Summary
Vi udviklede en metode til at detektere Phytophthora capsici zoospores i vandkilder ved hjælp af et filter papir DNA ekstraktion metode kombineret med en loop-medieret isotermisk forstærkning (LAMP) analyse, der kan analyseres i marken eller i laboratoriet.
Abstract
Phytophthora capsici er en ødelæggende oomycete patogen, der påvirker mange vigtige solanaceous og cucurbit afgrøder forårsager betydelige økonomiske tab i vegetabilsk produktion årligt. Phytophthora capsici er jordbåren og et vedvarende problem i grøntsagsmarker på grund af sin langlivede overlevelse strukturer (oosporer og klamydosporer), der modstår forvitring og nedbrydning. Den vigtigste metode til spredning er gennem produktion af zoosporer, som er encellede, flagellated sporer, der kan svømme gennem tynde film af vand til stede på overflader eller i vandfyldte jordporer og kan ophobes i vandpytter og damme. Derfor kan vanding damme være en kilde til patogenet og de første punkter i sygdomsudbrud. Påvisning af P. capsici i kunstvanding vand er vanskeligt ved hjælp af traditionelle kultur-baserede metoder, fordi andre mikroorganismer til stede i miljøet, såsom Pythium spp., normalt overgrow P. capsici gør det målbart. For at bestemme tilstedeværelsen af P. capsici sporer i vandkilder (vandingsvand, afstrømning, osv.), vi udviklet en hånd pumpe-baseret filter papir (8-10 μm) metode, der fanger patogenets sporer (zoosporer) og senere bruges til at forstærke patogenets DNA gennem en roman loop-medieret isotermisk forstærkelse (LAMP) assay designet til den specifikke forstærkning af Pici caps. Denne metode kan forstærke og detektere DNA fra en koncentration så lavt som 1,2 x 102 zoosporer/ml, hvilket er 40 gange mere følsomt end konventionel PCR. Der blev ikke opnået krydsforstærkning ved afprøvning af nært beslægtede arter. LAMP blev også udført ved hjælp af en kolonmetrisk LAMP master mix farvestof, der viser resultater, der kunne læses med det blotte øje for on-site hurtig detektion. Denne protokol kan tilpasses til andre patogener, der bor, ophobes eller spredes via forurenede vandingssystemer.
Introduction
Genbrug af vand i gårde og planteskoler bliver mere og mere populære på grund af stigningen i vandomkostninger og miljøhensyn bag vandforbruget. Mange vandingsmetoder er blevet udviklet for avlere for at reducere spredningen og forekomsten af plantesygdomme. Uanset kilden til vandet (kunstvanding eller nedbør), afstrømning genereres, og mange grøntsager og planteskole avlere har en dam til at indsamle og genbruge afstrømning1. Dette skaber et reservoir for mulig patogen akkumulering begunstige spredningen af patogener, når det genvundne vand bruges til at overrisleafgrøder 2,3,4. Oomycete plantepatogener især drage fordel af denne praksis som zoosporer vil ophobes i vand og den primære dispersive spore er selv-motile, men kræver overfladevand5,6,7. Phytophthora capsici er et oomycet patogen, der påvirker et betydeligt antal solanaceous og cucurbit afgrøder på forskellige måder8. Ofte er symptomerne dæmpning-off af planter, rod og krone rådne; dog i afgrøder som agurk, squash, melon, græskar, vandmelon, aubergine og peber, kan hele høsten gå tabt på grund af frugt rådne9. Selv om der er kendte metoder til påvisning af dette plantepatogen, kræver de fleste, at der allerede er fundet en infektion, hvilket er for sent til, at eventuelle forebyggende fungicider har enbetydelig virkning 10.
Den traditionelle metode til at teste vandingsvand til påvisning og diagnosticering af målrettede mikroorganismer er en forældet tilgang , når hastighed og følsomhed er afgørende for succes og rentabelafgrødeproduktion 11,12. Plantevæv, der er modtageligt for det målrettede patogen (f.eks. aubergine til P. capsici), er fastgjort til en modificeret fælde, der er suspenderet i en vandings dam i længere tid, før det fjernes og inspiceres for infektion. Prøver fra plantevævet belagt derefter på halvselektive medier (PARPH) og inkuberes for dyrs vækst, hvor derefter udføres morfologisk identifikation ved hjælp af et sammensat mikroskop13. Der findes andre lignende påvisningsmetoder for andre plantepatogener , der anvender selektive medier og plettering af små mængder forurenetvand,før de erunderdyrende 14,15. Disse metoder kræver alt fra 2 til 6 uger, flere runder af sub-culturing at isolere organismen, og erfaring på Phytophthora diagnostik at være i stand til at genkende de vigtigste morfologiske tegn i hver art. Disse traditionelle metoder fungerer ikke godt til påvisning af kunstvanding vand forurenet med P. capsici på grund af faktorer som interferens fra andre mikroorganismer, der også er til stede i vandkilderne. Nogle hurtigt voksende mikroorganismer som Pythium spp. og vandbårne bakterier kan overgrow på pladen gør P. capsici målbart16,17.
Formålet med denne undersøgelse var at udvikle en følsom og specifik molekylær metode, der kan anvendes i både felt- og laboratoriemiljøer til at detektere P. capsici zoosporer i kunstvandingsvand. Protokollen omfatter udvikling af en ny loop-medieret isotermisk forstærkning (LAMP) primer sæt i stand til specifikt at forstærke P. capsici, baseret på en 1121-base par (bp) fragment af P. capsici18,19. En tidligere udviklet LAMP primer fra Dong et al. (2015) blev anvendt i forhold til den analyse, der blev udviklet til denne undersøgelse20.
LAMP-analysen er en forholdsvis ny form for molekylær detektion, der har vist sig at være hurtigere, følsom og specifik end konventionel polymerasekædereaktion (PCR)21. Konventionelle PCR-analyser kan generelt ikke påvise under 500 kopier (1,25 pg/μL); I modsætning hertil har tidligere undersøgelser vist, at LAMP's følsomhed kan være 10 til 1.000 gange højere end konventionel PCR og let kan detektere selv 1 fg/μL genomisk DNA22,23. Derudover kan analysen udføres hurtigt (ofte i 30 min) og on-site (i marken) ved hjælp af en bærbar varmeblok til forstærkning og et kolormetrisk farvestof, der skifter farve til en positiv prøve (fjerne behovet for elektroforese). I denne undersøgelse sammenlignede vi følsomheden af PCR- og LAMP-analyser ved hjælp af en filterudsugningsmetode. Den foreslåede detektionsmetode gør det muligt for forskere og udvidelsesagenter nemt at detektere tilstedeværelsen af P. capsici sporer fra forskellige vandkilder på mindre end to timer. Analysen har vist sig at være mere følsom end konventionel PCR og blev valideret in situ ved at opdage tilstedeværelsen af patogenet i kunstvandingsvand, der anvendes af en producent. Denne detektionsmetode vil gøre det muligt for avlerne at anslå tilstedeværelsen og befolkningstætheden af patogenet i forskellige vandkilder, der anvendes til kunstvanding, forhindre ødelæggende udbrud og økonomiske tab.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Påvisning af Phytophthora capsici på stedet fra vandingsvand ved hjælp af bærbar løkkemedieret isotermisk forstærkning
- Opsætning af pumpen og filter
- Fastgør en filtreringskolbe til et rør, der er forbundet med en håndpumpe, så der, når pumpen aktiveres, trækkes luft ind gennem filtreringskolbens munding.
- Buchner-tragten monteres i gummiproppen i filtreringskolbens munding og sæt filterpapiret i passende størrelse ind i Buchner-tragten, så luften trækkes gennem filterpapiret. Filterpapiret skal have en opbevaringsstørrelse på 15 μm.
BEMÆRK: Filterpapiret skal passe til buchnertragtens kanter, så der flyder minimalt vand rundt om filterpapiret.
- Vandprøvetagning og -filtrering
- Tag vandprøver fra den målrettede kilde. Vand kan have små mængder af snavs, men ikke signifikant sediment eller jord.
- Hæld op til 1.000 ml (1 liter) testvand over filterpapiret placeret inde i Buchner-tragten langsomt nok til at forhindre overløb, mens håndpumpen (eller vakuum) bruges til at skabe en suge til at trække vandet igennem.
BEMÆRK: Der er ingen minimums mængde vand, der kan testes ved hjælp af denne metode, og selv om det er foreslået mindst 50 ml, er 1000 ml det maksimale for denne metode. - Brug pincet, fjern filterpapiret fra Buchner-tragten og skær det i små stykker med steril saks. Der tilsættes så mange stykker (8-12), som kan nedsænkes i den mængde ekstraktionsbuffer (400 μL til magnetisk perlebaseret ekstraktion), som protokollen kræver, i et 1,5 ml rør. Gem de resterende stykker filterpapir til behandling, når det første sæt er udtrukket.
- Vortex eller på anden måde omryste stykker af filterpapir og udvinding buffer i 10 s hvert minut i 5 min. Fjern derefter filterpapiret, der mister så lidt udsugningsbuffer som muligt, ved hjælp af krævn. Dette trin gentages med de resterende stykker filterpapir, indtil alle stykker er blevet hvirvlet/omrørt og dyppet i ekstraktionsbufferen.
- Magnetisk perlebaseret udvinding af DNA fra filterpapir
- Til 1,5 ml-røret (som nu indeholder ca. 200-300 μL ekstraktionsbuffer), tilsættes 20 μL proteinase K og 10 μL 10 ng/μL RNase.
- Inkuber ved stuetemperatur i 15 min.
- Der tilsættes 500 μL magnetiske perler med bindingsbufferen til prøven, og der blandes godt ved omrystning. Derefter inkuberes i 5 min ved stuetemperatur.
- Placer røret i den magnetiske separator rack i 2 min, indtil alle perler er blevet trukket til magneten. Fjern og kassér supernatanten.
- Fjern røret fra den magnetiske separator. Der tilsættes 500 μL vaskepude buffer 1, og du skal hænge perlerne igen ved at ryste røret kraftigt. Vent i 30 s og derefter placere røret tilbage i den magnetiske separator. Vent i 2 min, indtil alle perler er trukket mod magneten, før du fjerner og kasserer supernatanten.
BEMÆRK: Når vi venter på, at de magnetiske perler magnetiserer til separatoren, anbefaler vi, at røret vendes, som kan løsne magnetiske perler fast på hætten og siderne af røret og resultere i, at et større antal perler fastgøres. - Trin 1.3.5 gentages med 500 μL vaskepude 2.
- Trin 1.3.5 gentages med 500 μL ethanol på 80 %.
- Lufttørre den magnetiske perle pellet i 15 min ved stuetemperatur (18-27 °C) med låget åbent. Hvis temperaturen ikke tillader det, inkuberes i en behandsket hånd med hætten åben i 15 min.
- Fjern røret fra den magnetiske separator. Tilsæt 50 μL elution buffer og re-suspendere perlerne ved pipettering op og ned i 1 min.
- Placer røret tilbage i en magnetisk separator. Vent 2 min, før supernatanten overføres uden at forstyrre perlerne til et separat rør til DNA-opbevaring.
BEMÆRK: Her kan eksperimentet sættes på pause, før du går videre. Ekstraheret DNA skal opbevares på is eller i en -20 °C fryser.
- Anvendelse af nyudviklet LAMP-analyse
- Lamp primerblandingen klargøres med 0,2 μM af hver F3- og B3-primer, 0,8 μM for hver Loop-F- og Loop-B-primer og 1,6 μM af hver FIP- og BIP-primer (tabel 2).
- Følgende LAMP-opløsning til et enkelt PCR-rør eller til hvert enkelt rør i 8-rørstriben: 2,5 μL primerblanding (trin 1.4.1), 12,5 μL LAVA LAMP master mix, 1 μL udvundet DNA og 9 μL ddH2O. Det samlede volumen er 25 μL.
BEMÆRK: Hvis du bruger det bærbare forstærkningsinstrument (f.eks. - Angiv to rør som positive og negative kontroller. Til den positive kontrol skal du enten bruge en kontrol, der leveres af LAVA LAMP-sættet, eller en kendt positiv DNA-prøve. Brug ddH2O til den negative kontrol. For begge erstattes 1 μL ekstrahyp af ekstraheret DNA med 1 μL af den positive kontrol eller ddH2O.
- Prøverne ind i en varmeblok (eller et bærbart forstærkningsinstrument), der er indstillet til 64 °C i 45 minutter.
BEMÆRK: Andre ekstraktionsmetoder kan anvendes her i stedet for magnetisk perlebaseret ekstraktion. CTAB og et kommercielt DNA-ekstraktionssæt blev begge afprøvet med succes ved hjælp af standardprotokollerne og erstatte filterpapirstykkerne med planteprøven24,25. Resultaterne blev sammenlignet i tabel 2. Hvis koncentrationen af DNA kan kvantificeres, anvendes mellem 1-10 ng genomisk DNA.
- Visualisering af resultater
- Hvis det udføres i en laboratorieindstilling, skal du se forstærkningsprodukterne ved at lægge 5 μL af hver prøve i en 1% agarosegel, køre dem i en gelelektrophoresismaskine og afbildle dem i en UV-billedmaskine.
- Hvis der blev brugt et kolometrisk farvestof (f.eks.
- Hvis der blev anvendt et bærbart forstærkningsinstrument (f.eks.
- Anvendelse af tidligere udviklet PCR-analyse
BEMÆRK: Hvis der anvendes en konventionel PCR-analyse, forbliver trin 1-3 de samme, og følgende trin skal anvendes i stedet for trin 1.4 og 1.5.- Der tilsættes 1 μL af hver DNA-ekstraktion til individuelle rør, der indeholder følgende komponenter: 12,5 μL grøn PCR-masterblanding, 9,5 μL ddH2O og 1 μL forreste og omvendte primere (tabel 2).
- Spin ned hver prøve ved hjælp af en mikrocentrifuge og placere rør i en termisk cycler.
- Følgende termiske cyklusrindstillinger i overensstemmelse med de tidligere publikationer: 94 °C i 5 min. 30 cyklusser ved 94 °C i 30 s, glødning ved 54 °C i 30 s, forlængelse ved 72 °C i 1 min. og endelig forlængelse ved 72 °C i 10 min.
- Kør produktet i en 1% agarose gel. Overhold tilstedeværelsen af bands under UV-lys, hvor positive reaktioner vil have et bånd størrelse på ~ 508 bp.
- Traditionel detektionsmetode
BEMÆRK: Der er flere metoder til selektiv plettering til patogendetektion, og følgende er en generel protokol for P. capsici.- Først skal du opnå en sund aubergine frugt (en modtagelig vært for P. capsici)og overflade sterilisere ved at vaske frugtoverfladen med 70% isopropylalkohol.
- Placer aubergine frugt i mælkekasser med en flotation enhed (polyethylen skum eller andre) og indsætte i kunstvanding damme. Fastgør hver agn fælde til et enkelt punkt og lad fælderne i vandreservoiret (genanvendt kunstvanding vand) i mindst 7 dage, eller indtil frugt rådne symptomer er observeret. Saml frugten og transporter den til laboratoriet.
- Skyl og tør frugten i en steril hætte, før små stykker inficeret væv fjernes, og læg dem på en plade af PARPH-medie ændret med 25 mg/L pentachloronitrobenzen, 0,0005% pimaricin, 250 mg/L ampicillin, 10 mg/L rifampicin og 50 mg/L hymexazol. Inkuber plader ved 25 °C i 5 dage.
- Se plader under et sammensat mikroskop til traditionel morfologisk identifikation 4 dage efter isolering.
2. Bestemmelse af detektionsgrænsen for zoosporkoncentration
- Gør zoospore suspension
- Inkuber P. capsici på V8 agar (100 ml V8 juice, 900 ml ddH2O, 1 g CaCO3)plader i 1 uge ved 26 °C. Flere plader kan bruges til at opnå en større mængde af zoospor suspension.
- Inkuber pladerne under kontinuerlig lys ved stuetemperatur i 3 dage for at stimulere sporulation.
- Pladerne må oversættes ved at tilsætte 15 ml ddH2O til hver plade, og de sættes i et køleskab på 4 °C i 25 min. Vend derefter tilbage til stuetemperatur i 30 min.
- Omrør pladerne for at løsne zoosporer og pipette opløsningen til et enkelt 50 ml rør fra alle pladerne.
- For at opnå et nøjagtigt skøn over zoosporkoncentrationen tilsættes 10 μL af sporeaffjedringen på et hæmocytometer, og der observeres under et mikroskop for at tælle zoosporer og anslå den gennemsnitlige koncentration.
- Seriel fortynding
- Der tilsættes 1 ml af sporeaffjedringen og 9 ml ddH2O til et separat rør. Gentag dette trin for så mange 10-fold fortyndinger som ønsket.
- Sporeopløsninger indsendes derefter til DNA-ekstraktion baseret på den tidligere protokol ved hjælp af filtreringsmetoden.
BEMÆRK: Hvis der ønskes et større affjedringsvolumen, skal volumenet fordobles: 2 ml sporeaffjedring og 18 ml ddH2O.
- Påvisning af koncentrationsgrænse for zoospor
- Vurder grænse for detektion af spore ved at køre hver seriel fortynding individuelt gennem analysen, indtil der ikke længere observeres klart positive resultater. Når den endelige fortynding er opnået, fortyndes med en faktor på 2 (4,8 til 2,4 i dette eksempel) og køre analysen igen for at få en mere præcis detektionsgrænse.
- Udvikling og optimering af LAMP-metoden
BEMÆRK: LAMP primere er designet på grundlag af et 1121-base par (bp) fragment af P. capsici (Li et al.19) som vist i supplerende figur 2.- Hvis der anvendes farvestof (f.eks. Warmstart), anvendes følgende opløsning: 2,5 μL primerblanding, 12,5 μL kolotrimetrisk farvestof, 0,5 μL grønt fluorescerende farvestof, 1 μL ekstraudvundet DNA og 8,5 μL ddH2O. Det samlede volumen er 25 μL.
- Når du bruger det bærbare forstærkningsinstrument sammen med LAVALAMP mastermix, skal du have et indledende trin på 95 °C i 3 minutter som anbefalet af producenten, men dette er ikke nødvendigt. En endelig glødning skridt er ikke forpligtet til at observere farveændring eller forstærkning graf. Kør ikke et warmstart-trin, hvis det kommercielle farvestof skal anvendes.
- Se LAMP-analysen resulterer i en af følgende metoder: kør prøver på en 1% agarosegel eller se ved hjælp af en UV-billedmaskine med det blotte øje eller udsigt på Genie III-forstærkningsskærmen i realtid.
- Optimer lampens temperatur ved hjælp af det bærbare forstærkningsinstrument og analyseres ved hjælp af realtidsforstærkningsgrafen for at få hastighed og følsomhedsniveau. Kør prøver med unikke temperaturer for at bestemme den hurtigste forstærkning med den højeste følsomhed.
- Detektionsgrænsen for den LAMPEudviklede analyse bestemmes ved at foretage en seriel fortynding af ekstraheret DNA (som ved sporeaffjedring i trin 2.2.1) og opretholde reaktionsbetingelserne som tidligere beskrevet for LAMP-reaktionen for hver fortynding.
- Registreringsgrænsebestemmelse og sammenligning med konventionel PCR-metode
- Brug DNA udvundet i trin i punkt 1.3 til at sammenligne detektionsniveauet for konventionel PCR med LAMP-analysens.
- Der tilsættes 1 μL DNA til et PCR-rør, der indeholdt 1 μL af både frem- og tilbage-PCR-primere (tabel 2), 12,5 μL grøn PCR Mastermix og 9,5 μL ddH2O i alt 25 μL.
- Forstærke prøver i en termisk cycler under følgende betingelser: 94 °C i 5 min. 30 denatureringscyklusser ved 94 °C i 30 s, glødning ved 54 °C i 30 s, forlængelse ved 72 °C i 1 min. og endelig forlængelse ved 72 °C i 10 min.
- Kør prøver i en elektroforese maskine på en 1% agarose gel og se på en UV-billedbehandling maskine. Den undtagene båndstørrelse var 508 bp.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Optimering af LAMP-metoden
I denne undersøgelse, vi opdaget tilstedeværelsen af Phytophthora capsici i kunstvanding vand ved hjælp af en bærbar loop-medieret isotermisk forstærkning (LAMP) assay. For det første blev den foreslåede LAMP-analyse optimeret ved at teste forskellige LAMP-primerkoncentrationer [F3, B3 (0,1-0,5 μM hver); LF, LB (0,5-1,0 μM hver) og FIP, BIP (0,8-2,4 μM hver)], varigheder (30-70 min) og temperaturer (55-70 °C). Den endelige LAMP primer mix, der anvendes i denne undersøgelse var: 0,2 μM af hver F3 og B3 primer, 0,8 μM af hver Loop-F og Loop-B primer, 1,6 μM af hver FIP og BIP primer. Optimering af reaktionstemperaturen blev udført i det bærbare forstærkningsinstrument (f.eks. Den optimale temperatur blev bekræftet at være 64 °C (data ikke vist). Den optimale køretid for analyse ved 64 °C var 45 min, da de laveste koncentrationer, der var positive for detektion (1,2 x 102 sporer/ml), stadig forstærkes med 40 min, mens højere koncentrationer forstærkes ved 20 min (Figur 2D). De forstærkede LAMP-produkter blev yderligere observeret på 1% agarosegel plettet med en nukleinsyreplet for at bekræfte forstærkning. Alle reaktioner blev gentaget mindst tre gange.
Isolater af P. capsici blev taget fra Tennessee, Florida og Georgien og blev forelagt den samme protokol, der er beskrevet i metoderne. Alle prøver af P. capsici isolater blev forstærket med succes i alle kørsler af analysen (Figur 3).
Detektion og følsomhed test af Phytophthora capsici i kunstvanding vand ved hjælp af bærbare LAMP assay
Vi standardiserede denne filterpapirbaserede LAMP-metode under laboratorieforhold ved hjælp af en seriel fortynding af P. capsici spore suspensioner (Figur 1). Serielle fortyndinger blev fremstillet af en P. capsici spore suspension fra 4,8 x 104 zoosporer/ml og køres med LAMP-analysen i tre eksemplarer. Sporekoncentrationer er vist snarere end DNA-koncentration på grund af den metode, der er involveret for DNA-ekstraktion. CTAB DNA-ekstraktion af den højeste sporekoncentration var 4,5 ng/μL målt ved Nanodrop, og den magnetiske perle-DNA-ekstraktionsprotokol gav 3,8 ng/μL26. Det nydesignede LAMP primersæt kunne registrere en koncentration helt ned til 1,2 x 102 sporer/ml (Figur 2B, 2C og 2D) med alle ekstraktionsmetoder. Følsomheden vist i grafen for forstærkning på det bærbare forstærkningsinstrument var identisk med den, der vises i UV-billedet uden yderligere følsomhed. Den samme serielle fortynding blev kørt i en LAMP reaktion ved hjælp af kolormetriske farvestof til at bestemme graden af følsomhed over for det blotte øje for feltdetektion. Den laveste observerbare koncentration var 4,8 x 103 sporer/ml (Figur 2C).
For at vurdere denne analyses evne ved hjælp af prøver fra den virkelige verden blev der udtaget vandprøver fra syv damme, der anvendes til kommerciel grøntsagsproduktion i Tift County, Georgia (tabel 1, figur 5og supplerende figur 1). Ud af de 7 damme viste 3 positive LAMP-resultater (P1, P4 og P6) (Figur 6A, 6B og 6C). Disse resultater tyder på, at den bærbare filter papirbaseret LAMP metode kunne være meget nyttigt for påvisning af patogenet selv med en lav zoospor koncentration. Dette viser anvendeligheden af LAMP som en mere følsom detektionsanalyse end PCR til screening af vandforurening af kunstvanding med P. capsici.
Komparativ analyse af forskellige metoder: Traditionel lokkemad, konventionel PCR og den bærbare LAMP-baserede analyse
For at sammenligne LAMP's detektionsfølsomhed med konventionel PCR blev dna'et udvundet af den serielle fortynding af sporesuspensioner kørt i en PCR-reaktion. Resultaterne viste, at konventionelle PCR var 40x mindre følsomme end LAMP, kun i stand til at opdage en zoospor koncentration så lavt som 4,8 x 103 sporer / ml (Figur 2A). Desuden blev DNA-prøverne fra filtreret vandingsbassinvand testet ved hjælp af konventionel PCR, og kun én af de tre positive prøver (P4) blev med succes forstærket som forventet båndstørrelse plus betydelige forurenende foranstaltninger, hvilket resulterede i nogle udtværings- og uspecifik bånd (Figur 6D). Tabel 3 viser forskellene mellem detektionsmetoder, der anvender sådanne variabler som tid, omkostninger, følsomhed og forberedelse påkrævet. LAMP var den billigste metode blandt disse tre metoder, og det var også den hurtigste, lige fra 30-60 min for forstærkning (DNA-ekstraktion udelukket). Konventionelle PCR varierede fra 120-180 min for forstærkning (DNA-ekstraktion udelukket).
Endelig, at bestemme specificiteten af primere, prøver af nært beslægtede oomycete patogener (Phytophthora sansomeana, Phytophthora sojae, Phytophthora cinnamomi, Phytophthora palmivora, Pythium ultimum var. ultimum, Phytopythium vexans, Phytopythium helicoidesog Pythium aphanidermatum) blev opnået, DNA blev udvundet ved hjælp af samme protokol for konsistens og evalueret ved den nye LAMP-analyse med en positiv og negativ kontrol (Figur 4) for at bestemme specificiteten af primere. Alle ikke-målprøver var negative ved hjælp af den optimerede 64 °C i 45 min. Dette blev observeret på real-time forstærkning graf og afbildet på en 1% agarose gel under UV-lys.
Figur 1: Diagram, der viser de forskellige trin, der er involveret i Phytophthora capsici fra en seriel fortynding af en koncentreret sporeaffjedring under laboratorieforhold. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Laboratorieoptimering af grænsen for påvisning af Phytophthora capsici. (A)Konventionel PCR-analyse blev udført ved hjælp af specifikke P. capsici primere på serielle fortyndingsfaktorer og visualiseret på 1% agarosegel. 1, Stige; 2-7, 4,8 x 104,4,8 x 103,4,8 x 102,2,4 x 102,1,2 x 102 sporer/ ml, henholdsvis og 7, negativ vandkontrol. (B) LAMP assay serielle fortynding faktorer visualiseret på 1% agarose gel. 1-6, en faldende sporekoncentration: 4,8 x 104,4,8 x 103,4,8 x 102,2,4 x 102,1,2 x 102 sporer/ml og 7, negativ vandkontrol. (C) LAMP resultater visualiseret ved hjælp af kolormetriske farvestof. 1-6, en faldende sporekoncentration: 4,8 x 104,4,8 x 103,4,8 x 102,2,4 x 102,1,2 x 102 sporer/ml og 7, negativ vandkontrol. dD) LAMP-resultater visualiseret på forstærkningsgrafen. Rød = 4,8 x 104, Mørkeblå = 4,8 x 103, Orange = 4,8 x 102, Lyseblå = 2,4 x 102, Grøn = 1,2 x 102 sporer/ml, Pink = Negativ kontrol (andre Phytophthora arter), Gul = ddH2O. e) En standardkurve, der viser kvantificeringen af de værdier, der er vist i realtidsresultaterne. Ln (Spore tæller) vises på X-aksen, og minutter til forstærkning på Y-aksen. (F)LAMP-analyse med offentliggjort primer (Dong et al. 2015) om serielle fortyndingsfaktorer visualiseret på 1% agarosegel. 1-6, en faldende sporekoncentration: 4,8 x 104,4,8 x 103,4,8 x 102,2,4 x 102,1,2 x 102 sporer/ml og 7, negativ vandkontrol. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Forstærkning af P. capsici DNA fra forskellige steder. (A) LAMP resultater visualiseret på 1% agarose gel. 1, PC_TN1; 2, PC_TN2; 3, PC_FL1; 4,PC_FL2; 5, PC_GA1; 6, PC_GA2; N, Negativt kontrolelement. Prøver 1 og 2 blev isoleret fra TN; prøver 3 og 4 isoleret fra FL prøver 5 og 6 blev isoleret fra GA.(B)Resultater visualiseret ved hjælp af det kolojmetriske farvestof. 1, PC_TN1; 2, PCTN2; 3, PC_FL1; 4,PC_FL2; 5, PC_GA1; 6, PC_GA2. (C) Resultater visualiseret på forstærkningsgrafen. Rød, PC_TN1; Orange, PCTN2; Gul, PC_FL1; Grøn, PC_FL2; Mørkeblå, PC_GA1; Lyseblå, PC_GA2; Pink, negativ kontrol. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Specificitetsbestemmelse af LAMP-analysen ved hjælp af DNA fra ikke-målarter P. capsici. aA) LAMP-assayreaktion med beslægtede ikke-målarter på agarosegel og visualiseret på 1 % agarosegel. L, Stige; 1, Phytophthora sansomeana; 2, Phytophthora sojae; 3, Phytophthora cinnamomi; 4, Phytophthora palmivora; 5, Pythium ultimum var. ultimum; 6, Phytopythium vexans; 7, Negativ kontrol; 8, Phytophthora capsica. (B) LAMP resultater visualiseret ved hjælp af kolojmetriske farvestof. 1, Phytophthora sansomeana; 2, Phytophthora sojae; 3, Phytophthora cinnamomi; 4, Phytophthora palmivora; 5, Pythium ultimum var. ultimum; 6, Phytopythium vexans; 7, Negativ kontrol; 8, Phytophthora capsici (C) LAMP resultater visualiseret på forstærkning grafen. Rød = Phytophthora capcisi, alle andre ikke-målarter prøver blev ikke forstærket. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Billeder, der viser prøveudtagning og behandling af genanvendt vand til påvisning af Phytophthora capsici i marken. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: Resultater fra påvisning af Phytophthora capsici på stedet i vandingsvandkilder. aA) Agarosegel, der viser resultater fra LAMP-forstærkningen af testet vand fra syv gård i South Georgia. Prøvenavne fra venstre mod højre: P1, P2, P3, P4, P5, P6, P7, Negativ kontrol, N. (B) LAMP resultater visualiseret ved hjælp af warmstart kolojmetrisk farvestof af feltprøver: P1, P2, P3, P4, P5, P6, P7, Negativ kontrol, N. (C) Resultater fra LAMPcation af feltprøver ved hjælp af graf. Rød: P1, Grøn: P2, Lilla: P3, Gul: P4, Blå: P5, Orange: P6, Pink: P7, Negativ kontrol, N. (D) Agarose gel viser konventionelle PCR resultater af forstærkningen ved hjælp af specifikke primere PC-1/PC-2 (bemærk end kun ét sted testet positiv i forhold til tre i LAMP). Klik her for at se en større version af dette tal.
| Dam navn | Amt, Stat | Målafgrøder til kunstvanding | REGISTRERING AF PCR | Registrering af lamper | Sygdomshistorie (Y/N) |
| kr. | Tift, GA | Grøntsager | | + | N |
| kr. | Tift, GA | Grøntsager | - | - | N |
| kr. | Tift, GA | Grøntsager | - | - | N |
| P4 | Tift, GA | Grøntsager | + | + | N |
| kr. | Tift, GA | Grøntsager | - | - | N |
| P6 | Tift, GA | Grøntsager | - | + | N |
| kr. | Tift, GA | Grøntsager | - | - | N |
Tabel 1: Påvisning af vandingsvand fra det sydlige GA.
| Primer type | Navn på Primer | Sekvens 5'-3' | Kilde | ||
| Lampe | PCA3-F3 | TGTGTGTGTTCGATCACA | Denne undersøgelse | ||
| PCA3-B3 | TTTTTGCGTGCGTCCAGA | Denne undersøgelse | |||
| PCA3-FIP | GACACCAAGCACTCGTACTOGTTTTTTACAATTGTGCAGAGGGAGGA | Denne undersøgelse | |||
| PCA3-BIP | AGAACGAGTATTCGGCGGCGTTTTGAAAAAGGACCCCCG | Denne undersøgelse | |||
| PCA3-LF | TGTCGAATGGATTTGCGATCTT | Denne undersøgelse | |||
| PCA3-LB | ATACGCAGGTCATTTGACTGAC | Denne undersøgelse | |||
| Pcr | PC-1 | GTCTTGTACCCTATCATGGCG | Zhang et al., 2006 | ||
| PC-2 | CGCCACAGCAGGAAAAGCATT | Zhang et al., 2006 | |||
Tabel 2: Primere, der anvendes i denne undersøgelse.
| Parametre | Traditionelle | Konventionel PCR | Lampe |
| Følsomhed | Na | 4,8 x 102 sporer/ml | 1.2 X 102 sporer/ml |
| Tidspunkt | 2 uger eller længere | 2-3 timer (ikke inklusive DNA-ekstraktion) | 30 minutter - 1 time (ikke inklusive DNA-ekstraktion) |
| Under forberedelse | • Oprettelse af medier • Plettering og isolering og • Design af en fælde |
• Spore samling ved hjælp af filterpapir • DNA-ekstraktion og • PCR-analyse |
• Spore samling ved hjælp af filterpapir • DNA-ekstraktion og • LAMP-analyse |
| Materialer | • Autoklave • Medier og plader • Inkubationsrum • Flow hætte • Aubergine • Mælkekasse |
• Termiskcykator • Agar gel • Gel Doc |
• Varmeblok eller • Genie III |
| Omkostninger | 5,00 dollar per fælde | $0.60 pr. reaktion | $0.75 pr. reaktion |
Tabel 3: Sammenligning af metoder til påvisning af P. capsici.
Supplerende figur 1: Placering af Tift County, GA og prøver af kunstvandingsvand taget fra forskellige steder inde fra staten. Positive prøver blev vist som røde prikker. Klik her for at downloade dette tal.
Supplerende figur 2: Design af LAMP primer sæt. Pile viser retning af, hvordan primere læses. Klik her for at downloade dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Afprøvning af vandingsvand til fytopatogener er et afgørende skridt for avlere, der bruger kunstvanding damme og genanvendtvand 27. Kunstvanding damme giver et reservoir og yngleplads for en række fytopatogener som overskydende kunstvanding vand er rettet fra marken til dammen transporterer med det eventuelle patogener, der kan have værettil stede 16,27. Den traditionelle metode til påvisning af en plantepatogener i en stor vandkilde er at sætte en agn til patogenet ved hjælp af modtagelige vært væv (f.eks frugt, blade) suspenderet i dammen og vente på en infektion, der skal finde sted, derefter fjerne frugt / blade og bekræfte diagnosen med mikroskopi eller molekylære metoder13,14. Disse metoder er begrænsende på grund af den tid, der kræves for at køre detektionstesten (2 uger eller længere), og den nødvendige arbejdskraft og det nødvendige udstyr. Derudover er der behov for omfattende erfaring og viden inden for visuel diagnose, patogenmorfologi og taksonomi for at opnå nøjagtige resultater. Molekylære teknikker som PCR, qPCR og DNA-hybridisering kræver betydeligt mindre tid (3-4 timer) end de traditionelle metoder til påvisning; men de kræver dyrt udstyr og et laboratorium indstilling. Desuden giver disse teknikker ikke mulighed for behandling af store mængder vand. Serologiske analyser også, falder kort i deres påvisning evne på grund af ikke-mål positive reaktioner, og ingen artsspecifikke analyser for Phytophthora arter er blevet udviklet. Loop-medieret isotermisk forstærkning (LAMP) er for nylig blevet brugt som en on-site diagnose teknik til hurtig og følsom påvisning af flere patogener som analysen kræver kun en enkelt temperatur i stedet for en termisk cycler28,29. LAMP kan køres i feltet ved hjælp af et kolonmetrisk farvestof til visuel bekræftelse eller ved hjælp af en forstærkningsmaskine i realtid for resultater på mindre enden time og 30.
Målet med dette eksperiment var at udvikle en hurtig og følsom metode til at påvise tilstedeværelsen af Phytophthora capsici i vandkilder enten på stedet eller i et laboratorium. For at øge hastigheden af detektion og for at bekæmpe begrænsningerne af de tidligere nævnte metoder til påvisning af P. capsici i kunstvanding vand, vi designet en metode ved hjælp af filterpapir til at fange sporer og udtrække deres DNA fra en større mængde vand. Efter sporer blev fanget ved hjælp af filterpapir teknik og DNA blev ekstraheret, tilstedeværelsen af patogenet blev bekræftet baseret på en nydesignet LAMP primer sæt er specifikke for P. capsici. Detektionsfølsomhed og specificitet blev sammenlignet ved hjælp af LAMP og PCR. I alle 3 replikations og med alle zoosporekoncentrationerne var LAMP en hurtigere og mere følsom detektionsmetode (tabel 3). Denne metode er ikke begrænset ved at have en lille prøve volumen som traditionelle metoder, da denne metode kan testes op til 1 L vand på et enkelt tidspunkt, hvilket øger chancerne for patogen detektion. Det blev bemærket i test, at hælde kunstvanding vand langsomt gennem Buchner tragt med en hastighed på ikke mere end 40 ml per sekund øget spore fange evne filterpapir.
For at validere detektionsprotokollen blev der også udtaget vandprøver fra det felt, hvor P. capsici var mistænkt for at være til stede (supplerende figur 1) for at teste den designede metode med et praktisk scenario. Ud af de 7 testede bedrifter var 3 positive for tilstedeværelsen af P. capsici ved hjælp af LAMP-analysen (figur 6A-6C), mens kun én bedrift var positiv, når den konventionelle PCR-analyse (figur 6D) viste LAMP som en mere følsom analyse for denne metode til test af vandingsvand. Selv om dette filter baseret LAMP assay kunne detektere DNA fra en koncentration så lavt som 1,2 x 102 zoosporer / ml, som var betydeligt mindre end den oprindelige følsomhed af denne analyse (0,01 ng genomisk DNA svarende til ~ 5 sporer) med ufiltreret zoospor suspension. Den tidligere LAMP-analyse fra Dong et. al. (2015)20 blev kørt på samme serielle fortynding og følsomhedsniveauet var det samme (figur 2F). Detektionsniveauet for en PCR-analyse med ufiltreret sporeopløsning har også vist et højere detektionsniveau (tilsvarende ~10 sporer), hvilket var meget lig de tidligere PCR-baserede resultater10. Den spore detektion grænse for den traditionelle agn metode til påvisning blev ikke kontrolleret som en enkelt spore kan forårsage infektion afhængigt af dens individuelle evne. Den nedsat følsomhed, der findes i både LAMP- og PCR-analyser, skyldes sandsynligvis, at nogle sporer strømmer gennem eller omkring filterpapiret eller en gang, der er fastgjort til filterpapiret, ikke kan ekstraheres med 100 % effektivitet. Ikke desto mindre kan dette nye LAMP- og filtersystem behandle og analysere en langt større mængde vand end tidligere metoder og giver et højere niveau af specificitet og hastighed til registrering i marken.
Af de anvendte ekstraktionsmetoder var magnetisk perlebaseret ekstraktion den hurtigste og krævede ikke brug af eksterne maskiner såsom perleslækker eller centrifuge, hvilket gjorde det nyttigt for ekstraktioner på marken og komplimenterer LAMP-analysens bærbare funktion. Den CTAB-baserede metode gav den højeste koncentration af DNA, men tog den længste tid, mens det kommercielle anlægs DNA-ekstraktionssæt (f.eks.
Med både CTAB og den kommercielle plante DNA ekstraktion kit, under homogenisering af filterpapir blev det bemærket, at homogenisering var mere vellykket og gav en højere koncentration, hvis CTAB løsning (eller ekstraktion buffer) blev tilføjet til røret med stykker af filterpapir før perle slå eller hånd homogenisering påbegyndt. Perle slå blev gjort 3 gange i et minut hver, men vortexing og omrøring røret i mellem hver runde var nødvendig for fuldstændig homogenisering i alle ekstraktionsmetoder. Det er vigtigt, at filterpapiret sidder fast på siderne eller bunden af røret, så det er vigtigt at sikre, at filterpapiret er væk fra væggene, så det bliver homogeniseret.
Den samlede tid, der kræves for forstærkning er 90-120 min og kan nemt gøres i marken for on-site diagnose. Denne filtermetode er også designet til at filtrere betydelige mængder vand for at øge de mulige chancer for påvisning af patogenet. Denne metode gælder også for mange patogener, der kan ophobes i en vandkilde, især slægter som: Pythium, Phytophthora, Fusarium, og bakterier; den eneste ændring, der kræves, vil være udviklingen af et lige så specifikt LAMP-primersæt til det målrettedepatogen 30.
En betydelig effekt af dette arbejde er udviklingen af en meget følsom og hurtig filter papirbaseret LAMP assay til påvisning af P. capsici i kunstvanding vandkilder. Vi forventer, at denne undersøgelse vil føre til en øget bevidsthed om forurening af genanvendt kunstvanding vand, i sidste ende forbedre forvaltningen af Phytophthora associerede sygdomme, og dermed reducere produktionsomkostningerne og øge høstudbyttet. Sådanne oplysninger er meget nødvendige for at forbedre grøntsagsproduktionens bæredygtighed og øge rentabiliteten af grøntsagsproduktioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre eller interessekonflikter.
Acknowledgments
Dette arbejde modtog økonomisk støtte fra Georgien Commodity Commission for Grøntsager projekt ID # FP00016659. Forfatterne takker Dr. Pingsheng Ji, University of Georgia og Dr. Anne Dorrance, Ohio State University for at give rene kulturer Phytophthora spp. Vi takker også Li Wang og Deloris Veney for deres tekniske bistand gennem hele undersøgelsen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose gel powder | Thomas Scientific | C997J85 | |
| Buchner funnel | Southern Labware | JBF003 | |
| Bullet Blender | Next Advance | BBX24 | |
| Centrifuge 5430 | Eppendorf | 22620509 | |
| Chloroform | Fischer Scientific | C298-500 | |
| CTAB solution | Biosciences | 786-565 | |
| Dneasy Extraction Kit | Qiagen | 69104 | |
| Filter Flask | United | FHFL1000 | |
| Filter Paper | United Scientific Supplies | FPR009 | |
| Gel Green 10000X | Thomas Scientific | B003B68 (1/EA) | |
| Genie III | OptiGene | ||
| Hand pump | Thomas Scientific | 1163B06 | |
| Iso-amyl Alcohol | Fischer Scientific | BP1150-500 | |
| LAVA LAMP master mix | Lucigen | 30086-1 | |
| Magnetic bead DNA extraction | Genesig | genesigEASY-EK | |
| Magnetic Separator | Genesig | genesigEASY-MR | |
| polyvinylpyrrolidone | Sigma Aldrich | PVP40-500G | |
| Primers | Sigma Aldrich | ||
| Prism Mini Centrifuge | Labnet | C1801 | |
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | 1861096 | |
| UV Gel Doc | Analytik Jena | 849-00502-2 | |
| Warmstart Colorimetric Dye | Lucigen | E1800m | |
| Wide Mini ReadySub-Cell GT Cell | Bio-Rad | 1704489EDU | |
| 70% isopropanol | Fischer Scientific | A451-1 |
References
- Hong, C., Moorman, G. J. Plant pathogens in irrigation water: challenges and opportunities. Critical Reviews in Plant Sciences. 24 (3), 189-208 (2005).
- Malkawi, H. I., Mohammad, M. J. Physiology, Genetics, Morphology, & Microorganisms, E. o. Survival and accumulation of microorganisms in soils irrigated with secondary treated wastewater. Journal of Basic Microbiology. 43 (1), 47-55 (2003).
- Bush, E. A., Hong, C., Stromberg, E. L. Fluctuations of Phytophthora and Pythium spp. in components of a recycling irrigation system. Plant Disease. 87 (12), 1500-1506 (2003).
- Ghimire, S. R., et al. Distribution and diversity of Phytophthora species in nursery irrigation reservoir adopting water recycling system during winter months. Journal of Phytopathology. 159 (11-12), 713-719 (2011).
- Hausbeck, M. K., Lamour, K. H. Phytophthora capsici on vegetable crops: research progress and management challenges. Plant Disease. 88 (12), 1292-1303 (2004).
- Gevens, A., Donahoo, R., Lamour, K., Hausbeck, M. Characterization of Phytophthora capsici from Michigan surface irrigation water. Phytopathology. 97 (4), 421-428 (2007).
- Thomson, S., Allen, R. Occurrence of Phytophthora species and other potential plant pathogens in recycled irrigation water. Plant Disease Reporter. 58 (10), 945-949 (1974).
- Lamour, K. H., Stam, R., Jupe, J., Huitema, E. The oomycete broad-host-range pathogen Phytophthora capsici. Journal of Molecular Plant Pathology. 13 (4), 329-337 (2012).
- Sanogo, S., Ji, P. Water management in relation to control of Phytophthora capsici in vegetable crops. Agricultural Water Management. 129, 113-119 (2013).
- Zhang, Z., Li, Y., Fan, H., Wang, Y., Zheng, X. Molecular detection of Phytophthora capsici in infected plant tissues, soil and water. Plant Pathology. 55 (6), 770-775 (2006).
- Trout, C., Ristaino, J., Madritch, M., Wangsomboondee, T. Rapid detection of Phytophthora infestans in late blight-infected potato and tomato using PCR. Plant Disease. 81 (9), 1042-1048 (1997).
- Sankaran, S., Mishra, A., Ehsani, R., Davis, C. A review of advanced techniques for detecting plant diseases. Commputers and Electronics in Agriculture. 72 (1), 1-13 (2010).
- Wang, Z., et al. Development of an improved isolation approach and simple sequence repeat markers to characterize Phytophthora capsici populations in irrigation ponds in southern Georgia. Applied and Environmental Microbiology. 75 (17), 5467-5473 (2009).
- Ali-Shtayeh, M., MacDonald, J. Occurrence of Phytophthora species in irrigation water in the Nablus area (West Bank of Jordan). Phytopathologia Mediterranea. , 143-150 (1991).
- Pringsh, P. Comparison of serological and culture plate methods for detecting species of Phytophthora, Pythium, and Rhizoctonia in ornamental plants. Plant Disease. 74 (9), 655 (1990).
- Stewart-Wade, S. M. Plant pathogens in recycled irrigation water in commercial plant nurseries and greenhouses: their detection and management. Irrigation Science. 29 (4), 267-297 (2011).
- Aragaki, M., Uchida, J. Y. Morphological distinctions between Phytophthora capsici and P. tropicalis sp. nov. Mycologia. 93 (1), 137-145 (2001).
- Tomlinson, J., Boonham, N. Potential of LAMP for detection of plant pathogens. CAB Reviews Perspectives in Agriculture Veterinary Science Nutrition and Natural Resources. 3 (066), 1-7 (2008).
- Li, P., et al. A PCR-based assay for distinguishing between A1 and A2 mating types of Phytophthora capsici. Journal of the American Society for Horticultural Science. 142 (4), 260-264 (2017).
- Dong, Z., et al. Loop-mediated isothermal amplification assay for sensitive and rapid detection of Phytophthora capsici. Canadian Journal of Plant Pathology. 37 (4), 485-494 (2015).
- Khan, M., et al. Comparative evaluation of the LAMP assay and PCR-based assays for the rapid detection of Alternaria solani. Frontiers in Microbiology. 9, 2089 (2018).
- Sowmya, N., Thakur, M., Manonmani, H. K. Rapid and simple DNA extraction method for the detection of enterotoxigenic Staphylococcus aureus directly from food samples: comparison of PCR and LAMP methods. Journal of Applied Microbiology. 113 (1), 106-113 (2012).
- Waliullah, S., et al. Comparative analysis of different molecular and serological methods for detection of Xylella fastidiosa in blueberry. PLOS ONE. 14 (9), 0221903 (2019).
- Böhm, J., et al. Real-time quantitative PCR: DNA determination in isolated spores of the mycorrhizal fungus Glomus mosseae and monitoring of Phytophthora infestans and Phytophthora citricola in their respective host plants. Journal of Phytopathology. 147, 409-416 (1999).
- Klimczak, L., Prell, H. J. C. Isolation and characterization of mitochondrial DNA of the oomycetous fungus Phytophthora infestans. Current Genetics. 8 (4), 323-326 (1984).
- Ghimire, S. R., et al. Detection of Phytophthora species in a run-off water retention basin at a commercial nursery in plant hardiness zones 7 b of Virginia in winter. Phytopathology. 96 (6), (2006).
- Feng, W., Hieno, A., Kusunoki, M., Suga, H., Kageyama, K. J. P. LAMP detection of four plant-pathogenic oomycetes and its application in lettuce fields. Plant Disease. 103 (2), 298-307 (2019).
- Aglietti, C., et al. Real-time loop-mediated isothermal amplification: an early-warning tool for quarantine plant pathogen detection. AMB Express. 9 (1), 50 (2019).
- Almasi, M. A. Development of a colorimetric loop-mediated isothermal amplification assay for the visual detection of Fusarium oxysporum f. sp. melonis. Horticultural Plant Journal. 5 (3), 129-136 (2019).
- Gill, D. J. Pathogenic Pythium from irrigation ponds. Plant Disease Reporter. 54 (12), 1077-1079 (1970).
