Summary
Desarrollamos un método para detectar zoosporas phytophthora capsici en fuentes de agua utilizando un método de extracción de ADN de papel de filtro junto con un ensayo de amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP) que se puede analizar en el campo o en el laboratorio.
Abstract
Phytophthora capsici es un patógeno oomiceto devastador que afecta a muchos cultivos importantes solanáceos y cucurbitos que causan pérdidas económicas significativas en la producción de hortalizas anualmente. Phytophthora capsici es transmitido por el suelo y un problema persistente en los campos vegetales debido a sus estructuras de supervivencia de larga duración (oosporas y clamidosporas) que resisten la intemperie y la degradación. El principal método de dispersión es a través de la producción de zoosporas, que son esporas unicelulares y flageladas que pueden nadar a través de finas películas de agua presentes en superficies o en poros de suelo llenos de agua y pueden acumularse en charcos y estanques. Por lo tanto, los estanques de riego pueden ser una fuente del patógeno y los puntos iniciales de los brotes de enfermedades. La detección de P. capsici en el agua de riego es difícil utilizando métodos tradicionales basados en el cultivo porque otros microorganismos presentes en el medio ambiente, como Pythium spp., generalmente el crecimiento excesivo de P. capsici lo hacen indetectable. Para determinar la presencia de esporas de P. capsici en fuentes de agua (agua de riego, escorrentía, etc.), desarrollamos un método de filtro a base de bomba manual (8-10 m) que captura las esporas del patógeno (zoosporas) y más tarde se utiliza para amplificar el ADN del patógeno a través de un nuevo ensayo de amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP) como ensayo diseñado para la amplificación específica de P. Este método puede amplificar y detectar el ADN a partir de una concentración tan baja como 1,2 x 102 zoosporas/ml, que es 40 veces más sensible que la PCR convencional. No se obtuvo amplificación cruzada al probar especies estrechamente relacionadas. LAMP también se realizó utilizando un tinte de mezcla maestro LAMP colorimétrico, mostrando resultados que se podían leer a simple vista para la detección rápida in situ. Este protocolo podría adaptarse a otros patógenos que residen, se acumulan o se dispersan a través de sistemas de riego contaminados.
Introduction
El reciclaje de agua en granjas y viveros se está volviendo cada vez más popular debido al aumento de los costos de agua y las preocupaciones ambientales detrás del uso del agua. Se han desarrollado muchos métodos de riego para los cultivadores para reducir la propagación y la aparición de enfermedades de las plantas. Independientemente de la fuente del agua (irrigación o precipitación), se genera escorrentía, y muchos cultivadores de hortalizas y viveros tienen un estanque para recoger y reciclar la escorrentía1. Esto crea un reservorio para una posible acumulación de patógenos favoreciendo la propagación de patógenos cuando el agua reciclada se utiliza para regar cultivos2,3,4. Los patógenos de las plantas de oomycete se benefician particularmente de esta práctica, ya que las zoosporas se acumularán en el agua y la espora dispersiva primaria es automotilo pero requiere agua superficial5,,6,,7. Phytophthora capsici es un patógeno oomiceto que afecta a un número significativo de cultivos solanáceos y cucuridos de diferentes maneras8. A menudo, los síntomas son amortiguación de las plántulas, la pudrición de la raíz y la corona; sin embargo, en cultivos como el pepino, la calabaza, el melón, la calabaza, la sandía, la berenjena y la pimienta, las cosechas enteras pueden perderse debido a la putrefacción de la fruta9. Aunque existen métodos conocidos para detectar este patógeno vegetal, la mayoría requieren que ya se haya producido una infección que es demasiado tarde para que los fungicidas preventivos tengan un efecto significativo10.
El método tradicional para probar el agua de riego para la detección y diagnóstico de microorganismos específicos es un enfoque anticuado cuando la velocidad y la sensibilidad son cruciales para el éxito y la producción rentable de cultivos11,,12. El tejido vegetal susceptible al patógeno objetivo (por ejemplo, la berenjena para P. capsici)se une a una trampa modificada que se suspende en un estanque de riego durante un período prolongado antes de ser retirada e inspeccionada en busca de infección. Las muestras del tejido vegetal se chapan en medios semies selectivos (PARPH) y se incuban para el crecimiento del cultivo, luego la identificación morfológica se realiza utilizando un microscopio compuesto13. Existen otros métodos de detección similares para otros patógenos vegetales que utilizan medios selectivos y enchapar pequeñas cantidades de agua contaminada antes del sub-cultivo14,15. Estos métodos requieren entre 2 y 6 semanas, varias rondas de sub-cultivo para aislar el organismo, y experiencia en diagnóstico Phytophthora para ser capaz de reconocer los caracteres morfológicos clave de cada especie. Estos métodos tradicionales no funcionan bien para la detección de agua de riego contaminada por P. capsici debido a factores como la interferencia de otros microorganismos que también están presentes en las fuentes de agua. Algunos microorganismos de rápido crecimiento como Pythium spp. y las bacterias transmitidas por el agua pueden crecer en exceso en la placa haciendo que P. capsici no sea detectable16,17.
El propósito de este estudio fue desarrollar un método molecular sensible y específico que se pueda utilizar tanto en entornos de campo como de laboratorio para detectar las zoosporas P. capsici en el agua de riego. El protocolo incluye el desarrollo de un novedoso conjunto de imprimación de amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP) capaz de amplificar específicamente P. capsici,basado en un fragmento de par de 1121 bases (bp) de P. capsici18,,19. (2015) se utilizó una imprimación LAMP previamente desarrollada de Dong et al. (2015) en comparación con el ensayo que se desarrolló para este estudio20.
El ensayo LAMP es una forma relativamente nueva de detección molecular que se ha demostrado que es más rápida, sensible y específica que la reacción en cadena de la polimerasa convencional (PCR)21. En general, los ensayos de PCR convencionales no pueden detectar menos de 500 copias (1,25 pg/L); por el contrario, estudios anteriores han demostrado que la sensibilidad de LAMP puede ser de 10 a 1.000 veces mayor que la PCR convencional y puede detectar fácilmente incluso 1 fg/L de ADN genómico22,,23. Además, el ensayo se puede llevar a cabo rápidamente (a menudo en 30 minutos) y in situ (en el campo) mediante el uso de un bloque de calentamiento portátil para la amplificación y un tinte colorimétrico que cambia de color para una muestra positiva (eliminando la necesidad de electroforesis). En este estudio, comparamos la sensibilidad de los ensayos de PCR y LAMP utilizando un método de extracción de filtros. El método de detección propuesto permite a los investigadores y agentes de extensión detectar fácilmente la presencia de esporas de P. capsici de diferentes fuentes de agua en menos de dos horas. El ensayo ha demostrado ser más sensible que el PCR convencional y se validó in situ mediante la detección de la presencia del patógeno en el agua de riego utilizada por un cultivador. Este método de detección permitirá a los cultivadores estimar la presencia y densidad de población del patógeno en diversas fuentes de agua que se utilizan para el riego, evitando brotes devastadores y pérdidas económicas.
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Protocol
1. Detección in situ de Phytophthora capsici del agua de riego utilizando amplificación isotérmica mediada por bucle portátil
- Configuración de la bomba y el filtro
- Coloque un matraz filtrante en un tubo que esté conectado a una bomba de mano para que cuando se active la bomba, se extraiga aire a través de la boca del matraz de filtrado.
- Coloque el embudo Buchner en el tapón de goma en la boca del matraz filtrante y coloque la pieza de papel de filtro del tamaño adecuado en el embudo Buchner para que el aire se extraiga a través del papel de filtro. El papel filtrante debe tener un tamaño de retención de 15 m.
NOTA: El papel de filtro debe ajustarse a los bordes del embudo Buchner para que fluya un mínimo de agua alrededor del papel de filtro.
- Muestreo y filtrado de agua
- Tome muestras de agua de la fuente objetivo. El agua puede tener pequeñas cantidades de escombros, pero no sedimentos o suelos significativos.
- Vierta hasta 1.000 ml (1 litro) de agua de prueba sobre el papel de filtro colocado dentro del embudo Buchner lo suficientemente lentamente como para evitar el desbordamiento, mientras que la bomba de mano (o vacío) se utiliza para crear una succión para tirar del agua a través.
NOTA: No hay una cantidad mínima de agua que se pueda probar con este método, y aunque se sugiere al menos 50 ml, 1000 ml es el máximo para este método. - Con fórceps, retire el papel de filtro del embudo Buchner y córtelo en trozos pequeños con tijeras estériles. Agregue tantas piezas (8-12) como pueda sumergirse en la cantidad de tampón de extracción (400 ml para la extracción magnética basada en cuentas) requerida por el protocolo en un tubo de 1,5 ml. Guarde los trozos restantes de papel de filtro para procesarlos después de extraer el primer conjunto.
- Vórtice o agitar de otro modo los trozos de papel de filtro y tampón de extracción durante 10 s cada minuto durante 5 min. A continuación, con fórceps, retire el papel de filtro perdiendo la menor parte posible del búfer de extracción. Repita este paso con los trozos restantes de papel de filtro hasta que todas las piezas hayan sido vórtice/agitadas y empapadas en el búfer de extracción.
- Extracción magnética basada en cuentas de ADN del papel filtrante
- En el tubo de 1,5 ml (que ahora contiene aproximadamente 200-300 l de tampón de extracción), agregue 20 l de proteinasa K y 10 l de 10 ng/L RNase.
- Incubar a temperatura ambiente durante 15 min, vórtice o agitar el tubo cada 3 min.
- Agregue 500 l de perlas magnéticas con el tampón de unión a la muestra y mezcle bien agitando. Luego incubar durante 5 minutos a temperatura ambiente.
- Coloque el tubo en el bastidor separador magnético durante 2 minutos hasta que todas las perlas se hayan tirado al imán. Retire y deseche el sobrenadante.
- Retire el tubo del separador magnético. Agregue 500 l de Wash Buffer 1 y vuelva a suspender las perlas agitando el tubo vigorosamente. Espere 30 s y vuelva a colocar el tubo en el separador magnético. Espere 2 minutos hasta que todas las perlas hayan sido tiradas hacia el imán antes de retirar y desechar el sobrenadante.
NOTA: Al esperar a que las perlas magnéticas se magneticen al separador, se recomienda invertir el tubo, que puede desalojar las perlas magnéticas pegadas a la tapa y los lados del tubo y dar lugar a un mayor número de perlas que se unen. - Repita el paso 1.3.5 con 500 s de Wash Buffer 2.
- Repita el paso 1.3.5 con 500 l de etanol al 80%.
- Ventilar el pellet de cuentas magnéticas durante 15 minutos a temperatura ambiente (18-27 oC) con la tapa abierta. Si las temperaturas no lo permiten, incubar en una mano enguantina con la tapa abierta durante 15 min.
- Retire el tubo del separador magnético. Agregue 50 ml de tampón de elución y vuelva a suspender las perlas pipeteando hacia arriba y hacia abajo durante 1 min.
- Coloque el tubo de nuevo en un separador magnético. Espere 2 minutos antes de transferir el sobrenadante sin alterar las perlas a un tubo separado para el almacenamiento de ADN.
NOTA: Aquí el experimento se puede pausar antes de continuar. El ADN extraído debe almacenarse sobre hielo o en un congelador de -20 oC.
- Aplicación del nuevo ensayo LAMP
- Preparar la mezcla de imprimación LAMP utilizando 0,2 m de cada imprimación F3 y B3, 0,8 m de cada imprimación Loop-F y Loop-B, y 1,6 m de cada imprimación FIP y BIP(Tabla 2).
- Añadir la siguiente solución LAMP a un solo tubo de PCR, o a cada tubo individual en la tira de 8 tubos: 2,5 l de mezcla de imprimación (paso 1.4.1), 12,5 ml de mezcla maestra de LAVA LAMP, 1 oL de ADN extraído y 9 l de ddH2O. El volumen total es de 25 l.
NOTA: Si utiliza el instrumento de amplificación portátil (por ejemplo, Genie III) con tinte colorimétrico (por ejemplo, Warmstart), consulte la sección 2.4.2- 2.4.3. - Designe dos tubos como controles positivos y negativos. Para el control positivo, utilice un control proporcionado por el kit LAVA LAMP o una muestra de ADN positivo conocida. Para el control negativo, utilice ddH2O. Para ambos, sustituya los 1 l del ADN extraído por 1 l del control positivo o ddH2O.
- Ajuste las muestras en un bloque de calor (o instrumento de amplificación portátil) ajustado a 64 oC durante 45 min.
NOTA: Aquí se pueden utilizar otros métodos de extracción en lugar de la extracción magnética basada en cuentas. CTAB y un kit comercial de extracción de ADN se probaron con éxito utilizando los protocolos estándar y sustituyendo las piezas de papel de filtro por la muestra de planta24,,25. Los resultados se compararon en la Tabla 2. Si se puede cuantificar la concentración de ADN, utilice entre 1-10 ng de ADN genómico.
- Visualización de resultados
- Si se realiza en un entorno de laboratorio, vea los productos de amplificación cargando 5 ml de cada muestra en un gel de agarosa del 1%, ejecutándolos en una máquina de electroforesis de gel e imágenes de ellos en una máquina de imágenes UV.
- Si se utilizó un tinte colorimétrico (por ejemplo, Warmstart), vea el cambio de color para determinar los resultados como positivos o negativos.
- Si se utilizó un instrumento de amplificación portátil (por ejemplo, Genie III), vea el gráfico de amplificación en la pantalla para determinar los resultados.
- Aplicación del ensayo de PCR previamente desarrollado
NOTA: Si utiliza un ensayo de PCR convencional, los pasos 1-3 siguen siendo los mismos y se deben aplicar los siguientes pasos en lugar de los pasos 1.4 y 1.5.- Añadir 1 l de cada extracción de ADN a tubos individuales que contengan los siguientes componentes: 12,5 ml de mezcla maestra de PCR verde, 9,5 ml de ddH2O y 1 l de imprimaciones hacia delante y hacia atrás(Tabla 2).
- Gire hacia abajo cada muestra usando una microcentrífuga y coloque los tubos en un ciclor térmico.
- Utilice los siguientes ajustes de ciclor térmico de acuerdo con las publicaciones anteriores: 94 oC durante 5 min, 30 ciclos de desnaturalización a 94 oC durante 30 s, recocido a 54 oC durante 30 s, extensión a 72 oC durante 1 min, y extensión final a 72 oC durante 10 min.
- Ejecute el producto en un gel de agarosa al 1%. Observar la presencia de bandas bajo la luz UV donde las reacciones positivas tendrán un tamaño de banda de 508 bp.
- Método tradicional de detección
NOTA: Existen varios métodos de chapado selectivo para la detección de patógenos, y el siguiente es un protocolo general para P. capsici.- En primer lugar, obtener una fruta de berenjena saludable (un huésped susceptible para P. capsici) y esterilizar la superficie lavando la superficie de la fruta con 70% de alcohol isopropílico.
- Coloque la fruta de la berenjena en cajas de leche con un dispositivo de flotación (espuma de polietileno u otro) y despliéúela en estanques de riego. Asegure cada trampa de cebo a un solo punto y deje las trampas en el depósito de agua (agua de riego reciclada) durante al menos 7 días o hasta que se observen los síntomas de pudrición de la fruta. Recoger la fruta y transportarla al laboratorio.
- Enjuagar y secar la fruta en una capucha estéril antes de retirar pequeños trozos de tejidos infectados y colocarlos en una placa de medio PARPH modificada con 25 mg/L pentachloronitrobenceno, 0.0005% pimaricina, 250 mg/L ampicilina, 10 mg/l ririficinina y 50 mg/L himexazol. Incubar las placas a 25oC durante 5 días.
- Vea las placas bajo un microscopio compuesto para la identificación morfológica tradicional a los 4 días después del aislamiento.
2. Determinar el límite de detección de la concentración de zoospora
- Hacer suspensión de zoospora
- Incubar P. capsici en agar V8 (100 ml de jugo V8, 900 ml de ddH2O, 1 g de CaCO3)placas durante 1 semana a 26oC. Múltiples placas se pueden utilizar para obtener una mayor cantidad de suspensión de zoospora.
- Incubar las placas bajo luz continua a temperatura ambiente durante 3 días para estimular la esporulación.
- Inundar las placas añadiendo 15 ml de ddH2O a cada plato y colocarlas en una nevera de 4oC durante 25 min. A continuación, volver a la temperatura ambiente durante 30 min.
- Agitar las placas para desalojar las zoosporas y pipetear la solución en un solo tubo de 50 ml de todas las placas.
- Para obtener una estimación precisa de la concentración de zoospora, añada 10 l de la suspensión de esporas en un hemocicómetro y observe bajo un microscopio para contar zoosporas y estimar la concentración media.
- Dilución en serie
- Añadir 1 ml de la suspensión de esporas y 9 ml de ddH2O a un tubo separado. Repita este paso para tantas diluciones de 10 veces como desee.
- A continuación, se someten soluciones spore para la extracción de ADN basadas en el protocolo anterior utilizando el método de filtración.
NOTA: Si se desea un mayor volumen de suspensión, duplique el volumen: 2 ml de suspensión de esporas y 18 ml de ddH2O.
- Detección del límite de concentración de zoospora
- Evalúe el límite de detección de esporas ejecutando cada dilución en serie individualmente a través del ensayo hasta que ya no se observen resultados claramente positivos. Una vez obtenida la dilución final, diluir por un factor de 2 (4.8 a 2.4 en este ejemplo) y ejecutar el ensayo de nuevo para obtener un límite de detección más preciso.
- Desarrollo y optimización del método LAMP
NOTA: Las imprimaciones LAMP se diseñaron sobre la base de un fragmento de par de 1121 bases (bp) de P. capsici (Li et al.19) como se muestra en la Figura suplementaria 2.- Si se utiliza un tinte colorimétrico (p. ej., Warmstart), utilice la siguiente solución: 2,5 ml de mezcla de imprimación, 12,5 ml de tinte colorimétrico, 0,5 ml de tinte fluorescente verde, 1 ml de ADN extraído y 8,5 l de ddH2O. El volumen total es de 25 l.
- Cuando utilice el instrumento de amplificación portátil con la mastermix LAVALAMP, tenga un paso inicial de 95 oC durante 3 minutos según lo recomendado por el fabricante, pero esto no es necesario. No es necesario un paso final de recocido para observar el cambio de color o el gráfico de amplificación. No ejecute un paso de inicio cálido si se va a utilizar el tinte colorimétrico comercial.
- Ver el ensayo LAMP da como resultado uno de los siguientes métodos: ejecutar muestras en un gel de agarosa del 1% o ver usando una máquina de imágenes UV a simple vista o ver en la pantalla de amplificación en tiempo real Genie III.
- Optimice la temperatura del ensayo LAMP utilizando el instrumento de amplificación portátil y analizado utilizando el gráfico de amplificación en tiempo real para la velocidad y el nivel de sensibilidad. Ejecute muestras con temperaturas únicas para determinar la amplificación más rápida con el nivel más alto de sensibilidad.
- Determinar el límite de detección del ensayo desarrollado por LAMP realizando una dilución en serie del ADN extraído (como con la suspensión de esporas en el paso 2.2.1) y manteniendo las condiciones de reacción descritas anteriormente para la reacción LAMP para cada dilución.
- Determinación del límite de detección y comparación con el método pcR convencional
- Utilice el ADN extraído en los pasos de la sección 1.3 para comparar el nivel de detección de PCR convencional con el del ensayo LAMP.
- Añadir 1 l de ADN a un tubo de PCR que contenía 1 l de imprimaciones pcR hacia adelante y hacia atrás (Tabla 2), 12,5 l de Mastermix PCR verde, y 9,5 l de ddH2O para un total de 25 l.
- Amplificar las muestras en un ciclor térmico utilizando las siguientes condiciones: 94oC durante 5 min, 30 ciclos de desnaturalización a 94oC durante 30 s, recocido a 54oC durante 30 s, extensión a 72oC durante 1 min y extensión final a 72oC durante 10 min.
- Ejecute muestras en una máquina de electroforesis en un gel de agarosa al 1% y visualí y visualí en una máquina de imágenes UV. El tamaño de banda exceptuado era de 508 bp.
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Representative Results
Optimización del método LAMP
En este estudio, detectamos la presencia de Phytophthora capsici en el agua de riego utilizando un ensayo de amplificación isotérmica mediada por bucle portátil (LAMP). En primer lugar, el ensayo LAMP propuesto se optimizó probando diferentes concentraciones de imprimación LAMP [F3, B3 (0,1–0,5 oM cada una); LF, LB (0,5–1,0 M cada uno) y FIP, BIP (0,8–2,4 m cada uno)], duraciones (30–70 min) y temperaturas (55–70 oC). La mezcla final de imprimación LAMP utilizada en este estudio fue: 0,2 m de cada imprimación F3 y B3, 0,8 m de cada imprimación Loop-F y Loop-B, 1,6 m de cada imprimación FIP y BIP. La optimización de la temperatura de reacción se realizó en el instrumento de amplificación portátil (por ejemplo, Genie III) determinando qué temperatura realizó la reacción más rápida sin amplificación negativa adicional. Se confirmó que la temperatura óptima era de 64 oC (no se muestran datos). El tiempo óptimo para ejecutar el ensayo a 64 oC fue de 45 min, ya que las concentraciones más bajas que fueron positivas para la detección (1,2 x 102 esporas/ml) todavía se amplificaron en 40 min, mientras que las concentraciones más altas se amplificaron a 20 min (Figura 2D). Los productos LAMP amplificados se observaron además en un 1% de gel de agarosa teñido con una mancha de ácido nucleico para confirmar la amplificación. Todas las reacciones se repitieron al menos tres veces.
Los aislados de P. capsici fueron tomados de Tennessee, Florida y Georgia y fueron sometidos al mismo protocolo descrito en los métodos. Todas las muestras de aislados de P. capsici se amplificaron con éxito en todas las corridas del ensayo (Figura 3).
Pruebas de detección y sensibilidad de Phytophthora capsici en agua de riego mediante ensayo LAMP portátil
Estandarizamos este método LAMP basado en papel de filtro en condiciones de laboratorio utilizando una dilución en serie de suspensiones de esporas P. capsici (Figura 1). Las diluciones en serie se hicieron a partir de una suspensión de esporas P. capsici a partir de 4,8 x 104 zoosporas/ml y se ejecutaron con el ensayo LAMP en triplicado. Se muestran concentraciones de esporas en lugar de concentración de ADN debido al método implicado para la extracción del ADN. La extracción de ADN CTAB de la concentración más alta de esporas fue de 4,5 ng/L medida por Nanodrop, y el protocolo magnético de extracción de ADN de perlas produjo 3,8 ng/L26. El conjunto de imprimación LAMP de nuevo diseño podría detectar una concentración tan baja como 1,2 x 102 esporas/ml(Figura 2B, 2C y 2D)con todos los métodos de extracción. La sensibilidad mostrada en el gráfico de amplificación en el instrumento de amplificación portátil era idéntica a la mostrada en la imagen UV sin sensibilidad adicional. La misma dilución en serie se ejecutó en una reacción LAMP utilizando el tinte colorimétrico para determinar el nivel de sensibilidad a simple vista para la detección de campo. La concentración observable más baja fue de 4,8 x 103 esporas/ml(Figura 2C).
Para evaluar la capacidad de este ensayo utilizando muestras del mundo real, se recogieron muestras de agua de siete estanques utilizados para la producción comercial de vegetales en el condado de Tift, Georgia (Tabla 1, Figura 5y Figura complementaria 1). De los 7 estanques, 3 mostraron resultados positivos de LAMP (P1, P4 y P6)(Figura 6A, 6B y 6C). Estos resultados sugieren que el método LAMP basado en papel de filtro portátil podría ser muy útil para la detección del patógeno incluso con una baja concentración de zoospora. Esto demuestra la aplicabilidad de LAMP como un ensayo de detección más sensible que la PCR para la detección de la contaminación del agua de riego por P. capsici.
Análisis comparativo de diferentes métodos: cebo tradicional, PCR convencional y el ensayo portátil basado en LAMP
Para comparar la sensibilidad de detección de LAMP con la PCR convencional, el ADN extraído de la dilución en serie de las suspensiones de esporas se ejecutó en una reacción PCR. Los resultados mostraron que la PCR convencional era 40 veces menos sensible que LAMP, sólo capaz de detectar una concentración de zoospora tan baja como 4,8 x 103 esporas/ml(Figura 2A). Además, las muestras de ADN obtenidas a partir de agua filtrada de estanques de riego se analizaron utilizando PCR convencional, y sólo una de las tres muestras positivas (P4) se amplificó con éxito como tamaño de banda esperado más contaminantes significativos que resultan en algunas manchas y bandas inespecíficas (Figura 6D). La Tabla 3 muestra las diferencias entre los métodos de detección utilizando variables como el tiempo, el costo, la sensibilidad y la preparación requeridas. LAMP fue el método menos costoso entre estos tres métodos y también fue el más rápido, que va desde 30-60 min para amplificación (extracción de ADN excluida). La PCR convencional osciló entre 120-180 min para amplificación (extracción de ADN excluida).
Finalmente, para determinar la especificidad de las imprimaciones, muestras de patógenos oomicetos estrechamente relacionados (Phytophthora sansomeana, Phytophthora sojae, Phytophthora cinnamomi, Phytophthora palmivora, Pythium ultimum var. ultimum, Phytopythium vexans, Phytopythium helicoides, y Pythium aphanidermatum) se obtuvieron, ADN se extrajo utilizando el mismo protocolo para la consistencia y evaluado por el nuevo ensayo LAMP con un control positivo y negativo (Figura 4) para determinar la especificidad de las imprimaciones. Todas las muestras no objetivo fueron negativas utilizando los 64 oC optimizados durante 45 min. Esto se observó en el gráfico de amplificación en tiempo real y se hizo una imagen en un gel de agarosa del 1% bajo la luz UV.
Figura 1: Diagrama que muestra los diferentes pasos implicados en Phytophthora capsici a partir de una dilución en serie de una suspensión de esporas concentrada en condiciones de laboratorio. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Optimización de laboratorio del límite para la detección de Phytophthora capsici. (A) El ensayo de PCR convencional se llevó a cabo utilizando imprimaciones P. capsici específicas en factores de dilución en serie y se visualizó en gel de agarosa al 1%. 1, Escalera; 2-7, 4.8 x 104, 4.8 x 103, 4.8 x 102, 2.4 x 102, 1.2 x 102 esporas/mL, respectivamente y 7, control negativo del agua. (B) Factores de dilución en serie del ensayo LAMP visualizados en gel de agarosa al 1%. 1-6, concentración de esporas decrecientes: 4,8 x10 4, 4,8 x 103, 4,8 x 102, 2,4 x10 2, 1,2 x 102 esporas/ml, y 7, control negativo del agua. (C) Resultados LAMP visualizados utilizando el tinte colorimétrico. 1-6, concentración de esporas decrecientes: 4,8 x10 4, 4,8 x 103, 4,8 x 102, 2,4 x10 2, 1,2 x 102 esporas/ml, y 7, control negativo del agua. (D) Resultados LAMP visualizados en el gráfico de amplificación. Rojo 4,8 x 104, Azul oscuro a 4,8 x 103, Naranja a 4,8 x 102, Azul claro a 2,4 x 102, Verde a 1,2 x 102 esporas/ml, Rosa - Control negativo (otras especies de Phytophthora), Amarillo á ddH2O. (E) Una curva estándar que muestra la cuantificación de los valores mostrados en los resultados en tiempo real. Ln (Recuento de esporas) se muestra en el eje X y minutos para amplificarse en el eje Y. (F) Ensayo LAMP con imprimación publicada (Dong et al. 2015) sobre factores de dilución en serie visualizados en gel de agarosa al 1%. 1-6, concentración de esporas decrecientes: 4,8 x10 4, 4,8 x 103, 4,8 x 102, 2,4 x10 2, 1,2 x 102 esporas/ml, y 7, control negativo del agua. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Amplificación del ADN P. capsici de varios lugares. (A) Resultados LAMP visualizados en gel de agarosa al 1%. 1, PC_TN1; 2, PC_TN2; 3, PC_FL1; 4,PC_FL2; 5, PC_GA1; 6, PC_GA2; N, Control negativo. Las muestras 1 y 2 se aislaron de TN; 3 y 4 aisladas de FL; las muestras 5 y 6 se aislaron de los resultados de GA. (B) visualizados utilizando el tinte colorimétrico. 1, PC_TN1; 2, PCTN2; 3, PC_FL1; 4,PC_FL2; 5, PC_GA1; 6,PC_GA2. (C) Resultados visualizados en el gráfico de amplificación. Rojo, PC_TN1; Naranja, PCTN2; Amarillo, PC_FL1; Verde, PC_FL2; Azul oscuro, PC_GA1; Azul claro, PC_GA2; Rosa, control negativo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Determinación de la especificidad del ensayo LAMP utilizando ADN de especies no objetivo P. capsici. (A) Reacción del ensayo LAMP con especies no objetivo relacionadas en gel de agarosa y visualizada en gel de agarosa al 1%. L, Escalera; 1, Phytophthora sansomeana; 2, Phytophthora sojae; 3, Phytophthora cinnamomi; 4, Phytophthora palmivora; 5, Pythium ultimum var. ultimum; 6, Phytopythium vexans; 7, Control negativo; 8, Phytophthora capsica. (B) LAMP resultados visualizados utilizando el tinte colorimétrico. 1, Phytophthora sansomeana; 2, Phytophthora sojae; 3, Phytophthora cinnamomi; 4, Phytophthora palmivora; 5, Pythium ultimum var. ultimum; 6, Phytopythium vexans; 7, Control negativo; 8, Phytophthora capsici (C) LAMP resultados visualizados en el gráfico de amplificación. Rojo - Phytophthora capcisi, todas las demás muestras de especies no objetivo no fueron amplificadas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Imágenes que muestran el muestreo y el procesamiento de agua reciclada para la detección de Phytophthora capsici en el campo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Resultados de la detección in situ de Phytophthora capsici en fuentes de agua de riego. (A) Gel de agarosa que muestra los resultados de la amplificación LAMP de agua probada de siete granjas en Georgia del Sur. Nombres de muestra de izquierda a derecha: P1, P2, P3, P4, P5, P6, P7, Control negativo, N. (B) LAMP resultados visualizados utilizando tinte colorimétrico warmstart de muestras de campo: P1, P2, P3, P4, P5, P6, P7, Control negativo, N. (C) Resultados de la amplificación LAMP de muestras de campo utilizando gráfico. Rojo: P1, Verde: P2, Púrpura: P3, Amarillo: P4, Azul: P5, Naranja: P6, Rosa: P7, Control negativo, N. (D) Gel de agarosa que muestra los resultados de PCR convencionales de la amplificación utilizando imprimaciones específicas PC-1/PC-2 (nota que sólo un sitio dio positivo en comparación con tres en LAMP). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Nombre del estanque | Condado, Estado | Cultivos objetivo para el riego | Detección de PCR | Detección de lámparas | Antecedentes de enfermedad (Y/N) |
| P1 | Tift | Verduras | | + | N |
| P2 | Tift | Verduras | - | - | N |
| P3 | Tift | Verduras | - | - | N |
| P4 | Tift | Verduras | + | + | N |
| P5 | Tift | Verduras | - | - | N |
| P6 | Tift | Verduras | - | + | N |
| P7 | Tift | Verduras | - | - | N |
Tabla 1: Detección de agua de riego de Southern GA.
| Primer tipo | Primer nombre | Secuencia 5'-3' | Fuente | ||
| Lámpara | PCA3-F3 | TGTGTGTGTGTTCGATCACA | Este estudio | ||
| PCA3-B3 | TTTTTGCGTGCGTCCAGA | Este estudio | |||
| PCA3-FIP | GACACCAAGCACTCAGTACTOGTTTTTACAATTGTGCAGAGGGAGGA | Este estudio | |||
| PCA3-BIP | AGAACGAGTATTCGGCGGCGTTGAAAAAGGACCACCCG | Este estudio | |||
| PCA3-LF | TGTCGAATGGATTTGCGATCTT | Este estudio | |||
| PCA3-LB | ATACGCAGGTCATTTGACTGAC | Este estudio | |||
| Pcr | PC-1 | GTCTTGTACTATCATGGCG | Zhang et al., 2006 | ||
| PC-2 | CGCCACAGCAGGAAAAGCATT | Zhang et al., 2006 | |||
Tabla 2: Primers utilizados en este estudio.
| Parámetros | Tradicional | PCR convencional | Lámpara |
| Sensibilidad | Na | 4.8 X 102 esporas/ml | 1.2 X 102 esporas/ml |
| Hora | 2 semanas o más | 2-3 horas (sin incluir la extracción de ADN) | 30 minutos - 1 hora (sin incluir la extracción de ADN) |
| Preparación | • Creación de medios • Revestimiento y aislamiento y • Diseñar una trampa |
• Recolección de esporas con papel de filtro • Extracción de ADN y • Ensayo de PCR |
• Recolección de esporas con papel de filtro • Extracción de ADN y • Ensayo LAMP |
| Materiales | • Autoclave • Medios y placas • Sala de incubación • Capucha de flujo • Berenjena • Caja de leche |
• Ciclor térmico • Gel de agar • Gel Doc |
• Bloque de calor o • Genie III |
| Costo | $5.00 por trampa | $0.60 por reacción | $0.75 por reacción |
Tabla 3: Comparación de métodos para la detección de P. capsici.
Figura complementaria 1: Ubicación del condado de Tift, GA y muestras de agua de riego tomadas de varios lugares desde dentro del estado. Las muestras positivas se mostraron como puntos rojos. Haga clic aquí para descargar esta figura.
Figura complementaria 2: Diseño del conjunto de imprimación LAMP. Las flechas muestran la dirección de cómo se leen los imprimadores. Haga clic aquí para descargar esta figura.
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Discussion
La prueba de agua de riego para fitopatógenos es un paso crucial para los cultivadores que utilizan estanques de riego y agua reciclada27. Los estanques de riego proporcionan un reservorio y caldo de cultivo para una serie de fitopatógenos, ya que el exceso de agua de riego se dirige desde el campo hasta el estanque que lleva consigo cualquier patógeno que pueda haber estado presente16,,27. El método tradicional para la detección de patógenos vegetales en una gran fuente de agua consiste en establecer un cebo para el patógeno utilizando tejido huésped susceptible (por ejemplo, fruta, hojas) suspendido en el estanque y esperar a que se realice una infección, luego retirar la fruta/hojas y confirmar el diagnóstico con microscopía o métodos moleculares13,,14. Estos métodos son limitantes debido a la cantidad de tiempo necesario para ejecutar la prueba de detección (2 semanas o más), y la mano de obra y el equipo requeridos. Además, se requiere una amplia experiencia y conocimientos en diagnóstico visual, morfología de patógenos y taxonomía para obtener resultados precisos. Las técnicas moleculares como la PCR, el qPCR y la hibridación del ADN requieren mucho menos tiempo (3-4 h) que los métodos tradicionales de detección; sin embargo, requieren equipos costosos y un entorno de laboratorio. Además, estas técnicas no permiten el procesamiento de grandes volúmenes de agua. Los ensayos serológicos también se quedan cortos en su capacidad de detección debido a reacciones positivas no objetivo, y no se han desarrollado ensayos específicos de especies para especies de Phytophthora. La amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP) se ha utilizado recientemente como una técnica de diagnóstico in situ para la detección rápida y sensible de múltiples patógenos, ya que el ensayo sólo requiere una sola temperatura en lugar de un ciclor térmico28,,29. LAMP se puede ejecutar en el campo utilizando un tinte colorimétrico para la confirmación visual o utilizando una máquina de amplificación en tiempo real para obtener resultados en menos de una hora30.
El objetivo de este experimento fue desarrollar un método rápido y sensible para detectar la presencia de Phytophthora capsici en fuentes de agua, ya sea in situ o en un laboratorio. Para aumentar la velocidad de detección y combatir las limitaciones de los métodos mencionados anteriormente para detectar P. capsici en el agua de riego, diseñamos un método utilizando papel de filtro para capturar las esporas y extraer su ADN de un mayor volumen de agua. Después de que las esporas fueron capturadas utilizando la técnica de papel de filtro y se extrajo ADN, se confirmó la presencia del patógeno sobre la base de un conjunto de imprimación LAMP de nuevo diseño específico de P. capsici. La sensibilidad y especificidad de detección se comparó utilizando LAMP y PCR. En las 3 replicaciones y con todas las concentraciones de zoospora, LAMP fue un método de detección más rápido y sensible (Tabla 3). Este método no está limitado por tener un pequeño volumen de muestra como métodos tradicionales, ya que este método se puede probar hasta 1 L de agua a la vez, aumentando las posibilidades de detección de patógenos. Se observó en las pruebas que verter agua de riego lentamente a través del embudo Buchner a una velocidad de no más de 40 ml por segundo aumentó la capacidad de captura de esporas del papel de filtro.
Para validar el protocolo de detección, también se tomaron muestras de agua del campo donde se sospechaba que P. capsici estaba presente(Figura complementaria 1) para probar el método diseñado con un escenario práctico. De las 7 granjas probadas, 3 fueron positivas por la presencia de P. capsici utilizando el ensayo LAMP (Figura 6A-6C) mientras que sólo una granja fue positiva cuando se utilizó el ensayo PCR convencional (Figura 6D), mostrando LAMP como un ensayo más sensible para este método de prueba de agua de riego. Aunque, este ensayo LAMP basado en filtros pudo detectar ADN a partir de una concentración tan baja como 1,2 x 102 zoosporas/ml que era significativamente menor que la sensibilidad original de este ensayo (0,01 ng ADN genómico equivalente a 5 esporas) con suspensión de zoospora sin filtrar. El anterior ensayo LAMP de Dong et. al. (2015)20 se ejecutó en la misma dilución en serie y el nivel de sensibilidad fue el mismo (Figura 2F). El nivel de detección de un ensayo de PCR con solución de esporas sin filtrar también ha mostrado un mayor nivel de detección (equivalente a 10 esporas) que era muy similar a los anteriores hallazgos basados en PCR10. El límite de detección de esporas del método tradicional de detección de cebo no se comprobó ya que una sola espora podría causar infección dependiendo de su capacidad individual. La disminución de la sensibilidad que se encuentra en los ensayos LAMP y PCR es probable debido a algunas esporas que fluyen a través o alrededor del papel de filtro, o una vez unidas al papel de filtro, incapaces de extraerse con 100% de eficiencia. Sin embargo, este nuevo sistema LAMP y filtro puede procesar y analizar un volumen de agua mucho mayor que los métodos anteriores y confiere un mayor nivel de especificidad y velocidad para la detección en el campo.
De los métodos de extracción utilizados, la extracción magnética basada en cuentas fue la más rápida y no requirió el uso de máquinas externas como un batidor de cuentas o centrífuga, por lo que era útil para extracciones en el campo y complementa la característica portátil del ensayo LAMP. El método basado en CTAB produjo la mayor concentración de ADN, pero tomó la mayor cantidad de tiempo, mientras que el kit de extracción de ADN de la planta comercial (por ejemplo, DNeasy) fue el segundo en el tiempo requerido y la concentración de ADN adquirida.
Tanto con CTAB como con el kit de extracción de ADN de la planta comercial, durante la homogeneización del papel de filtro se observó que la homogeneización tuvo más éxito y produjo una mayor concentración si la solución CTAB (o tampón de extracción) se añadió al tubo con los trozos de papel de filtro antes de que comenzara el golpeo de cordón o la homogeneización de la mano. La paliza de cuentas se realizó 3 veces durante un minuto cada una, pero el vórtice y agitar el tubo entre cada ronda era necesario para una homogeneización completa en todos los métodos de extracción. Es importante destacar que el papel de filtro está sujeto a quedarse atascado en los lados o en la parte inferior del tubo, por lo que es crucial asegurarse de que el papel de filtro está fuera de las paredes para que se homogeneice.
El tiempo total requerido para la amplificación es de 90-120 min y se puede hacer fácilmente en el campo para el diagnóstico in situ. Este método de filtro también está diseñado para filtrar cantidades significativas de agua para aumentar las posibles posibilidades de detección del patógeno. Este método también es aplicable a muchos patógenos que se pueden acumular en una fuente de agua, particularmente géneros tales como: Pythium, Phytophthora, Fusarium, y bacterias; el único cambio requerido será el desarrollo de una imprimación LAMP igualmente específica para el patógeno objetivo30.
Un resultado significativo de este trabajo es el desarrollo de un ensayo LAMP altamente sensible y rápido basado en papel para la detección de P. capsici en fuentes de agua de riego. Esperamos que este estudio conduzca a un aumento en la concienciación sobre la contaminación del agua de riego reciclada, eventualmente mejorar la gestión de las enfermedades asociadas a Phytophthora, y en consecuencia reducir los costos de producción y aumentar el rendimiento de los cultivos. Esta información es muy necesaria para mejorar la sostenibilidad de la producción vegetal y mejorar la rentabilidad de las producciones vegetales.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar ni ningún conflicto de intereses.
Acknowledgments
Este trabajo recibió el apoyo financiero del proyecto de la Comisión de Productos Básicos de Georgia para Hortalizas, ID, FP00016659. Los autores agradecen a la Dra. Pingsheng Ji, Universidad de Georgia y Dra. Anne Dorrance, Universidad Estatal de Ohio por proporcionar culturas puras de Phytophthora spp. También agradecemos a Li Wang y Deloris Veney por su asistencia técnica durante todo el estudio.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose gel powder | Thomas Scientific | C997J85 | |
| Buchner funnel | Southern Labware | JBF003 | |
| Bullet Blender | Next Advance | BBX24 | |
| Centrifuge 5430 | Eppendorf | 22620509 | |
| Chloroform | Fischer Scientific | C298-500 | |
| CTAB solution | Biosciences | 786-565 | |
| Dneasy Extraction Kit | Qiagen | 69104 | |
| Filter Flask | United | FHFL1000 | |
| Filter Paper | United Scientific Supplies | FPR009 | |
| Gel Green 10000X | Thomas Scientific | B003B68 (1/EA) | |
| Genie III | OptiGene | ||
| Hand pump | Thomas Scientific | 1163B06 | |
| Iso-amyl Alcohol | Fischer Scientific | BP1150-500 | |
| LAVA LAMP master mix | Lucigen | 30086-1 | |
| Magnetic bead DNA extraction | Genesig | genesigEASY-EK | |
| Magnetic Separator | Genesig | genesigEASY-MR | |
| polyvinylpyrrolidone | Sigma Aldrich | PVP40-500G | |
| Primers | Sigma Aldrich | ||
| Prism Mini Centrifuge | Labnet | C1801 | |
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | 1861096 | |
| UV Gel Doc | Analytik Jena | 849-00502-2 | |
| Warmstart Colorimetric Dye | Lucigen | E1800m | |
| Wide Mini ReadySub-Cell GT Cell | Bio-Rad | 1704489EDU | |
| 70% isopropanol | Fischer Scientific | A451-1 |
References
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