Summary
フィルターペーパーDNA抽出法と、現場や研究室で分析できるループ媒介等熱増幅(LAMP)アッセイを用いて、水源中の フィトフトーラ・カプシチ 動物園の胞子を検出する方法を開発しました。
Abstract
フィトフトラカプシーチ は、毎年野菜生産に大きな経済的損失を引き起こす多くの重要なソラ紀とcucurbit作物に影響を与える壊滅的な卵母菌病原体です。 フィトフトラカプチーは 土壌を媒介し、風化や劣化に抵抗する長命の生存構造(オースポアおよびクラミドスポア)による野菜畑の持続的な問題です。分散の主な方法は、表面や水で満たされた土壌の毛穴に存在する水の薄膜を泳ぐことができ、水たまりや池に蓄積することができる単細胞、フラグ付き胞子である動物園の胞子の生産を通じてです。したがって、灌漑池は、病原体の発生源であり、病気の発生の初期点となり得る。灌漑水中の P.カプシチ の検出は、 ピシウム sppなどの環境中に存在する他の微生物が通常P. カプシチ を検出不能にするため、伝統的な培養ベースの方法を使用して困難である。 P.カプシシ 胞子の水源(灌漑水、流出など)の存在を判断するために、病原体の胞子(zoospore)を捕捉し、後に新しいループ媒介等熱増幅(LAMP)を介して特異的な増幅法を通じて病原体のDNAを増幅するハンドポンプベースのろ紙(8-10 μm)法を開発しました 。 この方法は、従来のPCRの40倍の感度を持つ1.2 x 102 の動物園/mLの低濃度からDNAを増幅して検出することができます。密接に関連する種を試験する場合、クロス増幅は得られない。LAMPは、カラーメトリックLAMPマスターミックス染料を用いて行われ、現場での迅速な検出のために肉眼で読み取ることができる結果を表示しました。このプロトコルは、汚染された灌漑システムを介して存在、蓄積、または分散している他の病原体に適応することができる。
Introduction
水の使用量の増加や水の使用に伴う環境問題により、農場や保育園の水のリサイクルがますます普及しています。植物病の広がりや発生を減らすために、生産者のために多くの灌漑方法が開発されています。水源(灌漑や降水量)に関係なく、流出が発生し、多くの野菜や保育園の生産者は、流出を収集し、リサイクルする池を持っています1.これは、再生水が作物2、3、43を灌漑するために使用される場合、病原体の広がりを支持2する可能性のある病原体蓄積のための貯水池を4作成します。動物園の胞子は水に蓄積し、一次分散胞子は自己運動性であるが、表面水55、6、76を必要とするので、Oomycete7植物病原体は、この練習の恩恵を特に受ける。フィトフトラカプシチは、異なる方法で、ナス類とキュビリット作物のかなりの数に影響を与えるオマイセテ病原体8.多くの場合、症状は苗、根とクラウンの腐敗の減衰です。しかし、キュウリ、スカッシュ、メロン、カボチャ、スイカ、ナス、コショウなどの作物では、果実腐敗9のために収穫全体が失われる可能性があります。この植物病原体を検出する方法は知られているが、ほとんどの感染は、任意の予防殺菌剤が有意な効果を有するには遅すぎる既に起こるために行われている10を必要とします。
標的微生物の検出と診断のための灌漑水をテストする従来の方法は、速度と感度が成功し、収益性の高い作物生産11、12,12に不可欠である時代遅れのアプローチです。標的病原体(例えば、P.カプシチのナス)に感染のために除去され、検査される前に長期間、灌漑池に吊り下げられる変性トラップに付着している植物組織(例えば、P.カプシチのナス)に付着している。次いで植物組織からのサンプルを半選択的培地(PARPH)上でめっきし、培養増殖のためにインキュベートし、次いで、複合顕微鏡13を用いて形態学的同定が行われる。他の植物病原体に対しても、選択的培地を用いて、少量の汚染水をめっきしてから、14,15,15をサブ培養する前に同様の検出方法がある。これらの方法は、2〜6週間の任意の場所、生物を分離するためのサブ培養のいくつかのラウンド、および各種の主要な形態学的文字を認識することができるようにフィトフトーラ診断上の経験を必要とする。これらの伝統的な方法は、水源にも存在する他の微生物による干渉などの要因により、P.カプシチによって汚染された灌漑水の検出にはうまく機能しません。ピシウム属細菌や水媒介細菌のような急速に成長している微生物は、P.カプシチを検出不能16、17,17にするプレート上で増殖する可能性があります。
本研究の目的は、灌漑水中のP.カプシチ動物園を検出するために、現場と実験室の両方の設定で使用できる敏感で特異的な分子法を開発することであった。このプロトコルは、P.カプシチの1121基対(bp)フラグメントに基づいて、P.カプシチを特異的に増幅することができる新規ループ媒介等温増幅(LAMP)プライマーセットの開発を含む、 P. capsici19.19Dong et al. (2015) から以前に開発された LAMP プライマーは、この研究のために開発されたアッセイと比較して使用されました20.
LAMPアッセイは、従来のポリメラーゼ連鎖反応(PCR)21よりも迅速、感受性、および特異的であることが実証された比較的新しい分子検出形態である。一般に、従来のPCRアッセイでは500コピー(1.25 pg/μL)以下では検出できません。対照的に、以前の研究では、LAMPの感度は従来のPCRよりも10〜1,000倍高く、ゲノムDNA22,23,23の1fg/μLでも容易に検出できることが示されている。さらに、アッセイは、増幅のためのポータブル加熱ブロックと正のサンプルの色を変化させる着色色素(電気泳動の必要性を取り除く)を使用して、迅速に(多くの場合、30分)およびオンサイト(フィールド)を行うことができます。本研究では、フィルター抽出法を用いてPCRとLAMPアッセイの感度を比較した。提案された検出方法により、研究者および拡張剤は、異なる水源からのP.カプシシ胞子の存在を2時間以内に容易に検出することができる。このアッセイは、従来のPCRよりも感度が高く、栽培者が使用する灌漑水中の病原体の存在を検出することによってその時点で検証されました。この検出方法により、生産者は灌漑に使用されている様々な水源における病原体の存在と人口密度を推定し、壊滅的な発生や経済的損失を防ぐことができます。
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Protocol
1. ポータブルループ媒介等温増幅を用いた灌漑水からの フィトフトーラカプシチ のオンサイト検出
- ポンプとフィルターの設定
- ハンドポンプに接続されたチューブにフィルターフラスコを取り付け、ポンプが作動したときに、濾過フラスコの口から空気が吸い込まれるようにします。
- Buchner漏斗をゴム栓にろ過フラスコの口に合わせ、適切なサイズのろ紙をBuchner漏斗に収め、空気が濾紙を通して引き抜くようにします。フィルター用紙の保持サイズは15 μmである必要があります。
注: フィルタペーパーは、フィルタペーパーの周りを最小限の水が流れるよう、Buchner漏斗の端に収まる必要があります。
- 水のサンプリングとフィルタリング
- ターゲットソースから水サンプルを採取します。水は少量の破片を含むが、重要な堆積物や土壌を有しないかもしれない。
- Buchner漏斗の中に置かれたろ過紙の上に最大1,000 mL(1リットル)の試験水を注ぎ、ハンドポンプ(または真空)を使用して水を引き抜く吸引を作成します。
注:この方法でテストできる水の最小量はなく、少なくとも50 mLが推奨されていますが、この方法の最大値は1000 mLです。 - 鉗子を使用して、Buchner漏斗からろ過用紙を取り出し、滅菌はさみで小さく切ります。プロトコルで必要な抽出バッファ(磁気ビーズベースの抽出用400 μL)の量に、1.5 mLチューブにできるだけ多くの部分(8-12)を追加します。最初のセットが抽出された後の処理のために、残りのフィルター用紙を保存します。
- 渦またはそれ以外の場合は、5分間毎分10 sの濾紙および抽出バッファーの断片を攪拌する。次に、鉗子を使用して、抽出バッファーをできるだけ少なく失った濾紙を取り除く。すべての部分が渦/攪拌され、抽出バッファーに浸されるまで、フィルターペーパーの残りの部分でこのステップを繰り返します。
- フィルターペーパーからのDNAの磁気ビーズベース抽出
- 1.5 mLチューブ(現在は約200~300 μLの抽出バッファーを含む)に、20 μLのプロテイナーゼKと10 ng/μL RNaseの10 μLを加えます。
- 室温で15分間インキュベートし、渦を振ったり、3分ごとにチューブを振ったりします。
- 結合バッファーを含む 500 μL の磁気ビーズをサンプルに加え、振ることでよく混ぜます。その後、室温で5分間インキュベートします。
- すべてのビーズが磁石に引き込まれるまで、チューブを磁気分離器ラックに2分間置きます。上清を取り除き、捨てます。
- 磁気セパレータからチューブを取り外します。500 μLのウォッシュバッファ1を加え、チューブを激しく振ってビーズを再中断します。30 s を待ってから、チューブを磁気セパレータに戻します。すべてのビーズが磁石に向かって引っ張られるまで2分待ってから、上清を取り出して捨てます。
注:磁気ビーズがセパレータに磁化するのを待つ場合は、チューブを反転させ、キャップとチューブの側面に貼り付けられた磁気ビーズを取り外し、より多くのビーズが取り付けられる可能性があります。 - 500 μL のウォッシュバッファー 2 でステップ 1.3.5 を繰り返します。
- 80%エタノールの500 μLでステップ1.3.5を繰り返します。
- 蓋を開けた状態で、磁気ビーズペレットを室温(18~27°C)で15分間エアドライします。温度が許さない場合は、15分間キャップを開けた手袋をした手でインキュベートします。
- 磁気セパレータからチューブを取り外します。溶出バッファーを 50 μL 追加し、1 分間上下にピペット処理してビーズを再中断します。
- チューブを磁気セパレータに戻します。DNA保存のためにビーズを邪魔することなく上清を移す前に2分待ちます。
注: ここでは、実験を一時停止してから次に進むことができます。抽出したDNAは氷の上または-20°Cの冷凍庫に保存する必要があります。
- 新開発ランプアッセイの適用
- 各F3およびB3プライマーの0.2 μM、各ループFおよびループBプライマーの0.8 μM、および各FIPおよびBIPプライマーの1.6 μMを使用してLAMPプライマーミックスを準備する(表2)。
- 次のLAMP溶液を1つのPCRチューブに加えるか、または8チューブストリップ内の各チューブに追加します:プライマーミックス2.5 μL(ステップ1.4.1)、LAVA LAMPマスターミックスの12.5 μL、抽出DNA1 μL、および9 μLのddH2O。総容積は25μLである。
注:ポータブル増幅器(例えば、Genie III)を色分け染め(例えば、ウォームスタート)と併用する場合は、セクション2.4.2- 2.4.3を参照してください。 - 2 つのチューブを正と負のコントロールとして指定します。陽性コントロールには、LAVA LAMP キットによって提供されるコントロール、または既知の陽性 DNA サンプルのいずれかを使用します。負のコントロールには、ddH2O を使用します。両方とも、抽出したDNAの1μLを、陽性対照またはddH2Oの1μLに置き換える。
- サンプルをヒートブロック(またはポータブル増幅器)にセットし、64°Cに設定して45分間設定します。
注: 磁気ビードベースの抽出の代わりに、他の抽出方法を使用できます。CTABと市販のDNA抽出キットは、いずれも標準プロトコルを用いて試験に成功し、植物試料24,25,25の濾紙片を置換した。結果は、表2で比較した。DNAの濃度を定量化できる場合は、1〜10ngゲノムDNAを使用してください。
- 結果の可視化
- 実験室で行う場合、各サンプルの5μLを1%アガロースゲルにロードし、ゲル電気泳動機で動かし、UVイメージングマシンでイメージングすることで、増幅産物を見ます。
- 色分け染め(ウォームスタートなど)を使用した場合は、色の変化を表示して結果を正または負の値にします。
- ポータブル増幅器(例えば、Genie III)を使用した場合、画面上の増幅グラフを見て結果を決定する。
- 先に開発したPCRアッセイの適用
注: 従来の PCR アッセイを使用する場合、手順 1 ~ 3 は同じままであり、ステップ 1.4 および 1.5 の代わりに次の手順を適用する必要があります。- 各DNA抽出の1μLを、次の成分を含む個々のチューブに加える:12.5μLのグリーンPCRマスターミックス、9.5 μLのddH2O、および1μLの順方向および逆プライマー(表2))。
- マイクロ遠心分離機を使用して各サンプルをスピンダウンし、チューブをサーマルサイクラーに入れます。
- 以前の出版物に従って以下のサーマルサイクラーの設定を使用してください:5分のための94°C、30のsのための94°Cで変性の30サイクル、30のsのための54°Cでの延長、1分のための72°Cで延長、そして10分のための72°Cで最終延長。
- 1%アガロースゲルで製品を実行します。陽性反応が約508bpのバンドサイズを有するUV光下のバンドの存在を観察する。
- 従来の検出方法
注:病原体の検出のための選択的なめっきの複数の方法があり、以下は P.カプシチのための一般的なプロトコルです。- まず、健康なナス果実 (P.カプシチの感受性の宿主)を得て、70%イソプロピルアルコールで果実表面を洗浄して表面滅菌する。
- ナスの果実を浮遊装置(ポリエチレンフォームなど)を備えたミルククレートに入れ、灌漑池に展開します。各餌トラップを1点に固定し、少なくとも7日間、または果実腐敗症状が観察されるまで、水溜所(リサイクル灌漑水)にトラップを残します。果物を収集し、実験室に輸送します。
- 滅菌フードで果物をすすいで乾燥させてから、感染した組織の小片を取り除き、25mg/Lペンタクロロベンゼン、0.0005%ピマリシン、250mg/Lアンピシリン、10mg/Lリファンピシン、50mg/Lハイメクサゾールで修正したPARPH培地のプレートに置きます。プレートを25°Cで5日間インキュベートします。
- 分離後4日で従来の形態学的同定のための複合顕微鏡の下でプレートを見る。
2. 動物園の濃度の検出限界の決定
- 動物園のサスペンションを作る
- V8寒天(V8ジュース100mL、ddH2Oの900 mL、CaCO3の1g)プレートを26°Cで1週間インキュベートP.カプシチ。 複数のプレートを使用して、より多くの動物用懸濁液を得ることができます。
- 胞子を刺激するために室温で連続光の下でプレートを3日間インキュベートします。
- 各プレートに15mLのddH2Oを加えてプレートを浸水させ、4°Cの冷蔵庫に25分間入れます。その後、室温に戻して30分間おきます。
- すべてのプレートから1つの50 mLチューブに溶液を取り除くためにプレートを攪拌し、溶液をピペット。
- 動物園の濃度の正確な推定値を得るために、胞子懸濁液の10 μLをヘモサイトメーターに加え、顕微鏡下で観察して動物園を数え、平均濃度を推定します。
- 連続希釈
- 胞毛懸濁液1mLとddH2O9mLを2別のチューブに加えます。必要に応じて 10 倍の希釈液に対してこの手順を繰り返します。
- その後、濾過法を用いて、以前のプロトコルに基づいてDNA抽出のために胞毛溶液を提出する。
注:サスペンションのボリュームが大きい場合は、2 mLの胞子懸濁液と18 mLのddH2Oのボリュームを2倍にします。
- 動物園の集中限界の検出
- 明らかに肯定的な結果が観察されなくなるまでアッセイを通して各シリアル希釈を個別に実行して、胞子検出限界を評価する。最終的な希釈が得られたら、2倍(この例では4.8〜2.4)で希釈し、より正確な検出限界を得るためにアッセイを再実行します。
- LAMP法の開発と最適化
注:LAMPプライマーは、補助図2に示すように、P.カプシチ(Liらら19)の1121ベースペア(bp)断片に基づいて設計された。- 着色色素(例えば、ウォームスタート)を使用する場合は、プライマーミックス2.5μL、12.5μLの着色色素、0.5μLの緑色蛍光色素、1μLの抽出DNA、および8.5μLのddH2Oを使用してください。総容積は25μLである。
- LAVALAMPマスターミックスでポータブル増幅器を使用する場合、メーカーが推奨する3分間95°Cの初期工程を有するが、これは必須ではない。最終的なアニーリングステップは、色の変化や増幅グラフを観察するために必要とされません。市販の着色色素を使用する場合は、ウォームスタートステップを実行しないでください。
- LAMPアッセイの結果として、1%のアガロースゲルでサンプルを実行するか、Genie IIIリアルタイム増幅画面で裸眼または視視を行ったUVイメージングマシンを使用してサンプルを実行します。
- ポータブル増幅器を使用してLAMPアッセイの温度を最適化し、感度の速度とレベルをリアルタイムの増幅グラフを使用して分析します。サンプルを一意の温度で実行し、最高レベルの感度で最速の増幅を決定します。
- 抽出したDNAの連続希釈(ステップ2.2.1の胞子懸濁液と同様)を行い、各希釈に対するLAMP反応に関して前述した反応条件を維持することにより、LAMPの開発アッセイの検出限界を決定します。
- 検出限界判定と従来PCR法との比較
- セクション1.3のステップで抽出したDNAを使用して、従来のPCRの検出レベルとLAMPアッセイの検出レベルを比較します。
- 1 μL の DNA を、順方向 PCR と逆 PCR プライマーの両方を含む PCR チューブに 1 μL を加えます (表 2)、グリーン PCR マスターミックスの 12.5 μL、ddH2O の 9.5 μL を合計 25 μL に追加します。
- サーマルサイクラーでサンプルを増幅するには、5分間94°C、30°Cで30サイクル、30sで54°Cでアニール、72°Cで1分間延長、最終延長は72°Cで10分間延長します。
- 1%アガロースゲルで電気泳動機でサンプルを実行し、UVイメージングマシンで見ます。この除かれたバンドサイズは508bpであった。
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Representative Results
LAMP法の最適化
本研究では、ポータブルループ媒介等温増幅(LAMP)アッセイを用いて、灌漑水中の フィトフトーラカプシ の存在を検出した。まず、提案されたLAMPアッセイは、異なるLAMPプライマー濃度[F3、B3(それぞれ0.1〜0.5 μM)をテストすることによって最適化されました。LF、LB(各0.5~1.0 μM)およびFIP、BIP(0.8~2.4 μM)、持続時間(30~70分)、温度(55~70°C)この研究で使用された最終的なLAMPプライマーミックスは、各F3およびB3プライマーの0.2μM、各ループFおよびループBプライマーの0.8μM、各FIPおよびBIPプライマーの1.6μMであった。反応温度の最適化は、追加の陰性増幅なしで最も速い反応を行った温度を決定することによって、携帯用増幅器(例えば、Genie III)で行った。最適温度は64°Cであることが確認された(データは示さなかった)。64°Cでアッセイを実行するための最適な時間は45分で、検出に陽性であった最も低い濃度(1.2 x 102 の胞子/mL)は依然として40分増幅し、より高い濃度は20分で増幅した(図2D)。増幅されたLAMP生成物は、増幅を確認するために核酸染色で染色された1%アガロースゲルでさらに観察された。すべての反応を少なくとも3回繰り返した。
P.カプシチの分離株はテネシー州、フロリダ州、ジョージア州から採取され、方法に記載されているのと同じ議定書に提出された。P.カプシチ分離株のすべてのサンプルは、アッセイのすべての実行で正常に増幅された(図3)。
ポータブルLAMPアッセイを用いた灌漑水中のフィトフトーラカプシチの検出と感度試験
P.カプシチ胞子懸濁液の連続希釈を用いて、実験室条件下でこのフィルタ紙ベースのLAMP法を標準化しました(図1)。連続希釈は、4.8 x 104の動物園/mLから始まるP.カプシチ胞子懸濁液から作られ、3倍にLAMPアッセイで実行されました。DNA抽出に関与する方法により、DNA濃度ではなく胞毛濃度が示される。最も高い胞子濃度のCTAB DNA抽出は、ナノドロップで4.5 ng/μL測定し、磁気ビーズDNA抽出プロトコルは3.8 ng/μL26を生成した。新しく設計されたLAMPプライマーセットは、抽出のすべての方法で1.2 x 102の胞子/mL(図2B、2C、&2D)の低濃度を検出することができた。 2D携帯型増幅器上の増幅のグラフに示された感度は、追加の感度を伴うUV画像に示されたものと同一であった。同じシリアル希釈法を、測色色色素を用いたLAMP反応で実行し、現場検出のための肉眼に対する感度を決定した。最も低い観測濃度は4.8 x 103の胞子/mLであった(図2C)。
実世界のサンプルを用いてこのアッセイの能力を評価するために、水サンプルは、ジョージア州ティフト郡の商業用野菜生産に使用される7つの池から採取した(表1、図5、および補足図1)。7つの池のうち、3は正のLAMPの結果を示した(P1、P4、およびP6) (図6A、6B、及び6C)。これらの結果は、移植性のろ紙ベースのLAMP法が、低い動物座の濃度であっても病原体の検出に非常に有用であることを示唆している。P.カプシチによる灌漑水汚染をスクリーニングするためのPCRよりも感度の高い検出アッセイとしてのLAMPの適用性を示しています。
異なる方法の比較分析:従来の餌付け、従来のPCR、およびポータブルLAMPベースのアッセイ
LAMPの検出感度を従来のPCRと比較するために、胞子懸濁液の連続希釈から抽出したDNAをPCR反応で実行した。結果は、従来のPCRがLAMPよりも40倍低く、4.8 x 103胞子/mLの低い動物園の濃度しか検出できないことが検出できないことが示された(図2A)。さらに、濾過された灌漑池水から得られたDNAサンプルを従来のPCRを用いて試験し、3つの陽性サンプル(P4)のうちの1つだけが期待されるバンドサイズと有意な汚染として正常に増幅され、いくつかのスミアおよび非特異的バンドをもたらした(図6D)。表 3 に、時間、コスト、感度、必要な準備などの変数を使用した検出方法の違いを示します。LAMPは、これらの3つの方法の中で最も安価な方法であり、それはまた、増幅のために30〜60分(DNA抽出を除く)の範囲の最速でした。従来のPCRは、増幅のために120〜180分(DNA抽出を除く)の範囲でした。
最後に、プライマーの特異性を決定するために、密接に関連する卵母菌病原体のサンプル(フィトフトラ・サンソマーナ、フィトフトラ・ソジャエ、フィトフトラ・シナモミ、フィトフトラ・パルミボラ、ピシウム・ウルティム・ヴァルム)。最後端、フィトピチウム毒素、フィトピチウムヘリコイド、およびピシウムアファニダーマム)が得られ、同じプロトコルを用いてDNAを抽出し、正および陰性対照を有する新しいLAMPアッセイ(図4)で評価し、プライマーの特異性を決定した。すべての非標的試料は、最適化された64°Cを45分間使用して陰性であった。これは、リアルタイム増幅グラフ上で観察され、UV光下の1%アガロースゲル上で画像化された。
図1:実験室条件下での濃縮胞子懸濁液の連続希釈からフィトフトーラカプシチに関与する異なるステップを示す図。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:フィトフトーラカプシチの検出の限界の実験室最適化.(A)従来のPCRアッセイは、連続希釈因子に特異的なP.カプシチープライマーを用いて実施し、1%アガロースゲル上で可視化した。1、はしご。2-7、4.8 x 10 4、4.8 x103、4.8 x 102、2.4x 102、1.2x 102胞子/mL、7、負の水制御。4(B)1%アガロースゲルに可視化されたLAMPアッセイ連続希釈因子。1-6、減少する胞子濃度:4.8 x 10 4、4.8 x 103、4.8x 10 2、2.4 x 1042、1.2x 102の胞子/mL、および7、負の水制御。2(C)カラーメトリック色素を使用して可視化されたLAMP結果。1-6、減少する胞子濃度:4.8 x 10 4、4.8 x 103、4.8x 10 2、2.4 x 1042、1.2x 102の胞子/mL、および7、負の水制御。2(D)AMP の結果を増幅グラフに可視化した。赤 = 4.8 x 104,ダークブルー=4.8 x 103,オレンジ=4.8 x 102,水色=2.4 x 102,緑=1.2 x 102胞子/mL、ピンク=ネガティブコントロール(他のフィトフソラ種)、イエロー=ddH2O。(E) リアルタイム結果に示された値の定量化を示す標準曲線。Ln(胞子数)はX軸上に示され、Y軸上では分増幅する。(F)1%アガロースゲルに可視化された連続希釈因子に対する公開プライマー(Dongら 2015)によるLAMPアッセイ。1-6、減少する胞子濃度:4.8 x 10 4、4.8 x 103、4.8x 10 2、2.4 x 1042、1.2x 102の胞子/mL、および7、負の水制御。2この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:様々な場所からのP.カプシチDNAの増幅。(A)1%アガロースゲルで可視化されたLAMPの結果。1、PC_TN1;2、PC_TN2;3、PC_FL1;4,PC_FL2;5、PC_GA1;6、PC_GA2;N、ネガティブコントロール。サンプル1と2はTNから分離した。FLから分離されたサンプル3および4;試料5および6は、GAから分離した(B)着色色素を用いて可視化された結果。1、PC_TN1;2、PCTN2;3、PC_FL1;4,PC_FL2;5、PC_GA1;6、PC_GA2。(C) 増幅グラフで可視化された結果。赤、PC_TN1;オレンジ, PCTN2;黄色、PC_FL1;緑、PC_FL2;濃い青色、PC_GA1。水色、PC_GA2。ピンク、ネガティブコントロール。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:非標的種P.カプシチ由来のDNAを用いたLAMPアッセイの特異性判定。(A)アガロースゲル上の関連非標的種とのLAMPアッセイ反応を1%アガロースゲル上で可視化した。L、はしご;1,フィトフソラ・サンソマナ;2,フィトフソラ・ソジェ;3,フィトフソラ・シナモミ;4,フィトフソラ・パルミヴォラ;5、ピシウム・ウルティム var. 最後通告;6,フィトピチウムベキサン;7、ネガティブコントロール;8、フィトフトーラカプシカ(B)LAMP結果は、比色色素を用いて可視化した。1,フィトフソラ・サンソマナ;2,フィトフソラ・ソジェ;3,フィトフソラ・シナモミ;4,フィトフソラ・パルミヴォラ;5、ピシウム・ウルティム var. 最後通告;6,フィトピチウムベキサン;7、ネガティブコントロール;8、フィトフトーラカプシチ(C)LAMP結果を増幅グラフ上に可視化した。赤=フィトフトーラ・カプチシ、他の非標的種サンプルはすべて増幅されなかった。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:現場でのフィトフトーラ・カプシチの検出のためのリサイクル水のサンプリングと処理を示す写真。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図6:灌漑水源におけるフィトフトーラカプチーのオンサイト検出の結果(A) 南ジョージア州の7農場から試験水のLAMP増幅の結果を示すアガロースゲル。左から:P1、P2、P3、P4、P5、P6、P7、陰性制御、N.(B)フィールドBサンプルの暖動着色色素を使用して視覚化されたLAMP結果:P1、P2、P3、P4、P5、P6、P7、陰性制御、N. (C) フィールドサンプルのLAMP増幅結果赤:P1、緑:P2、パープル:P3、イエロー:P4、ブルー:P5、オレンジ:P6、ピンク:P7、ネガティブコントロール、N.(D)アガロースゲルは、特定のプライマーPC-1/PC-2を使用して増幅の従来のPCR結果を示す(1つのサイトよりも1つのサイトよりも正のランプでテストされた)。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| 池の名前 | 郡 | 灌漑のための目標作物 | PCR 検出 | ランプ検出 | 疾患の履歴 (Y/N) |
| P1 | トフト、GA | 野菜 | | + | N |
| P2 | トフト、GA | 野菜 | - | - | N |
| P3 | トフト、GA | 野菜 | - | - | N |
| P4 | トフト、GA | 野菜 | + | + | N |
| P5 | トフト、GA | 野菜 | - | - | N |
| P6 | トフト、GA | 野菜 | - | + | N |
| P7 | トフト、GA | 野菜 | - | - | N |
表1:南方地域からの灌漑水の検出
| プライマータイプ | プライマー名 | シーケンス 5'-3' | ソース | ||
| ランプ | PCA3-F3 | TGTGTGTGTGTTCGATCACA | 本研究 | ||
| PCA3-B3 | TTTTGCGTGCッカガ | 本研究 | |||
| PCA3-FIP | ガッカッカクテクトクトクトクトッタカアットクトクトクトガガガガガガガガガガ | 本研究 | |||
| PCA3-BIP | アガックガガットタッグクッチョクトクトクトット | 本研究 | |||
| PCA3-LF | TGTCGAATGGATTGCATT | 本研究 | |||
| PCA3-LB | アタクチャグトキャットガクトガク | 本研究 | |||
| Pcr | PC-1 | GTCTTGTACCCTATCATGGCG | 張ら、2006年 | ||
| PC-2 | CGCカガガガガーアアグキャット | 張ら、2006年 | |||
表2:本研究で用いたプライマー
| パラメーター | 従来 | 従来の PCR | ランプ |
| 感度 | Na | 4.8 X 102 胞子/ml | 1.2 X 102 胞子/ml |
| 時間 | 2週間以上 | 2~3時間(DNA抽出を含まない) | 30分 - 1時間(DNA抽出を含まない) |
| 準備 | • メディア作成 • めっきと隔離 • トラップの設計 |
• フィルターペーパーを使用した胞毛コレクション • DNA抽出と • PCR アッセイ |
• フィルターペーパーを使用した胞毛コレクション • DNA抽出と • ランプアッセイ |
| 材料 | • オートクレーブ • メディアおよびプレート • インキュベーションルーム • フローフード • ナス • ミルククレート |
• サーマルサイクラー • 寒天ゲル • ゲルドク |
• ヒートブロックまたは • 魔神3世 |
| コスト | トラップあたり$ 5.00 | 反応あたり$0.60 | 反応1回あたり0.75ドル |
表3:P.カプシチ検出法の比較
補足図1:ティフト郡の位置、GAおよび州内から様々な場所から採取された灌漑水のサンプル。陽性サンプルは赤い点として示した。こちらをダウンロードしてください。
補足図2:LAMPプライマーセットの設計矢印はプライマーの読み方の方向を示します。こちらをダウンロードしてください。
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Discussion
植物病原体の灌漑水の試験は、灌漑池とリサイクル水27を使用して生産者にとって重要なステップです。灌漑池は、過剰な灌漑水が16、27存在している可能性のある病原体を運ぶ池にフィールドから向けられているように、植物病原体の数のための貯水池と27繁殖地を提供します。大きな水源における植物病原体の検出のための伝統的な方法は、池に懸濁した感受性の宿主組織(例えば、果実、葉)を用いて病原体の餌をセットし、感染が起こるのを待ち、その後、果実/葉を取り除き、顕微鏡法または分子法13,14,14で診断を確認することである。これらの方法は、検出テストの実行に必要な時間(2週間以上)、および必要な労働および機器のために制限されています。また、正確な結果を得るには、視覚診断、病原体形態、分類に関する豊富な経験と知識が必要です。PCR、qPCR、DNAハイブリダイゼーションなどの分子技術は、従来の検出方法よりも大幅に短い時間(3-4時間)を必要とします。しかし、高価な機器と実験室の設定が必要です。さらに、これらの技術は、大量の水の処理を可能にしません。血清学的アッセイも非標的陽性反応による検出能力が不足し、フィトフトーラ種に対する種特異的アッセイは開発されていない。ループ媒介等温増幅(LAMP)は、アッセイがサーマルサイクラー28,29,29ではなく単一の温度しか必要としないため、複数の病原体を迅速かつ敏感に検出するためのオンサイト診断技術として最近使用されている。LAMPは、視覚的な確認のための比色色素を使用して、または1時間30未満の結果のためのリアルタイム増幅機を使用して、フィールドで実行することができます。
この実験の目的は、現場または実験室の水源中の フィトフトーラカプシ の存在を検出するための迅速かつ敏感な方法を開発することであった。検出速度を上げ、前述の灌漑水中の カプシチ を検出する方法の限界に対処するために、濾紙を用いて胞子を捕捉し、大量の水からDNAを抽出する方法を設計しました。濾紙技術を用いて胞子を捕捉し、DNAを抽出した後 、P.カプシチに特異的な新設計のLAMPプライマーセットに基づいて病原体の存在を確認した。検出感度と特異性をLAMPとPCRを用いて比較した。すべての3つの複製およびすべての動物園の集中で、LAMPはより速く、より敏感な検出方法であった(表3)。この方法は、従来の方法として小さなサンプル体積を有することによって制限されないが、この方法は、一度に1Lまでの水を試験することができるので、病原体検出の可能性を高める。テストでは、毎秒40mL以下の速度でBuchner漏斗を通して灌漑水をゆっくりと注ぐことで、濾紙の胞毛捕獲能力が増加することが指摘されました。
検出プロトコルを検証するために、P.カプシチが存在すると疑われる分野からの水サンプルも採取され(補足図1)、実際のシナリオで設計された方法を試験した。試験した7つの農場のうち、3はLAMPアッセイ(図6A-6C)を用いたP.カプシチの存在に陽性であったが、従来のPCRアッセイ(図6D)を使用する場合は1つの農場だけが陽性であったが、この灌漑水を試験する方法のより敏感なアッセイとしてLAMPを示した。しかし、このフィルターベースのLAMPアッセイは、1.2 x 102の動物園/mLの低い濃度からDNAを検出することができ、これは、このアッセイの元の感受性(0.01 ngゲノムDNAは〜5胞子に相当)を濾過されていない動物園の懸濁液で有意に低かった。ドンらによる以前のランプアッセイal. (2015)20は同じシリアル希釈で実行され、感度のレベルは同じであった (図 2F)。また、濾過されていない胞子溶液を用いたPCRアッセイの検出レベルは、以前のPCRベースの所見10と非常によく似た高いレベルの検出(10個の胞子に相当する)も示している。従来の餌付け検出方法の胞毛検出限界は、個々の能力に応じて感染を引き起こす可能性がある単一の胞毛としてチェックされなかった。LAMPおよびPCRアッセイの両方に見られる感度の低下は、フィルターペーパーを通ってまたは周りに流れるいくつかの胞子、または一度フィルターペーパーに取り付けられたもので、100%効率で抽出することができない可能性があります。それにもかかわらず、この新しいLAMPとフィルタシステムは、以前の方法よりもはるかに高い水量を処理し、分析することができ、フィールド内検出のためのより高いレベルの特異性と速度を与えます。
使用される抽出方法のうち、磁気ビーズベースの抽出は最も迅速であり、ビーズビーターや遠心分離機などの外部機械を使用する必要がなくて、現場での抽出に役立ち、LAMPアッセイのポータブル機能を補完しました。CTABベースの方法は、DNAの最高濃度を得たが、最も長い時間を要したが、市販の植物DNA抽出キット(例えば、DNeasy)は、取得した時間とDNA濃度の両方で2番目であった。
CTABと市販植物DNA抽出キットの両方を使用すると、濾紙の均質化中に、均質化がより成功し、ビードの叩きまたは手の均質化が開始される前に濾紙片を用いてCTAB溶液(または抽出バッファー)をチューブに添加すると、より高い濃度が得られたことが指摘された。ビーズの叩きは、それぞれ1分間3回行ったが、全ての抽出方法において完全な均質化のためには、各ラウンドの間にチューブをボルテックスおよび攪拌する必要があった。重要なことに、フィルターペーパーはチューブの側面または底部に詰まるので、均質化されるようにフィルタペーパーが壁から外れているかどうかを確認することが重要です。
増幅に必要な合計時間は90〜120分で、現場での診断のために現場で簡単に行うことができます。このフィルター法は、病原体の検出の可能性を高めるために、大量の水をろ過するように設計されています。この方法は、水源に蓄積することができる多くの病原体にも適用可能です, 例えば属: ピシウム, フィトフトーラ, フザリウム, 細菌;必要な唯一の変更は、標的病原体30に対して同じように特異的なLAMPプライマーセットの開発である。
この研究の重要な出力は、灌漑水源における P.カプシチ の検出のための高感度かつ迅速なフィルター紙ベースのLAMPアッセイの開発です。この研究は、リサイクルされた灌漑水の汚染に対する意識の高まり、最終的にはフィトフトーラ関連疾患の管理を改善し、その結果、生産コストを削減し、作物収量を増加させることが期待される。野菜の生産の持続可能性を向上させ、野菜生産の収益性を高めるために、このような情報が非常に必要とされています。
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Disclosures
著者は、開示するものや利益相反を何も持っていません。
Acknowledgments
この作品は、ジョージア州野菜商品委員会プロジェクトID# FP00016659の財政支援を受けました。著者らは、ピシェン・ジ博士(ジョージア大学)とオハイオ州立大学アン・ドランス博士に感謝し、 フィトフトーラ・スップの純粋な文化を提供してくれた。また、研究を通じて彼らの技術的支援のために李王とデロリス・ヴェニーに感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose gel powder | Thomas Scientific | C997J85 | |
| Buchner funnel | Southern Labware | JBF003 | |
| Bullet Blender | Next Advance | BBX24 | |
| Centrifuge 5430 | Eppendorf | 22620509 | |
| Chloroform | Fischer Scientific | C298-500 | |
| CTAB solution | Biosciences | 786-565 | |
| Dneasy Extraction Kit | Qiagen | 69104 | |
| Filter Flask | United | FHFL1000 | |
| Filter Paper | United Scientific Supplies | FPR009 | |
| Gel Green 10000X | Thomas Scientific | B003B68 (1/EA) | |
| Genie III | OptiGene | ||
| Hand pump | Thomas Scientific | 1163B06 | |
| Iso-amyl Alcohol | Fischer Scientific | BP1150-500 | |
| LAVA LAMP master mix | Lucigen | 30086-1 | |
| Magnetic bead DNA extraction | Genesig | genesigEASY-EK | |
| Magnetic Separator | Genesig | genesigEASY-MR | |
| polyvinylpyrrolidone | Sigma Aldrich | PVP40-500G | |
| Primers | Sigma Aldrich | ||
| Prism Mini Centrifuge | Labnet | C1801 | |
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | 1861096 | |
| UV Gel Doc | Analytik Jena | 849-00502-2 | |
| Warmstart Colorimetric Dye | Lucigen | E1800m | |
| Wide Mini ReadySub-Cell GT Cell | Bio-Rad | 1704489EDU | |
| 70% isopropanol | Fischer Scientific | A451-1 |
References
- Hong, C., Moorman, G. J. Plant pathogens in irrigation water: challenges and opportunities. Critical Reviews in Plant Sciences. 24 (3), 189-208 (2005).
- Malkawi, H. I., Mohammad, M. J. Physiology, Genetics, Morphology, & Microorganisms, E. o. Survival and accumulation of microorganisms in soils irrigated with secondary treated wastewater. Journal of Basic Microbiology. 43 (1), 47-55 (2003).
- Bush, E. A., Hong, C., Stromberg, E. L. Fluctuations of Phytophthora and Pythium spp. in components of a recycling irrigation system. Plant Disease. 87 (12), 1500-1506 (2003).
- Ghimire, S. R., et al. Distribution and diversity of Phytophthora species in nursery irrigation reservoir adopting water recycling system during winter months. Journal of Phytopathology. 159 (11-12), 713-719 (2011).
- Hausbeck, M. K., Lamour, K. H. Phytophthora capsici on vegetable crops: research progress and management challenges. Plant Disease. 88 (12), 1292-1303 (2004).
- Gevens, A., Donahoo, R., Lamour, K., Hausbeck, M. Characterization of Phytophthora capsici from Michigan surface irrigation water. Phytopathology. 97 (4), 421-428 (2007).
- Thomson, S., Allen, R. Occurrence of Phytophthora species and other potential plant pathogens in recycled irrigation water. Plant Disease Reporter. 58 (10), 945-949 (1974).
- Lamour, K. H., Stam, R., Jupe, J., Huitema, E. The oomycete broad-host-range pathogen Phytophthora capsici. Journal of Molecular Plant Pathology. 13 (4), 329-337 (2012).
- Sanogo, S., Ji, P. Water management in relation to control of Phytophthora capsici in vegetable crops. Agricultural Water Management. 129, 113-119 (2013).
- Zhang, Z., Li, Y., Fan, H., Wang, Y., Zheng, X. Molecular detection of Phytophthora capsici in infected plant tissues, soil and water. Plant Pathology. 55 (6), 770-775 (2006).
- Trout, C., Ristaino, J., Madritch, M., Wangsomboondee, T. Rapid detection of Phytophthora infestans in late blight-infected potato and tomato using PCR. Plant Disease. 81 (9), 1042-1048 (1997).
- Sankaran, S., Mishra, A., Ehsani, R., Davis, C. A review of advanced techniques for detecting plant diseases. Commputers and Electronics in Agriculture. 72 (1), 1-13 (2010).
- Wang, Z., et al. Development of an improved isolation approach and simple sequence repeat markers to characterize Phytophthora capsici populations in irrigation ponds in southern Georgia. Applied and Environmental Microbiology. 75 (17), 5467-5473 (2009).
- Ali-Shtayeh, M., MacDonald, J. Occurrence of Phytophthora species in irrigation water in the Nablus area (West Bank of Jordan). Phytopathologia Mediterranea. , 143-150 (1991).
- Pringsh, P. Comparison of serological and culture plate methods for detecting species of Phytophthora, Pythium, and Rhizoctonia in ornamental plants. Plant Disease. 74 (9), 655 (1990).
- Stewart-Wade, S. M. Plant pathogens in recycled irrigation water in commercial plant nurseries and greenhouses: their detection and management. Irrigation Science. 29 (4), 267-297 (2011).
- Aragaki, M., Uchida, J. Y. Morphological distinctions between Phytophthora capsici and P. tropicalis sp. nov. Mycologia. 93 (1), 137-145 (2001).
- Tomlinson, J., Boonham, N. Potential of LAMP for detection of plant pathogens. CAB Reviews Perspectives in Agriculture Veterinary Science Nutrition and Natural Resources. 3 (066), 1-7 (2008).
- Li, P., et al. A PCR-based assay for distinguishing between A1 and A2 mating types of Phytophthora capsici. Journal of the American Society for Horticultural Science. 142 (4), 260-264 (2017).
- Dong, Z., et al. Loop-mediated isothermal amplification assay for sensitive and rapid detection of Phytophthora capsici. Canadian Journal of Plant Pathology. 37 (4), 485-494 (2015).
- Khan, M., et al. Comparative evaluation of the LAMP assay and PCR-based assays for the rapid detection of Alternaria solani. Frontiers in Microbiology. 9, 2089 (2018).
- Sowmya, N., Thakur, M., Manonmani, H. K. Rapid and simple DNA extraction method for the detection of enterotoxigenic Staphylococcus aureus directly from food samples: comparison of PCR and LAMP methods. Journal of Applied Microbiology. 113 (1), 106-113 (2012).
- Waliullah, S., et al. Comparative analysis of different molecular and serological methods for detection of Xylella fastidiosa in blueberry. PLOS ONE. 14 (9), 0221903 (2019).
- Böhm, J., et al. Real-time quantitative PCR: DNA determination in isolated spores of the mycorrhizal fungus Glomus mosseae and monitoring of Phytophthora infestans and Phytophthora citricola in their respective host plants. Journal of Phytopathology. 147, 409-416 (1999).
- Klimczak, L., Prell, H. J. C. Isolation and characterization of mitochondrial DNA of the oomycetous fungus Phytophthora infestans. Current Genetics. 8 (4), 323-326 (1984).
- Ghimire, S. R., et al. Detection of Phytophthora species in a run-off water retention basin at a commercial nursery in plant hardiness zones 7 b of Virginia in winter. Phytopathology. 96 (6), (2006).
- Feng, W., Hieno, A., Kusunoki, M., Suga, H., Kageyama, K. J. P. LAMP detection of four plant-pathogenic oomycetes and its application in lettuce fields. Plant Disease. 103 (2), 298-307 (2019).
- Aglietti, C., et al. Real-time loop-mediated isothermal amplification: an early-warning tool for quarantine plant pathogen detection. AMB Express. 9 (1), 50 (2019).
- Almasi, M. A. Development of a colorimetric loop-mediated isothermal amplification assay for the visual detection of Fusarium oxysporum f. sp. melonis. Horticultural Plant Journal. 5 (3), 129-136 (2019).
- Gill, D. J. Pathogenic Pythium from irrigation ponds. Plant Disease Reporter. 54 (12), 1077-1079 (1970).
