Summary
Nous avons développé une méthode pour détecter phytophthora capsici zoospores dans les sources d’eau à l’aide d’une méthode d’extraction d’ADN de papier filtre couplée à un test d’amplification isothermique (LAMP) à médiation en boucle qui peut être analysé sur le terrain ou en laboratoire.
Abstract
Phytophthora capsici est un pathogène dévastateur de l’oomycéte qui affecte de nombreuses importantes cultures de solanacée et de cucurbitacées causant des pertes économiques importantes dans la production végétale chaque année. Phytophthora capsici est transmis par le sol et un problème persistant dans les champs de légumes en raison de ses structures de survie à longue durée de vie (oospores et chlamydospores) qui résistent aux intempéries et à la dégradation. La principale méthode de dispersion consiste à produire des zoospores, qui sont des spores à unicellulaire et flagellées qui peuvent nager à travers de minces couches d’eau présentes sur les surfaces ou dans des pores de sol remplis d’eau et qui peuvent s’accumuler dans des flaques d’eau et des étangs. Par conséquent, les étangs d’irrigation peuvent être une source de l’agent pathogène et les premiers points d’éclosion de la maladie. La détection de P. capsici dans l’eau d’irrigation est difficile en utilisant des méthodes traditionnelles basées sur la culture parce que d’autres micro-organismes présents dans l’environnement, tels que Pythium spp., généralement surgrow P. capsici le rendant indétectable. Pour déterminer la présence de spores de P. capsici dans les sources d’eau (eau d’irrigation, ruissellement, etc.), nous avons mis au point une méthode de papier filtre à pompe manuelle (8-10 μm) qui capture les spores de P. capsici. l’agent pathogène (zoospores) et est plus tard utilisée pour amplifier l’ADN de l’agent pathogène par le biais d’une nouvelle amplification isothermique (LAMP) à médiation en boucle. Cette méthode peut amplifier et détecter l’ADN d’une concentration aussi faible que 1,2 x 102 zoospores/mL, qui est 40 fois plus sensible que le PCR conventionnel. Aucune amplification croisée n’a été obtenue lors de l’essai d’espèces étroitement apparentées. LAMP a également été réalisé à l’aide d’un colorant de mélange de maître de lampe colorimétrique, affichant des résultats qui pourraient être lus à l’œil nu pour la détection rapide sur place. Ce protocole pourrait être adapté à d’autres agents pathogènes qui résident, s’accumulent ou sont dispersés par des systèmes d’irrigation contaminés.
Introduction
Le recyclage de l’eau dans les fermes et les pépinières est de plus en plus populaire en raison de l’augmentation des coûts de l’eau et des préoccupations environnementales liées à l’utilisation de l’eau. De nombreuses méthodes d’irrigation ont été mises au point pour permettre aux producteurs de réduire la propagation et l’apparition des maladies végétales. Indépendamment de la source de l’eau (irrigation ou précipitations), le ruissellement est généré, et de nombreux producteurs de légumes et de pépinières ont un étang pour recueillir et recycler le ruissellement1. Cela crée un réservoir pour l’accumulation possible de pathogènes favorisant la propagation des agents pathogènes lorsque l’eau recyclée est utilisée pour irriguer les cultures2,3,4. Les agents pathogènes des plantes d’Oomycète bénéficient particulièrement de cette pratique car les zoospores s’accumuleront dans l’eau et la spore dispersive primaire est auto-motile mais nécessite l’eau de surface5,6,7. Phytophthora capsici est un pathogène oomycéte qui affecte un nombre important de cultures solanacées et cucurbitées de différentes façons8. Souvent, les symptômes sont l’amortissement des semis, de la racine et de la pourriture de la couronne; toutefois, dans les cultures telles que le concombre, la courge, le melon, la citrouille, la pastèque, l’aubergine et le poivre, des récoltes entières peuvent être perdues en raison de la pourriture des fruits9. Bien qu’il existe des méthodes connues de détection de ce pathogène végétal, la plupart exigent qu’une infection ait déjà eu lieu, ce qui est trop tard pour que les fongicides préventifs aient un effet significatif10.
La méthode traditionnelle pour tester l’eau d’irrigation pour la détection et le diagnostic de micro-organismes ciblés est une approche désuète lorsque la vitesse et la sensibilité sont cruciales pour le succès et la production agricole rentable11,12. Les tissus végétaux sensibles à l’agent pathogène ciblé (p. ex., l’aubergine pour P. capsici)sont attachés à un piège modifié qui est suspendu dans un étang d’irrigation pendant une période prolongée avant d’être enlevé et inspecté pour détecter l’infection. Les échantillons prélevés sur le tissu végétal sont ensuite plaqués sur des milieux semi-sélectifs (PARPH) et incubés pour la croissance de la culture, puis l’identification morphologique est effectuée à l’aide d’un microscope composé13. Il existe d’autres méthodes de détection similaires pour d’autres agents pathogènes végétaux utilisant des milieux sélectifs et en plaisantant de petites quantités d’eau contaminée avant de sous-cultiver14,15. Ces méthodes nécessitent entre 2 et 6 semaines, plusieurs cycles de sous-culture pour isoler l’organisme, et l’expérience sur les diagnostics phytophthora pour être en mesure de reconnaître les caractères morphologiques clés de chaque espèce. Ces méthodes traditionnelles ne fonctionnent pas bien pour la détection de l’eau d’irrigation contaminée par P. capsici en raison de facteurs tels que l’interférence par d’autres micro-organismes qui sont également présents dans les sources d’eau. Certains micro-organismes à croissance rapide comme Pythium spp. et les bactéries d’origine hydrique peuvent surgrow sur la plaque rendant P. capsici indétectable16,17.
Le but de cette étude était de développer une méthode moléculaire sensible et spécifique qui peut être utilisée à la fois dans les milieux de terrain et de laboratoire pour détecter les zoospores P. capsici dans l’eau d’irrigation. Le protocole comprend le développement d’un nouvel ensemble d’amorces isothermiques médiés en boucle (LAMP) capable d’amplifier spécifiquement P. capsici, basé sur un fragment de 1121 paires de base (pb) de P. capsici18,19. Une amorce LAMP précédemment développée de Dong et coll. (2015) a été utilisée par rapport à l’essai qui a été développé pour cette étude20.
L’essai LAMP est une forme relativement nouvelle de détection moléculaire qui s’est avérée plus rapide, plus sensible et plus spécifique que la réaction en chaîne conventionnelle de polymérase (PCR)21. En général, les tests PCR conventionnels ne peuvent pas détecter à moins de 500 copies (1,25 pg/μL); en revanche, des études antérieures ont montré que la sensibilité de LAMP peut être 10 à 1000 fois plus élevée que le PCR conventionnel et peut facilement détecter même 1 fg/μL d’ADN génomique22,23. En outre, l’essai peut être effectué rapidement (souvent en 30 min) et sur place (sur le terrain) en utilisant un bloc de chauffage portable pour l’amplification et un colorant colorimétrique qui change de couleur pour un échantillon positif (en supprimant le besoin d’électrophorèse). Dans cette étude, nous avons comparé la sensibilité des tests PCR et LAMP à l’aide d’une méthode d’extraction de filtre. La méthode de détection proposée permet aux chercheurs et aux agents d’extension de détecter facilement la présence de spores de P. capsici provenant de différentes sources d’eau en moins de deux heures. L’essai s’est avéré plus sensible que le PCR conventionnel et a été validé in situ en détectant la présence de l’agent pathogène dans l’eau d’irrigation utilisée par un producteur. Cette méthode de détection permettra aux producteurs d’estimer la présence et la densité de population de l’agent pathogène dans diverses sources d’eau qui sont utilisées pour l’irrigation, prévenir les flambées dévastatrices et les pertes économiques.
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Protocol
1. Détection sur place de Phytophthora capsici à partir de l’eau d’irrigation à l’aide d’une amplification isothermique à médiation en boucle
- Configuration de la pompe et du filtre
- Attachez une fiole filtrante à un tube qui est relié à une pompe à main de sorte que lorsque la pompe est activée, l’air sera tiré par la bouche de la fiole filtrante.
- Placez l’entonnoir Buchner dans le bouchon en caoutchouc à la bouche de la fiole filtrante et placez le morceau de papier filtre de taille appropriée dans l’entonnoir Buchner afin que l’air soit tiré à travers le papier filtre. Le papier filtre doit avoir une taille de rétention de 15 μm.
REMARQUE : Le papier filtre doit s’adapter aux bords de l’entonnoir Buchner afin qu’un minimum d’eau circule autour du papier filtre.
- Échantillonnage et filtrage de l’eau
- Prenez des échantillons d’eau de la source ciblée. L’eau peut avoir de petites quantités de débris, mais pas des sédiments ou du sol importants.
- Verser jusqu’à 1 000 mL (1 litre) d’eau d’essai sur le papier filtre placé à l’intérieur de l’entonnoir Buchner assez lentement pour éviter le débordement, tandis que la pompe à main (ou vide) est utilisée pour créer une aspiration pour tirer l’eau à travers.
REMARQUE : Il n’y a pas de quantité minimale d’eau qui puisse être testée à l’aide de cette méthode, et bien qu’elle soit suggérée au moins 50 mL, 1000 mL est le maximum pour cette méthode. - À l’aide de forceps, retirer le papier filtre de l’entonnoir Buchner et le couper en petits morceaux avec des ciseaux stériles. Ajouter autant de morceaux (8-12) que possible dans la quantité de tampon d’extraction (400 μL pour l’extraction à base de perles magnétiques) requise par le protocole dans un tube de 1,5 mL. Enregistrez les morceaux restants de papier filtre pour le traitement après l’extraction du premier ensemble.
- Vortex ou autrement agiter les morceaux de papier filtre et tampon d’extraction pendant 10 s chaque minute pendant 5 min. Ensuite, à l’aide de forceps, retirez le papier filtre qui perd le moins possible de la mémoire tampon d’extraction. Répétez cette étape avec les morceaux restants de papier filtre jusqu’à ce que toutes les pièces aient été vortexées/agitées et trempées dans le tampon d’extraction.
- Extraction magnétique d’ADN à base de perles à partir de papier filtre
- Pour le tube de 1,5 mL (qui contient maintenant environ 200-300 μL de tampon d’extraction), ajouter 20 μL de protéinase K et 10 μL de 10 ng/μL RNase.
- Incuber à température ambiante pendant 15 min, vortex ou secouer le tube toutes les 3 minutes.
- Ajouter 500 μL de perles magnétiques avec le tampon de liaison à l’échantillon et bien mélanger en secouant. Incuber pendant 5 min à température ambiante.
- Placez le tube dans la grille du séparateur magnétique pendant 2 min jusqu’à ce que toutes les perles aient été tirées vers l’aimant. Retirer et jeter le supernatant.
- Retirez le tube du séparateur magnétique. Ajouter 500 μL de tampon de lavage 1 et re-suspendre les perles en secouant vigoureusement le tube. Attendez 30 s, puis placez le tube dans le séparateur magnétique. Attendez 2 min jusqu’à ce que toutes les perles aient été tirées vers l’aimant avant d’enlever et de jeter le supernatant.
REMARQUE : Lorsque vous attendez que les perles magnétiques magnétisent au séparateur, nous vous recommandons d’inverser le tube, qui peut déloger les perles magnétiques collées au bouchon et aux côtés du tube et entraîner un plus grand nombre de perles attachées. - Répétez l’étape 1.3.5 avec 500 μL de tampon de lavage 2.
- Répétez l’étape 1.3.5 avec 500 μL d’éthanol à 80%.
- Aérérechez le granulé de perle magnétique pendant 15 min à température ambiante (18-27 °C) avec le couvercle ouvert. Si les températures ne le permettent pas, incuber dans une main gantée avec le bouchon ouvert pendant 15 min.
- Retirez le tube du séparateur magnétique. Ajouter 50 μL de tampon d’élution et re-suspendre les perles en faisant des pipes de haut en bas pendant 1 min.
- Remettre le tube dans un séparateur magnétique. Attendez 2 min avant de transférer le supernatant sans déranger les perles dans un tube séparé pour le stockage de l’ADN.
REMARQUE : Ici, l’expérience peut être interrompue avant de passer à autre chose. L’ADN extrait doit être stocké sur de la glace ou dans un congélateur de -20 °C.
- Application de l’essai LAMP nouvellement développé
- Préparer le mélange d’amorces LAMP à l’aide de 0,2 μM de chaque amorce F3 et B3, de 0,8 μM de chaque amorce Loop-F et Loop-B et de 1,6 μM de chaque amorce FIP et BIP (tableau 2).
- Ajoutez la solution LAMP suivante à un seul tube PCR ou à chaque tube individuel de la bande de 8 tubes : 2,5 μL de mélange d’amorces (étape 1.4.1), 12,5 μL de mélange principal lava lamp, 1 μL d’ADN extrait et 9 μL de ddH2O. Le volume total est de 25 μL.
REMARQUE : Si vous utilisez l’instrument d’amplification portatif (p. ex., Genie III) avec colorant colorimétrique (p. ex., Warmstart), reportez-vous à la section 2.4.2- 2.4.3. - Désignez deux tubes comme des contrôles positifs et négatifs. Pour le contrôle positif, utilisez soit un contrôle fourni par le kit LAVA LAMP, soit un échantillon d’ADN positif connu. Pour le contrôle négatif, utilisez ddH2O. Pour les deux, remplacer le 1 μL de l’ADN extrait par 1 μL du contrôle positif ou ddH2O.
- Placez les échantillons dans un bloc thermique (ou instrument d’amplification portatif) réglé à 64 °C pendant 45 min.
REMARQUE : D’autres méthodes d’extraction peuvent être utilisées ici au lieu de l’extraction magnétique à base de perles. CTAB et un kit d’extraction d’ADN commercial ont tous deux été testés avec succès à l’aide des protocoles standard et en remplaçant les morceaux de papier filtre pour l’échantillon de la plante24,25. Les résultats ont été comparés au tableau 2. Si la concentration de l’ADN peut être quantifiée, utiliser entre 1-10 ng d’ADN génomique.
- Visualisation des résultats
- S’il est effectué en laboratoire, affichez les produits d’amplification en chargeant 5 μL de chaque échantillon dans un gel agarose de 1 %, en les exécutant dans une machine d’électrophorèse de gel et en les imaginant dans une machine d’imagerie UV.
- Si un colorant colorimétrique (p. ex., Warmstart) a été utilisé, affichez le changement de couleur pour déterminer les résultats comme positifs ou négatifs.
- Si un instrument d’amplification portatif (p. ex., Genie III) a été utilisé, affichez le graphique d’amplification à l’écran pour déterminer les résultats.
- Application d’un test PCR déjà développé
REMARQUE : Si vous utilisez un test PCR classique, les étapes 1 à 3 restent les mêmes et les étapes suivantes doivent être appliquées à la place des étapes 1.4 et 1.5.- Ajouter 1 μL de chaque extraction d’ADN à des tubes individuels contenant les composants suivants : 12,5 μL de mélange principal PCR vert, 9,5 μL de ddH2O et 1 μL d’amorces avant et inverses (tableau 2).
- Faites tourner chaque échantillon à l’aide d’une microcentrifuge et placez les tubes dans un cycleur thermique.
- Utiliser les paramètres de cycleur thermique suivants conformément aux publications précédentes : 94 °C pour 5 min, 30 cycles de dénaturation à 94 °C pour 30 s, annealing à 54 °C pour 30 s, extension à 72 °C pendant 1 min, et extension finale à 72 °C pour 10 min.
- Exécutez le produit dans un gel agarose de 1%. Observez la présence de bandes sous la lumière UV où les réactions positives auront une taille de bande d’environ 508 pb.
- Méthode traditionnelle de détection
REMARQUE : Il existe plusieurs méthodes de placage sélectif pour la détection des agents pathogènes, et voici un protocole général pour P. capsici.- Tout d’abord, obtenir un fruit d’aubergine sain (un hôte sensible pour P. capsici) et la surface stériliser en lavant la surface des fruits avec 70% d’alcool isopropyle.
- Placer les aubergines dans des caisses de lait à l’aide d’un dispositif de flottaison (mousse de polyéthylène ou autre) et les déployer dans les bassins d’irrigation. Fixez chaque piège à appâts à un seul point et laissez les pièges dans le réservoir d’eau (eau d’irrigation recyclée) pendant au moins 7 jours ou jusqu’à ce que des symptômes de pourriture des fruits soient observés. Recueillir les fruits et les transporter au laboratoire.
- Rincer et sécher les fruits dans une hotte stérile avant d’enlever de petits morceaux de tissus infectés et les placer sur une plaque de parph moyenne modifiée avec 25 mg/L pentachloronitrobenzène, 0,0005% pimaricine, 250 mg/L ampicilline, 10 mg/L rifampicine et 50 mg/L hymexazol. Incuber les plaques à 25 °C pendant 5 jours.
- Voir les plaques sous un microscope composé pour l’identification morphologique traditionnelle à 4 jours après l’isolement.
2. Détermination de la limite de détection de la concentration de zoospores
- Fabrication de la suspension zoospore
- Incuber P. capsici sur agar V8 (100 mL de jus V8, 900 mL de ddH2O, 1 g de plaques CaCO3) pendant 1 semaine à 26 °C. Plusieurs plaques peuvent être utilisées pour obtenir une plus grande quantité de suspension zoospore.
- Incuber les plaques sous la lumière continue à température ambiante pendant 3 jours pour stimuler la sporulation.
- Inonder les assiettes en ajoutant 15 mL de ddH2O à chaque assiette et les placer dans un réfrigérateur à 4 °C pendant 25 min. Puis revenir à la température ambiante pendant 30 min.
- Agiter les plaques pour déloger les zoospores et la pipette de la solution dans un seul tube de 50 ml de toutes les plaques.
- Pour obtenir une estimation précise de la concentration de zoospores, ajouter 10 μL de suspension de spores sur un hémocytomètre et observer au microscope pour compter les zoospores et estimer la concentration moyenne.
- Dilution en série
- Ajouter 1 ml de suspension des spores et 9 ml de ddH2O à un tube séparé. Répétez cette étape pour autant de dilutions 10 fois que souhaité.
- Les solutions spores sont ensuite soumises pour l’extraction de l’ADN sur la base du protocole précédent à l’aide de la méthode de filtration.
REMARQUE : Si un plus grand volume de suspension est souhaité, doublez le volume : 2 mL de suspension de spores et 18 mL de ddH2O.
- Détection de la limite de concentration des zoospores
- Évaluer la limite de détection des spores en exécutant chaque dilution en série individuellement à travers l’essai jusqu’à ce que des résultats clairement positifs ne soient plus observés. Une fois la dilution finale obtenue, diluer par un facteur de 2 (4,8 à 2,4 dans cet exemple) et exécuter l’essai à nouveau pour obtenir une limite de détection plus précise.
- Développement et optimisation de la méthode LAMP
REMARQUE : Les amorces LAMP ont été conçues sur la base d’unfragment de paire de 1121 bases (pb) de P. capsici (Li et al.19) comme le montre la figure supplémentaire 2 .- Si le colorant colorimétrique (p. ex., Warmstart) est utilisé, utilisez la solution suivante : 2,5 μL de mélange d’amorce, 12,5 μL de colorant colorimétrique, 0,5 μL de colorant fluorescent vert, 1 μL d’ADN extrait et 8,5 μL de ddH2O. Le volume total est de 25 μL.
- Lors de l’utilisation de l’instrument d’amplification portable avec MASTERmix LAVALAMP, avoir une première étape de 95 °C pendant 3 min comme recommandé par le fabricant, mais ce n’est pas nécessaire. Une dernière étape d’anneaux n’est pas nécessaire pour observer le graphique de changement de couleur ou d’amplification. Ne pas exécuter une étape warmstart si le colorant colorimétrique commercial doit être utilisé.
- Voir les résultats de l’analyse LAMP dans l’une des méthodes suivantes: exécuter des échantillons sur un gel agarose 1% ou de vue à l’aide d’une machine d’imagerie UV à l’œil nu ou de voir à l’écran d’amplification genie III en temps réel.
- Optimisez la température de l’essai LAMP à l’aide de l’instrument d’amplification portable et analysez à l’aide du graphique d’amplification en temps réel pour la vitesse et le niveau de sensibilité. Exécutez des échantillons avec des températures uniques pour déterminer l’amplification la plus rapide avec le plus haut niveau de sensibilité.
- Déterminer la limite de détection de l’essai développé par LAMP en effectuant une dilution en série de l’ADN extrait (comme avec la suspension des spores à l’étape 2.2.1) et en maintenant les conditions de réaction comme précédemment décrit pour la réaction de LAMP pour chaque dilution.
- Détermination et comparaison des limites de détection avec la méthode PCR conventionnelle
- Utilisez l’ADN extrait par étapes de la section 1.3 pour comparer le niveau de détection du PCR conventionnel avec celui de l’essai LAMP.
- Ajouter 1 μL d’ADN à un tube PCR qui contenait 1 μL d’amorces PCR avant et inverses (tableau 2), 12,5 μL de Green PCR Mastermix et 9,5 μL de ddH2O pour un total de 25 μL.
- Amplifier les échantillons dans un cycleur thermique en utilisant les conditions suivantes : 94 °C pour 5 min, 30 cycles de dénaturation à 94 °C pour 30 s, annealing à 54 °C pour 30 s, extension à 72 °C pendant 1 min, et extension finale à 72 °C pendant 10 min.
- Exécutez des échantillons dans une machine d’électrophorèse sur un gel agarose de 1% et affichez-les sur une machine d’imagerie UV. La taille de la bande exceptée était de 508 pb.
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Representative Results
Optimisation de la méthode LAMP
Dans cette étude, nous avons détecté la présence de Phytophthora capsici dans l’eau d’irrigation à l’aide d’un test d’amplification isothermique (LAMP) à médiation en boucle portable. Tout d’abord, l’essai lamp proposé a été optimisé en testant différentes concentrations d’amorces de LAMP [F3, B3 (0,1–0,5 μM chacune); LF, LB (0,5–1,0 μM chacun) et FIP, BIP (0,8–2,4 μM chacun)], durées (30–70 min) et températures (55–70 °C). Le mélange d’amorce lamp final utilisé dans cette étude était : 0,2 μM de chaque amorce F3 et B3, 0,8 μM de chaque amorce Loop-F et Loop-B, 1,6 μM de chaque amorce FIP et BIP. L’optimisation de la température de réaction a été effectuée dans l’instrument d’amplification portable (p. ex., Genie III) en déterminant quelle température a effectué la réaction la plus rapide sans amplification négative supplémentaire. La température optimale a été confirmée à 64 °C (données non indiquées). Le temps optimal pour exécuter l’essai à 64 °C était de 45 min, car les concentrations les plus faibles qui étaient positives pour la détection (1,2 x 102 spores/mL) encore amplifiées par 40 min, tandis que des concentrations plus élevées amplifiées à 20 min (figure 2D). Les produits amplifiés de LAMP ont été observés plus loin sur le gel d’agarose de 1% taché avec une tache d’acide nucléique pour confirmer l’amplification. Toutes les réactions ont été répétées au moins trois fois.
Des isolats de P. capsici ont été prélevés du Tennessee, de la Floride et de la Géorgie et ont été soumis au même protocole décrit dans les méthodes. Tous les échantillons d’isolats P. capsici ont été amplifiés avec succès dans toutes les séries de l’essai (figure 3).
Détection et test de sensibilité de Phytophthora capsici dans l’eau d’irrigation à l’aide d’un test LAMP portatif
Nous avons normalisé cette méthode de lampe à papier filtre dans des conditions de laboratoire à l’aide d’une dilution en série des suspensions de spores de P. capsici (figure 1). Les dilutions en série ont été faites à partir d’une suspension de spore p. capsici à partir de 4,8 x 104 zoospores/mL et courent avec l’essai LAMP en triple. Les concentrations de spores sont indiquées plutôt que la concentration d’ADN en raison de la méthode impliquée pour l’extraction d’ADN. L’extraction de l’ADN CTAB de la concentration de spores la plus élevée était de 4,5 ng/μL mesurée par Nanodrop, et le protocole d’extraction de l’ADN des perles magnétiques a donné 3,8 ng/μL26. L’ensemble d’amorces LAMP nouvellement conçu pourrait détecter une concentration aussi faible que 1,2 x 102 spores/mL (figure 2B, 2C et 2D) avec toutes les méthodes d’extraction. La sensibilité indiquée dans le graphique de l’amplification sur l’instrument d’amplification portable était identique à celle indiquée dans l’image UV sans sensibilité supplémentaire. La même dilution en série a été exécuté dans une réaction lamp utilisant le colorant colorimétrique pour déterminer le niveau de sensibilité à l’œil nu pour la détection de champ. La concentration observable la plus faible était de 4,8 x 103 spores/mL (figure 2C).
Pour évaluer la capacité de cet essai à l’aide d’échantillons réels, des échantillons d’eau ont été prélevés dans sept étangs utilisés pour la production commerciale de légumes dans le comté de Tift, en Géorgie (tableau 1, figure 5et figure supplémentaire 1). Sur les 7 étangs, 3 ont montré des résultats positifs de LAMP (P1, P4 et P6)(figure 6A, 6B et 6C). Ces résultats suggèrent que la méthode portable de lampe à papier de filtre pourrait être très utile pour la détection de l’agent pathogène même avec une faible concentration de zoospores. Cela démontre l’applicabilité de LAMP comme un test de détection plus sensible que le PCR pour le dépistage de la contamination de l’eau d’irrigation par P. capsici.
Analyse comparative des différentes méthodes : appâtage traditionnel, PCR conventionnel et essai portatif à base de LAMP
Afin de comparer la sensibilité de détection de LAMP avec le PCR conventionnel, l’ADN extrait de la dilution en série des suspensions de spores a été exécuté dans une réaction de PCR. Les résultats ont montré que le PCR conventionnel était 40 fois moins sensible que LAMP, seulement capable de détecter une concentration de zoospores aussi faible que 4,8 x 103 spores/mL (figure 2A). De plus, les échantillons d’ADN obtenus à partir d’eau d’étang d’irrigation filtrée ont été testés à l’aide de PCR conventionnel, et un seul des trois échantillons positifs (P4) a été amplifié avec succès en fonction de la taille prévue de la bande, ainsi que des contaminants importants, ce qui a entraîné des bandes de frottis et non spécifiques (Figure 6D). Le tableau 3 affiche les différences entre les méthodes de détection à l’aide de variables telles que le temps, le coût, la sensibilité et la préparation requises. LAMP était la méthode la moins coûteuse parmi ces trois méthodes et elle était également la plus rapide, allant de 30-60 min pour l’amplification (extraction d’ADN exclue). Le PCR conventionnel variait de 120-180 min pour l’amplification (extraction d’ADN exclue).
Enfin, pour déterminer la spécificité des amorces, des échantillons d’agents pathogènes oomycétes étroitement apparentés (Phytophthora sanssoana, Phytophthora sojae, Phytophthora cinnamomi, Phytophthora palmivora, Pythium ultimum var. ultimum, Phytopythium vexans, Phytopythium helicoides, et Pythium aphanidermatum) ont été obtenus, l’ADN a été extrait en utilisant le même protocole pour la cohérence et évalué par le nouveau test DEMP avec un contrôle positif et négatif (Figure 4) pour déterminer la spécificité des amorces. Tous les échantillons non ciblés étaient négatifs à l’aide du 64 °C optimisé pendant 45 min. Ceci a été observé sur le graphique d’amplification en temps réel et photographié sur un gel d’agarose de 1% sous la lumière UV.
Figure 1 : Diagramme montrant les différentes étapes de Phytophthora capsici à partir d’une dilution en série d’une suspension concentrée des spores dans des conditions de laboratoire. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Optimisation en laboratoire de la limite de détection de Phytophthora capsici. (A) L’essai pcr conventionnel a été effectué à l’aide d’amorces P. capsici spécifiques sur les facteurs de dilution en série et visualisé sur 1% gel agarose. 1, Échelle; 2-7, 4,8 x 104, 4,8 x 103, 4,8 x 102, 2,4 x 102, 1,2 x 102 spores/mL, respectivement et 7, contrôle négatif de l’eau. (B) Facteurs de dilution en série d’essai de LAMPE visualisés sur le gel agarose de 1%. 1-6, une diminution de la concentration de spores : 4,8 x 104, 4,8 x 103, 4,8 x 102, 2,4 x 102, 1,2 x 102 spores/mL, et 7, contrôle négatif de l’eau. (C) Résultats LAMP visualisés à l’aide du colorant colorimétrique. 1-6, une diminution de la concentration de spores : 4,8 x 104, 4,8 x 103, 4,8 x 102, 2,4 x 102, 1,2 x 102 spores/mL, et 7, contrôle négatif de l’eau. (D) Résultats de LAMPE visualisés sur le graphique d’amplification. Rouge = 4,8 x 104, Bleu foncé = 4,8 x 103, Orange = 4,8 x 102, Bleu clair = 2,4 x 102, Vert = 1,2 x 102 spores/mL, Rose = Contrôle négatif (autre espèce phytophroute), Jaune = ddH2O. EE) Courbe standard indiquant la quantification des valeurs indiquées dans les résultats en temps réel. Ln (Compte de spores) est affiché sur l’axe X, et minutes à l’amplification sur l’axe Y. (F) Test DE LAMP avec amorce publiée (Dong et al. 2015) sur les facteurs de dilution en série visualisés sur 1% gel agarose. 1-6, une diminution de la concentration de spores : 4,8 x 104, 4,8 x 103, 4,8 x 102, 2,4 x 102, 1,2 x 102 spores/mL, et 7, contrôle négatif de l’eau. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Amplification de l’ADN de P. capsici à partir de divers endroits. (A) Résultats de lampe visualisés sur 1% gel agarose. 1, PC_TN1; 2, PC_TN2; 3, PC_FL1; 4 PC_FL2; 5, PC_GA1; 6, PC_GA2; N, Contrôle négatif. Les échantillons 1 et 2 ont été isolés de la TN; échantillons 3 et 4 isolés de FL; Les échantillons 5 et 6 ont été isolés de GA. (B) Résultats visualisés à l’aide du colorant colorimétrique. 1, PC_TN1; 2, PCTN2; 3, PC_FL1; 4 PC_FL2; 5, PC_GA1; 6, PC_GA2. (C) Résultats visualisés sur le graphique d’amplification. Rouge, PC_TN1; Orange, PCTN2; Jaune, PC_FL1; Vert, PC_FL2; Bleu foncé, PC_GA1; Bleu clair, PC_GA2; Rose, contrôle négatif. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Détermination de la spécificité des essais LAMP à l’aide de l’ADN des espèces non visées P. capsici. (A) Réaction d’essai de LAMPE avec des espèces non cibles apparentées sur le gel d’agarose et visualisée sur le gel d’agarose de 1%. L, Échelle; 1, Phytophthora sansomeana; 2, Phytophthora sojae; 3, Phytophthora cinnamomi; 4, Phytophthora palmivora; 5, Pythium ultimum var. ultimum; 6, Phytopythium vexans; 7, Contrôle négatif; 8, Phytophthora capsica. (B) RÉSULTATS DE LAMPE visualisés à l’aide du colorant colorimétrique. 1, Phytophthora sansomeana; 2, Phytophthora sojae; 3, Phytophthora cinnamomi; 4, Phytophthora palmivora; 5, Pythium ultimum var. ultimum; 6, Phytopythium vexans; 7, Contrôle négatif; 8, Phytophthora capsici (C) Résultats LAMP visualisés sur le graphique d’amplification. Rouge = Phytophthora capcisi, tous les autres échantillons d’espèces non ciblées n’ont pas été amplifiés. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 5 : Images montrant l’échantillonnage et le traitement de l’eau recyclée pour la détection de Phytophthora capsici sur le terrain. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 6 : Résultats de la détection sur place de Phytophthora capsici dans les sources d’eau d’irrigation. (A) Gel Agarose montrant les résultats de l’amplification LAMP de l’eau testée de sept fermes en Géorgie du Sud. Exemples de noms de gauche à droite : P1, P2, P3, P4, P5, P6, P7, Contrôle négatif, N. (B) Résultats de la LAMPE visualisés à l’aide de colorant colorimétrique warmstart d’échantillons de champ : P1, P2, P3, P4, P5, P6, P7, Contrôle négatif, N. (C) Résultats de l’amplification de la LAMP d’échantillons de champ à l’aide de graphiques. Rouge: P1, Vert: P2, Violet: P3, Jaune: P4, Bleu: P5, Orange: P6, Rose: P7, Contrôle négatif, N. (D) Gel Agarose montrant les résultats pcr conventionnels de l’amplification à l’aide d’amorces spécifiques PC-1/PC-2 (note qu’un seul site testé positif par rapport à trois dans LAMP). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
| Nom de l’étang | Comté, État | Cibler les cultures pour l’irrigation | Détection PCR | Détection de lampe | Histoire de la maladie (Y/N) |
| P1 | Tift, GA | Légumes | | + | ¡n |
| P2 | Tift, GA | Légumes | - | - | ¡n |
| P3 | Tift, GA | Légumes | - | - | ¡n |
| P4 | Tift, GA | Légumes | + | + | ¡n |
| P5 | Tift, GA | Légumes | - | - | ¡n |
| P6 | Tift, GA | Légumes | - | + | ¡n |
| P7 | Tift, GA | Légumes | - | - | ¡n |
Tableau 1 : Détection de l’eau d’irrigation provenant de l’AG du Sud.
| Type d’amorce | Nom de l’amorce | Séquence 5'-3' | Source | ||
| Lampe | PCA3-F3 | TGTGTGTGTGTTTTGCACACACA | Cette étude | ||
| PCA3-B3 | TTTTTGCGTGCGTCCAGA | Cette étude | |||
| PCA3-FIP | GACACCAACTCACTCTACTTOGTTTACAATTGTGCAGAGGGAGGA | Cette étude | |||
| PCA3-BIP | AGAACGAGTATTGCGGCGTTTGTGAAAAAAGACCACCCCCCCCCCCC | Cette étude | |||
| PCA3-LF | TGTCGAATGGATTGCGATCTTT | Cette étude | |||
| PCA3-LB | ATACGCAGGTTTGACTGAC | Cette étude | |||
| Pcr | PC-1 | GTCTTGTACCTATCATGGCGGCGGCGGCG | Zhang et coll., 2006 | ||
| PC-2 | CGCCACAGCAGGAAAAGCATT | Zhang et coll., 2006 | |||
Tableau 2 : Amorces utilisées dans cette étude.
| Paramètres | Traditionnelle | PCR conventionnel | Lampe |
| Sensibilité | Na | 4,8 X 102 spores/ml | 1,2 X 102 spores/ml |
| Heure | 2 semaines ou plus | 2-3 heures (sans compter l’extraction d’ADN) | 30 minutes - 1 heure (sans compter l’extraction d’ADN) |
| Préparation | • Création de médias • Placage et isolement et • Conception d’un piège |
• Collecte de spores à l’aide de papier filtre • extraction d’ADN et • Essai pcr |
• Collecte de spores à l’aide de papier filtre • extraction d’ADN et • Test de lampe |
| Matériaux | • Autoclave • Médias et plaques • Salle d’incubation • Capot d’écoulement • Aubergine • Caisse de lait |
• Cycleur thermique • Gel agar • Gel Doc |
• Bloc de chaleur ou • Génie III |
| Coût | 5,00 $ par piège | 0,60 $ par réaction | 0,75 $ par réaction |
Tableau 3 : Comparaison des méthodes de détection de P. capsici.
Figure supplémentaire 1 : Emplacement du comté de Tift, ga et échantillons d’eau d’irrigation prélevés à divers endroits de l’État. Des échantillons positifs ont été montrés sous forme de points rouges. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce chiffre.
Figure supplémentaire 2 : Conception de l’ensemble d’amorces LAMP. Les flèches montrent la direction de la lecture des amorces. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce chiffre.
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Discussion
L’essai de l’eau d’irrigation pour les phytopathogènes est une étape cruciale pour les producteurs utilisant des étangs d’irrigation et de l’eau recyclée27. Les étangs d’irrigation fournissent un réservoir et un terrain de reproduction pour un certain nombre de phytopathogènes car l’excès d’eau d’irrigation est dirigé du champ à l’étang transportant avec lui tous les agents pathogènes qui peuvent avoir été présents16,27. La méthode traditionnelle de détection d’agents pathogènes végétaux dans une grande source d’eau consiste à mettre un appât pour l’agent pathogène en utilisant des tissus hôtes sensibles (p. ex., des fruits, des feuilles) suspendus dans l’étang et attendre qu’une infection ait lieu, puis enlever les fruits/feuilles et confirmer le diagnostic par microscopie ou méthodes moléculaires13,14. Ces méthodes sont limitées en raison de la quantité de temps nécessaire pour exécuter le test de détection (2 semaines ou plus), et le travail et l’équipement requis. En outre, une vaste expérience et des connaissances dans le diagnostic visuel, la morphologie des pathogènes et la taxonomie sont nécessaires pour des résultats précis. Les techniques moléculaires telles que le PCR, le qPCR et l’hybridation de l’ADN exigent beaucoup moins de temps (3-4 h) que les méthodes traditionnelles de détection; cependant, ils nécessitent un équipement coûteux et un cadre de laboratoire. En outre, ces techniques ne permettent pas le traitement de grands volumes d’eau. Les tests sérologiques aussi, ne sont pas à la hauteur de leur capacité de détection en raison de réactions positives non ciblées, et aucun test spécifique aux espèces pour les espèces phytophthora n’a été mis au point. L’amplification isothermique (LAMP) à médiation en boucle a récemment été utilisée comme technique de diagnostic sur place pour la détection rapide et sensible de plusieurs agents pathogènes, car l’essai ne nécessite qu’une seule température plutôt qu’un cycle thermique28,29. LAMP peut être exécuté sur le terrain à l’aide d’un colorant colorimétrique pour la confirmation visuelle ou à l’aide d’une machine d’amplification en temps réel pour obtenir des résultats en moins d’une heure30.
L’objectif de cette expérience était de développer une méthode rapide et sensible pour détecter la présence de Phytophthora capsici dans les sources d’eau sur place ou en laboratoire. Afin d’augmenter la vitesse de détection et de lutter contre les limites des méthodes précédemment mentionnées pour détecter P. capsici dans l’eau d’irrigation, nous avons conçu une méthode utilisant du papier filtre pour capturer les spores et extraire leur ADN d’un plus grand volume d’eau. Après que les spores ont été capturées à l’aide de la technique du papier filtre et l’ADN a été extrait, la présence de l’agent pathogène a été confirmée sur la base d’un ensemble d’amorces LAMP nouvellement conçu spécifique à P. capsici. La sensibilité et la spécificité de détection ont été comparées à l’aide de LAMP et pcr. Dans les 3 réplications et avec toutes les concentrations de zoospores, LAMP était une méthode de détection plus rapide et plus sensible (tableau 3). Cette méthode n’est pas limitée en ayant un petit volume d’échantillons comme méthodes traditionnelles, car cette méthode peut être mise à l’essai jusqu’à 1 L d’eau en un seul moment, ce qui augmente les chances de détection des agents pathogènes. Il a été noté dans les essais que verser l’eau d’irrigation lentement à travers l’entonnoir Buchner à une vitesse de pas plus de 40 mL par seconde a augmenté la capacité de capture des spores du papier filtre.
Pour valider le protocole de détection, des échantillons d’eau provenant du champ où P. capsici était soupçonné d’être présent ont également été prélevés (figure supplémentaire 1)pour tester la méthode conçue avec un scénario pratique. Sur les 7 fermes testées, 3 étaient positives pour la présence de P. capsici àl’aidede l’essai LAMP ( figure 6A-6C) alors qu’une seule ferme était positive lors de l’utilisation du test PCR conventionnel(figure 6D),montrant LAMP comme un test plus sensible pour cette méthode d’essai de l’eau d’irrigation. Bien que, ce test de LAMPE à base de filtre pourrait détecter l’ADN d’une concentration aussi faible que 1,2 x 102 zoospores/mL qui était significativement inférieure à la sensibilité initiale de cet essai (0,01 ng ADN génomique équivalent à ~5 spores) avec suspension zoospore non filtrée. Le précédent test LAMP de Dong et. al. (2015)20 a été exécuté sur la même dilution en série et le niveau de sensibilité était le même (Figure 2F). Le niveau de détection d’un test PCR avec solution de spores non filtrées a également montré un niveau plus élevé de détection (équivalent ~10 spores) qui était très similaire aux résultats précédents basés sur PCR10. La limite de détection des spores de la méthode traditionnelle de détection des appâts n’a pas été vérifiée car une seule spore pouvait causer une infection en fonction de sa capacité individuelle. La diminution de la sensibilité constatée dans les tests LAMP et PCR est probablement due à certaines spores qui circulent à travers ou autour du papier filtre, ou une fois attachée au papier filtre, incapables d’être extraites avec une efficacité de 100%. Néanmoins, ce nouveau système de lampe et de filtre peut traiter et analyser un volume d’eau beaucoup plus élevé que les méthodes précédentes et confère un niveau plus élevé de spécificité et de vitesse pour la détection sur le terrain.
Parmi les méthodes d’extraction utilisées, l’extraction à base de perles magnétiques était la plus rapide et ne nécessitait pas l’utilisation de machines externes telles qu’un batteur de perles ou une centrifugeuse, ce qui le rendait utile pour les extractions sur le terrain et complimentait la caractéristique portable de l’essai LAMP. La méthode basée sur le CTAB a produit la plus forte concentration d’ADN, mais a pris le plus de temps, tandis que le kit d’extraction d’ADN de plante commerciale (p. ex., DNeasy) a été le deuxième dans le temps requis et la concentration d’ADN acquise.
Avec le CTAB et le kit d’extraction commerciale de l’ADN des plantes, lors de l’homogénéisation du papier filtre, il a été noté que l’homogénéisation était plus réussie et a donné une concentration plus élevée si la solution CTAB (ou tampon d’extraction) a été ajoutée au tube avec les morceaux de papier filtre avant le battement de perles ou l’homogénéisation des mains a commencé. Le battement de perle a été fait 3 fois pendant une minute chacun, mais vortexing et agitant le tube entre chaque rond était nécessaire pour l’homogénéisation complète dans toutes les méthodes d’extraction. Fait important, le papier filtre est sujet à se coincer sur les côtés ou le bas du tube, il est donc crucial de s’assurer que le papier filtre est hors des murs afin qu’il soit homogénéisé.
Le temps total requis pour l’amplification est de 90-120 min et peut être facilement fait sur le terrain pour le diagnostic sur place. Cette méthode de filtre est également conçue pour filtrer des quantités importantes d’eau afin d’augmenter les chances possibles de détection de l’agent pathogène. Cette méthode s’applique également à de nombreux agents pathogènes qui peuvent s’accumuler dans une source d’eau, en particulier des genres tels que: Pythium, Phytophthora, Fusarium, et les bactéries; le seul changement requis sera le développement d’un ensemble d’amorces LAMP tout aussi spécifique pour le pathogène ciblé30.
Un résultat significatif de ces travaux est le développement d’un test de lampe à papier très sensible et rapide à base de papier pour la détection de P. capsici dans les sources d’eau d’irrigation. Nous nous attendons à ce que cette étude conduise à une sensibilisation accrue à la contamination de l’eau d’irrigation recyclée, améliorant éventuellement la gestion des maladies associées à phytophthora, et par conséquent à réduire les coûts de production et à augmenter le rendement des cultures. Ces informations sont très nécessaires pour améliorer la durabilité de la production végétale et améliorer la rentabilité des productions végétales.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer ni aucun conflit d’intérêts.
Acknowledgments
Ces travaux ont reçu le soutien financier du projet ID# FP00016659 de la Georgia Commodity Commission for Vegetables. Les auteurs remercient le Dr Pingsheng Ji, Université de Géorgie et le Dr Anne Dorrance, Ohio State University pour fournir des cultures pures de Phytophthora spp. Nous remercions également Li Wang et Deloris Veney pour leur assistance technique tout au long de l’étude.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose gel powder | Thomas Scientific | C997J85 | |
| Buchner funnel | Southern Labware | JBF003 | |
| Bullet Blender | Next Advance | BBX24 | |
| Centrifuge 5430 | Eppendorf | 22620509 | |
| Chloroform | Fischer Scientific | C298-500 | |
| CTAB solution | Biosciences | 786-565 | |
| Dneasy Extraction Kit | Qiagen | 69104 | |
| Filter Flask | United | FHFL1000 | |
| Filter Paper | United Scientific Supplies | FPR009 | |
| Gel Green 10000X | Thomas Scientific | B003B68 (1/EA) | |
| Genie III | OptiGene | ||
| Hand pump | Thomas Scientific | 1163B06 | |
| Iso-amyl Alcohol | Fischer Scientific | BP1150-500 | |
| LAVA LAMP master mix | Lucigen | 30086-1 | |
| Magnetic bead DNA extraction | Genesig | genesigEASY-EK | |
| Magnetic Separator | Genesig | genesigEASY-MR | |
| polyvinylpyrrolidone | Sigma Aldrich | PVP40-500G | |
| Primers | Sigma Aldrich | ||
| Prism Mini Centrifuge | Labnet | C1801 | |
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | 1861096 | |
| UV Gel Doc | Analytik Jena | 849-00502-2 | |
| Warmstart Colorimetric Dye | Lucigen | E1800m | |
| Wide Mini ReadySub-Cell GT Cell | Bio-Rad | 1704489EDU | |
| 70% isopropanol | Fischer Scientific | A451-1 |
References
- Hong, C., Moorman, G. J. Plant pathogens in irrigation water: challenges and opportunities. Critical Reviews in Plant Sciences. 24 (3), 189-208 (2005).
- Malkawi, H. I., Mohammad, M. J. Physiology, Genetics, Morphology, & Microorganisms, E. o. Survival and accumulation of microorganisms in soils irrigated with secondary treated wastewater. Journal of Basic Microbiology. 43 (1), 47-55 (2003).
- Bush, E. A., Hong, C., Stromberg, E. L. Fluctuations of Phytophthora and Pythium spp. in components of a recycling irrigation system. Plant Disease. 87 (12), 1500-1506 (2003).
- Ghimire, S. R., et al. Distribution and diversity of Phytophthora species in nursery irrigation reservoir adopting water recycling system during winter months. Journal of Phytopathology. 159 (11-12), 713-719 (2011).
- Hausbeck, M. K., Lamour, K. H. Phytophthora capsici on vegetable crops: research progress and management challenges. Plant Disease. 88 (12), 1292-1303 (2004).
- Gevens, A., Donahoo, R., Lamour, K., Hausbeck, M. Characterization of Phytophthora capsici from Michigan surface irrigation water. Phytopathology. 97 (4), 421-428 (2007).
- Thomson, S., Allen, R. Occurrence of Phytophthora species and other potential plant pathogens in recycled irrigation water. Plant Disease Reporter. 58 (10), 945-949 (1974).
- Lamour, K. H., Stam, R., Jupe, J., Huitema, E. The oomycete broad-host-range pathogen Phytophthora capsici. Journal of Molecular Plant Pathology. 13 (4), 329-337 (2012).
- Sanogo, S., Ji, P. Water management in relation to control of Phytophthora capsici in vegetable crops. Agricultural Water Management. 129, 113-119 (2013).
- Zhang, Z., Li, Y., Fan, H., Wang, Y., Zheng, X. Molecular detection of Phytophthora capsici in infected plant tissues, soil and water. Plant Pathology. 55 (6), 770-775 (2006).
- Trout, C., Ristaino, J., Madritch, M., Wangsomboondee, T. Rapid detection of Phytophthora infestans in late blight-infected potato and tomato using PCR. Plant Disease. 81 (9), 1042-1048 (1997).
- Sankaran, S., Mishra, A., Ehsani, R., Davis, C. A review of advanced techniques for detecting plant diseases. Commputers and Electronics in Agriculture. 72 (1), 1-13 (2010).
- Wang, Z., et al. Development of an improved isolation approach and simple sequence repeat markers to characterize Phytophthora capsici populations in irrigation ponds in southern Georgia. Applied and Environmental Microbiology. 75 (17), 5467-5473 (2009).
- Ali-Shtayeh, M., MacDonald, J. Occurrence of Phytophthora species in irrigation water in the Nablus area (West Bank of Jordan). Phytopathologia Mediterranea. , 143-150 (1991).
- Pringsh, P. Comparison of serological and culture plate methods for detecting species of Phytophthora, Pythium, and Rhizoctonia in ornamental plants. Plant Disease. 74 (9), 655 (1990).
- Stewart-Wade, S. M. Plant pathogens in recycled irrigation water in commercial plant nurseries and greenhouses: their detection and management. Irrigation Science. 29 (4), 267-297 (2011).
- Aragaki, M., Uchida, J. Y. Morphological distinctions between Phytophthora capsici and P. tropicalis sp. nov. Mycologia. 93 (1), 137-145 (2001).
- Tomlinson, J., Boonham, N. Potential of LAMP for detection of plant pathogens. CAB Reviews Perspectives in Agriculture Veterinary Science Nutrition and Natural Resources. 3 (066), 1-7 (2008).
- Li, P., et al. A PCR-based assay for distinguishing between A1 and A2 mating types of Phytophthora capsici. Journal of the American Society for Horticultural Science. 142 (4), 260-264 (2017).
- Dong, Z., et al. Loop-mediated isothermal amplification assay for sensitive and rapid detection of Phytophthora capsici. Canadian Journal of Plant Pathology. 37 (4), 485-494 (2015).
- Khan, M., et al. Comparative evaluation of the LAMP assay and PCR-based assays for the rapid detection of Alternaria solani. Frontiers in Microbiology. 9, 2089 (2018).
- Sowmya, N., Thakur, M., Manonmani, H. K. Rapid and simple DNA extraction method for the detection of enterotoxigenic Staphylococcus aureus directly from food samples: comparison of PCR and LAMP methods. Journal of Applied Microbiology. 113 (1), 106-113 (2012).
- Waliullah, S., et al. Comparative analysis of different molecular and serological methods for detection of Xylella fastidiosa in blueberry. PLOS ONE. 14 (9), 0221903 (2019).
- Böhm, J., et al. Real-time quantitative PCR: DNA determination in isolated spores of the mycorrhizal fungus Glomus mosseae and monitoring of Phytophthora infestans and Phytophthora citricola in their respective host plants. Journal of Phytopathology. 147, 409-416 (1999).
- Klimczak, L., Prell, H. J. C. Isolation and characterization of mitochondrial DNA of the oomycetous fungus Phytophthora infestans. Current Genetics. 8 (4), 323-326 (1984).
- Ghimire, S. R., et al. Detection of Phytophthora species in a run-off water retention basin at a commercial nursery in plant hardiness zones 7 b of Virginia in winter. Phytopathology. 96 (6), (2006).
- Feng, W., Hieno, A., Kusunoki, M., Suga, H., Kageyama, K. J. P. LAMP detection of four plant-pathogenic oomycetes and its application in lettuce fields. Plant Disease. 103 (2), 298-307 (2019).
- Aglietti, C., et al. Real-time loop-mediated isothermal amplification: an early-warning tool for quarantine plant pathogen detection. AMB Express. 9 (1), 50 (2019).
- Almasi, M. A. Development of a colorimetric loop-mediated isothermal amplification assay for the visual detection of Fusarium oxysporum f. sp. melonis. Horticultural Plant Journal. 5 (3), 129-136 (2019).
- Gill, D. J. Pathogenic Pythium from irrigation ponds. Plant Disease Reporter. 54 (12), 1077-1079 (1970).
