Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Akut Chorioamnionitis'in Yenidoğan Bağırsak Gelişimi Üzerindeki Etkilerini İncelemek için Anne İltihaba Fetal MaruzIyetin Bir Murine Modeli

Published: June 24, 2020 doi: 10.3791/61464
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 3, 1,4
1Division of Neonatology, Stead Family Department of Pediatrics, University of Iowa, 2Division of Maternal Fetal Medicine, Department of Obstetrics & Gynecology, University of Iowa, 3Division of Neonatology, Department of Pediatrics, Vanderbilt University, 4Department of Microbiology & Immunology, University of Iowa

Summary

FEMI'nin yavruların bağırsak sisteminin gelişimi üzerindeki etkilerini incelemek için canlı organizmaların komplikasyonları olmadan anne iltihabına (FEMI) fetal maruziyeti simüle etmek için bir chorioamnionitis modeli geliştirdik. Bu, chorioamnionitis'i takiben bağırsak hasarı gelişimi için mekanistik nedenlerin incelenmesine izin verir.

Abstract

Chorioamnionitis, preterm doğumun yaygın bir çökelticisidir ve nekrotizan enterokolit (NEC) de dahil olmak üzere prematürite morbiditelerinin çoğu ile ilişkilidir. Ancak, bu iki koşul arasında mekanistik bir bağlantı henüz keşfedilmemiştir. Lipopolisakkarit (LPS) kaynaklı fetal inflamasyon ve anne iltihabı (FEMI) içeren bir koryoamniyozit modelini benimsedik. Bu FEMI modeli, birçok klinik chorioamnionitis vakasında da bulunan steril bir maternal, plasental ve fetal enflamatuar kaskadı indükler. Canlı bakterileri kullanan ve koliyoamniyotitle sonuçlanan artan bir enfeksiyonun patofizyolojisini daha doğru bir şekilde taklit eden modeller mevcut olsa da, bu yöntemler olgunlaşmamış bağırsak sisteminin ve ilişkili gelişen mikrobiyomun gelişimi üzerinde dolaylı etkilere neden olabilir. Bu protokolü kullanarak, LPS kaynaklı FEMI'nin gebelik kaybı ve erken doğumda doza bağlı bir artışın yanı sıra yavrularda normal bağırsak gelişiminin bozulmasına neden olduğunu gösterdik. Ayrıca, FEMI'nin yavrularda bağırsak yaralanmasını ve serum sitokinleri önemli ölçüde artırdığını, aynı zamanda her ikisi de bağırsak iltihabına karşı doğuştan gelen ilk bağışıklık hattını sağlayan kadeh ve Paneth hücrelerini azaltdığını gösterdik. LPS kaynaklı FEMI'nin benzer bir modeli, chorioamnionitis ile merkezi sinir sisteminin sonraki anormallikleri arasındaki ilişkiyi modellemek için kullanılmış olsa da, bu protokol, chorioamnionitis ve NEC arasında potansiyel bir bağlantı olarak koryoamniyozit ve daha sonra bağırsak gelişimindeki pertürbasyonlar arasında mekanistik bir bağlantı kurmaya çalışan ilk protokoldür.

Introduction

Koryonik zarlar memeli hamileliğinde ayrılmaz bir rol oynar. Birden fazla işleve hizmet eden korozyon ve amnion içerirler. Fetüsü çevreler ve korurlar, anne ve fetal bölmeler arasında parakrin sinyali kolaylaştırırlar1ve koryonik membranlar içinde parturition1'inbaşlatılmasında rol alabilen yerel geri bildirim döngüleri oluştururlar. Zarların mevcut anlaşılması, amniyonun yapısal bariyer fonksiyonu sağladığını ve koronun öncelikle gelişmekte olan fetüsü anne bağışıklık sisteminden korumak için immünolojik bir tampon sağladığını gösterir2. Bu zarların iltihabı chorioamnionitis olarak bilinir. Tarihsel olarak, klinik koryoamniyozit tanısı anne ateşinin varlığı artı bir veya daha fazla fetal veya maternal klinik bulgu3,4 .4.'densonra konur. Bununla birlikte, bu tanım klinik olarak yararlı olsa da, hassasiyet eksikliği chorioamnionitis araştırmasını zorlaştırdı. 2015 yılında, tanıyı açıklığa kavuşturmak amacıyla, Eunice Kennedy Shriver Ulusal Çocuk Sağlığı ve İnsan Gelişimi Enstitüsü tarafından yapılan bir uzman paneli çalıştayı, koryoamniyonuti rahim içi inflamasyon veya enfeksiyon veya her ikisi (üçlü I)3olarak tanımladı. Bu açıklama önemlidir, çünkü mikrobiyal indüklenen enfeksiyon uterus / amniyotik iltihabın önemli bir nedeni olmakla birlikte, steril rahim / amniyotik inflamasyondan daha az görülür5,6,7. Genel olarak, chorioamnionitis, dönem teslimatlarının% 2\u20124'ünde ve 25 \u201230% preterm teslimatlarında görüldüğü gibi önemli bir halk sağlığı sorunu olmaya devam etmektedir8,9.

Koliyoamniyonut fetüs ve yenidoğan üzerinde önemli etkilere sahip olabilir. Literatürde chorioamnionitis'in prematürite morbiditelerinin çoğunun artan riski ile ilişkili olduğu iyi belgelenmiştir, bronkopulmoner displazi10, serebral beyaz madde yaralanması11, intraventriküler kanama12, prematürite retinopatisi13ve hem şüpheli hem de doğrulanmış erken başlangıçlı yenidoğan sepsis14,15. Olgunlaşmamış bağırsak sisteminin yaralanma ve onarım mekanizmalarıyla ilgilendiğimiz için, chorioamnionitis'in daha sonra nekrotizan enterokolit (NEC) gelişimi ile de ilişkili olduğunu belirtmek önemlidir15,16. NEC, preterm bebeklerin iltihaplanmaya ve sonraki bağırsak nekrozuna disregüle edilmiş konakçı yanıtı ile sonuçlanan yıkıcı bir gastrointestinal hastalığıdır17. Her yıl, NEC Amerika Birleşik Devletleri'nde 4000'den fazla bebeği etkiler ve bu bebeklerin üçte birine kadarı hastalıktan ölür18. NEC patogenez muhtemelen bağırsak olgunlaşmamışlığı, olgunlaşmamış bağışıklık sisteminin düzensizliği, bağırsak iltihabı ve bakteriyel translokasyon19'un bir kombinasyonunu içerir . Daha da önemlisi, NEC'in başlangıcı genellikle doğumdan haftalar sonra ve koryoamniyozite potansiyel maruziyet meydana gelir, bu da chorioamnionitis ile NEC'in sonraki gelişimi arasındaki mekanistik bağlantıyı belirsiz hale getirir20. Chorioamnionitis'in NEC patofizyolojisine katkıda bulunabileceği potansiyel bir mekanizma, maternal bağışıklık sisteminin yukarı doğrullaştırılması ve daha sonra normal fetal gelişimsel kalıpları bozabilecek güçlü bir fetal inflamatuar yanıt üretmesidir21,22,23.

Korneaların ve koyunların birden fazla memeli modeli kemirgenlerde ve koyunlarda bulunur24,25,26,27,28,29,30,31,32. Bununla birlikte, koliamnionit kaynaklı fetal inflamasyondan (FEMI) sonra ilk yenidoğan döneminin ötesinde bağırsak sisteminin gelişimi ile ilgili çok az veri bulunmaktadır. FEMI ile olgunlaşmamış bağırsak sisteminin yaralanmasının daha sonra gelişmesi arasındaki ilişkiyi araştırmak için lipopolisakkarit (LPS) kaynaklı FEMI modelini uyarladık. Lipopolisakkaritler gram negatif bakteriler üzerindeki hücre dışı yüzeyin önemli bir bileşenidir ve insanlar da dahil olmak üzere birden fazla ökaryotik türün doğuştan gelen bağışıklık sisteminin güçlü bir uyarıcısıdır33. Maternal LPS enjeksiyonu, canlı bakterilerin şaşırtıcı etkileri olmadan steril bir enflamatuar kaskad ile sonuçlanır ve preterm doğum34indüksiyonu için iyi kurulmuş bir modeldir Akut chorioamnionitis ve cenin enflamatuar yanıt sendromu (FIRS) modeli, koryoamniyonit24,35. Ayrıca bir koyun modeli 36 ve bir murine model37 , 38 ,39,40hem serebral beyaz hem de gri madde yaralanmasına neden olduğu gösterilmiştir. Bununla birlikte, bildiğimiz kadarıyla, bu chorioamnionitis ve FEMI modelini gastrointestinal sistemin gelişimi üzerindeki etkilerini araştırmak ve ayrıca chorioamnionitis ile daha sonra NEC41,42gelişimi arasındaki olası bir mekanistik bağlantıyı araştırmak için ilk kullananlarız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Tüm hayvan prosedürleri Iowa Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (Protokol #8041401) tarafından onaylandı. Tüm hayvanlar, Iowa Üniversitesi'nde Laboratuvar Hayvan Bakımı Değerlendirme ve Akreditasyon Derneği (AALAC) onaylı bir vivariumda barındırıldı. Tüm fareler vahşi tip Suş C57Bl / 6J'ydi.

1. Hamile farelerde FEMI'nin kurulması

  1. LPS hazırlığı
    1. Escherichia coli O55:B5'ten türetilen LPS kullanın (stok konsantrasyonu 2 mg/mL).
    2. LPS stok konsantrasyonunu 1:100 steril salin ile seyreltin ve 20 μg/mL çalışma konsantrasyonu elde edin.
  2. Maternal LPS enjeksiyonu
    1. Gebelik günü e15'te hamile barajları enjekte edin. Bu zaman noktası, murine gebelik yoluyla yaklaşık% 75'tir ve bu modeli, chorioamnionitis'e bağlı erken doğumların çoğunluğunun gerçekleştiği insan gebeliklerinin erken üçüncü üç aylık dönemine gelişimsel olarak benzer hale getirir.
    2. Uygun LPS dosing belirlemek için enjeksiyondan hemen önce hamile fareleri tartın.
    3. Aşağıdaki formülü kullanarak çalışma konsantrasyonunun dozunu hesaplayın: toplam 100 μg / kg LPS dozu için 5 μL x gram vücut ağırlığı (gbw). Hayvanları kontrol için, enjeksiyon için eşdeğer bir normal salin hacmi kullanın.
    4. Vortex LPS çözeltisi, her enjeksiyondan önce 15 saniye boyunca üç kez yüksekte.
    5. LPS hacmini 1 mL şırınna çekin.
    6. Hamile fareyi scruffing tekniği ile zapt edin. Dorsal reumbency pozisyonunda tutun ve enjeksiyonu gerçekleştirin.
      1. 30\u201240° açıyla karnın sağ alt çeyreğini (mesane ve karın damarlarını önlemek için) üzerine 30 ölçer 8 mm iğne eğimi yerleştirin. İğnenin yaklaşık 1/4 ila 1/2 uzunluğunu yerleştirin.
      2. Enjekte etmeden önce negatif basınç sağlamak için şırınna pistonu geri çekin. Negatif basınç varsa enjeksiyona devam edin.
      3. Enjeksiyondan sonra, fareleri yaklaşık 30 dakika izleyin ve daha sonra hamileliğin geri kalanı için kafeslere geri dönün.

2. Yavruların teslimi ve bakımı ve bağırsak hasadı

  1. E20'de vajinal doğum yoluyla normal olarak yavrular teslim edin.
    NOT: Bu model Şekil 1'de görülebilen ve aşağıdaki sonuçlarda tartışılan beklenen bir doza bağımlı fetal kayıp oranına sahiptir.
  2. Yavruların annelerle kalmasına ve reklam libitum beslemeleri almasına izin verin.
  3. Hasat gününde, tipik olarak doğum sonrası 14 (P14), Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi protokollerine uygun olarak servikal çıkık yoluyla yavrulara ötenazi.
  4. Makas ve forseps kullanarak, karnın orta çizgisine, deri ve peritondan, karnın tüm uzunluğu boyunca dikey bir kesi yapın. İnce bağırsağı mideden makasla sökmeğe çıkarın ve asalarla mezteri çıkarın.
  5. İnce bağırsağın distal 1/3'ü (insan ileumunun kesit temsilcisi), proksimal ince bağırsağı, cecum'ı ve kolonu atarak izole edin ve saklayın.
  6. İleum kısmını makas kullanarak ikiye bölün.
  7. Proksimal yarısını daha sonra RNA nicelemesi için bir RNA stabilizasyon çözeltisine yerleştirin.
  8. Distal yarısını slayt hazırlığı için% 10 nötr tamponlu formalin içine yerleştirin.

3. Bağırsak yaralanması puanlaması

  1. Bölüm parafin gömülü doku 5 μm kalınlığında dilimler halinde ve cam slaytlar üzerine monte.

    NOT: Örnekleri parafin gömme, bölümleme ve slaytlara montaj için bir histoloji çekirdeğine gönderiyoruz.
  2. Slaytları standart prosedürlere göre ayrıştırın.
  3. Standart prosedürlere göre hematoksilin ve eozin ile leke bölümleri.
  4. Daha önce açıklandığı gibi bağırsak yaralanması için 3 puan ölçeğinde puan bölümleri42,43.
    1. Hafif mikroskopi kullanarak, villus bütünlüğünü ve bodrum zarından ayırmayı değerlendiren 3 puanlık bir ölçekte iki ayrı kör araştırmacı tarafından genelleştirilmiş bağırsak yaralanmasını değerlendirin43 (Ek Şekil 1). Bağırsak hasarı en iyi 20x büyütme ve sayısal diyafram 0.50'de değerlendirilir.
    2. Normal mukozayı tanımlamak için 0 puanı atayın.
    3. Subepithelial Gruenhagen'in uzayının gelişimini, vakuolizasyon veya villi'nin lamina propria veya uçları ile sınırlı olan subepithelial kaldırmayı kapsayan hafif yaralanmayı tanımlayan 1 puan atayın.
    4. Villi, villi distorsiyon veya mukozal ülserasyon ve lamina proprianın parçalanmasından daha büyük epitel kaldırma ve vakuolizasyon ile belirtilen ciddi yaralanmayı tanımlamak için 2 puan atayın.

4. Paneth ve kadeh hücrelerinin nicelleştirilmesi

  1. Deparaffinizasyonun ardından, aşağıdaki adımlara göre daha önce açıklandığı gibi hem kadeh hem de Paneth hücrelerini belirtmek için Alcian Blue/Periodic Acid Schiff lekesi ile Adım2.8'den doku bölümlerinin leke slaytları.
    NOT: Alcian Blue/Periodic Acid Schiff lekesi Paneth veya goblet hücrelerine özgü olmasa da, deneyimlerimize göre, kör deneyimli araştırmacılar hücresel hedefli antikorlara kıyasla bu lekeyi kullanarak eşdeğer hücresel nicelemelere sahiptir, önemli ölçüde daha az arka plan lekesi46.
  2. Deparaffinize, leke ve susuz slaytlar aşağıdaki gibi.
    1. İki kez 10 dakika boyunca ksilen olarak bastırın.
      DİkKAT: Duman kaputunda ksilen kullanılmalıdır.
    2. %100 EtOH ile durulayın.
    3. 3 dakika boyunca % 100 EtOH'da, daha sonra 3 dakika boyunca% 90 EtOH'da, ardından 3 dakika boyunca% 70 EtOH'da ve son olarak 3 dakika boyunca% 50 EtOH'da slaytları batırın.
    4. Akan musluk suyunun altında 5 dakika yıkayın.
      DİkKAT: Doku örneğinin kaybını önlemek için bölümü akan sudan uzağa doğru yönlendirin.
    5. Alcian mavi leke solüsyonlarını standart bir kahve filtresi ile filtreleyin.
    6. Alcian mavi lekesinde 15 dakika leke slaytları ve ardından 2 dakika boyunca akan musluk suyu altında yıkayın.
    7. 200 mL çift damıtılmış suda 1 mg periyodik asit seyreltin. Bu çözeltide 5 dakika boyunca slaytları batırın. Daha sonra akan musluk suyunun altında 1 dakika yıkayın.
    8. Schiff'in reaktifiyle 10 dakika lekele. Akan musluk suyunun altında 5 dakika yıkayın.
    9. Slaytları hematoksilin ile 1 dakika lekeleyin ve ardından 2 dakika boyunca akan musluk suyunun altında yıkayın.
    10. Onları asit alkolüne batırın (1 mL hidroklorik asit 99 mL%70 EtOH karıştırılır) 1 dakika boyunca.
    11. Scott'ın musluk suyuna (musluk suyunda% 0.1 NaHCO3 konsantrasyonu) 1 dakika batırın ve ardından 1 dakika boyunca akan musluk suyunun altında yıkayın.
    12. Slaytları susuz kalsın.
      1. Her slaydı %70 EtOH'da 10 kez daldırın, sonra %90 EtOH'da 10 kez ve %100 EtOH'da 10 kez daldırın.
      2. 10 dakika boyunca % 100 EtOH'da batır, ardından her biri 3 dakika boyunca taze ksilende iki kez batır.
    13. Numunenin üzerine bir damla montaj ortamı yerleştirin ve üzerine bir kapak parçası yerleştirin.
  3. Kadeh hücre sayımı
    1. Hafif mikroskopi kullanarak kadeh hücrelerini sayın (Tamamlayıcı Şekil 2). Bağırsak dokusunun her bir parçası için, kadeh hücrelerinin sayısını ve 500 epitel hücresini sayın ve 100 epitel hücresi başına bir oran olarak goblet hücre oranını ifade edin. Kadeh hücreleri en iyi 20x büyütme ve sayısal diyafram 0.5'te sayılır.
  4. Paneth hücre sayımı
    1. Işık mikroskopisi kullanarak Paneth hücrelerini sayın (Tamamlayıcı Şekil 2). Bağırsak dokusunun her parçası için, bağırsak mahzeni başına Paneth hücrelerinin bir oranı olarak ifade edin. Her bağırsak dokusu parçası başına 100 bağırsak mahzeni sayın. Paneth hücreleri en iyi 20x-60x büyütme ve sayısal diyafram 0.50-1.30 olarak sayılır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Embriyonik 15. günde FEMI'ye maruz kalmak, doza bağlı gebelik kaybına ve doz bağımlı preterm işgücü oranına yol açar (Şekil 1)42. Deneyler için, fetüsleri önemli bir inflamatuar hakarete maruz tutarken gebelik kaybını ve prematüritesini (hem prematürite hem de intrauterin fetal ölüm arasında% 50 kayıp) en aza indirmek için 100 μg / kg LPS dozunu kullanmayı seçtik.

Bu yaklaşımı kullanarak, FEMI'nin yavruların sonraki yaralanması üzerindeki etkilerini inceledik. Genelleştirilmiş bağırsak yaralanmasını ölçmek için 3 noktalı histolojik bir ölçek kullanarak, doğumda (P0) ve yetişkinlikte (P56 veya 8 haftalık yaşam) önemli yaralanmalar bulduk (Şekil 2). Bu yaralanmanın FEMI dışındaki hayvanlara herhangi bir ek uyaran olmaması durumunda meydana geldiğini belirtmek önemlidir, bu da FEMI'nin tek başına yenidoğan murine bağırsak sisteminin normal homeostazını bozduğunu düşündürmektedir. Fare, yaşamın ilk 4 haftasında gelişmeye devam eden nispeten olgunlaşmamış bir bağırsakla doğduğundan47,48, bu aynı zamanda olgunlaşmamış bağırsak sistemlerine sahip preterm bebeklerle ilgilidir.

FEMI'nin hem bağırsak epitelinin normal gelişimi hem de olgunlaşmamış bağırsak sisteminin savunma mekanizmaları üzerindeki etkisini daha da anlamak için, insan ileuma benzeyen küçük bağırsak sisteminin distal üçte biri olan musin üreten kadeh hücrelerinin ve antimikrobiyal peptit üreten Paneth hücrelerinin sayısını ölçtük. FEMI'nin, FEMI'siz hayvanlara kıyasla hem kadeh hücrelerinin hem de Paneth hücrelerinin kaybına neden olarak bağırsak epitelinin normal bileşimini bozduğunu bulduk (Şekil 3).

FEMI'nin yenidoğan inflamatuar yanıtı üzerindeki etkilerini araştırmak için, ELEKTROKimyasal inflamatuar ile ELISA kullanarak, IL-1β, IL-10, KC-GRO (IL-8'in murine eşdeğeri) ve IL-6'yı içeren çeşitli serum inflamatuar belirteçlerini FEMI'li ve FEMI'siz yavruların serumundan ölçtük (Şekil 4). FEMI'nin P0'daki tüm sitokinler için enflamatuar kaskadını önemli ölçüde artırdığını bulduk. İlerleyen yaşlarda inflamatuar basamak (P7\u2012P56) zaman noktası ve sitokine göre farklılık gösterdi. En ilginç olanı, IL-6 için, FEMI ve sham gruplarında P7\u2012P28'de benzer seviyeler vardı, ancak ikincil bir müdahale olmamasına rağmen, P56'daki FEMI grubunda önemli ölçüde daha yüksek seviyeler vardı. Il-6'nın FEMI modelinde doğum sonrası bağırsak hasarı gelişimi için kritik bir sitokin olduğunu gösterdiğimiz için bu özellikle önemlidir.

Figure 1
Şekil 1: FEMI dozunun gebelik sonuçlarına etkisi. Hamilelik çöplerinin hayatta kalması, daha yüksek gebelik kaybı (A) ve daha yüksek erken doğum oranlarına (B) neden olan daha yüksek dozlarla bağımlıdır. Şekil Fricke ve ark42'denizin alınarak uyarlanmıştır. 100 μg/ kg LPS dozunu kullanan FEMI, yavrular için bir haftalık yaşam boyu% 50 sağkalım yaratır. Her veri noktası, n > 8 gebeliğini ve en az üç bireysel deneyi temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: FEMI'nin zamanla distal küçük bağırsak yaralanması patinolojileri üzerine etkisi. Bağırsak örnekleri doğumda, 1 haftalık yaşamda, 2 haftalık yaşamda ve 8 hafta yaşamda FEMI'ye (100 μg/ kg LPS) veya sahte kontrole maruz kalan farelerden hasat edildi. Örnekler kör araştırmacılar tarafından 3 puanlık yaralanma ölçeği kullanılarak puanlandı42,43. FEMI tek başına daha fazla hakaretle doğumda, 1 haftalık yaşamda ve 8 haftalık yaşamda önemli miktarda yaralanmaya neden oldu. Şekil Fricke ve ark.42'denizin alınarak uyarlanmıştır. Her veri noktası, 10 yavru > ve en az 3 hamile barajdan en az üç bireysel deneyi temsil eder. Mann-Whitney parametrik olmayan T testi, her zaman diliminde bağırsak yaralanması skorlarını karşılaştırmak için kullanıldı. Yıldız işareti p < 0.05'i gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: FEMI, gelişim sırasında ince bağırsakta normal kadeh ve Paneth hücre miktarlarında değişikliklere neden olur. Bağırsak örnekleri doğumda, FEMI'ye (100 μg/ kg LPS) veya sahte kontrole maruz kalan farelerden 1, 2, 4 ve 8 haftalık yaşamda hasat edildi. Örnekler hem kadeh hem de Paneth hücrelerini tespit etmek için Alcian mavisi/Periyodik Asit Schiff lekesi ile boyandı ve bunlar kör bir araştırmacı tarafından ölçüldü. FEMI'li hayvanlardan hem kadeh hücreleri hem de Paneth hücreleri, her yaştaki sham kontrollerine kıyasla bir eğilim veya önemli bir düşüş gösterdi. Elgin ve ark.41'inizniyle uyarlanmış şekil. Her veri noktası, 10 yavru > ve en az üç bireysel deneyi temsil eder. Hata çubukları ortalamanın standart hatasını temsil eder. Öğrenci T testi, her zaman noktasında kadeh ve Paneth hücrelerinin miktarlarını karşılaştırmak için kullanılmıştır. Yıldız işareti p < 0.05'i gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4: FEMI, P0'da doğumdan hemen sonra tüm sitokinler için küresel bir yenidoğan inflamatuar dalgalanmaya neden olarak P56'da il-6'nın geç dalgalanmasını neden eder. Serum sitokinler P0, P7, P14 ve P28'de üreticinin talimatlarına göre elektrokimyaminsans ile ELISA kullanılarak ölçüldülür ve plakalar 620 nm'de okunurdu. Sitokin değerleri burada bir radar arsasında temsil edilir ve tüm sitokinler maksimum değerin yüzdesi olarak çizilir. FEMI grubunda P0'daki tüm sitokinlerde (IL-1β, IL-10, KC-GRO ve IL-6) kontrol grubuna kıyasla anlamlı artışlar oldu (hepsi p < 0.05). Femi'li yavrularda P56'daki IL-6 seviyelerinde de FEMI'ye kıyasla yeniden canlanan bir artış oldu (parametrik olmayan Kruskal-Wallis testi ile p < 0.05), bu geç zaman diliminde kontrole kıyasla FEMI grubunda önemli ölçüde yükselen tek sitokindi. Elgin ve ark.41'inizniyle uyarlanmış şekil. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 1: H&E lekeli ileal dokunun bağırsak yaralanması skoru. Yaralanma skorları, villi vakuolizasyon derecesi, mukozal ülserasyon, lamina propria hasarı ve daha önce açıklandığı gibi villi içinde kanama varlığına göre üç noktalı bağırsak yaralanması puanlama ölçeği (0=normal, 1=hafif yaralanma, 2=ağır yaralanma) ile belirlenir43. Elgin ve ark.41'inizniyle uyarlanmış şekil. Bu rakamı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Şekil 2: Kadeh ve Paneth hücrelerinin Alcian Blue/PAS boyamasının temsili görünümü. Bağırsak dokularının Alcian Blue/PAS lekelenmesi, bağırsak villisinde (beyaz oklarla işaretlenmiş üst panel, 20x büyütmede çekilen görüntü) bulunan kadeh hücrelerinin ve lamina propriasında bağırsak villisinin altında bulunan Lieberkuhn'un mahzenlerinde bulunan Paneth hücrelerinin (sarı oklarla işaretlenmiş alt panel, 60x büyütmede çekilen görüntü) net bir şekilde görselleştirilmesini sağlar. Bu rakamı indirmek için lütfen tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Chorioamnionitis terimin% 2\u20124'ünü ve 25\u201230% preterm teslimatlarının%8,9'unuetkiler. Bununla birlikte, koryoamniyonulün etkisi, fetüs ve yenidoğan 10 , 11 , 12 , 13,14,15,16üzerinde önemli etkileri olduğu gösterildiği için doğumu uzun süre uzatabilir. Daha da önemlisi, chorioamnionitis'in NEC15,16'nın sonraki gelişimi ile ilişkili olduğu gösterilmiştir. Hala eksik anlaşılsa da, NEC patogenez muhtemelen bağırsak olgunlaşmamışlığı, olgunlaşmamış bağışıklık sisteminin düzensizliği, bağırsak iltihabı ve bakteriyel translokasyonun bir kombinasyonunu içerir ve bağırsak nekrozunun son ortak yolu ile sonuçlanır19. Bununla birlikte, chorioamnionitis ve daha sonra NEC gelişimi arasında mekanistik bir bağlantı belirsizliğini korumaktadır20ve chorioamnionitis'in önceki hayvan modelleri bu ilişkiyi incelemek için yetersiz kalmıştır. Bu bilgi açığını gidermek için, yenidoğan doğumuna ve sağkalıma izin vermek için yaygın olarak kullanılan LPS kaynaklı korine chorioamnionitis modelini ve erken doğum34,37,38,39,40'ı değiştirdik. Bunu yaparken, anne iltihabına (FEMI) fetal maruziyetin sonraki bağırsak gelişimi üzerindeki etkisini incelemek için chorioamnionitis42'de görülen enflamatuar durumu yaklaşık olarak inceleyen bir model oluşturduk.

Bu protokolle, LPS kaynaklı FEMI kullanan bu murine chorioamnionitis modelinin, hem kısa hem de uzun süreli bağırsak yaralanmasının yanı sıra normal bağırsak gelişiminin kesintiye uğramasına, özellikle de her ikisi de bağırsak iltihabına karşı doğuştan gelen ilk bağışıklık hattını sağlayan hem kadeh hem de Paneth hücrelerinin küçültülmesine neden olduğunu gösterdik. Bu model ile görülen bağırsak hasarı ve histolojik hücresel değişiklikler NEC'de görülen yaralanmayı taklit etmek için etkili bir model olduğunu göstermektedir. Bunun başlıca nedeni, Paneth hücrelerinin ve kadeh hücrelerinin her ikisinin de NEC patogenezine karışması ve histolojik yaralanma kalıplarının insan nec41 , 42,49vakalarında görülenlere benzer olmasıdır. Bu nedenle, bu LPS kaynaklı FEMI chorioamnionitis modeli, chorioamnionitis ve daha sonra bağırsak yaralanması arasındaki mekanistik bağlantıyı, özellikle NEC'in gelişimini ve canlı bakterileri kullanan mevcut modellerle mümkün olmayacak olan chorioamnionitis'in gelişmekte olan mikrobiyom üzerindeki potansiyel etkilerini araştırmak için ideal bir modeldir.

In vivo, chorioamnionitis genellikle zarların erken yırtılması ve chorioamnionitis klinik fenotipi ile sonuçlanan artan bir bakteriyel enfeksiyon içerir ve bu patofizyolojiyi daha doğru yansıtan chorioamnionitis hayvan modellerivardır 25,28,30,32. Bununla birlikte, laboratuvarımız gelişen mikrobiyom da dahil olmak üzere bağırsak gelişimini incelediğinden, bir chorioamnionitis modelinde canlı bakterilerin varlığı mikrobiyom analizini şaşırtanaydı. Bu nedenle, canlı bakterileri kullanan mevcut chorioamnionitis modelleri, chorioamnionitis ile daha sonra NEC gelişimi arasındaki mekanistik bağlantıyı araştırmak için pratik değildir. Ek olarak, LPS kaynaklı chorioamnionitis modelleri zaten postnatal beyaz ve gri madde beyin hasarı modellemede etkili olmuştur36Bu yöntemin doğum sırasında chorioamnionitis'e maruz kalma ile ilişkili prematürite morbiditelerini modellemenin etkili bir yolu olduğunu göstermiştir.

Bu modelin FEMI'yi indük etmek için kullanılan LPS dozu üzerinde oldukça bağımlı olduğunu da belirtmek önemlidir. Bu protokoldeki birincil kritik adım, LPS'nin intraperitoneal enjeksiyonu ile gebe barajlarında FEMI indüksiyonudur; bu nedenle, şaşırtıcı olmayan bir şekilde, FEMI'yi teşvik etmek için kullanılan LPS dozunun bu deneylerin sonuçlarında son derece önemli olduğunu bulduk. İlk deneylerde, 100 μg / kg LPS'lik bir doz kullanıldı, çünkü bu LPS dozu anne mortalitesi ile ilişkili değildi ve yaklaşık% 50 yenidoğan sağkalımının yanı sıra yavrularda önemli bağırsak yaralanması ile sonuçlandı41,42.

LPS, Toll benzeri reseptör 4 (TLR4) kompleksine bağlanır, hücre içi sinyal proteinlerinin toplanmasına, sitokin üretimine ve pro-enflamatuar sinyalizasyonun başlatılmasına neden olur50. TLR2, TLR3, TLR4, TLR7, TLR8 ve TLR9 gibi toll benzeri reseptörler (TLR'ler), virüs, bakteri ve mantar gibi çeşitli patojenler ve mikroorganizmalarla görülen enflamatuar yanıtın indüksiyonunda önemlidir51. İlginçtir ki, TLR3'ün yukarı yönlü regülasyonunun da yenidoğan murine rotavirüs modelinde artan histolojik bağırsak hasarı ve viral dökülme ile ilişkili olduğu gösterilmiştir; ayrıca, TLR3 nakavt bu etkileri düzeltti52. Bu nedenle, model TLR4 yollarını kullanırken, diğer TLR'lerin uyarılmasının benzer bulgulara yol edebileceğini varsaymak mantıklıdır.

Bu metodolojiyi kullanarak, hamile barajlardaki LPS enjeksiyonlarının amniyotik sıvıyı tutarken anne, plasental ve fetal enflamatuar belirteçlerde artışlara neden olduğunu ve plaseta doğrudan hasara neden olduğunu gösterebildik42. İlginçtir ki, bu metodoloji rahim arterlerinde direnç değişikliği göstermedi. FEMI modeli ayrıca, maruz kalan yavruların IL-6 bağımlı yolu41 aracılığıyla 42 önemli bağırsak yaralanmasına sahip olduğunu ve goblet hücreleri ve Paneth hücreleri41gibi bağırsağın önemli savunma mekanizmalarını etkileyebileceğini gösterdiğimiz için yavrular üzerinde önemli bir etkiye sahiptir. Bu yaralanma, yenidoğan yavrularını sonraki LPS kaynaklı bağırsak hasarına veiltihaplanma 41'e giderek daha duyarlı hale getirir, bu da chorioamnionitis'e maruz kalan bebeklerin NEDEN NEC geliştirmeye karşı artan bir duyarlılığa sahip olduğunu açıklayabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Acknowledgments

Bu çalışma kısmen Ulusal Sağlık Enstitüleri (DK097335 & T32AI007260) ve Iowa Stead Üniversitesi Aile Pediatri Bölümü aracılığıyla desteklendi.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10% neutral buffered formalin Sigma HT501128
Alcian blue stain Newcomer supply 1003A
C57Bl6/J mice Jackson Laboratories 664
Ethanol Decon labs 2701
HCl Sigma H1758
Hematoxylin stain Leica 381562
LPS Sigma L2880
NaHCO3 Sigma S6014
Nikon Eclipse Ni-U Microscope Nikon 2CE-MQVJ-1
Periodic Acid ACROS H5106 CAS# 10450-59-9
RNAlater Thermofisher Am7021
Schiff's reagent Sigma S5133
Secor Imager 2400 Meso Scale Discovery (MSD)
V-Plex Assay Meso Scale Discovery (MSD)
Xylene Sigma 534056

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Myatt, L., Sun, K. Role of fetal membranes in signaling of fetal maturation and parturition. International Journal of Developmental Biology. 54 (2-3), 545-553 (2010).
  2. Verbruggen, S. W., Oyen, M. L., Phillips, A. T., Nowlan, N. C. Function and failure of the fetal membrane: Modelling the mechanics of the chorion and amnion. PLoS One. 12 (3), 0171588 (2017).
  3. Higgins, R. D., et al. Evaluation and Management of Women and Newborns With a Maternal Diagnosis of Chorioamnionitis: Summary of a Workshop. Obstetrics & Gynecology. 127 (3), 426-436 (2016).
  4. Peng, C. C., Chang, J. H., Lin, H. Y., Cheng, P. J., Su, B. H. Intrauterine inflammation, infection, or both (Triple I): A new concept for chorioamnionitis. Pediatrics and Neonatology. 59 (3), 231-237 (2018).
  5. Romero, R., et al. Prevalence and clinical significance of sterile intra-amniotic inflammation in patients with preterm labor and intact membranes. American Journal of Reproductive Immunology. 72 (5), 458-474 (2014).
  6. Romero, R., et al. Sterile intra-amniotic inflammation in asymptomatic patients with a sonographic short cervix: prevalence and clinical significance. Journal of Maternal-Fetal and Neonatal. , 1-17 (2014).
  7. Romero, R., et al. Sterile and microbial-associated intra-amniotic inflammation in preterm prelabor rupture of membranes. Journal of Maternal-Fetal and Neonatal Medicine. 28 (12), 1394-1409 (2015).
  8. Goldenberg, R. L., Culhane, J. F., Iams, J. D., Romero, R. Epidemiology and causes of preterm birth. Lancet. 371 (9606), 75-84 (2008).
  9. Erdemir, G., et al. Histological chorioamnionitis: effects on premature delivery and neonatal prognosis. Pediatrics and Neonatology. 54 (4), 267-274 (2013).
  10. Metcalfe, A., Lisonkova, S., Sabr, Y., Stritzke, A., Joseph, K. S. Neonatal respiratory morbidity following exposure to chorioamnionitis. BMC Pediatrics. 17 (1), 128 (2017).
  11. Anblagan, D., et al. Association between preterm brain injury and exposure to chorioamnionitis during fetal life. Scientific Reports. 6, 37932 (2016).
  12. Villamor-Martinez, E., et al. Corrigendum: Chorioamnionitis Is a Risk Factor for Intraventricular Hemorrhage in Preterm Infants: A Systematic Review and Meta-Analysis. Frontiers in Physiology. 10, 102 (2019).
  13. Villamor-Martinez, E., et al. Chorioamnionitis as a risk factor for retinopathy of prematurity: An updated systematic review and meta-analysis. PLoS One. 13 (10), 0205838 (2018).
  14. Randis, T. M., et al. Incidence of early-onset sepsis in infants born to women with clinical chorioamnionitis. Journal of Perinatal Medicine. 46 (8), 926-933 (2018).
  15. Rodrigo, F. G. M., Henriquez F, G. G., Aloy, F. J., Perez, G. A. A. Outcomes of very-low-birth-weight infants exposed to maternal clinical chorioamnionitis: a multicentre study. Neonatology. 106 (3), 229-234 (2014).
  16. Been, J. V., Lievense, S., Zimmermann, L. J., Kramer, B. W., Wolfs, T. G. Chorioamnionitis as a risk factor for necrotizing enterocolitis: a systematic review and meta-analysis. Journal of Pediatrics. 162 (2), 236-242 (2013).
  17. Tanner, S. M., et al. Pathogenesis of necrotizing enterocolitis: modeling the innate immune response. American Journal of Pathology. 185 (1), 4-16 (2015).
  18. Fitzgibbons, S. C., et al. Mortality of necrotizing enterocolitis expressed by birth weight categories. Journal of Pediatric Surgery. 44 (6), 1075-1076 (2009).
  19. Vongbhavit, K., Underwood, M. A. Prevention of Necrotizing Enterocolitis Through Manipulation of the Intestinal Microbiota of the Premature Infant. Clinical Therapeutics. 38 (4), 716-732 (2016).
  20. Yee, W. H., et al. Incidence and timing of presentation of necrotizing enterocolitis in preterm infants. Pediatrics. 129 (2), 298-304 (2012).
  21. Gantert, M., et al. Chorioamnionitis: a multiorgan disease of the fetus. Journal of Perinatology. 30, 21-30 (2010).
  22. Hudalla, H., et al. LPS-induced maternal inflammation promotes fetal leukocyte recruitment and prenatal organ infiltration in mice. Pediatric Research. 84 (5), 757-764 (2018).
  23. Yamada, N., et al. Histological severity of fetal inflammation is useful in predicting neonatal outcome. Placenta. 36 (12), 1490-1493 (2015).
  24. Wolfe, K. B., et al. Modulation of lipopolysaccharide-induced chorioamnionitis in fetal sheep by maternal betamethasone. Reproductive Sciences. 20 (12), 1447-1454 (2013).
  25. Normann, E., et al. A novel mouse model of Ureaplasma-induced perinatal inflammation: effects on lung and brain injury. Pediatric Research. 65 (4), 430-436 (2009).
  26. Burd, I., Brown, A., Gonzalez, J. M., Chai, J., Elovitz, M. A. A mouse model of term chorioamnionitis: unraveling causes of adverse neurological outcomes. Reproductive Sciences. 18 (9), 900-907 (2011).
  27. Dell'Ovo, V., et al. An animal model for chorioamnionitis at term. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 213 (3), 387 (2015).
  28. Randis, T. M., et al. Group B Streptococcus beta-hemolysin/cytolysin breaches maternal-fetal barriers to cause preterm birth and intrauterine fetal demise in vivo. Journal of Infectious Diseases. 210 (2), 265-273 (2014).
  29. Breen, K., et al. TLR-4-dependent and -independent mechanisms of fetal brain injury in the setting of preterm birth. Reproductive Sciences. 19 (8), 839-850 (2012).
  30. Burd, I., Balakrishnan, B., Kannan, S. Models of fetal brain injury, intrauterine inflammation, and preterm birth. American Journal of Reproductive Immunology. 67 (4), 287-294 (2012).
  31. Agrawal, V., et al. Role of Notch signaling during lipopolysaccharide-induced preterm labor. Journal of Leukocyte Biology. 100 (2), 261-274 (2016).
  32. Filipovich, Y., Klein, J., Zhou, Y., Hirsch, E. Maternal and fetal roles in bacterially induced preterm labor in the mouse. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 214 (3), 381-389 (2016).
  33. Alexander, C., Rietschel, E. T. Bacterial lipopolysaccharides and innate immunity. Journal of Endotoxin Research. 7 (3), 167-202 (2001).
  34. McCarthy, R., et al. Mouse models of preterm birth: suggested assessment and reporting guidelines. Biology of Reproduction. 99 (5), 922-937 (2018).
  35. Rueda, C. M., et al. Lipopolysaccharide-Induced Chorioamnionitis Promotes IL-1-Dependent Inflammatory FOXP3+ CD4+ T Cells in the Fetal Rhesus Macaque. Journal of Immunology. 196 (9), 3706-3715 (2016).
  36. Gavilanes, A. W., et al. Chorioamnionitis induced by intraamniotic lipopolysaccharide resulted in an interval-dependent increase in central nervous system injury in the fetal sheep. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 200 (4), 431-438 (2009).
  37. Boksa, P. Effects of prenatal infection on brain development and behavior: a review of findings from animal models. Brain, Behavior, and Immunity. 24 (6), 881-897 (2010).
  38. Knuesel, I., et al. Maternal immune activation and abnormal brain development across CNS disorders. Nature Reviews Neurology. 10 (11), 643-660 (2014).
  39. Garay, P. A., Hsiao, E. Y., Patterson, P. H., McAllister, A. K. Maternal immune activation causes age- and region-specific changes in brain cytokines in offspring throughout development. Brain, Behavior, and Immunity. 31, 54-68 (2013).
  40. Smith, S. E., Li, J., Garbett, K., Mirnics, K., Patterson, P. H. Maternal immune activation alters fetal brain development through interleukin-6. Journal of Neuroscience. 27 (40), 10695-10702 (2007).
  41. Elgin, T. G., et al. Fetal exposure to maternal inflammation interrupts murine intestinal development and increases susceptibility to neonatal intestinal injury. Disease Models & Mechanisms. 12 (10), (2019).
  42. Fricke, E. M., et al. Lipopolysaccharide-induced maternal inflammation induces direct placental injury without alteration in placental blood flow and induces a secondary fetal intestinal injury that persists into adulthood. American Journal of Reproductive Immunology. 79 (5), 12816 (2018).
  43. Wynn, J. L., et al. Targeting IL-17A attenuates neonatal sepsis mortality induced by IL-18. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (19), 2627-2635 (2016).
  44. Brown, K. S., et al. Tumor necrosis factor induces developmental stage-dependent structural changes in the immature small intestine. Mediators of Inflammation. 2014, 852378 (2014).
  45. McElroy, S. J., et al. The ErbB4 ligand neuregulin-4 protects against experimental necrotizing enterocolitis. American Journal of Pathology. 184 (10), 2768-2778 (2014).
  46. McElroy, S. J., et al. Tumor necrosis factor receptor 1-dependent depletion of mucus in immature small intestine: a potential role in neonatal necrotizing enterocolitis. American Journal of Physiology - Gastrointestinal and Liver Physiology. 301 (4), 656 (2011).
  47. Stanford, A. H., et al. A direct comparison of mouse and human intestinal development using epithelial gene expression patterns. Pediatric Research. , (2019).
  48. McElroy, S. J., Weitkamp, J. H. Innate Immunity in the Small Intestine of the Preterm Infant. NeoReviews. 12 (9), 517-526 (2011).
  49. McElroy, S. J., Underwood, M. A., Sherman, M. P. Paneth cells and necrotizing enterocolitis: a novel hypothesis for disease pathogenesis. Neonatology. 103 (1), 10-20 (2013).
  50. Park, B. S., Lee, J. O. Recognition of lipopolysaccharide pattern by TLR4 complexes. Experimental & Molecular Medicine. 45, 66 (2013).
  51. Lester, S. N., Li, K. Toll-like receptors in antiviral innate immunity. Journal of Molecular Biology. 426 (6), 1246-1264 (2014).
  52. Pott, J., et al. Age-dependent TLR3 expression of the intestinal epithelium contributes to rotavirus susceptibility. PLOS Pathogens. 8 (5), 1002670 (2012).

Tags

JoVE'de Bu Ay Sayı 160 Lipopolisakkarit (LPS) Anne iltihabına fetal maruziyet (FEMI) Chorioamnionitis Bağırsak gelişimi Paneth hücresi Goblet hücresi
Akut Chorioamnionitis'in Yenidoğan Bağırsak Gelişimi Üzerindeki Etkilerini İncelemek için Anne İltihaba Fetal MaruzIyetin Bir Murine Modeli
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Juber, B. A., Elgin, T. G., Fricke,… More

Juber, B. A., Elgin, T. G., Fricke, E. M., Gong, H., Reese, J., McElroy, S. J. A Murine Model of Fetal Exposure to Maternal Inflammation to Study the Effects of Acute Chorioamnionitis on Newborn Intestinal Development. J. Vis. Exp. (160), e61464, doi:10.3791/61464 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter