Summary
Здесь мы представляем протокол для измерения потока in vitro Ca2 "в нейронах среднего мозга и их вниз по течению воздействия на каспазы-3 с использованием первичных культур среднего мозга мыши. Эта модель может быть использована для изучения патофизиологических изменений,связанных с аномальной активностью Ca 2 в нейронах среднего мозга, и для проверки новых терапевтических средств на антиапоптотические свойства.
Abstract
Болезнь Паркинсона (PD) является разрушительным нейродегенеративным расстройством, вызванным дегенерацией дофаминергических (DA) нейронов. Чрезмерный приток Ca2 "из-за ненормальной активации рецепторов глутамата приводит к возбудимости DA и был определен в качестве важного механизма для потери нейронов DA. В этом исследовании мы изолировали, диссоциативные и культурные нейроны среднего мозга от мышей брюшной мезенцефалон (VM) эмбрионов мыши ED14. Затем мы заражаем долгосрочные первичные культуры среднего мозга мыши адено-ассоциированным вирусом (AAV), выражают генетически закодированный индикатор кальция, GCaMP6f под контролем человека нейрон-специфический синапсин промоутер, hSyn. Используя живую конфокаловую визуализацию, мы показываем, что культурные нейроны среднего мозга мышиотображают спонтанные потоки Ca 2, обнаруженные AAV-hSyn-GCaMP6f. Ванна применение глутамата к середине мозга культур вызывает аномальныевысоты во внутриклеточных Ca 2 "в нейронах, и это сопровождается активацией каспазы-3 в нейронах DA, как показано на иммуностимулятора. Методы для выявления глутамата опосредованного апоптоза в первичных нейронов мыши DA имеют важное применение для высокого содержания скрининга препаратов, которые сохраняют здоровье нейронов DA.
Introduction
Болезнь Паркинсона (PD) является вторым наиболее распространенным нейродегенеративным расстройством во всем мире, без известного лечения. Оценки показывают, что распространенность PD будет продолжать расти и, по оценкам, превысит 1 миллион диагнозов к 2030 году только в Соединенных Штатах1. С несколькими эффективными методами лечения в настоящее время доступны для борьбы с PD, существует настоятельная необходимость разработки более эффективных методов лечения. PD характеризуется быстрой и прогрессирующей потерей среднего мозга допамина (DA) нейронов2. Механизмы, которые лежат в основе нейродегенерации в PD плохо изучены. Фактические данные свидетельствуют о вероятном сближении нескольких механизмов, таких как окислительный стресс и митохондриальная дисфункция и т.д., которые способствуют началу апоптотических сигнальных каскадов и возможной гибеликлеток 3.
Один из таких конвергентных механизмов, глутамат-опосредованная возбудимость была вовлечена в несколько нейродегенеративных заболеваний, в том числе PD4. В то время как глутамат-опосредованная возбудимость, как полагают, работает главным образом через стимуляцию рецепторов NMDA через чрезмерное увеличение внутриклеточной концентрации Ca2 "и в конечном итоге начало апоптоза, Ca2"-проницаемые рецепторы АМРА также были вовлечены в ацитотоксичныйответ 5,6,7. Таким образом, представляет интерес для определения вклада рецепторов АМРА в глутамат-опосредованного апоптоза в модели PD. Это может быть достигнуто с помощью NB'X, блокатор аМРА и кайнат, который при концентрациях микромоляров является селективным для рецепторовАМРА 8. Глутамат-опосредованная возбудимость и апоптотические сигнальные каскады являются идеальной целью ниже по течению для измерения степени гибели клеток и потенциальной мишенью для терапевтического вмешательства. Таким образом, разработка метода высокого содержания для оценки глутамата опосредовано модуляции активности кальция и связанных вниз по течению сигнализации в первичных брюшной мезенцефалической (VM) нейронов будет иметь важное место для скрининга новых методов лечения на их способность сохранить здоровье нейронов.
Здесь мы разработали протокол, в котором мы выражаем генетически закодированный индикатор кальция (GECI), GCaMP6f, используя AAV2/5 с человеческим синапсином (hSyn) продвигателем для измерения ca2 "активность мыши VM первичных нейронов в ответ на применение глутамата, которые могут быть измерены на физиологическом и молекулярном уровне. Этот скрининг с высоким содержанием может быть адаптирован для открытия фармацевтических препаратов илиметодов лечения, которые модулируют активность Ca 2 , чтобы сохранить здоровье нейронов VM. Мы предлагаем, что эта основная модель культуры является эффективным способом проверки для новых мероприятий PD, на основе их способности сохранять здоровье нейронов VM и смягчить прогрессирование PD.
Protocol
Все процедуры, связанные с использованием животных субъектов были одобрены Техасского университета институционального ухода за животными и использования комитета (25ноября 2019; АУПЗ 2019-0346).
ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовка решений клеточной культуры должна быть сделана с использованием стерильной процедуры в кабинете биологической безопасности и фильтруется на 0,2 мкм для предотвращения загрязнения.
1. Подготовка решений и культурной среды
- Приготовьте раствор ламинина, разбавляя 20 л ламинина 1 мг/мл в 2 мл стерильного дистиллированного H2O. Приготовьте в день вскрытия.
- Подготовка 10% лошади (лошадь) сыворотки (ES) остановить решение, добавив 5 мл ES до 45 мл 1x Хэнка сбалансированный солевой раствор (HBSS). Стерильный фильтр с использованием фильтровальной системы 0,2 мкм или наконечника шприц-фильтра. Хранить при 4 градусов по Цельсию.
- Приготовьте 4% бульонного раствора сыворотки крупного рогатого скота (BSA), добавив 2 г порошка BSA в 1x фосфатный солевой раствор (PBS) и доведя до конечного объема 45 мл. Стерильный фильтр с использованием фильтровальной системы 0,2 мкм или наконечника шприц-фильтра. Хранить при 4 градусов по Цельсию.
- Подготовка раствора бульона папаина путем разбавления папаина до 3 мг/мл в 1x HBSS. Стерильный фильтр с использованием фильтровальной системы 0,2 мкм или наконечника шприц-фильтра. Хранить при -20 градусов по Цельсию.
- Приготовьте раствор дезоксирибонуклеазы (DNase), добавив 20 мг порошка DNase в стерильный H2O и доведя до конечного объема 20 мл. Стерильный фильтр с использованием фильтровальной системы 0,2 мкм или наконечника шприц-фильтра. Хранить при -20 градусов по Цельсию.
- Приготовьте раствор аскорбиновой кислоты, добавив 352 мг аскорбиновой кислоты в стерильный дистиллированный H2O и доведя до конечного объема 20 мл. Нагрейте в ванне 37 градусов по Цельсию, чтобы раствориться при необходимости. Стерильный фильтр с использованием фильтровальной системы 0,2 мкм или наконечника шприц-фильтра. Хранить при -20 градусов по Цельсию.
- Подготовьтесь к клеточной культуре Medium, добавив следующее до 50 мл нейробазальной среды: 500 МКЛ Glutamax (100x), 500 МКЛ конской сыворотки, 1 мл B-27, 100 МКЛ аскорбиновой кислоты, 500 мл пенициллина-стрептомицина, 50 МКЛ канамицина и 50 МКЛ ампициллина. Стерильный фильтр с использованием фильтровальной системы 0,2 мкм. Хранить при 4 градусов по Цельсию.
- Подготовка 0,01% Triton X-100 Решение, добавив 1 мл Triton X-100 в 9 мл 1x PBS, чтобы сделать 10% решение. Как Triton X-100 является вязким, пипетка медленно, чтобы кончик заполнить полностью. Нагрейте в ванне 37 градусов по Цельсию, чтобы раствориться при необходимости. Хранить при 4 градусов по Цельсию.
- Чтобы разбавить 10% акций Triton X-100 до 0,01%, выполните 3 серийных разбавления 1:10. Разбавить 1 мл 10% акций в 9 мл 1x PBS, чтобы сделать 1% решение. Разбавить 1 мл 1% раствора в 9 мл 1x PBS, чтобы сделать 0,1% раствора. Разбавить 1 мл раствора 0,1% в 9 мл 1x PBS, чтобы сделать решение 0,01%.
- Приготовьте 10% и 1% нормального раствора козьей сыворотки (NGS), добавив 1 мл NGS до 9 мл 1x PBS для 10% раствора. Добавьте 100 мл NGS в 9,9 мл 1x PBS, чтобы сделать 1% раствор.
- Приготовьте раствор глутамата (100 мМ) путем добавления 735 мг L-glutamic кислоты в стерильный дистиллированный H2O и довнесите до конечного объема 50 мл. Solubility в этой концентрации будет проблемой. Добавление небольших объемов (100 МЛ) 1 М соляной кислоты достаточно для повышения солубности.
- Приготовьте биржевой раствор NB'X (10 мМ), добавив 50 мг NB-X в стерильный дистиллированный H2O и довнесите до конечного объема 13 мл.
2. Приготовление культурных блюд и кавер-клипов (Сделано за день до вскрытия)
ПРИМЕЧАНИЕ: Мы обнаружили, что сочетание трех агентов покрытия, поли-L-лизин, поли-L-орнитин, и ламинин позволяет идеальной клеточной адгезии и жизнеспособности.
- Поместите 10 35 мм чашки Петри в шкаф биологической безопасности. Поместите два круглых 12 мм крышки в каждом блюде и заполнить 70% EtOH в течение 10 минут. Используйте вакуумную линию, чтобы аспирировать оставшийся EtOH из каждого блюда, позволяя EtOH полностью испаряться.
- Pipette 90-100 л 0,1% раствора поли-L-лизина на каждой крышке, убедившись, что вся обложка покрыта раствором поли-L-лизина. Накройте посуду крышками и поместите в инкубатор 37 градусов по Цельсию на 1 ч.
- Аспират оставшегося раствора поли-L-лизина из каждого крышки и промыть стерильным H2O.
- Повторите шаги 2.2 - 2.3 с 0,1% раствором поли-L-орнитин.
- Опять же, повторите шаги 2.2 - 2.3 с 0.01% раствором ламинина. Поместите в инкубатор CO 2 на 37 градусовпо Цельсию до готовности к обливию клеток на следующий день.
3. Мыши эмбриональные вскрытия
ПРИМЕЧАНИЕ: Мы используем от 4 до 6 время беременных мышей на культуру. Хотя большая часть процесса вскрытия происходит за пределами биологического шкафа безопасности по-прежнему важно поддерживать стерильные процедуры. Обильное использование 70% EtOH на поверхностях возле микроскопа вскрытия и на хирургических инструментах является идеальным. Маска также может носиться во время вскрытия для дальнейшего предотвращения загрязнения. Кроме того, мы используем 4 отдельных антибиотика в среде культуры, поэтому загрязнение маловероятно. Однако, если использование антибиотиков является проблематичным, это вскрытие установки могут быть перемещены внутри стерильного капюшона. Для сохранения жизнеспособности клеток все растворы для вскрытия должны быть предварительно охлажденные при 4 градусах Цельсия, а вскрытия должны быть завершены как можно быстрее. Мы не выполняем вскрытия на льду. Метод вскрытия эмбриональных нейронов среднего мозга мыши идентичен ранее описанным методам9,,10.
- Подготовьте пространство на скамейке возле микроскопа вскрытия с абсорбентной площадкой и спрей либерально с 70% EtOH.
- Спрей две 100 х 15 мм стеклянные чашки Петри и один 50 х 10 мм стеклянная чашка Петри с 70% EtOH и позволяют EtOH испаряться. После испарения поместите 50 мл стерильной 1x HBSS в каждую чашку Петри диаметром 100 х 15 мм.
- Погрузите хирургические ножницы, типсы и лезвие микротома в 70% EtOH в течение 10 минут минимум для стерилизации. Поместите инструменты на абсорбянтную площадку, чтобы высохнуть.
- Используя CO2 с последующим вывихом шейки матки, усыпляйте 2-3-месячных приуминых мышей беременности на эмбриональный день 14.
- Спрей брюшной полости усыпанных мышей с 70% EtOH. С помощью тибря захватить нижнюю часть живота и открыть брюшную полость с помощью хирургических ножниц. Начните резки рядом, где тибры держат живот, делая боковые порезы с каждой стороны, пока брюшная стенка может быть сложена обратно и матка хорошо видна.
- Используя хирургические ножницы, вырезать оба конца рога матки. Затем удалите матку и поместите в чашку Петри с 1x HBSS.
- С помощью прямых типсов тщательно удаляют эмбрионы из матки. Оставьте эмбрионы в HBSS на протяжении всего этого процесса. Используя либо типсы, либо лезвие микротомы, быстро обезглавливайте эмбрионы, разрезая возле шеи. Создание как уровень разреза, как это возможно.
- Под рассечением микроскопа перемести голову эмбриона в сухую 50-мм чашку Петри и поместите на вентраловую сторону. Стабилизация головы с типсами путем размещения и проникновения вблизи глаз / морды. Force должны быть под углом вниз на 45 ", чтобы избежать проникновения мезенцефалона.
- Используя типсы в другой руке, тщательно удалите полупрозрачный слой кожи и черепа прямо перед выдающимся хребтом мезенцефалона. Начните вблизи средней линии и удалить кожу и череп caudally до мезенцефалона полностью подвергается.
- Держите типсы перпендикулярно подвергаются мезенцефалон с одним кончиком между корой и мезенцефалоном, а другой вблизи мозжечка. Нажмите вниз и щепотку щипся вместе, чтобы удалить весь средний мозг. Средний сегмент должен быть толщиной около 0,5 мм. Поместите сегмент среднего браина во второе блюдо Петри, наполненное свежим 1x HBSS. Повторите этот процесс для каждого эмбриона.
- Используя микроскоп вскрытия, распо положение сегмента мозга с брюшной стороны лицом вверх. Если околивания все еще прикреплены, тщательно удалите его, схватив с типсами и поднимая вверх и подальше от сегмента мозга.
- Сегмент мозга должен иметь 4 видимых квадранта. Поместите сегмент таким образом, чтобы два меньших квадранта были расположены выше двух больших квадрантов. Существует видный хребет, отделяющий два верхних (малых) квадранта от нижних двух (больших) квадрантов.
- Используя щипцы щепотку и отделить превосходные квадранты от нижних квадрантов, а затем отказаться от превосходных квадрантов. Остальные нижние квадранты будут иметь избыток ткани боковой на спинной стороне, эта ткань будет выглядеть менее непрозрачной, чем остальные брюшной ткани. Удалить менее плотной спинной ткани и отказаться. Оставшийся сегмент должен содержать как Substantia nigra pars compacta (SNc), так и вентрал-тегменталовую область (VTA).
- Используя тибры сократить оставшийся сегмент брюшной ткани на 4 меньших частей и с помощью 1mL широкий родила пипетки передачи этих сегментов в 15 мл конической трубки с 1x HBSS. Держите коническую трубку с сегментами мозга на льду на протяжении всей процедуры.
- Повторите этот процесс для всех оставшихся сегментов мозга.
4. Диссоциация клеток
- Энзиматическое переваривание клеток
- Тщательно аспирировать HBSS из 15 мл конической трубки, содержащей сегменты среднего браина, оставляя сегменты в нижней части трубки.
- Добавьте в трубку раствор папаина на 800 мкл и поместите в инкубатор 37 градусов по Цельсию в течение 7 минут. Resuspend клетки, щелкивая трубку и заменить на 37 C инкубатор для дополнительных 7 мин.
- С широкой скважины 1 мл пипетки отзыв удалить только сегменты среднего брайна в 1 мл aliquot DNase. Разрешить сегментов достичь нижней части aliquot или около 1 мин экспозиции.
- С широкой скважины 1 мл пипетки кончик удалить только сегменты среднего брайна в 15 мл конической трубки, содержащей 2 мл стоп-раствора. Разрешить сегменты, чтобы поселиться в нижней части трубки и повторить промыть в дополнительной конической трубки заполнены стоп-раствор.
- Механическая тритурация клеточной подвески
- Во второй остановке раствор промыть трубку, используя широко родила 1 мл пипетки кончик, пипетки клетки вверх и вниз 10 раз, пока Есть нет больших сегментов ткани видны. Важно, чтобы избежать более тритурации для минимального лиза клеток.
- Медленно пипетка 300 МКЛ 4% BSA раствора в нижней части 15 мл конической трубки, содержащей сегменты мозга. Аккуратно снимите наконечник пипетки, чтобы сохранить слой подвески. Центрифуга при 0,4 х г в течение 3 мин. Затем тщательно аспирировать супернатантные и повторное течение клетки в 400 йл среды клеточной культуры.
5. Покрытие ячеек
ПРИМЕЧАНИЕ: Основываясь на опыте, собирается около 100 000 жизнеспособных клеток на эмбрион. 2-3 месяца старые приученные супоросые мыши типично имеют размеры помета 8-10 зародышей; таким образом, приблизительная оценка общего урожая клеток на время беременной мыши составляет около 1 миллиона клеток.
- С помощью гемоцитометра преформировать количество клеток, а затем разбавить подвеску до 2000 клеток / йл с помощью среды клеточной культуры. Тритурировать кратко смешать.
- Удалите крышки с раствором ламинина из шага 2 из инкубатора и аспирировать оставшийся раствор ламинина из покрытых coverslips с помощью вакуума. Плита быстро, чтобы избежать coverslips от высыхания полностью. Pipette 100 L (2.0 x 105 клеток/крышки) на каждую крышку и поместите чашки Петри в инкубатор 37 градусов по Цельсию на 1 ч.
- Аккуратно добавьте 3 мл среды клеточной культуры к каждому блюду и поместите обратно в инкубатор 37 градусов по Цельсию. Преформ половина среднего изменения 2 раза в неделю в течение 2 недель.
6. Инфекция клеточной культуры на 14 DIV с адено-ассоциированных вирусных (AAV) векторов
- Для каждого блюда приготовьте 1 мл сыворотки свободной среды DMEM с 1 мл hSyn-GCaMP6f AAV (1.0 x 1013 titer)
- Аспирировать клеточной культуры среды из каждого блюда и заменить 1 мл сыворотки бесплатно DMEM, содержащий hSyn-GCaMP6f. Поместите блюда обратно в инкубатор 37 градусов по Цельсию на 1 ч.
- Аспирировать сыворотку свободной среды, содержащей AAVs и заменить 3 мл клеточной культуры среды. Поместите блюда обратно в инкубатор 37 градусов по Цельсию. Мы обнаружили, что 5-7 дней AAV инфекции позволяет для идеального уровня экспрессии GCaMP. Продолжайте меняться среды каждые 2-3 дня в течение этого периода вирусной инфекции.
7. Live confocal Ca2 "изображения между 19-21 DIV
ПРИМЕЧАНИЕ: Как уже упоминалось в шаге 6.3, визуализация может быть сделано между 5-7 дней после вирусной инфекции. Это идеальное окно для достижения видимого выражения флюорофора на уровнях, которые позволяют обнаруживать спонтанную активность Ca2.
- Подготовка буферов записи
- Чтобы сделать 1 l буфера записи HEPES, добавьте: 9.009 г NaCl, 0,3728 г KCl, 0,901 г D-глюкозы, 2,381 г HEPES, 2 мл 1 M CaCl2 стокового раствора и 500 л 1 M MgCl2 стокового раствора до 800 мл стерильных дистиллированных H2O. Принесите рН до 7,4 с NaOH. Довести до конечного тома 1 л.
- Чтобы сделать 200 мл буфера записи 20 МК глутамата, разбавить 40 МКЛ из 100 мМ глутамата фондового раствора в 200 мл буфера записи HEPES описано выше.
- Чтобы сделать 200 мл 10-метрового буфера записи NB'X, разбавить 200 МЛ из 10 мМ NB'X фондового раствора в 200 мл буфера записи HEPES.
- Конфокальные изображения
- Заполните стерильную 35-мм чашку Петри 3 мл буфера записи.
- Удалите 35-мм чашку Петри с зараженными культурами из инкубатора 37 градусов по Цельсию. Используя тонкие типсы наконечника, тщательно схватите край одного крышки и быстро перенесите его в чашку Петри, наполненную буфером записи. Поместите оставшиеся крышки в среде обратно в инкубатор 37 градусов по Цельсию. Транспорт блюдо с записью буфера на конфокальный микроскоп.
- Запустите программное обеспечение для визуализации. Перейти к следующему шагу, пока он инициализируется.
- Запустите перистальтический насос и поместите линию в буфер записи. Калибруйте скорость потока до 2 мл/мин.
- Перенесите зараженную крышку из 35-мм чашки Петри в записывающую ванну.
- Используя 10x цель погружения воды и BF свет, найти плоскость фокусировки и искать регион с высокой плотностью нейронов клеток органов. Переключитесь на цель погружения в воду 40x и с помощью света BF переориентация образца.
- В окне "Dyes list" в FluoView выберите AlexaFluor 488 и примените его.
- Выражение AAV может быть переменным; поэтому, чтобы предотвратить передержку и фототравмирование фторфоров, начните с низких настроек HV и лазерной мощности. Для канала AlexaFluor 488 установите высокое напряжение (HV) до 500, увеличение до 1x, и компенсируется до 0. Для 488 лазерной линии установлена мощность до 5%. Для того, чтобы увеличить эффективный объем изображения в z-плоскости, увеличить размер пинхол до 300 мкм. Используйте опцию сканирования "фокус x2" для оптимальной настройки сигналов выбросов до уровня субнасыщения. Отсюда настройки могут быть скорректированы до тех пор, пока не будет достигнута идеальная видимость каждого канала.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы точно захватить весь диапазон потоков Ca2 "с GCaMP, отрегулируйте базовые настройки HV и лазерной мощности, с тем чтобы обеспечить увеличение флуоресцентной интенсивности без перенасыщения детектора. - После оптимизации настроек микроскопа переместите сцену, чтобы найти область с несколькими ячейками, отображающих спонтанные изменения в флуоресценции GCaMP6f, и сосредоточьтесь на нужной плоскости для визуализации.
- Используйте инструмент "Clip rect", чтобы обрезать рамку изображения до размера, который может достичь интервала кадра чуть менее 1 секунды. Это необходимо для того, чтобы интервал изображения был 1 кадр в секунду.
- Установите окно "Interval" значением 1,0, а окно "Num" - 600.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для того, чтобы доставить различные буферы записи в нужную точку времени (300 с), важно откалибровать задержку насоса, чтобы доставить новое решение в ванну. Это будет зависеть от скорости перфузии раствора (2 мл/мин) и длины линии, используемой для перекачки раствора. - Для захвата фильма серии t выберите опцию «Время», а затем используйте опцию сканирования «XYt» для начала визуализации.
- Следите за строкой прогресса изображения и переместите линию из буфера записи HEPES в буфер записи глутамата 20 МК в соответствующую точку времени (например, если задержка насоса откалибрована для доставки раствора на 60 с, перемести линию в буфер глутамата на 240 кадров, чтобы доставить глутамат в 300 с).
- Когда изображение будет завершено, выберите кнопку Series Done и сохраните готовый фильм серии t.series. Продолжайте окутывать 20 МКМ глутамата в течение еще 5 минут, так что культурные нейроны были подвержены глутамат в общей сложности 10 мин. Повторите этот процесс для каждого обложки, чтобы быть изображены.
- После дополнительного 5-минутного воздействия 20 МКМ глутамата, удалите крышку из ванны и поместите обратно в 35-мм чашку Петри, содержащую буфер записи до дня завершения изображения. После завершения, перейти к шагу 8.
- Ca2 "анализ следов
- Выполните анализ изображений в ImageJ. Установите плагин BIO-FORMATS для ImageJ, который позволит . OIB файлы изображений, чтобы открыть.
- В панели инструментов ImageJ щелкните Анализируйте Установите измеренияи выберите поле для среднего серого значения (MGV).
- В ImageJ откройте t-серии фильма в качестве гиперстака.
- Перетащите ползунок для фильма и определить кадр с максимальным глутамата ответ визуализировать все нейроны, которые реагируют на глутамат. Используйте полигон инструмент, чтобы проследить все видимые тела нейронных клеток, добавив их ИИ в список "ROI менеджер".
- При законченном отслеживании и добавлении ROIs выберите все ИИ в окне ROI Manager и используйте выбор Multi measure в более подробном списке опций. Копировать и вставлять эти данные в электронную таблицу. Завершите этот процесс для анализа всех фильмов.
- Для каждой рентабельности инвестиций конвертируем необработанные данные MGV из каждого кадра в значения F/F0, используя уравнение: F/F0 и F(t) - F0/ F0. Где F (t) - MGV любого данного кадра, а F0 - средний базовый MGV из 10 кадров, где нет потоков Ca2.
- Используя статистическое программное обеспечение, такое как OriginPro 2020, преобразованныеследы F/F 0 могут быть сделаны в линейные графики. Функция "Пик-анализатор" может быть использована (или аналогичная функция при использовании другого программного обеспечения) для измерения пиковой амплитуды реакции глутамата, задержки для ответа на глутамат и области под кривой.
8. Иммуноутания культур
ПРИМЕЧАНИЕ: После фиксации с формалином, coverslips могут храниться в 1x PBS при 4 кк до готовности к обработке для иммуностимулятора. Первичная и вторичная инкубация антител была сделана в серийном порядке, как такая инкубация с первичным антителом anti-Caspase-3 и его дополнительным вторичным антителом предшествовала инкубации с первичным антителом anti-TH и его дополнительным вторичным антителом.
- Сразу же после воздействия глутамата поместите крышку обратно в 35-мм чашку Петри, аспирировать буфер записи и добавить 3 мл 10% формалина. Пусть сидят в течение 40 минут при комнатной температуре (RT).
- Промыть блюдо 3 раза с 1x PBS.
- Аспирировать PBS и проницать клетки в 1 мл 0,01% Тритон X-100 в PBS в течение 2 мин.
- Промыть блюдо 3 раза с 1x PBS.
- Аспирировать PBS и блокировать клетки в 1 мл 10% NGS в PBS в течение 40 мин.
- Промыть блюдо 3 раза с 1x PBS.
- Добавьте 1 мл первичного антитела кролика anti-Caspase-3 к 1 мл 1% NGS в PBS (1:1000 разбавления). Аспирировать PBS из блюда и заменить первичным раствором антитела. Поместите на шейкер и инкубировать в течение 1,5 ч на RT.
- Промыть блюдо 3 раза с 1x PBS.
- Добавьте 1 МЛ козьего антиплиха AlexaFluor 488 вторичных антител к 1 мл 1% NGS в PBS (1:1000 разбавления). Аспират PBS из блюда и заменить вторичным раствором антитела. Поместите на шейкер и инкубировать в течение 1 ч на RT. Перемещение вперед защитить образцы от света.
- Промыть блюдо 3 раза с 1x PBS.
- Повторите шаги 8.7 - 8.10, но используя куриное анти-TH первичное антитело (1:1000) в шаге 8.7 и коза anti-chicken AlexaFluor 594 вторичное антитело (1:1000) в шаге 8.9.
- После окончательного полоскания PBS поместите 30 МКЛ монтажной среды на слайд микроскопа. Используя типсы захватить крышку из 35 мм чашки Петри и место coverslip с клетками, обращенных вниз в монтажной среде. Обе крышки помещаются на одном слайде микроскопа, если поместить правильно. Поместите в сухую, темную область и дайте монтажной среде высохнуть на ночь.
9. Конфокальные изображения иммуноогромных культур
- Конфокальные изображения
- Запустите программное обеспечение для визуализации. Поместите образец на сцену микроскопа.
- С помощью микроскопа окуляры, используя 20x увеличение цели и эпифлуоресцентный свет с фильтром TRITC, сосредоточить образец и поиск тела клетки TH.
- После обнаружения тела клетки TH, центр его в поле зрения, а затем перейти к 60x увеличение цели.
- Выберите AlexaFluor 488 и AlexaFluor 594 красителей в окне "список красителей".
- Как и в случае с живой визуализацией, начните с низкого уровня HV, усиления, смещения и настройки мощности лазера для предотвращения фотоотверга. Используйте опцию сканирования "фокус x2" для оценки флуоресцентной интенсивности каждого канала и соответствующей настройки. Поскольку позже эти изображения будут количественно определены по флуоресцентной интенсивности, необходимо поддерживать согласованные настройки изображения во всех областях зрения. Таким образом, лучше всего взглянуть на несколько примеров каждого состояния, чтобы получить представление о диапазоне флуоресцентной интенсивности в разных образцах.
- После того, как идеальные настройки изображения определены, выберите опцию сканирования "фокус x2" и перемести ячейку, интересную для ячейки, в центр поля зрения. Увеличьте цифровой зум до 3x с помощью ползунка "увеличить".
- Используя ручку фокусировки, найдите плоскость фокусировки с самой яркой флуоресценцией и захватите одно изображение XY плоскости. Сохраните изображение до конца.
- Переключитесь на цель увеличения в 20 раз для поиска другой ячейки TH. Повторите этот процесс до тех пор, пока из каждого состояния не будет отобрано нужное количество ячеек.
- Анализ изображений
- В панели инструментов ImageJ щелкните Анализируйте Установите измерения ивыберите коробки для области, интегрированной плотности и среднего серого значения.
- Откройте изображение в качестве гиперстака с каждым каналом, разделенным перетаскиванием и падением в панель инструментов ImageJ или выбором изображения через меню файлов.
- Используйте канал TH (594 нм), чтобы нарисовать ROIs вокруг тела клетки. Используя инструмент отслеживания полигонов в ImageJ, внимательно отслеживайте внешний край тела клетки. Там, где расстояние между клеточной мембраной и ядром клетки является самым маленьким, проследите прямую линию через цитозол к краю ядра, а затем внимательно следуйте контуру ядра, чтобы исключить его. Затем проследите прямую линию обратно к внешней мембране, граничащих с начальной линией как можно ближе, и продолжать следовать контуру тела клетки, пока рентабельность инвестиций не будет завершена.
- Использование сочетания клавиш "T" или использование пути меню панели инструментов Анализ Инструменты (ru) ROI Manager,откройте менеджера рентабельности инвестиций и добавьте рентабельность инвестиций, которая только что была привлечена к списку.
- Выберите окно канала caspase-3 (488 нм), а затем выберите добавленную рентабельность инвестиций в списке «ROI Manager».
- В окне ROI Manager выберите кнопку Измерения. Окно результатов будет отображаться с измерениями, установленными ранее. Скопировать их в электронную таблицу и повторить этот процесс для каждой ячейки.
Representative Results
После первоначального культивирования клеток, мы лечили VM культуры блюда на 14 DIV с 1 йл AAV hSyn-GCaMP6f и позволило в течение 5 дней вирусного выражения. В день визуализации HEPES буфер записи был подготовлен свежий. Мы использовали два условия; в одном условии 20 мкм глутамат применялся в течение 10 мин, в то время как в другом состоянии 5 мин из 10 МК NB'X применение предшествовало 10 мин совместного применения 10 МК NB'X и 20 МК глутамата. В обоих условиях мы наблюдали неоднородные и спонтанные изменения в флуоресценции GCaMP6f, которыеуказывают на спонтанные потоки Ca 2 , как показано на репрезентативных следах(рисунок 1A,B, Дополнительный фильм 1-2). Применение 20 глютамита 20 МК генерируется надежный и устойчивый Ca2 "ответ как в спонтанно активных и тихие нейроны (Рисунок 1A, Дополнительный фильм 1). Применение 10 МК NB'X снижение спонтанной активности, и частично заблокировали глутамат ответ (Рисунок 1B, Дополнительный фильм 2). Степень, в которой применение глутамата стимулировало ответ Ca2 в каждом состоянии, была количественно оценена с использованием области под кривой, пиковой амплитудой и задержкой ответа. Обе области под кривой и пик амплитуды были похожи как для глутамата и NB'X й глутамата обработанных условиях(рисунок 1C), в то время как задержка в ответ был значительно увеличен в NB'X и глутамат состояние (Рисунок 2A,B) . В дополнение к количественной ca2 "ответ на лечение глутамата, мы фиксированной и окрашенных образцов с анти-каспазы-3 антитела в качестве меры глутамата опосредованного апоптоза. Мы наблюдали диапазон активации каспазы-3 в условиях(рисунок 3A,B). Активация Каспаса-3 была количественно определена по области измерения и средняя интенсивность каспазы-3. По сравнению с необработанными контрольными клетками, средняя площадь клеток с активацией каспазы-3 при глутамате и условиях ХЗХ и глутамата имеет тенденцию кзначению (рисунок 3B). Средняя интенсивность каспазы-3 была значительно выше в условиях глутамата и НБЗХ и глутамата по сравнению с необработанными контролями(рисунок 3B). Вместе эти результаты демонстрируют высококонтентные рамки, в которых апоптоз нейронов может быть измерен путемколичественной оценки реакций Ca 2 на возбудитоксические агенты и затем с анализом ниже по течению апоптотических событий, таких как активация каспасы-3 в том же наборе культур.
Рисунок 1: Культурные вентрал-мезенцефалическиенейроны отображают спонтанную активность Ca 2 и надежно стимулируются применением глутамата. (A) Представитель следы спонтанной ca2 "активности в VM нейронов и их ответ на 20 МК глутамата применения. (B) Репрезентативные следыспонтанной активности Ca 2 "в нейронах VM и их ответ на 10 МК NB'X и 20 МК глутамата применения. (C)Данные о населении, показывающие область под кривой и пиковой амплитудой следов Ca2. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Блокада АМПАР с помощью NB-X задерживает реакцию на применение глутамата в культурных брюшной мезенцефалических нейронах. (A) Представитель Ca2 "следы глутамата (серый) и NB'X й глутамат (синий) вызвал ответы. СредниеCa 2 "следы глутамата (черный) и NB'X й глутамат (красный) показаны накладной. (B) Данные о населении, показывающие задержку в ответ на глутамат и NB'X й глутамат вызвали ответы. Процентное изменение между глутамата и NB'X и глутамата условия отображается в правой панели. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Применение глутамата увеличивает экспрессию каспазы-3 в тирозин гидроксилазы (TH) положительных вентраловых мезенцефалических нейронов. (A) Представитель конфокальные изображения VM культур иммунотеных для каспазы-3 (зеленый) и TH (красный), шкала бар No 10 мкм . (B) Данные о населении, показывающие DA нейронной области и среднее серое значение экспрессии каспазы-3 в каждом состоянии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Дополнительный фильм 1: Спонтанная деятельность Ca2 "и ответ на глутамат приложения.
Спонтанные потоки Ca 2 "в присутствии буфера записи HEPES (0-300 с), а затем применение 20 мкм глутамата (301-600 с). Масштабная планка 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.
Дополнительный фильм 2: Спонтанная активность Ca2 "и ответ на NB'X и глутамат приложения.
Спонтанные потоки Ca2 "в присутствии буфера записи HEPES (0-300 с), а затем применение 10 МК NB'X (301-600 с), и 10 МК NB'X 20 ЗМ глутамат (601-900 с). Масштабная планка 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.
Discussion
Мы описываем долгосрочную первичную систему начальной брюшной мезенцефалии (VM) клеточной культуры для анализа высокого содержания апоптоза глутамата в нейронах. Исследования использовали первичные среднебрайн дофаминергические культуры, чтобы прояснить экзцитотоксичные механизмы в контексте моделей PD11,12. В этом исследовании мы используем комбинаторный подход с использованием генетически закодированных индикаторов кальция (GECIs) для измерения активности Ca2 и далее связываем эту активность с молекулярными изменениями ниже по течению, такими как инициирование апоптотических сигнальных каскадов4. Метод имеет множество преимуществ перед другими аналогичными системами клеточной культуры. Поскольку у нас есть особый интерес к excitotoxicity в контексте болезни Паркинсона, использование первичных культур VM клеток является идеальным. Используя различные методы перемещения поля, такие как сетчатые крышки или моторизованной стадии микроскопа XY в сочетании с TH иммуностимуляторов, мы можем непосредственно изучить клеточный тип конкретных эффектов глутамата опосредованного апоптоза в брюшной середине нейронов. Кроме того, 3-недельная модель клеточной культуры позволяет нейронам развивать их полный, зрелый молекулярный профиль, отражающий взрослые нейроны DA9. Предыдущие методы в основном сосредоточены на молекулярных изменений после глутамата опосредованнойвозбудимости 13,14. Модель уникальна своей способностью соотносить острые изменения в физиологии нейронов с молекулярными событиями ниже по течению в выявленных типах клеток. Одним из ограничений первичной модели культуры является то, что метод вскрытия захватывает весь брюшной мидбрайн, в том числе DA и ГАМК нейронов, а также нейронов из SNc и VTA. Фактические данные в настоящее время свидетельствует о том, что DA нейронов SNc имеют селективную уязвимость к кальцию и возможной смерти клеток по сравнению с DA нейронов соседних VTA15. К сожалению, дифференциация SNc от VTA нейронов в эмбриональных культурах оказалось трудно с несколькими анатомическими ориентирами, чтобы определить эти структуры в эмбриональном мозге.
Мы демонстрируем, что метод первичной культуры позволяет количественно оценить неоднородную спонтанную активность Ca2 (рисунок 1). Таким образом, это идеальная модель системы клеточной культуры для изучения тонально активных клеток, таких как кардиостимуляторы дофаминергических нейронов среднего мозга, неокортические нейроны, и ГАМК-нейронов супрахиазматического ядра (SCN)16,17. В большинстве применений, Ca2 "изображения не достигает того же временного разрешения, как электрофизиология. Таким образом, вполне вероятно, что одно событие Ca2 "аналогична всплеску нейронных потенциалов действия. Это может быть истолковано как означает, что Ca2 "изображение позволяет относительно точные измерения аномальной разрыва активности в клетках pacemaking и, следовательно, подходит для высокого содержания экрана Ca2" -опосредованное возбуждение смерти клеток.
Для достижения и поддержанияспонтанной активности Ca 2 важно рассмотреть два ключевых момента в протоколе. Во-первых, это плотность покрытия клеток после вскрытия. Для первичных нейронов VM, предыдущие исследования использовали около 100000 клеток /см 29,10. Мы адаптировали протокол к пластине плотность 200000 клеток / см2, что создает неоднородный диапазон спонтанной активности и увеличивает количество дофаминергических нейронов VM присутствует на каждом coverslip. Поскольку различные нейроны кардиостимуляторов имеютразличные свойства стрельбы 16, плотность покрытия должна быть настроена на клеточный тип изучается и оптимизирована для того, чтобы достичь идеального уровня спонтанной активности. Во-вторых, инкубацио время после вирусной инфекции AAVs. Как и плотность покрытия, это будет зависеть от конкретного контекста исследовательского вопроса и типа используемого AAV. Для конкретных AAV используется здесь, 5 дней инкубации после вирусной инфекции идеально подходит для достижения желаемого уровня экспрессии белка, что позволяет для динамических изменений в флуоресценции GCaMP для того, чтобы записать Ca2 "активности. Многие факторы определяют, насколько быстро и эффективно AAV будет выражать свой груз, большая часть которого выходит за рамки данного метода, но вкратце важно учитывать промоутерскую активность и скорость созревания и складки грузового белка.
Еще одним преимуществом метода является то, что он обеспечивает значительную гибкость в формате, векторах выражения, использовании оборудования для визуализации и спектре научных вопросов, которые могут быть решены. Кроме того, метод позволяет изучать широкий спектр конкретных вопросов, которые окружают глутамат-опосредованную возбудимость в PD, и другие модели дисфункции нервной системы. Например, глутамат-опосредованная возбудимость включает в себя несколько рецепторов и сигнальные каскады5. С помощью метода, и, как попродемонстрировано с блокатором AMPAR, NB'X на рисунке 1, можно вскрыть конкретные компоненты возбудимой реакции глутамата на физиологическом и молекулярном уровне. Предположительно, аналогичный подход с использованием ингибиторов систем второго посланника может быть использован для определения их вклада в возбуждение. Кроме того, ААВ, используемые здесь, могут быть адаптированы для выражения ГЕКИ с клеточными промоутерами или оптогенетическими датчиками, которые могут быть использованы для измерения других параметров, таких как высвобождение нейромедиатора.
Помимо первичных эмбриональных вскрытий и конфокальной визуализации, большая часть протокола использует базовые лабораторные навыки, которые не требуют специальной подготовки. Таким образом, ограничения модели включают сложность метода эмбрионального вскрытия, продолжительность времени, в течение которого клетки должны быть отучены для достижения зрелости, и доступ к конфокальному микроскопу или аналогичному аппарату визуализации. Многие преимущества и гибкость метода перевешивают эти ограничения, что делает это идеальной моделью для изучения роли глутамата опосредовано excitotoxicity в расстройствах нервной системы. Наконец, эта модель может быть эффективным инструментом для проверки новых соединений для анти-апоптотических эффектов и их способность сохранять здоровье нейронов DA.
Disclosures
Авторов нечего раскрывать.
Acknowledgments
Поддерживается грантами Американской ассоциации болезни Паркинсона (APDA) и NIH R01NS115809-01 для RS. Мы благодарим Техасский институт геномной медицины (TIGM) за предоставление время беременных мышей для создания первичных дофаминергических культур.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Formalin/PBS | VWR | 100496-506 | |
| 10X NA 0.3 water-immersion objective | Olympus | UMPLFLN10XW | |
| 12 mm circular cover glass No. 1 | Phenix Research Products | MS20-121 | |
| 20X NA 0.85 oil-immersion objective | Olympus | UPLSAPO20XO | |
| 35 mm uncoated plastic cell culture dishes | VWR | 25382-348 | |
| 40X NA 0.3 water-immersion objective | Olympus | LUMPLFLN40XW | |
| 60X NA 1.35 oil-immersion objective | Olympus | UPLSAPO60XO | |
| Ampicillin (sodium) | Gold Bio | A-301-25 | |
| B-27 supplement | ThermoFisher | 17504044 | 50x stock |
| Binolcular Microscope | Kent Scientific | KSCXTS-1121 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7030 | |
| Calcium Chloride (CaCl2), anhydrous | Sigma-Aldrich | 746495 | |
| Chicken polyclonal anti-Tyrosine Hydroxylase | Abcam | ab76442 | |
| Deoxyribonuclease I (DNase) | Sigma-Aldrich | DN25 | |
| D-glucose, andydrous | Sigma-Aldrich | RDD016 | |
| DMEM + GlutaMAX medium | ThermoFisher | 10569010 | 500 mL |
| Equine serum | ThermoFisher | 26050088 | heat-inactivated |
| Fiber Optic Illuminator, 100V | Kent Scientific | KSC5410 | |
| Filter System, PES 22UM 250ML | VWR | 28199-764 | |
| Fluoview 1000 confocal microscope | Olympus | ||
| Fluoview 1200 confocal microscope | Olympus | ||
| GlutaMAX supplement | ThermoFisher | 35050061 | |
| Goat polyclonal anti-chicken Alexa Fluor 594 | Abcam | ab150176 | |
| Goat polyclonal anti-rabbit Alexa Fluor 594 | Abcam | ab150077 | |
| Hanks-balanced Salt Solution (HBSS) 1x | ThermoFisher | 14175095 | 500 mL |
| HEPES | VWR | 101170-478 | |
| HeraCell 150 CO2 incubator | Heraeus (ThermoFisher) | ||
| ImageJ v1.52e | NIH | ||
| IRIS-Fine Scissors (Round Type)-S/S Str/31*8mm/13cm | RWD | S12014-13 | |
| Kanamycin monosulfate | Gold Bio | K-120-25 | |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| L-Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A7506 | |
| L-glutamic acid | VWR | 97061-634 | |
| Magnesium Chloride (MgCl2), andydrous | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| MPII Mini-Peristaltic Pump, 115/230 VAC, 50/60 Hz | Harvard Apparatus | 70-2027 | |
| MULLER Micro Forceps-Str, 0.15mm Tips, 11cm | RWD | F11014-11 | |
| NBQX | Hello Bio | HB0443 | |
| Neurobasal medium | ThermoFisher | 21103049 | 500 mL |
| Normal goat serum (NGS) | Abcam | ab7481 | |
| Origin 2020 | OriginLab | ||
| pAAV.Syn.GCaMP6f.WPRE.SV40 | Addgene | 100837-AAV1 | Titer: 1.00E+13 gc/ml |
| Papain | Worthington Biomedical Corporation | LS003126 | |
| Penicillin streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | 10,000 U/mL |
| Phosphate-buffered saline (PBS) 1x | ThermoFisher | 10010049 | 500 mL |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P4832 | |
| Poly-L-ornithine | Sigma-Aldrich | P4957 | |
| Potassium Chloride (KCl), anhydrous | Sigma-Aldrich | 746436 | |
| Pump Head Tubing Pieces For MPII | Harvard Apparatus | 55-4148 | |
| Rabbit monoclonal anti-caspase-3 | Abcam | ab32351 | |
| Sodium Chloride (NaCl), anhydrous | Sigma-Aldrich | 746398 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | BioXtra, ≥99.5% (GC) |
| Time-pregnant female C57BL/6 mice | Texas A&M Institue for Genomic Medicine | ||
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | 500 mL |
| Wide-bore blue pipette tips P1000 | VWR | 83007-380 |
References
- Marras, C., et al. Prevalence of Parkinson's disease across North America. NPJ Parkinson's Disease. 4, 21 (2018).
- Poewe, W., et al.
- Mehta, A., Prabhakar, M., Kumar, P., Deshmukh, R., Sharma, P. L. Excitotoxicity: bridge to various triggers in neurodegenerative disorders. European Journal of Pharmacology. 698 (1-3), 6-18 (2013).
- Ambrosi, G., Cerri, S., Blandini, F. A further update on the role of excitotoxicity in the pathogenesis of Parkinson's disease. Journal of Neural Transmission (Vienna). 121 (8), 849-859 (2014).
- Dong, X. X., Wang, Y., Qin, Z. H. Molecular mechanisms of excitotoxicity and their relevance to pathogenesis of neurodegenerative diseases. Acta Pharmaceutica Sinica B. 30 (4), 379-387 (2009).
- Vieira, M., et al. Excitotoxicity through Ca2+-permeable AMPA receptors requires Ca2+-dependent JNK activation. Neurobiology of Disease. 40 (3), 645-655 (2010).
- Sebe, J. Y., et al. Ca(2+)-Permeable AMPARs Mediate Glutamatergic Transmission and Excitotoxic Damage at the Hair Cell Ribbon Synapse. Journal of Neuroscience. 37 (25), 6162-6175 (2017).
- Brickley, S. G., Farrant, M., Swanson, G. T., Cull-Candy, S. G. CNQX increases GABA-mediated synaptic transmission in the cerebellum by an AMPA/kainate receptor-independent mechanism. Neuropharmacology. 41 (6), 730-736 (2001).
- Srinivasan, R., et al. Smoking-Relevant Nicotine Concentration Attenuates the Unfolded Protein Response in Dopaminergic Neurons. Journal of Neuroscience. 36 (1), 65-79 (2016).
- Henley, B. M., et al. Reliable Identification of Living Dopaminergic Neurons in Midbrain Cultures Using RNA Sequencing and TH-promoter-driven eGFP Expression. Journal of Visualized Experiments. (120), e54981 (2017).
- Douhou, A., Troadec, J. D., Ruberg, M., Raisman-Vozari, R., Michel, P. P. Survival promotion of mesencephalic dopaminergic neurons by depolarizing concentrations of K+ requires concurrent inactivation of NMDA or AMPA/kainate receptors. Journal of Neurochemistry. 78 (1), 163-174 (2001).
- Lavaur, J., et al. The noble gas xenon provides protection and trophic stimulation to midbrain dopamine neurons. Journal of Neurochemistry. 142 (1), 14-28 (2017).
- Kritis, A. A., Stamoula, E. G., Paniskaki, K. A., Vavilis, T. D. Researching glutamate - induced cytotoxicity in different cell lines: a comparative/collective analysis/study. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 91 (2015).
- Gupta, K., Hardingham, G. E., Chandran, S. NMDA receptor-dependent glutamate excitotoxicity in human embryonic stem cell-derived neurons. Neuroscience Letters. 543, 95-100 (2013).
- Surmeier, D. J., Obeso, J. A., Halliday, G. M. Selective neuronal vulnerability in Parkinson disease. Nature Reviews Neuroscience. 18 (2), 101-113 (2017).
- Ramirez, J. M., Tryba, A. K., Pena, F. Pacemaker neurons and neuronal networks: an integrative view. Current Opinion in Neurobiology. 14 (6), 665-674 (2004).
- Guzman, J. N., Sanchez-Padilla, J., Chan, C. S., Surmeier, D. J. Robust pacemaking in substantia nigra dopaminergic neurons. Journal of Neuroscience. 29 (35), 11011-11019 (2009).
