Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

En murinmodell av fostereksponering for maternal betennelse for å studere effekten av akutt chorioamnionitt på nyfødt tarmutvikling

Published: June 24, 2020 doi: 10.3791/61464
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 3, 1,4
1Division of Neonatology, Stead Family Department of Pediatrics, University of Iowa, 2Division of Maternal Fetal Medicine, Department of Obstetrics & Gynecology, University of Iowa, 3Division of Neonatology, Department of Pediatrics, Vanderbilt University, 4Department of Microbiology & Immunology, University of Iowa

Summary

Vi utviklet en modell av chorioamnionitis for å simulere fostereksponering for mors betennelse (FEMI) uten komplikasjoner av levende organismer for å undersøke effekten av FEMI på utviklingen av avkommets tarmkanal. Dette gjør det mulig å studere mekanistiske årsaker til utvikling av tarmskade etter chorioamnionitis.

Abstract

Chorioamnionitis er en vanlig utfelling av preterm fødsel og er forbundet med mange av morbiditeter av prematuritet, inkludert nekrotiserende enterokolitt (NEC). Imidlertid er det ennå ikke oppdaget en mekanistisk kobling mellom disse to forholdene. Vi har tatt i bruk en murinmodell av chorioamnionitt som involverer lipopolysakkarid (LPS)-indusert fostereksponering for mors betennelse (FEMI). Denne modellen av FEMI induserer en steril mors, placental og fosterinflammatorisk kaskade, som også er tilstede i mange tilfeller av klinisk chorioamnionitis. Selv om modeller eksisterer som bruker levende bakterier og mer nøyaktig etterligner patofysiologien til en stigende infeksjon som resulterer i chorioamnionitis, kan disse metodene forårsake indirekte effekter på utviklingen av den umodne tarmkanalen og tilhørende utviklende mikrobiom. Ved hjelp av denne protokollen har vi vist at LPS-indusert FEMI resulterer i en doseavhengig økning i graviditetstap og preterm fødsel, samt forstyrrelse av normal tarmutvikling hos avkom. Videre har vi vist at FEMI øker tarmskaden og serumcytokiner i avkom betydelig, samtidig som de reduserer beger og Paneth-celler, som begge gir en første linje med medfødt immunitet mot tarmbetennelse. Selv om en lignende modell av LPS-indusert FEMI har blitt brukt til å modellere sammenhengen mellom chorioamnionitis og påfølgende abnormiteter i sentralnervesystemet, til vår kunnskap, er denne protokollen den første til å forsøke å belyse en mekanistisk kobling mellom chorioamnionitis og senere perturbasjoner i tarmutvikling som en potensiell kobling mellom chorioamnionitis og NEC.

Introduction

De chorioniske membranene spiller en integrert rolle i pattedyr graviditet. De inkluderer kor og amnion, som tjener flere funksjoner. De omgir og beskytter fosteret, letter parakrinesignalering mellom mors og fosterrom1, og skaper lokale tilbakemeldingsløkker i de chorioniske membranene, som kan være involvert i å initiere parturition1. Nåværende forståelse av membranene indikerer at fosteret gir strukturell barrierefunksjon, og koreksjonen gir en immunologisk buffer primært for å beskytte det utviklende fosteret fra mors immunsystem2. Betennelse i disse membranene er kjent som chorioamnionitis. Historisk ble diagnosen klinisk chorioamnionitis gjort etter tilstedeværelsen av mors feber pluss ett eller flere foster- eller mors kliniske funn3,4. Men selv om denne definisjonen er klinisk nyttig, har mangelen på presisjon gjort chorioamnionitis forskning utfordrende. I 2015, i et forsøk på å avklare diagnosen, definerte et ekspertpanelverksted av Eunice Kennedy Shriver National Institute for Child Health and Human Development chorioamnionitis som intrauterin betennelse, eller infeksjon, eller begge (trippel I)3. Denne avklaringen er viktig fordi selv om mikrobiell indusert infeksjon er en viktig årsak til livmor/fosterbetennelse, forekommer den sjeldnere enn steril livmor/fosterbetennelse5,6,7. Totalt sett er chorioamnionitis fortsatt et betydelig folkehelseproblem, som det ses i 2 \ u20124% av terminleveranser og 25 \ u201230% av premature leveranser8,9.

Chorioamnionitis kan ha betydelige effekter på fosteret og neonatet. Det har blitt godt dokumentert i litteraturen at chorioamnionitis er forbundet med økt risiko for mange av sykelighetene i prematuritet, inkludert bronkopulmonal dysplasi10, cerebral hvit materieskade11, intraventricular blødning12, retinopati av prematuritet13, og både mistenkt og bekreftet tidlig start neonatal sepsis14,15. Som vi er interessert i skade- og reparasjonsmekanismer i den umodne tarmkanalen, er det viktig å merke seg at chorioamnionitis også er forbundet med senere utvikling av nekrotiserende enterokolitt (NEC)15,16. NEC er en ødeleggende gastrointestinal sykdom hos premature spedbarn som resulterer i en dysregulert vertsrespons på betennelse og påfølgende intestinal nekrose17. Hvert år påvirker NEC over 4000 spedbarn i USA, og opptil en tredjedel av disse spedbarnene dør av sykdommen18. Patogenesen av NEC innebærer sannsynligvis en kombinasjon av intestinal umodenhet, dysregulering av det umodne immunsystemet, tarmbetennelse og bakteriell translokasjon19, som kulminerer i en endelig felles vei for tarmnekrose. Det er viktig at utbruddet av NEC ofte oppstår uker etter fødselen og potensiell eksponering for chorioamnionitis, noe som gjør den mekanistiske koblingen mellom chorioamnionitis og påfølgende utvikling av NEC uklar20. En potensiell mekanisme som chorioamnionitis kan bidra til patofysiologien til NEC er gjennom oppregulering av mors immunsystem, og produserer deretter en sterk fosterinflammatorisk respons som kan forstyrre normale fosterutviklingsmønstre21,22,23.

Flere pattedyrmodeller av chorioamnionitis finnes hos gnagere og sauer24,25,26,27,28,29,30,31,32. Det finnes imidlertid få data om utviklingen av tarmkanalen utover den første nyfødte perioden etter chorioamnionitis-indusert fostereksponering for mors betennelse (FEMI). For å utforske forholdet mellom FEMI og påfølgende utvikling av skade i den umodne tarmkanalen, har vi tilpasset den lipopolysakkarid (LPS)-induserte FEMI-modellen. Lipopolysakkarider er en viktig del av den ekstracellulære overflaten på gram negative bakterier og er et potent stimulerende middel i det medfødte immunsystemet til flere eukaryote arter, inkludert mennesker33. Maternal LPS injeksjon resulterer i en steril inflammatorisk kaskade uten forvirrende effekter av levende bakterier, og det er en veletablert modell for induksjon av preterm fødsel34, samt en modell av akutt chorioamnionitis og fosteret inflammatorisk respons syndrom (FIRS), som er den mest alvorlige formen for chorioamnionitis24,35. Det har også vist seg å indusere både cerebral hvit og grå materie skade i en sauemodell36 og en murine modell37,38,39,40. Men så vidt vi vet, er vi de første til å bruke denne modellen av chorioamnionitis og FEMI for å undersøke dens effekter på utviklingen av mage-tarmkanalen forbi fødselen, samt å undersøke en mulig mekanistisk sammenheng mellom chorioamnionitis og senere utvikling av NEC41,42.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dyreprosedyrer ble godkjent av University of Iowa Institutional Animal Care and Use Committee (Protocol #8041401). Alle dyrene ble plassert i en forening for vurdering og akkreditering av laboratorie dyrepleie (AALAC) godkjent vivarium ved Universitetet i Iowa. Alle mus var vill type stamme C57Bl /6J.

1. Etablering av FEMI hos gravide mus

  1. LPS-forberedelse
    1. Bruk LPS avledet fra Escherichia coli O55:B5 (lagerkonsentrasjon 2 mg/ml).
    2. Fortynn LPS-lagerkonsentrasjonen 1:100 med steril saltvann for en arbeidskonsentrasjon på 20 μg/ml.
  2. Mors LPS-injeksjon
    1. Injiser gravide demninger på svangerskapsdagen e15. Dette tidspunktet er ca 75% gjennom murin graviditet, noe som gjør denne modellen utviklingsmessig lik tidlig tredje trimester av menneskelige graviditeter, som er når flertallet av premature fødsler på grunn av chorioamnionitis oppstår.
    2. Veie gravide mus umiddelbart før injeksjon for å bestemme passende LPS dosering.
    3. Beregn dosen av arbeidskonsentrasjon ved å bruke følgende formel: 5 μL x gram kroppsvekt (gbw), for en total dose LPS på 100 μg/kg. For kontrolldyr, bruk et tilsvarende volum av normal saltvann til injeksjon.
    4. Vortex LPS-oppløsning tre ganger i 15 sekunder før hver injeksjon.
    5. Trekk opp LPS-volumet i en 1 ml sprøyte.
    6. Hold gravid mus med scruffing teknikk. Hold i dorsal recumbency posisjon og utfør injeksjonen.
      1. Sett inn en 30 gauge 8 mm nål skrå opp over den høyre nedre kvadranten av magen (for å unngå blære og buk kar) i en 30\u201240 ° vinkel. Sett inn ca. 1/4 til 1/2 lengden på kanylen.
      2. Trekk sprøytestempepet tilbake for å sikre negativt trykk før injisering. Fortsett med injeksjonen hvis det er negativt trykk.
      3. Etter injeksjon, overvåke mus i ca 30 min og deretter gå tilbake til bur for resten av svangerskapet.

2. Levering og pleie av avkom, og tarmhøsting

  1. Lever valper normalt via vaginal fødsel på e20.
    MERK: Denne modellen har en forventet doseavhengig fostertapsrate som kan ses i figur 1 og diskuteres i resultatene nedenfor.
  2. Tillat valper å bli hos mødre og motta ad libitum feeds.
  3. På høstdagen, vanligvis postnatal dag 14 (P14), euthanize valper via cervical dislokasjon i samsvar med Institutional Animal Care and Use Committee protokoller.
  4. Bruk saks og tang, gjør et vertikalt snitt ned midtlinjen av magen, gjennom huden og bukhinnen, for hele lengden av magen. Sluk tynntarmen fra magen til cecum med saks og fjern mesenteriet med tang.
  5. Isoler og hold den distale 1/3 av tynntarmen (seksjonsrepresentant for humant ileum), og kast den proksimale tynntarmen, cecum og tykktarmen.
  6. Del ileumdelen i halvparten ved hjelp av saks.
  7. Plasser den proksimale halvdelen i en RNA-stabiliseringsløsning for senere RNA-kvantifisering.
  8. Plasser den distale halvdelen i 10% nøytral bufret formalin for lysbildeforberedelse.

3. Intestinal skade scoring

  1. Seksjon parafin innebygd vev i 5 μm tykke skiver og montering på glass lysbilder.

    MERK: Vi sender prøvene til en histologikjerne for parafininnbygging, seksjonering og montering på lysbilder.
  2. Deparaffiniser lysbilder i henhold til standardprosedyrer.
  3. Flekkseksjoner med hematoksylin og eosin i henhold til standardprosedyrer.
  4. Skår seksjoner på en 3-punkts skala for tarmskade som tidligere beskrevet42,43.
    1. Ved hjelp av lett mikroskopi, vurder generalisert tarmskade av to separate blindede undersøkere på en 3-punkts skala som evaluerer villusintegritet og separasjon fra kjellermembranen43 (Supplerende figur 1). Tarmskade vurderes best ved 20x forstørrelse og numerisk blenderåpning 0,50.
    2. Tilordne en poengsum på 0 for å beskrive normal slimhinne.
    3. Gi en skår på 1 beskrive mild skade som omfatter utviklingen av subepithelial Gruenhagen plass, vakuolisering eller subepithelial løft begrenset til lamina propria eller tips av villi.
    4. Tildel en poengsum på 2 for å beskrive alvorlig skade, indikert ved epitelløft og vakuolisering større enn halvparten av villi, villi-forvrengning eller slimhinnesår og oppløsning av lamina propria.

4. Kvantifisering av Paneth og begerceller

  1. Etter deparaffinering, flekk lysbilder av vev seksjoner fra trinn 2.8 med Alcian Blue / Periodic Acid Schiff flekk for å betegne både beger og Paneth celler som tidligere beskrevet44,45 i henhold til følgende trinn.
    MERK: Selv om Alcian Blue / Periodic Acid Schiff-flekken ikke er spesifikk for verken Paneth- eller begerceller, har blindede erfarne etterforskere tilsvarende cellulær kvantifisering ved hjelp av denne flekken sammenlignet med cellulære målrettede antistoffer, med betydelig mindre bakgrunnsfarging46.
  2. Deparaffiniser, flekk og dehydrer lysbilder som følger.
    1. Senk skliene ned i xylen i 10 minutter to ganger.
      FORSIKTIG: Xylen skal brukes i en avtrekkshette.
    2. Skyll med 100% EtOH.
    3. Senk lysbildene i 100 % EtOH i 3 minutter, deretter i 90 % EtOH i 3 minutter, etterfulgt av 70 % EtOH i 3 minutter, og til slutt nedsenke lysbilder i 50 % EtOH i 3 minutter.
    4. Vask under rennende vann fra springen i 5 min.
      FORSIKTIG: Før delen bort fra rennende vann for å unngå tap av vevsprøve.
    5. Filtrer Alcian blå flekkløsning med et standard kaffefilter.
    6. Flekk flekk glir i Alcian blå flekk i 15 min og vask deretter under rennende vann fra springen i 2 min.
    7. Fortynn 1 mg periodisk syre i 200 ml dobbelt destillert vann. Senk lysbildene ned i denne løsningen i 5 min. Vask deretter under rennende vann fra springen i 1 min.
    8. Flekk med Schiffs reagens i 10 min. Vask under rennende vann fra springen i 5 min.
    9. Flekk lysbildene med hematoksylin i 1 min og vask deretter under rennende vann fra springen i 2 min.
    10. Senk dem ned i syrealkohol (1 ml saltsyre blandet i 99 ml 70% EtOH) i 1 min.
    11. Senk dyp i Scotts vann fra springen (0,1 % konsentrasjon av NaHCO3 i vann fra springen) i 1 min og vask deretter under rennende vann fra springen i 1 min.
    12. Dehydrer lysbildene.
      1. Dypp hvert lysbilde 10 ganger i 70% EtOH, dypp deretter 10 ganger i 90% EtOH, og 10 ganger i 100% EtOH.
      2. Senk skliene ned i 100% EtOH i 10 min, etterfulgt av nedsenking to ganger i frisk xylen i 3 minutter hver.
    13. Legg en dråpe monteringsmedier på prøven og legg en deksleslip over den.
  3. Telling av begerceller
    1. Bruk lysmikroskopi til å telle begerceller (Tilleggsfigur 2). For hvert stykke tarmvev teller du antall begerceller og 500 epitelceller og uttrykker begercelleforhold som et forhold per 100 epitelceller. Begerceller telles best ved 20x forstørrelse og numerisk blenderåpning 0,5.
  4. Celletelling i paneth
    1. Bruk lysmikroskopi til å telle Paneth-celler (Tilleggsfigur 2). For hvert stykke tarmvev, uttrykk som et forhold mellom Paneth-celler per tarmkrypt. Tell 100 tarmkrypter per hvert stykke tarmvev. Paneth celler er best telt på 20x-60x forstørrelse og numerisk blenderåpning 0,50-1,30.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Eksponering for FEMI på embryonal dag 15 fører til et doseavhengig tap av graviditet og en doseavhengig grad av preterm labor (Figur 1)42. For forsøkene valgte vi å bruke en LPS-dose på 100 μg/kg for å minimere graviditetstap og prematuritet (50% tap mellom både prematuritet og intrauterin fosterdemping) mens vi utsatte fostrene for en betydelig inflammatorisk fornærmelse.

Ved hjelp av denne tilnærmingen undersøkte vi deretter effekten av FEMI på etterfølgende skade på avkom. Ved hjelp av en 3-punkts histopologisk skala for å måle generalisert tarmskade, fant vi betydelig skade ved fødselen (P0) og i voksen alder (P56 eller 8 ukers levetid) (Figur 2). Det er viktig å merke seg at denne skaden oppstod i fravær av ytterligere stimuli til andre dyr enn FEMI, noe som tyder på at FEMI alene forstyrrer den normale homeostase av den nyfødte murin tarmkanalen. Ettersom musen er født med en relativt umoden tarm som fortsetter å utvikle seg i løpet av de første 4 ukene av livet47,48, er dette relevant for premature spedbarn som også har umodne tarmkanaler.

For ytterligere å forstå effekten av FEMI på både den normale utviklingen av tarmepitelet og på forsvarsmekanismene i den umodne tarmkanalen, kvantifiserte vi antall mucinproduserende begerceller og antimikrobielle peptidproduserende Paneth-celler i den distale tredjedelen av den lille tarmkanalen som ligner på det menneskelige ileum. Vi fant at FEMI forstyrret den normale sammensetningen av tarmepitelet ved å indusere tap av både begerceller og Paneth-celler sammenlignet med dyr uten FEMI (Figur 3).

For å undersøke effekten av FEMI på neonatal inflammatorisk respons, ved hjelp av ELISA med elektrokjemiskluminescens, kvantifiserte vi en rekke seruminflammatoriske markører, som inkluderte IL-1β, IL-10, KC-GRO (murinekvivalenten til IL-8) og IL-6, fra serum av valper med og uten FEMI (figur 4). Vi fant at FEMI økte den inflammatoriske kaskaden betydelig for alle cytokiner ved P0. Den inflammatoriske kaskaden i senere aldre (P7 \u2012P56) var forskjellig basert på tidspunkt og cytokin. Mest interessant, for IL-6, var det lignende nivåer på P7 \ u2012P28 i FEMI- og sham-gruppene, men til tross for ingen sekundær intervensjon var det betydelig høyere nivåer i FEMI-gruppen på P56. Dette er spesielt viktig som vi har vist at IL-6 er en kritisk cytokin for utvikling av postnatal tarmskade i FEMI-modellen.

Figure 1
Figur 1: Effekt av FEMI-dose på graviditetsutfall. Overlevelse av graviditet kull er dose avhengig av høyere doser forårsaker høyere grad av graviditet tap (A) og høyere rater av for tidlig fødsel (B). Figuren er tilpasset med tillatelse fra Fricke et al42. FEMI ved hjelp av en LPS-dose på 100 μg/kg skaper en 50% overlevelse for valper med en ukes levetid. Hvert datapunkt er representativt for en n > 8 svangerskap og minst tre individuelle eksperimenter. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Effekt av FEMI på distale små tarmskademønstre over tid. Tarmprøver ble høstet ved fødselen, 1 uke i livet, 2 uker i livet og 8 ukers liv fra mus utsatt for FEMI (100 μg/kg LPS) eller sham control. Prøver ble scoret ved hjelp av en 3-punkts skadeskala av blindede etterforskere42,43. FEMI alene uten ytterligere fornærmelse forårsaket betydelig skade ved fødselen, 1 uke i livet og ved 8 ukers levetid. Figuren er tilpasset med tillatelse fra Fricke et al.42. Hvert datapunkt er representativt for en n > 10 valper og minst tre individuelle eksperimenter fra minst 3 gravide dammer. Mann-Whitney ikke-parametrisk T-testing ble brukt til å sammenligne intestinale skade score på hvert tidspunkt. Stjernen angir p < 0,05. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: FEMI induserer endringer av normal beger og Paneth cellemengder i tynntarmen under utvikling. Tarmprøver ble høstet ved fødselen, 1, 2, 4 og 8 ukers levetid fra mus utsatt for FEMI (100 μg/kg LPS) eller sham control. Prøver ble farget med Alcian blå / periodisk syre Schiff flekk for å oppdage både beger og Paneth celler og disse ble kvantifisert av en blindet etterforsker. Både begerceller og Paneth-celler fra dyr med FEMI viste enten en trend eller en betydelig nedgang sammenlignet med sham-kontroller i alle aldre. Figur tilpasset med tillatelse fra Elgin et al.41. Hvert datapunkt er representativt for en n > 10 valper og minst tre individuelle eksperimenter. Feilfelt representerer standardfeil av gjennomsnittet. Student T-testing ble brukt til å sammenligne mengder beger og Paneth celler på hvert tidspunkt. Stjernen angir p < 0,05. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: FEMI induserer en global neonatal inflammatorisk bølge for alle cytokiner umiddelbart etter fødselen ved P0, med en sen bølge av IL-6 ved P56. Serumcytokiner ble kvantifisert ved P0, P7, P14 og P28 ved hjelp av ELISA med elektrokjemi i henhold til produsentens instruksjoner, og plater ble lest ved 620 nm. Cytokinverdier er representert her i en radarplott, og alle cytokiner er plottet som prosent av maksimal verdi. Det var signifikant økning i alle cytokiner (IL-1β, IL-10, KC-GRO og IL-6) ved P0 i FEMI-gruppen sammenlignet med kontrollgruppen (alle p < 0,05). Det var også en gjenoppblomstrende økning i IL-6 nivåer på P56 i valpene med FEMI sammenlignet med ingen FEMI (p < 0,05 ved ikke-parametrisk Kruskal-Wallis testing), som var den eneste cytokin som var betydelig forhøyet i FEMI-gruppen sammenlignet med kontroll på dette sene tidspunktet. Figur tilpasset med tillatelse fra Elgin et al.41. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Supplerende figur 1: Intestinal skade score av H &E farget ileal vev. Skade score bestemmes av en tre-punkts intestinal skade scoring skala (0 = normal, 1 = mild skade, 2 = alvorlig skade) basert på graden av villi vakuolization, mucosal sårdannelse, lamina propria skade, og tilstedeværelse av blødning innen villi som tidligere beskrevet43. Figur tilpasset med tillatelse fra Elgin et al.41. Klikk her for å laste ned denne figuren.

Supplerende figur 2: Representativt utseende av Alcian Blue/PAS farging av beger og Paneth celler. Alcian Blue / PAS farging av tarmvev tillater klar visualisering av begerceller, tilstede i intestinal villi (topppanel merket med hvite piler, bilde tatt ved 20x forstørrelse), og Paneth-celler, tilstede i krypter av Lieberkuhn, som ligger under tarm villi i lamina propria (bunnpanel merket med gule piler, bilde tatt ved 60x forstørrelse). Klikk her for å laste ned denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Chorioamnionitis påvirker 2\u20124% av perioden og 25\u201230% av premature leveranser8,9. Imidlertid kan virkningen av chorioamnionitis strekke seg lenge etter fødselen, da det har vist seg å ha betydelige effekter på fosteret og neonat10,11,12,13,14,15,16. Viktigst, chorioamnionitis har vist seg å være forbundet med etterfølgende utvikling av NEC15,16. Mens det fortsatt er ufullstendig forstått, innebærer patogenesen av NEC sannsynligvis en kombinasjon av intestinal umodenhet, dysregulering av det umodne immunforsvaret, tarmbetennelse og bakteriell translokasjon, som kulminerer i en endelig felles vei for intestinal nekrose19. Imidlertid er en mekanistisk kobling mellom chorioamnionitis og etterfølgende utvikling av NEC fortsatt uklart20, og tidligere dyremodeller av chorioamnionitis har ikke vært tilstrekkelig til å undersøke dette forholdet. For å løse dette kunnskapsgapet endret vi den ofte brukte LPS-induserte murinmodellen av chorioamnionitis og preterm fødsel34,37,38,39,40 for å tillate neonatal fødsel og overlevelse. Ved å gjøre det har vi laget en modell som tilnærmer seg den inflammatoriske tilstanden sett i chorioamnionitis42 for å studere effekten av fostereksponering for mors betennelse (FEMI) på etterfølgende tarmutvikling.

Med denne protokollen har vi vist at denne murinmodellen av chorioamnionitis, ved hjelp av LPS-indusert FEMI, resulterer i både kort og langsiktig tarmskade samt avbrudd i normal tarmutvikling, spesielt nedregulering av både beger og Paneth-celler, som begge gir en første linje med medfødt immunitet mot tarmbetennelse. Tarmskaden og histologiske cellulære endringer som ses med denne modellen indikerer at det er en effektiv modell for å etterligne skaden sett i NEC. Dette skyldes først og fremst at nedreguleringen av Paneth-celler og begerceller begge har blitt involvert i patogenesen til NEC, og mønstrene for histopologisk skade ligner det som ses i menneskelige tilfeller av NEC41,42,49. Derfor er denne LPS-induserte FEMI-modellen av chorioamnionitis en ideell modell for å undersøke den mekanistiske koblingen mellom chorioamnionitis og senere tarmskade, spesielt utviklingen av NEC, samt potensielle effekter av chorioamnionitis på det utviklende mikrobiomet, som ikke ville være mulig med eksisterende modeller som bruker levende bakterier.

In vivo, chorioamnionitis innebærer ofte en stigende bakteriell infeksjon som ofte resulterer i preterm brudd på membraner og den kliniske fenotypen av chorioamnionitis, og dyremodeller av chorioamnionitis eksisterer som mer nøyaktig gjenspeiler denne patofysiologien25,28,30,32. Men fordi vårt laboratorium studerer tarmutvikling, inkludert det utviklende mikrobiomet, ville tilstedeværelsen av levende bakterier i en modell av chorioamnionitis forvirre mikrobiomeanalysen. Derfor er eksisterende modeller av chorioamnionitis som bruker levende bakterier upraktiske for å undersøke den mekanistiske koblingen mellom chorioamnionitis og senere utvikling av NEC. I tillegg har LPS-induserte modeller av chorioamnionitis allerede vært effektive i modellering av postnatal hvit og grå materie hjerneskade36, noe som viser at denne metoden er en effektiv måte å modellere sykeligheter av prematuritet som er forbundet med eksponering for chorioamnionitis på fødselstidspunktet.

Det er også viktig å merke seg at denne modellen er svært avhengig av dosen av LPS som brukes til å indusere FEMI. Det primære kritiske trinnet i denne protokollen er induksjon av FEMI i de gravide dammene med intraperitoneal injeksjon av LPS; Derfor har vi ikke overraskende funnet ut at dosen av LPS som brukes til å indusere FEMI er ekstremt viktig i resultatene av disse eksperimentene. Med innledende eksperimenter ble en dose på 100 μg / kg LPS brukt, da denne LPS-dosen ikke var forbundet med mødredødelighet og resulterte i omtrent 50% nyfødtoverlevelse samt betydelig tarmskade hos avkom41,42.

LPS binder seg til det tolllignende reseptor 4 (TLR4) komplekset, noe som resulterer i aggregering av intracellulære signalproteiner, cytokinproduksjon og initiering av proinflammatorisk signalering50. Toll-lignende reseptorer (TLRs) inkludert TLR2, TLR3, TLR4, TLR7, TLR8 og TLR9 er viktige i induksjonen av den inflammatoriske responsen som ses med en rekke patogener og mikroorganismer som virus, bakterier og sopp51. Interessant nok har upregulering av TLR3 også vist seg å korrelere med økt histolog tarmskade og viral shedding i en neonatal murin rotavirusmodell; videre, knockout av TLR3 ameliorated disse effektene52. Selv om modellen benytter seg av TLR4-veier, er det derfor rimelig å anta at stimulering av andre TLR-er kan gi lignende funn.

Ved hjelp av denne metoden har vi vært i stand til å vise at LPS-injeksjon i gravide dammer forårsaker økning i mors-, morkake- og fosterinflammatoriske markører mens vi sparer fostervann, samt induserer direkte skade på morkaken42. Interessant viste denne metoden ingen endring av motstand i livmorarteriene. FEMI-modellen har også en betydelig innvirkning på avkomene, da vi har vist at eksponerte valper har betydelig tarmskade42 gjennom en IL-6 avhengig bane41 og kan påvirke viktige forsvarsmekanismer i tarmen som begerceller og Paneth-celler41. Denne skaden gjør nyfødte avkom stadig mer utsatt for påfølgende LPS-indusert tarmskade og betennelse41 som kan forklare hvorfor spedbarn utsatt for chorioamnionitis har økt følsomhet for å utvikle NEC.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble delvis støttet gjennom National Institutes of Health (DK097335 &T32AI007260) og University of Iowa Stead Family Department of Pediatrics.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10% neutral buffered formalin Sigma HT501128
Alcian blue stain Newcomer supply 1003A
C57Bl6/J mice Jackson Laboratories 664
Ethanol Decon labs 2701
HCl Sigma H1758
Hematoxylin stain Leica 381562
LPS Sigma L2880
NaHCO3 Sigma S6014
Nikon Eclipse Ni-U Microscope Nikon 2CE-MQVJ-1
Periodic Acid ACROS H5106 CAS# 10450-59-9
RNAlater Thermofisher Am7021
Schiff's reagent Sigma S5133
Secor Imager 2400 Meso Scale Discovery (MSD)
V-Plex Assay Meso Scale Discovery (MSD)
Xylene Sigma 534056

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Myatt, L., Sun, K. Role of fetal membranes in signaling of fetal maturation and parturition. International Journal of Developmental Biology. 54 (2-3), 545-553 (2010).
  2. Verbruggen, S. W., Oyen, M. L., Phillips, A. T., Nowlan, N. C. Function and failure of the fetal membrane: Modelling the mechanics of the chorion and amnion. PLoS One. 12 (3), 0171588 (2017).
  3. Higgins, R. D., et al. Evaluation and Management of Women and Newborns With a Maternal Diagnosis of Chorioamnionitis: Summary of a Workshop. Obstetrics & Gynecology. 127 (3), 426-436 (2016).
  4. Peng, C. C., Chang, J. H., Lin, H. Y., Cheng, P. J., Su, B. H. Intrauterine inflammation, infection, or both (Triple I): A new concept for chorioamnionitis. Pediatrics and Neonatology. 59 (3), 231-237 (2018).
  5. Romero, R., et al. Prevalence and clinical significance of sterile intra-amniotic inflammation in patients with preterm labor and intact membranes. American Journal of Reproductive Immunology. 72 (5), 458-474 (2014).
  6. Romero, R., et al. Sterile intra-amniotic inflammation in asymptomatic patients with a sonographic short cervix: prevalence and clinical significance. Journal of Maternal-Fetal and Neonatal. , 1-17 (2014).
  7. Romero, R., et al. Sterile and microbial-associated intra-amniotic inflammation in preterm prelabor rupture of membranes. Journal of Maternal-Fetal and Neonatal Medicine. 28 (12), 1394-1409 (2015).
  8. Goldenberg, R. L., Culhane, J. F., Iams, J. D., Romero, R. Epidemiology and causes of preterm birth. Lancet. 371 (9606), 75-84 (2008).
  9. Erdemir, G., et al. Histological chorioamnionitis: effects on premature delivery and neonatal prognosis. Pediatrics and Neonatology. 54 (4), 267-274 (2013).
  10. Metcalfe, A., Lisonkova, S., Sabr, Y., Stritzke, A., Joseph, K. S. Neonatal respiratory morbidity following exposure to chorioamnionitis. BMC Pediatrics. 17 (1), 128 (2017).
  11. Anblagan, D., et al. Association between preterm brain injury and exposure to chorioamnionitis during fetal life. Scientific Reports. 6, 37932 (2016).
  12. Villamor-Martinez, E., et al. Corrigendum: Chorioamnionitis Is a Risk Factor for Intraventricular Hemorrhage in Preterm Infants: A Systematic Review and Meta-Analysis. Frontiers in Physiology. 10, 102 (2019).
  13. Villamor-Martinez, E., et al. Chorioamnionitis as a risk factor for retinopathy of prematurity: An updated systematic review and meta-analysis. PLoS One. 13 (10), 0205838 (2018).
  14. Randis, T. M., et al. Incidence of early-onset sepsis in infants born to women with clinical chorioamnionitis. Journal of Perinatal Medicine. 46 (8), 926-933 (2018).
  15. Rodrigo, F. G. M., Henriquez F, G. G., Aloy, F. J., Perez, G. A. A. Outcomes of very-low-birth-weight infants exposed to maternal clinical chorioamnionitis: a multicentre study. Neonatology. 106 (3), 229-234 (2014).
  16. Been, J. V., Lievense, S., Zimmermann, L. J., Kramer, B. W., Wolfs, T. G. Chorioamnionitis as a risk factor for necrotizing enterocolitis: a systematic review and meta-analysis. Journal of Pediatrics. 162 (2), 236-242 (2013).
  17. Tanner, S. M., et al. Pathogenesis of necrotizing enterocolitis: modeling the innate immune response. American Journal of Pathology. 185 (1), 4-16 (2015).
  18. Fitzgibbons, S. C., et al. Mortality of necrotizing enterocolitis expressed by birth weight categories. Journal of Pediatric Surgery. 44 (6), 1075-1076 (2009).
  19. Vongbhavit, K., Underwood, M. A. Prevention of Necrotizing Enterocolitis Through Manipulation of the Intestinal Microbiota of the Premature Infant. Clinical Therapeutics. 38 (4), 716-732 (2016).
  20. Yee, W. H., et al. Incidence and timing of presentation of necrotizing enterocolitis in preterm infants. Pediatrics. 129 (2), 298-304 (2012).
  21. Gantert, M., et al. Chorioamnionitis: a multiorgan disease of the fetus. Journal of Perinatology. 30, 21-30 (2010).
  22. Hudalla, H., et al. LPS-induced maternal inflammation promotes fetal leukocyte recruitment and prenatal organ infiltration in mice. Pediatric Research. 84 (5), 757-764 (2018).
  23. Yamada, N., et al. Histological severity of fetal inflammation is useful in predicting neonatal outcome. Placenta. 36 (12), 1490-1493 (2015).
  24. Wolfe, K. B., et al. Modulation of lipopolysaccharide-induced chorioamnionitis in fetal sheep by maternal betamethasone. Reproductive Sciences. 20 (12), 1447-1454 (2013).
  25. Normann, E., et al. A novel mouse model of Ureaplasma-induced perinatal inflammation: effects on lung and brain injury. Pediatric Research. 65 (4), 430-436 (2009).
  26. Burd, I., Brown, A., Gonzalez, J. M., Chai, J., Elovitz, M. A. A mouse model of term chorioamnionitis: unraveling causes of adverse neurological outcomes. Reproductive Sciences. 18 (9), 900-907 (2011).
  27. Dell'Ovo, V., et al. An animal model for chorioamnionitis at term. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 213 (3), 387 (2015).
  28. Randis, T. M., et al. Group B Streptococcus beta-hemolysin/cytolysin breaches maternal-fetal barriers to cause preterm birth and intrauterine fetal demise in vivo. Journal of Infectious Diseases. 210 (2), 265-273 (2014).
  29. Breen, K., et al. TLR-4-dependent and -independent mechanisms of fetal brain injury in the setting of preterm birth. Reproductive Sciences. 19 (8), 839-850 (2012).
  30. Burd, I., Balakrishnan, B., Kannan, S. Models of fetal brain injury, intrauterine inflammation, and preterm birth. American Journal of Reproductive Immunology. 67 (4), 287-294 (2012).
  31. Agrawal, V., et al. Role of Notch signaling during lipopolysaccharide-induced preterm labor. Journal of Leukocyte Biology. 100 (2), 261-274 (2016).
  32. Filipovich, Y., Klein, J., Zhou, Y., Hirsch, E. Maternal and fetal roles in bacterially induced preterm labor in the mouse. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 214 (3), 381-389 (2016).
  33. Alexander, C., Rietschel, E. T. Bacterial lipopolysaccharides and innate immunity. Journal of Endotoxin Research. 7 (3), 167-202 (2001).
  34. McCarthy, R., et al. Mouse models of preterm birth: suggested assessment and reporting guidelines. Biology of Reproduction. 99 (5), 922-937 (2018).
  35. Rueda, C. M., et al. Lipopolysaccharide-Induced Chorioamnionitis Promotes IL-1-Dependent Inflammatory FOXP3+ CD4+ T Cells in the Fetal Rhesus Macaque. Journal of Immunology. 196 (9), 3706-3715 (2016).
  36. Gavilanes, A. W., et al. Chorioamnionitis induced by intraamniotic lipopolysaccharide resulted in an interval-dependent increase in central nervous system injury in the fetal sheep. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 200 (4), 431-438 (2009).
  37. Boksa, P. Effects of prenatal infection on brain development and behavior: a review of findings from animal models. Brain, Behavior, and Immunity. 24 (6), 881-897 (2010).
  38. Knuesel, I., et al. Maternal immune activation and abnormal brain development across CNS disorders. Nature Reviews Neurology. 10 (11), 643-660 (2014).
  39. Garay, P. A., Hsiao, E. Y., Patterson, P. H., McAllister, A. K. Maternal immune activation causes age- and region-specific changes in brain cytokines in offspring throughout development. Brain, Behavior, and Immunity. 31, 54-68 (2013).
  40. Smith, S. E., Li, J., Garbett, K., Mirnics, K., Patterson, P. H. Maternal immune activation alters fetal brain development through interleukin-6. Journal of Neuroscience. 27 (40), 10695-10702 (2007).
  41. Elgin, T. G., et al. Fetal exposure to maternal inflammation interrupts murine intestinal development and increases susceptibility to neonatal intestinal injury. Disease Models & Mechanisms. 12 (10), (2019).
  42. Fricke, E. M., et al. Lipopolysaccharide-induced maternal inflammation induces direct placental injury without alteration in placental blood flow and induces a secondary fetal intestinal injury that persists into adulthood. American Journal of Reproductive Immunology. 79 (5), 12816 (2018).
  43. Wynn, J. L., et al. Targeting IL-17A attenuates neonatal sepsis mortality induced by IL-18. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (19), 2627-2635 (2016).
  44. Brown, K. S., et al. Tumor necrosis factor induces developmental stage-dependent structural changes in the immature small intestine. Mediators of Inflammation. 2014, 852378 (2014).
  45. McElroy, S. J., et al. The ErbB4 ligand neuregulin-4 protects against experimental necrotizing enterocolitis. American Journal of Pathology. 184 (10), 2768-2778 (2014).
  46. McElroy, S. J., et al. Tumor necrosis factor receptor 1-dependent depletion of mucus in immature small intestine: a potential role in neonatal necrotizing enterocolitis. American Journal of Physiology - Gastrointestinal and Liver Physiology. 301 (4), 656 (2011).
  47. Stanford, A. H., et al. A direct comparison of mouse and human intestinal development using epithelial gene expression patterns. Pediatric Research. , (2019).
  48. McElroy, S. J., Weitkamp, J. H. Innate Immunity in the Small Intestine of the Preterm Infant. NeoReviews. 12 (9), 517-526 (2011).
  49. McElroy, S. J., Underwood, M. A., Sherman, M. P. Paneth cells and necrotizing enterocolitis: a novel hypothesis for disease pathogenesis. Neonatology. 103 (1), 10-20 (2013).
  50. Park, B. S., Lee, J. O. Recognition of lipopolysaccharide pattern by TLR4 complexes. Experimental & Molecular Medicine. 45, 66 (2013).
  51. Lester, S. N., Li, K. Toll-like receptors in antiviral innate immunity. Journal of Molecular Biology. 426 (6), 1246-1264 (2014).
  52. Pott, J., et al. Age-dependent TLR3 expression of the intestinal epithelium contributes to rotavirus susceptibility. PLOS Pathogens. 8 (5), 1002670 (2012).

Tags

Denne måneden i JoVE Utgave 160 Lipopolysakkarid (LPS) Fostereksponering for mors betennelse (FEMI) Chorioamnionitis Tarmutvikling Paneth-cellen Begercelle
En murinmodell av fostereksponering for maternal betennelse for å studere effekten av akutt chorioamnionitt på nyfødt tarmutvikling
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Juber, B. A., Elgin, T. G., Fricke,… More

Juber, B. A., Elgin, T. G., Fricke, E. M., Gong, H., Reese, J., McElroy, S. J. A Murine Model of Fetal Exposure to Maternal Inflammation to Study the Effects of Acute Chorioamnionitis on Newborn Intestinal Development. J. Vis. Exp. (160), e61464, doi:10.3791/61464 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter