Summary

Électrorétinogramme couplé direct (DC-ERG) pour l’enregistrement des réponses électriques évoquées par la lumière de l’épithélium pigmentaire rétinien de souris

Published: July 14, 2020
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Summary

Ici, nous présentons une méthode pour enregistrer les réponses électriques évoquées par la lumière de l’épithélium pigmentaire rétinien (EPR) chez la souris en utilisant une technique connue sous le nom de DC-ERGs décrite pour la première fois par Marmorstein, Peachey et ses collègues au début des années 2000.

Abstract

L’épithélium pigmentaire rétinien (EPR) est un monocouche spécialisé de cellules stratégiquement situées entre la rétine et les choriocapillaris qui maintiennent la santé globale et l’intégrité structurale des photorécepteurs. L’EPR est polarisée, présente des récepteurs ou des canaux situés de façon apique et basique, et effectue le transport vectoriel de l’eau, des ions, des métabolites et sécrète plusieurs cytokines.

Des mesures in vivo non invasives de la fonction RPE peuvent être effectuées à l’aide d’ERGs couplés directs (DC-ERGs). La méthodologie derrière le DC-ERG a été mise au point par Marmorstein, Peachey et ses collègues à l’aide d’un système d’enregistrement de stimulation sur mesure et a ensuite démontré l’utilisation d’un système disponible dans le commerce. La technique DC-ERG utilise des capillaires en verre remplis de la solution de sel tamponné (HBSS) de Hank pour mesurer les réponses électriques plus lentes de l’EPR obtenues par les changements de concentration évoqués par la lumière dans l’espace sous-réceptif en raison de l’activité des photorécepteurs. Le stimulus léger prolongé et la longueur de l’enregistrement DC-ERG le rendent vulnérable à la dérive et au bruit, ce qui entraîne un faible rendement d’enregistrements utilisables. Ici, nous présentons une méthode rapide et fiable pour améliorer la stabilité des enregistrements tout en réduisant le bruit en utilisant la pression sous vide pour réduire/éliminer les bulles qui résultent de l’outgassing du HBSS et du support d’électrode. En outre, les artefacts de la ligne électrique sont atténués à l’aide d’un régulateur de tension / conditionneur de puissance. Nous incluons les protocoles de stimulation lumineuse nécessaires pour un système ERG disponible dans le commerce ainsi que des scripts pour l’analyse des composants DC-ERG : c-wave, oscillation rapide, pic lumineux et réponse éteinte. En raison de la facilité améliorée des enregistrements et du flux de travail rapide d’analyse, ce protocole simplifié est particulièrement utile en mesurant des changements relatifs à l’âge dans la fonction de RPE, la progression de la maladie, et dans l’évaluation de l’intervention pharmacologique.

Introduction

L’épithélium pigmentaire rétinien (EPR) est un monocouche de cellules spécialisées qui tapissent le segment postérieur de l’œil et exercent des fonctions critiques pour maintenir l’homéostasierétinienne 1. Le RPE prend en charge les photorécepteurs en régénérant leur pigment visuel photon-capture dans un processus appelé le cycle visuel2, en participant à la phagocytose diurne des pointes du segment extérieurhangar 3, et dans le transport des nutriments et des produits métaboliques entre les photorécepteurs et les choriocapillaris4,5. Les anomalies dans la fonction de RPE sous-tendent de nombreuses maladies rétiniennes humaines, telles que la dégénérescence maculaire relative à l’âge6,l’amaurosis congénital de Leber7,8 et la dystrophie maculaire vitelliforme meilleure9. Comme les tissus oculaires des donneurs sont souvent difficiles à obtenir uniquement à des fins de recherche, les modèles animaux avec des modifications génétiques peuvent fournir une autre façon d’étudier le développement des maladiesrétiniennes 10,11. En outre, l’émergence et l’application de la technologie CRISPR cas9 permettent maintenant des introductions génomiques (knock-in) ou des suppressions (knock-out) dans un processus simple en une étape dépassant les limites des technologies antérieures de ciblagegénétique 12. L’explosion de la disponibilité de nouveaux modèles muraux13 nécessite un protocole d’enregistrement plus efficace pour évaluer non invasivement la fonction RPE.

La mesure des réponses électriques évoquées par la lumière de l’EPR peut être obtenue à l’aide d’une technique d’électrorétogramme couplé directement (DC-ERG). Lorsqu’il est utilisé en combinaison avec des enregistrements ERG conventionnels qui mesurent le photorécepteur (a-wave) et bipolaire (b-onde) réponsescellulaires 14, le DC-ERG peut définir comment les propriétés de réponse de l’EPR changer avec la dégénérescencerétinienne 15,16,17 ou si le dysfonctionnement RPE précède la perte de photorécepteur. Ce protocole décrit une méthode adaptée des travaux de Marmorstein, Peachey et ses collègues qui ont développé pour la première fois la technique DC-ERG16,18,19,20 et améliore la reproductibilité et la facilité d’utilisation.

L’enregistrement DC-ERG est difficile à réaliser en raison du long temps d’acquisition (9 min) pendant lequel toute interruption ou introduction du bruit peut compliquer l’interprétation des données. L’avantage de cette nouvelle méthode est que les lignes de base atteignent un état stable dans un laps de temps plus court réduisant la probabilité que l’animal se réveille prématurément de l’anesthésie et est moins enclin à la formation de bulles dans les électrodes capillaires.

Protocol

Ce protocole fait suite aux lignes directrices sur les soins aux animaux décrites dans le protocole d’étude des animaux approuvé par le Comité des soins et de l’utilisation des animaux de l’Institut national de l’œil. 1. Importation de protocoles de stimulation lumineuse pour DC-ERG REMARQUE : Suivez les instructions ci-dessous pour importer les protocoles de stimulation lumineuse du DC-ERG dans le logiciel du système ERG (Tableau des matériaux<…

Representative Results

La figure 2 est un ensemble de données d’échantillons provenant de souris miR-204 ko/ko cre/+ (KO conditionnelle) et sauvages (WT). MiR-204 ko/ko cre/+ sont des souris avec un KO conditionnel de microARN 204 dans l’épithélium pigmentaire rétinien. Ces souris sont générées en croisant des souris miR-204 floxées (produites par NEIGEF)22 avec des souris VMD2-CRE23. MiR-204 est fortement exprimé dans l’EPR où il régule l’express…

Discussion

Étapes critiques

Un bon enregistrement DC-ERG nécessite des électrodes stables qui sont exemptes de bulles qui créent des artefacts et des dérives indésirables car elles sont extrêmement sensibles au dégazage et aux changements de température. Il est essentiel qu’une ligne de base stable soit atteinte lorsque les électrodes sont placées dans la solution de bain HBSS avant d’aller de l’avant avec l’enregistrement de la souris. Les petites bulles ont tendance …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été soutenu par des fonds intra-muros nei. Les auteurs reconnaissent sincèrement le Dr Sheldon Miller pour ses conseils scientifiques, ses conseils techniques et son expertise en physiologie et en maladie de l’EPR. Les auteurs remercient Megan Kopera et le personnel de soins aux animaux pour la gestion des colonies de souris, ainsi que le Dr Tarun Bansal, Raymond Zhou et Yuan Wang pour leur soutien technique.

Materials

Ag/AgCl (mouth) Electrode WPI Inc EP1 Mouth reference electrode for mouse
Ceramic Tile Sutter Instrument CTS Used to cut the glass capillary tube to an appropriate size
Cotton Tipped Cleaning Stick Puritan Medical Products 867-WC No Glue To be used as a spacer to improve the fit of the electrode holder assembly
Electroretinogram (ERG) System Diagnosys LLC E3 System Visual electrophysiology system to diagnose ophthalmic conditions in vision research and drug trials
Bunsen Burner Argos Technologies BW20002460 Or equivlaent to shape glass under flame
Glass Capillary Tube (1.5 mm) Sutter Instruments BF150-75 For filling with HBSS and making contact to the cornea
Hank’s Buffered Salt Solution (HBSS) Thermo Fisher Scientific Inc 14175-095 Commercially available. Maintain at RT
In-Line Filter Whatman 6722-5001 To protect vacuum pump from aerosols
Low Noise Cable for Microelectrode Holders WPI Inc 5372 Suggested for improving the length and placement of the cables and electrode holder assemblies
Magnetic Ball Joint WPI Inc 500871 For magnetically positioning the electrode holder assembly on the stage
MatLab Mathworks MatLab: For editing the analysis software
Matlab Curvefit Toolbox Mathworks Toolbox for MatLab (only required for editing the analysis software)
MatLab Compiler Mathworks Toolbox for MatLab (only required for editing and re-releasing the analysis software)
MatLab Runtime version 9.5 Mathworks R2018b (9.5) Required to run the analysis software: https://www.mathworks.com/products/compiler/matlab-runtime.html
Microelectrode Holders (45 degrees) WPI Inc MEH345-15 For holding the capillaries
Needle (25 ga) Covidien 8881250313 For filling the capillary tubes with HBSS
needle (ground) electrode Rhythmlink 13mm – one elctrode Subdermal needle electrode (ground) for mouse (13mm long, 0.4mm diameter needle, 1.5m leadwire)
Regulator/Power Conditioner Furman P-1800 Or equivalent to remove DC-offset from noise introduced through power line
Syringe (12 mL) Monoject 1181200777 For filling the capillary tubes with HBSS
T-clip Cole-Parmer 06852-20 For electrode holder assembly
Vacuum Desiccator Bel-Art 420120000 Clear polycarbonate bottom & cover
Pharmacological treatment
Lubricant eye gel Alcon 0078-0429-47 Helps lubricates corneal surface and maintain electrical contact with capillary electrodes
Phenylephrine Hydrochloride 2.5% Akorn 17478-201-15 Short acting mydriatic eye drops (for pupil dilation)
Proparacaine Hydrochloride 0.5% Akorn 17478-263-12 Local anesthetic for ophthalmic instillation
Tropicamide 0.5% Akorn 17478-101-12 Short acting mydriatic eye drops (for pupil dilation)
Xylazine AnaSed sc-362949Rx Analgesic and muscle relaxant
Zetamine (Ketamine HCl) VetOne 501072 Anesthetic for intramuscular injections

References

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Cite This Article
Miyagishima, K. J., Zhang, C., Malechka, V. V., Bharti, K., Li, W. Direct-Coupled Electroretinogram (DC-ERG) for Recording the Light-Evoked Electrical Responses of the Mouse Retinal Pigment Epithelium. J. Vis. Exp. (161), e61491, doi:10.3791/61491 (2020).

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