβ2m liés aux résidus de la chaîne H par le fond du PBG et résidus Q8, Y10, R12, N24, Y28, N98, N99 liés au domaine α3 de la chaîne H. Semblable au complexe Ptal-N*01:01/HeV1/bβ2m, dans la structure Ptal-N*01:01/HeV1/hβ2m, résidus conservés H31, D53, W60, Y63 de hβ2m qui correspondent à bβ2m, ont pris contact avec le fond du PBG et conservé les résidus Q8, Y10, R12, N24 qui correspondent à bβ2m liés au domaine α3 (figure 2A,2B).
Dans les structures globales Ptal-N*01:01/HeV1/bβ2m et Ptal-N*01:01/HeV1/hβ2m, l’écart moyen-carré des racines (RMSD) moyen des résidus 1-184 des chaînes H (formant l’α1α2 PBG) était de 0,248 sous toutes les superpositionsd’atomes de C α (figure 3A). Cette constatation indiquait qu’il n’y avait aucune différence entre ces deux complexes. Les conformations des peptides similaires dans les complexes avec différents β2m ont ensuite été comparées. La structure de l’alignement peptidique a montré que les conformations des peptides HeV1 dans ces deux complexes étaient assez similaires (Figure 3B). En outre, les structures de gp33 (KAVYNFATM) présentées par H-2Db et complexées de souris β2m (mβ2m) ou hβ2m ont été alignées. Le RMSD de l’α1α2 PBG de H-2Db était de 0,283 et les conformations globales des peptides dans ces deux structures étaient également similaires (Figure 3C,3D). Ces données indiquent que les β substitutionde 2m entre bβ2m et hβ2m, et mβ2m et hβ2m n’affectent pas les conformations des peptides présentés.
L’alignement des séquences a montré que les acides aminés β2m de différentes espèces sont fortement conservés (figure 4). Après analyse des β2m de différentes espèces ont montré que la plupart des acides aminés de β2m qui formaient les liaisons hydrogène avec la chaîne H du MHC I ont été conservés (Figure 4, Tableau 2). Pendant ce temps, les divers résidus étaient également des acides aminés ayant des propriétés chimiques similaires chez les mammifères. Cependant, les résidus clés impliqués dans la liaison de2m β à la chaîne H du MHC J’ai montré des polymorphismes chez les poulets, les poissons et les amphibiens (figure 4).
Tableau 1 : Les différents mammifères se combinent à des β2m. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger cette table.
Tableau 2 : Interactions de liaison hydrogène entre les βde 2m et les chaînes lourdes du MHC I de diverses espèces. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger cette table.
Figure 1 : Purification des protéines complexes solubles et refolded Ptal-N*01:01/HeV1 et photographies du cristal utilisé pour l’analyse de diffraction. Le M est des marqueurs de poids moléculaire en kDa. Le P1 est les agrégats. Le P2 est le complexe de la CSM. Le P3 est le complexe β2m. (A) Ptal-N*01:01/HeV1 n’a pas été formé sans la présence de β2m. (B) H-2Kd complexe a été formé par renaturation avec hβ2m. (C) Ptal-N *01:01/HeV1 complexe a été formé par renaturation avec bβ2m. Le profil est marqué par les positions approximatives des normes de masse moléculaire de 75,0, 44,0 et 13,7 kDa. (D) Ptal-N*01:01/ Le complexe HeV1 a été formé par renaturation avec hβ2m. (E) Le cristal est formé à partir du complexe Ptal-N*01:01/HeV1, qui a été formé par renaturation avec bβ2m. La flèche noire représente le cristal utilisé pour recueillir des données pendant la diffraction des rayons X. (F) Le cristal est formé à partir du complexe Ptal-N*01:01/HeV1 qui s’est formé par renaturation avec hβ2m. La flèche noire représente le cristal utilisé pour recueillir des données pendant la diffraction des rayons X. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Liaison à l’hydrogène entre β2m et chaîne lourde dans les complexes hybrides du MHC I. Liaison hydrogène entre β2m et chaîne H dans (A) Ptal-N*01:01/bβ2m/HeV1 et (B) Ptal-N*01:01/hβ2m/HeV1 MHC complexes. Les interactions de liaison hydrogène sont représentées par une ligne pointillée noire. Le carré représente la zone zoomée et montrée à droite dans les boîtes colorées correspondantes. Le rouge représente que les β2m et les β heterologousde 2m utilisent les mêmes acides aminés pour former des liaisons hydrogène avec la chaîne H. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Conformation similaire du complexe du MHC et des peptides antigéniques dans les complexes hybrides du MHC I. (A) La superposition des domaines α1α2 de Ptal-N*01:01/bβ2m (vert) et Ptal-N*01:01/hβ2m (gris). (B) La superposition du peptide HeV1 avec la superposition du domaine α1α2 de chaque molécule Ptal-N*01:01. HeV1 Peptide est représenté en rose en Ptal-N*01:01/bβ2m et en jaune en Ptal-N*01:01/hβ2m. (C) La superposition des domaines α1α2 de H-2Db /mouse β2m (mβ2m) (vert) et H-2Db /hβ2m (gris). (D) La superposition du peptide gp33 avec la superposition du domaine α1α2 de chaque molécule H-2Db. Peptide gp33 est représenté en bleu en H-2D b/mβ2m et en rose en H-2D b/hβ2m. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Alignement des séquences basées sur la structure de hβ2m avec β2m d’autres espèces. Les flèches noires dénotent β-brins. Les résidus mis en évidence en rouge sont complètement conservés, et les résidus dans les boîtes bleues sont très (>80%) Conservé. Les triangles jaunes représentent les acides aminés clés pour l’interaction entre les chaînes β2m et H. L’alignement des séquences a été généré à l’aide de Clustal X32 et ESPript33. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
La construction d’un complexe protéique hybride par substitution héterologique de différents taxons est une stratégie commune pour les investigations fonctionnelles et structurelles lorsque le complexe homologue n’est pas disponible, comme dans le MHC I et ses ligands. Toutefois, il y a peu de résumé s’agissant de la méthodologie et de la technologie. Dans ce cas, la structure de la chauve-souris MHC I, Ptal-N*01:01, stabilisée par bβ2m ou hβ2m a été analysée. Les acides aminés clés de βliaison de 2m à Ptal-N*01:01 se sont révélés conservés entre la chauve-souris et l’homme. Après analyse plus approfondie, les résidus clés impliqués dans la liaison deβ 2m à la chaîne H du MHC I se sont révélés conservés chez les mammifères mais polymorphes chez les poulets, les poissons et les amphibiens. Ces données indiquent qu’une β substitutionde 2m est un moyen faisable d’étudier le MHC I des mammifères. Cependant, la substitution entre les mammifères et les oiseaux, les poissons ou les amphibiens peut ne pas être possible.
Les études structurelles jouent un rôle essentiel dans la compréhension des mécanismes moléculaires de la présentation du peptide par les molécules du MHC I. La substitution β2m est couramment utilisée dans les études structurelles du MHC I14,16,17,18,26,27,28. Des travaux antérieurs ont montré que dans le MHC I bovin, N*01801, le murine β2m et le β bovinde 2m se sont comportés de la même manière lors de la liaison aux domaines α1α2 de la chaîne N*01801 H17. En l’espèce, la structure d’un seul peptide présenté par la même chaîne H du MHC I mais β2m a été analysée. Ces données montrent que les conformations du peptide sont similaires lorsqu’elles sont stabilisées par des β2m, ce qui indique que la substitution heterologous β2m n’affecte pas la présentation du peptide.
Peptides antigènes présentés par le MHC I sont reconnus par TCR pour la médiation de l’activation des cellules T29. Au cours de l’infection virale, l’évaluation des réponses immunitaires des cellules T spécifiques aux antigènes améliorera considérablement la compréhension des infections virales et des réponses immunitaires de l’hôte. Le tétramer peptidique-MHC est une technique importante pour évaluer les réponses des cellules T; il s’agit d’une technique pour tétramériser la molécule monomère du MHC, améliorer son affinité et la combiner avec de multiples TCRS sur les cellules T. Les tétramers sont largement utilisés dans la recherche et lediagnostic clinique 14,29,30. Récemment, les lymphocytes T (TCR-T) tcr-machinés sont devenus un sujet chaud dans l’immunothérapie de tumeur pour leur efficacité potentielle dans le traitement des tumeurs malignes31. La coloration du tétramer du MHC I est une méthode cruciale pour le dépistage de la liaison TCR spécifique aux peptides antigènes liés au cancer présentés par les molécules du MHC I29. Par conséquent, la préparation au tétras du CSM I joue un rôle essentiel dans le dépistage du TCR. En plus de la liaison de la chaîne MHC I H, β2m se lie également au CD8 à la surface des lymphocytes T, ce qui peut entraîner des taches non spécifiques lors du dépistage du TCR par coloration du tétramer du MHC I. Les β substitution de2m peuvent diminuer cette liaison non spécifique du tétramer MHC I.
Toutefois, il y a certaines limites au protocole. Premièrement, bien que E. coli demeure l’hôte d’expression dominant pour les protéines recombinantes, de nombreuses modifications post-translationnelles ne peuvent être effectuées et les produits protéiques exprimés forment des organismes d’inclusion insolubles. Ensuite, en raison de la substitution similaire de certains β2m non mammifères par des β mammifères de2m, on ne sait pas si les βde 2m non mammifères peuvent être remplacés par des β2m pour aider et stabiliser leur structure du MHC. Dans le protocole, nous avons inclus une description sur nos analyses essayées à l’aide du serveur NetMHCpan et Rosetta FlexPepDock. Malheureusement, ni l’une ni l’autre des prédictions produites ne correspondaient aux données expérimentales. Cela peut indiquer que les prédictions actuelles du peptide liant le MHC ne convenaient pas aux mammifères non humains et non souris comme les chauves-souris, qui peuvent avoir une autre façon de se lier au peptide. Par conséquent, nous devons combiner divers logiciels de prédiction et des résultats expérimentaux pour une analyse complète afin d’obtenir des peptides d’affinité élevée.
Dans le protocole décrit ici, l’étape clé est que le CSM peut être renaturé correctement. Il est très important d’obtenir un complexe de LAM avec une grande efficacité de refolding. Par conséquent, il est crucial de prêter attention à sélectionner des peptides appropriés et d’augmenter la pureté des corps d’inclusion.
En conclusion, on résume en l’espèce un protocole pour l’expression, le refolding, la cristallisation, la collecte de données cristallines et la détermination de la structure. De plus, la faisabilité d’une substitution β2m dans l’étude MHC I a été analysée. Cette étude fournit une référence solide pour comprendre le CSM I dans les études structurelles et fonctionnelles. En outre, ces données sont également significatives pour l’évaluation des réponses de cellule T pendant la maladie infectieuse et l’immunothérapie de tumeur.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à déclarer.
Acknowledgments
Cette étude a été soutenue par le fonds ouvert du laboratoire clé d’État de la biotechnologie pharmaceutique, Université de Nan-jing, Chine (Subvention no. KF-GN-201905), la National Natural Science Foundation of China (subventions 81971501). William J. Liu est soutenu par l’Excellent Young Scientist Program de la NSFC (81822040) et beijing New-star Plan of Science and Technology (Z181100006218080).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 kDa MMCO membrane | Merck millipore | PLGC07610 | |
| 30% Acrylamide | LABLEAD | A3291-500ml*5 | |
| 5×Protein SDS Loading | Novoprotein | PM099-01A | |
| AMICON ULTRA-15 15ML-10 KDa cutoff | Merck millipore | UFC901096 | |
| Ampicillin | Inalco | 1758-9314 | |
| APS | Sigma | A3678-100G | |
| BL21(DE3) strain | TIANGEN | CB105-02 | |
| DMSO | MP | 219605580 | Wear suitable gloves and eye/face protection. In case of contact with eyes, rinse immediately with plenty of water and seek medical advice. |
| DTT | Solarbio | D1070 | Gloves and goggles should be worn and operated in a ventilated kitchen. In case of contact with eyes, rinse immediately with plenty of water and seek medical advice. |
| EDTA-2Na | KeyGEN BioTECH | KGT515500 | |
| Glycerin | HUSHI | 10010618 | |
| GSH | Amresco | 0399-250G | |
| GSSG | Amresco | 0524-100G | |
| Guanidine hydrochloride | Amresco | E424-5KG | |
| hβ2m | our lab | Zhang, S. et al. Structural basis of cross-allele presentation by HLA-A*0301 and HLA-A*1101 revealed by two HIV-derived peptide complexes. Mol Immunol. 49 (1-2), 395-401, (2011). | |
| IPTG | Inalco | 1758-1400 | |
| L-Arginine Hydrochloride | Amresco | 0877-5KG | |
| NaCl | Solarbio | S8210 | |
| Protein Marker | Fermentas | 26614 | |
| SDS | Boao Rui Jing | A112130 | |
| Superdex Increase 200 10/300 GL | GE Healthcare | 28990944 | |
| TEMED | Thermo | 17919 | Gloves and goggles should be worn and operated in a ventilated kitchen. |
| Tris-HCl | Amresco | 0497-5KG | |
| Triton X-100 | Bioruler | RH30056-100mL | |
| Tryptone | Oxoid | LP0042 | |
| Yeast extract | Oxoid | LP0021 |
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