Summary
Qui descriviamo una forte cromatografia liquida ad alte prestazioni di [3H]-piantineetichettate myo-inositol che è un metodo altamente sensibile per rilevare e quantificare i polifosfati inositolo nelle piante.
Abstract
Gli esteri di fosfato di mio-inositol, chiamato anche fosfati inositol (InsPs), sono una classe di regolatori cellulari che giocano un ruolo importante nella fisiologia vegetale. myo A causa della loro carica negativa, della bassa abbondanza e della suscettibilità alle attività idrolitiche, la rilevazione e la quantificazione di queste molecole è difficile. Ciò vale in particolare per le forme altamente fosforilate contenenti legami diofospho "ad alta energia", anche denominati pirofosfati inositolo (PP-InsPs). A causa della sua elevata sensibilità, il forte scambio di anioni a liquido ad alte prestazioni (SAX-HPLC) di piante etichettate con [3H]-myo-inositol è attualmente il metodo di scelta per analizzare queste molecole. Utilizzando [3H]-myo-inositol alle piantine di piante radiolabel, varie specie InsP, tra cui diversi iomeri non enantiomerici, possono essere rilevate e discriminate con alta sensibilità. Qui viene descritta la configurazione di un sistema SAX-HPLC adatto, nonché il flusso di lavoro completo dalla coltivazione delle piante, l'etichettatura radio e l'estrazione InsP all'esecuzione SAX-HPLC e alla successiva analisi dei dati. Il protocollo qui presentato consente la discriminazione e la quantificazione di varie specie InsP, tra cui diversi iromeri non enantiomerici e dei PP-InsSp, InsP7 e InsP8, e può essere facilmente adattato ad altre specie vegetali. Ad esempio, vengono eseguite e discusse le analisi SAX-HPLC delle piantine Arabidopsis thaliana e Lotus japonicus. Il metodo qui descritto rappresenta uno strumento promettente per comprendere meglio i ruoli biologici degli InsP nelle piante.
Introduction
Quasi quattro decenni fa, i fosfati inositol (InsPs) sono emersi come molecole di segnalazione, dopo che Ins(1,4,5)P3 (InsP3) è stato identificato come un secondo messaggero che attiva il rilascio mediato dal recettore di Ca2 nelle celluleanimali 1,2. Ad oggi, nessun recettore InsP3 (IP3-R) è stato identificato nelle piante, il che mette in discussione un ruolo di segnalazione diretta per InsP3 nelle cellule vegetali3. Indipendentemente da ciò, InsP3 funge da precursore per altri InsP coinvolti in diversi processi di sviluppo dell'impianto, tra cui la regolazione di specifici percorsi disegnalazione 3,4,5,6,7,8. Ad esempio, l'InsP3 può essere ulteriormente fosforilato all'InsP6, noto anche come "acido fitico", che rappresenta una fonte importante di fosfato, mio-inositoloe cations, ed è stato dimostrato di svolgere ruoli chiave nella difesa delle piante contro patogeni, esportazione di mRNA e omeostasi fosfato5,9,10,11,12.
I pirofosfati inositolo (PP-InsPs) sono una classe di InsPs che contengono almeno un legame di fosfo ad alta energia, inizialmente identificato nelle cellule animali, nelle amebe e nel lievito, dove svolgono ruoli critici in vari processi cellulari13,14,15. Nonostante il lavoro seminale sui PP-InsPs nellepiante 16,17,18,19,20,21,,22,23,,24,25,,26, le funzioni biologiche e l'identità isomera di queste molecole rimangono ancora enigmatiche in gran parte. Nella pianta modello Arabidopsis thaliana, cellular InsP8 è stato proposto di regolare le difese contro gli erbivori insetti e funghi necrotrofici attraverso il rilevamento di coincidenza di InsP8 e jasmonato attivo dal recettore ASK1-COI1-JA. Inoltre, sono stati proposti ruoli di InsP8 e di altri PP-InsPs nell'omeostasi energetica e nel rilevamento dei nutrienti, oltre all'omeostasi del fosfato17,23,24,25,26.
Indipendentemente dal sistema biologico impiegato, una delle principali sfide metodologiche nello studio degli InsP è stata la rilevazione affidabile e la quantificazione precisa di queste molecole. Sono stati utilizzati metodi basati sulla spettrometria di massa per rilevare gli Insp, inclusi i PP-InsPs, dagli estratti cellulari. Tuttavia, tali studi non sono riusciti a differenziare gli iomersdistinti 26,27. Un altro approccio per analizzare gli InsPs utilizza il pull-down degli InsPs dai llisati cellulari utilizzando perline TiO2, seguito dall'elettroforesi gel poliacrilammide (PAGE) degli InsPs ellus. Gli InsPs possono quindi essere macchiati da toluidine blue o DAPI24,28,29. Tuttavia, finora non è possibile rilevare in modo affidabile gli InsP inferiori all'InsP5 dagli estratti vegetali utilizzando questo metodo. Recentemente, un metodo che utilizza [13C]-myo-inositol per l'analisi della risonanza magnetica nucleare (NMR) di InsPs è stato pubblicato come alternativa al forte scambio di anioni cromatografia liquida ad alte prestazioni (SAX-HPLC)30. Questa tecnica è stata segnalata per ottenere una sensibilità simile a SAX-HPLC e per consentire il rilevamento di 5-InsP7, così come la discriminazione di diversi iomeri InsP5 non enantiomerici da estratti cellulari. Tuttavia, l'implementazione del metodo basato su NMR richiede una sintesi chimica e non disponibile in modo commercial [13C]-myo-inositol. Pertanto, il metodo impiegato nella maggior parte dei casi è radiolabeling campioni con [3H]-myo-inositol, seguito da SAX-HPLC31,32,33. Questa tecnica si basa sull'assorbimento di mio-inositolradioattivo nell'impianto e sulla sua conversione in diversi InsP dall'attività combinata di chinasi cellulari e fosfasi.
Gli InsP con etichetta[3H] vengono quindi estratti e frazionati con SAX-HPLC. A causa della loro carica negativa, gli InsP interagiscono fortemente con la fase stazionaria carica positiva della colonna SAX-HPLC e possono essere eluzionati con un gradiente tampone contenente concentrazioni crescenti di fosfati per sovrapporsi agli InsPs dalla colonna. I tempi di eluizione dipendono quindi dalla carica e dalla geometria delle specie InsP da separare. In assenza di colonne chirali, solo gli iromi non enantiomerici possono essere separati da questo protocollo. Tuttavia, gli standard radiolabeled possono essere utilizzati per assegnare la natura isomeric di un picco InsP specifico. Molteplici sforzi compiuti in passato da vari laboratori per generare standard etichettati e non etichettati con metodi (bio)chimici o per purificarli da varie cellule e organismi hanno contribuito ad assegnare picchi a determinate specie InsP, e anche per restringere l'identità isomeric delle singole specie InsP5,7,21,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43. Inoltre, la recente chiarimenta dei percorsi ezimatici che portano alla formazione di PP-InsPs nelle piante, nonché la scoperta di un effettore di tipo III batterico con una specifica attività 1-phytase, forniscono informazioni su come generare standard utili per queste analisi10,17,18,22,23.
Le frazioni risultanti possono essere misurate in un contatore di scintillazione liquida a causa β decadimento del trizio (3H). Con l'aumento dei tempi di etichettatura, viene raggiunto un equilibrio isotopico a stato stabile, dopo di che i profili InsP ottenuti devono rappresentare lo status InsPdell'impianto 31. Il principale vantaggio di questo protocollo rispetto ad altre tecniche disponibili è l'elevata sensibilità ottenuta dall'uso del precursore diretto per gli Insp e dalla misurazione di un segnale radioattivo.
SAX-HPLC di campioni estratti da [3H]-myo-inositol-labeled plants or other organisms is commonly used for the detection and quantification of InsP che vanno da specie InsP inferiori a PP-InsPs, che rappresentano uno strumento prezioso per comprendere meglio il metabolismo, la funzione e le modalità di azione degli InsP. Finora, questo metodo è anche la scelta più appropriata per i ricercatori con particolare interesse per le specie InsP inferiori. Mentre le basi di questa procedura, su cui si basa il protocollo qui descritto, sono state precedentemente descritte7,21,31,34, manca ancora un protocollo dettagliato su misura per l'analisi degli InsP derivati dalle piante e in particolare dei PP-Insp. Le pubblicazioni precedenti hanno segnalato difficoltà a rilevare in modo affidabile i PP-InsPs, in particolare InsP8, a causa di uno o più dei seguenti fattori: quantità relativamente basse di materiale vegetale, [3H]-myo-inositol con bassa attività specifica (> 20 Ci/mmol), utilizzo di buffer di estrazione che non sono basati su acido perclorico o sono meno concentrati di 1 M, diversi buffer neutralizzanti, così come gradienti sub-ottimali o rilevamento di [3H] con un rilevatore on-line. Rispetto a tali studi, il protocollo qui presentato è progettato per il rilevamento affidabile di PP-Inps7,21,34.
Qui presentiamo un flusso di lavoro dettagliato, a partire dalla configurazione delle attrezzature per piantare ed etichettatura, estrazione InsP e la SAX-HPLC correre se stesso. Anche se il metodo è stato ottimizzato per la pianta modello A. thaliana, può essere facilmente modificato per studiare altre specie vegetali, come mostrato qui con il primo profilo InsP riportato del modello legume Lotus japonicus. Anche se l'uso di una diversa specie vegetale potrebbe richiedere una certa ottimizzazione, prevediamo che questi saranno minori, rendendo questo protocollo un buon punto di partenza per ulteriori ricerche negli InsPs vegetali. Al fine di facilitare le possibili ottimizzazioni, indichiamo ogni fase all'interno del protocollo in cui sono possibili modifiche, così come tutti i passaggi critici che possono essere difficili quando si stabilisce il metodo per la prima volta. Inoltre, vediamo come i dati ottenuti da questo metodo possono essere utilizzati per la quantificazione di specifici InsP e come diversi campioni possono essere analizzati e confrontati.
Protocol
1. Configurazione del sistema HPLC
- Impostare un sistema composto da due pompe HPLC indipendenti (pompa binaria), una per ogni buffer. Entrambe le pompe devono essere controllate insieme tramite un computer con il rispettivo software o avendo una pompa master. Implementare un lavaggio della guarnizione a pistone per entrambe le pompe, sia tramite forza gravitazionale o attraverso una terza pompa a bassa pressione. Designare una pompa per il buffer A (pompa a termine) e una per il buffer B (chiamato pompa B).
NOTA: entrambi devono essere in grado di generare pressioni fino a 60 bar (6 MPa) e flussi di almeno 0,5 mL/min. - Collegare entrambe le pompe a un mixer dinamico.
- Collegare il miscelatore a una valvola di iniezione con un loop campione di capacità di almeno 1 mL.
- Collegare la valvola di iniezione alla colonna con un capillare tramite i corrispondenti raccordi di estremità.
- Collegare la colonna al raccoglitore di frazioni utilizzando un capillare con una lunghezza appropriata.
NOTA: questa descrizione si basa sul nostro sistema HPLC (vedi La Tabella dei Materiali), che richiede più passaggi manuali rispetto ai sistemi più recenti e sofisticati. Il nostro sistema consente un facile accesso e modifica di tutti i componenti. Pompe quaternari (con il gradiente binario descritto qui) può anche essere utilizzato e porterà a profili di eluizione e la qualità complessiva delle analisi simili a quelle ottenute con pompe binarie.
2. Preparazione di buffer, colonna e sistema HPLC
- Preparare i buffer per l'estrazione degli InsP solubili: buffer di estrazione (1 M HClO4)e buffer di neutralizzazione (1 M K2CO3). Preparare entrambi i tamponi con acqua deionizzata ultra-pura. Sono stabili a temperatura ambiente per diversi mesi. Immediatamente prima dell'estrazione, aggiungere EDTA a entrambe le soluzioni ad una concentrazione finale di 3 mM (ad esempio, da una soluzione di stock EDTA da 250 mM filtrata).
CAUTION: HClO4 (acido perclorico) è fortemente corrosivo. - Preparare i buffer per la corsa SAX-HPLC: buffer A (1 mM EDTA) e buffer B (1 mM EDTA, 1,3 M (NH4)2HPO4; pH 3.8 con H3PO4). Preparare entrambi utilizzando acqua deionizzata ultra-pura seguita da filtrazione sottovuoto con filtri a membrana di dimensioni poro 0,2 m. Questi sono stabili a temperatura ambiente per diversi mesi.
NOTA: EDTA deve essere incluso in tutti i buffer per evitare interazioni di cations con InsPs, che potrebbero comportare una carica InsP alterata o persino complessi di sale InsP insolubili. - Programmare il gradiente come segue: 0-u20122 min, 0% buffer B; 2-u20127 min, fino al 10% buffer B; 7-u201268 min, fino all'84% buffer B; 68-u201282 min, fino al 100% buffer B; 82-u2012100 min, 100% buffer B, 100-u2012101 min, fino a 0% buffer B; 101-u2012125 min, 0% buffer B. La velocità di flusso ottimale per questo gradiente è di 0,5 mL/min.
- Durante la corsa, raccogliere le frazioni ogni minuto, a partire dal minuto 1 al minuto 96. I restanti 30 minuti del gradiente servono a lavare la colonna e il sistema, e non devono essere raccolti per il conteggio scintillante.
- Se possibile, impostare la pressione massima raggiungibile prima dell'arresto di emergenza delle pompe HPLC su 80 bar (8 MPa). In questo modo si previene danni critici alla resina della colonna.
- Quando si utilizza una nuova colonna SAX HPLC, lavarla accuratamente thoroughly (>50 mL) con acqua filtrata ultra-pura deionizzata prima del primo utilizzo.
NOTA: Ciò garantirà la rimozione del metanolo contenuto, impedendo così la precipitazione del sale nelle fasi successive. Se possibile, utilizzare una pompa HPLC separata. Se questo non è disponibile, assicurarsi che l'HPLC ha lavato con acqua prima di lavare la colonna. La velocità di flusso non deve superare i 2 mL/min. Dopo il lavaggio, la colonna è pronta per l'analisi e, se gestita correttamente, può essere utilizzata per le esecuzioni di 20 u201240. Dopo di che, la risoluzione diminuirà successivamente. Il lavaggio prolungato con buffer A (>1 h) e l'esecuzione del passaggio 2.6 possono contribuire ad aumentare la durata della colonna. Se la riduzione della risoluzione persiste, la colonna deve essere scambiata. Il gradiente può essere regolato per aumentare la separazione tra specie di polifosfato inositolo specifico o per diminuire il runtime complessivo. L'utilizzo di sistemi HPLC diversi (con un volume vuoto diverso o un volume diverso dei capillari) influenzerà fortemente i tempi di conservazione. Inoltre, le modifiche alle colonne hanno effetti minori sui tempi di conservazione. - Eseguire una "corsa fittizia". Invece di un campione estratto, iniettare acqua filtrata ultra-pura delonizzata nel sistema HPLC ed eseguire il gradiente standard. Le frazioni non devono essere raccolte.
NOTA: il passaggio 2.6 è facoltativo. Tuttavia, deve essere eseguita se si verifica una delle seguenti situazioni: viene installata una nuova colonna; Il sistema HPLC è stato utilizzato in anticipo per un metodo diverso; Il sistema HPLC non è stato utilizzato per più di 3 giorni; Si è verificato un problema con l'esecuzione precedente.
3. Coltivazione ed etichettatura delle piante con [3H]-myo-inositol
NOTA: I seguenti passaggi devono essere eseguiti con componenti sterili e in condizioni sterili,mentre si indossano guanti per proteggere le mani dalla contaminazione con il radiolabel. I supporti vegetali, soprattutto se contenenti saccarosio, sono soggetti a contaminazione microbica.
- Sterilizzare i semi di thaliana con 1 mL dell'1,2% di ipoclorito di sodio per 3 min seguito da 1 mL del 70% di etanolo per 3 min. Quindi aggiungere 1 mL di etanolo al 100%, pipetta i semi con l'etanolo su una carta da filtro circolare e lasciare loro asciugare all'aria sotto un flusso di laminare su una panca pulita.
- Quando si utilizzano semi di L. japonicus, metterli in un mortaio e strofinare i semi con carta vetrata prima della sterilizzazione per garantire un tasso di germinazione sufficiente.
- Semina i semi di Arabidopsis in 1-2 file su piatti quadrati di Petri pieni di solidi mezzi di crescita costituiti da metà forza Murashige e Skoog (MS) soluzione di sale, 1% saccarosio, 0,7% gomma gellan in acqua deionizzata regolata al pH 5.7 con KOH e permette loro di stratificarsi per almeno 1 giorno a 4 gradi centigradi al buio.
- Per i semi di Loto, seminarli in 1 fila su piatti Petri quadrati pieni di solidi supporti di crescita costituiti da agar batteriologico dello 0,8% in acqua deionizzata e consentire loro di stratificarsi per almeno 3 giorni a 4 gradi centigradi al buio.
- Mettere le piastre verticalmente in un'incubatrice di crescita o in una camera climatica e lasciare che crescano per 10-12 giorni in condizioni di breve giornata (8 h di luce a 22 gradi centigradi, 16 h di buio a 20 gradi centigradi).
- Trasferire 10-20 piantine in un pozzo di una piastra di coltura a fondo piatto ben chiara riempita con 2 mL di soluzione di sale MS a metà forza integrata con 1% di saccarosio e regolata al pH 5.7.
- Aggiungere 45 Ci di [3H]-myo-inositol (30-80 Ci/mmol, sciolto nel 90% di etanolo) e mescolare con un leggero vortice. Coprire la piastra con il coperchio corrispondente e sigillarla con nastro chirurgico microporoso (ad esempio, micropore o nastro leucopore), ristrutturandolo nell'incubatore di crescita.
CAUTION: [3H] è un emettitore beta a bassa energia che può essere un rischio di radiazioni nocive quando viene inalato, ingerito o assorbito attraverso la pelle nuda. Indossare sempre i guanti quando si maneggia materiale radioattivo o attrezzature che hanno un contatto diretto o indiretto con materiale radioattivo. Seguire anche le norme locali per una gestione sicura delle sostanze radiochimiche (ad esempio, indossare indumenti protettivi aggiuntivi, l'uso di un dosimetro e le indagini sulle superfici per le contaminazioni su base regolare). - Dopo 5 giorni di etichettatura, rimuovere le piantine dal supporto e lavarle brevemente con acqua deionizzata. Asciugarli con carta assorbente e trasferirli in un tubo microcentrifuge da 1,5 mL. Non riempire troppo il tubo e non posizionare più di 100 mg di FW/tubo, che corrisponde a circa 10-u201220 piantine di 17 giorni.
NOTA: Un eccesso di materiale vegetale diluirà l'acido durante il processo di estrazione e diminuirà fortemente l'efficienza di estrazione.- Bloccare il tubo in azoto liquido e conservarlo a -80 gradi centigradi fino all'estrazione.
NOTA: I campioni possono essere conservati a -80 gradi centigradi per diverse settimane senza compromettere la qualità del campione. Le condizioni di crescita (media, luce, temperatura, tempo) possono essere modificate in base alle esigenze di un esperimento specifico o di specie vegetali. Tuttavia, si dovrebbe fare attenzione quando si dilui il [3H]-myo-inositol, al fine di garantire corre SAX-HPLC quantificabili di buona qualità. Pertanto, si consiglia di iniziare con le concentrazioni [3H]-myo-inositol qui indicate e ridurlo passo dopo l'utente, se lo si desidera. Durante il periodo di etichettatura, gli impianti possono essere sottoposti a diversi trattamenti (ad esempio, stress ambientali o agenti chimici) per valutare l'impatto di tali condizioni sugli InsP globali. Per raggiungere l'etichettatura a stato stabile, si consiglia di etichettare gli impianti per almeno 5 giorni.
- Bloccare il tubo in azoto liquido e conservarlo a -80 gradi centigradi fino all'estrazione.
4. Estrazione di InsPs solubili
NOTA: Conservare campioni e reagenti sul ghiaccio durante l'intero processo di estrazione. Indossare sempre guanti e occhiali protettivi a causa dell'alto rischio di contatto con materiale radioattivo, soprattutto durante la macinazione. Tutto ciò che entra in contatto con i campioni è considerato come scorie radioattive e deve essere smaltito secondo le norme locali per lo smaltimento sicuro del materiale radioattivo.
- Preparare le soluzioni di lavoro per il buffer di estrazione e neutralizzazione come nel passaggio 2.1. Ogni campione richiederà 600 L di buffer di estrazione e 400 L di buffer di neutralizzazione. Conservare i buffer sul ghiaccio.
- Prelevate i campioni dal congelatore a -80 gradi centigradi e conservateli in azoto liquido fino a un'ulteriore lavorazione. Macinare i campioni con un pestello a tubo microcentrifuge fino a quando non iniziano a scongelarsi e aggiungere 500 L di tampone di estrazione ghiacciato. Continuare a macinare fino a quando il campione è completamente omogeneizzato e la soluzione ha un colore verde profondo (se le foglie sono presenti nel campione).
- Centrifugare i campioni per 10 min a 4 gradi centigradi ≥ 18000 x g. Trasferire il supernatant in un nuovo tubo da 1,5 mL. Tenete a mente che i tubi utilizzati per l'estrazione sono considerati rifiuti radioattivi solidi e devono essere smaltiti di conseguenza.
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Aggiungere con attenzione 300 L di buffer di neutralizzazione all'estratto. La precipitazione delle proteine e il gorgogliamento inizierà immediatamente. Mescolare ruotando con una punta di pipetta dopo un minuto e attendere alcuni secondi prima di pipetting una piccola quantità (5 lL) su carta pH (idealmente gamma di pH 6–9). Il pH deve essere compreso tra pH 7 e 8 alla fine.
- Se necessario, aggiungere piccole quantità (in genere 10-20 L) del buffer di neutralizzazione o del buffer di estrazione fino a raggiungere il pH desiderato. Lasciare riposare i campioni sul ghiaccio per almeno 1 h con un coperchio aperto.
- Centrifugare i campioni per 10 min a 4 gradi centigradi ≥ 18.000 x g. Trasferire il supernatant in un nuovo tubo da 1,5 mL.
NOTA: I campioni possono essere utilizzati direttamente in una pista SAX-HPLC o conservati su ghiaccio (se utilizzati più tardi nello stesso giorno) o congelati in azoto liquido e conservati a -80 gradi centigradi per 2-u20124 settimane. Per garantire un'elevata riproducibilità e comparabilità, si raccomanda di congelare sempre i campioni in azoto liquido per 5 minuti, anche se saranno utilizzati direttamente in seguito. L'immagazzinamento a lungo termine dei campioni estratti a -80 gradi centigradi è possibile, purché i campioni siano scongelati una sola volta. Se per l'analisi vengono utilizzati campioni congelati, assicurarsi che non siano visibili particelle dopo lo scongelamento. In caso contrario, centrifugare di nuovo per 10 min a 4 gradi centigradi ≥ 18.000 x g e trasferire il supernatant in un tubo fresco da 1,5 mL.
5. Esecuzione dell'esecuzione HPLC
- Equipaggiare il collettore di frazione con 96 piccole fiale scintillanti (capacità di 6 mL) e riempire ogni fiala con 2 mL di un cocktail scintillante adatto (ad esempio, cocktail di scintillazione liquida Ultima-Flo AP) compatibile con tamponi con basso pH e alta concentrazione di fosfato di ammonio (vedi Tabella dei Materiali).
NOTA: il numero di fiale e la dimensione delle fiale dipendono dal collettore di frazione e dal contatore di scintillazione utilizzati. È importante raccogliere almeno le prime 90 frazioni, seviene utilizzato il gradiente qui descritto, per ottenere un profilo polifosfato completo inositolo. Assicurarsi inoltre di etichettare correttamente ogni fiala e il rispettivo coperchio, per evitare confusione di frazioni o campioni. - Avviare il sistema/pompe HPLC e farlo pronto per l'esecuzione. Attivare il lavaggio della guarnizione del pistone e mantenerlo attivato durante l'intera corsa. Caricare il campione iniettando manualmente il supernatant completo dal punto 4.5 (circa 750 L) utilizzando una siringa adatta (vedi Tabella dei materiali). Se è possibile l'iniezione automatica, trasferire il campione alla fiala campione corrispondente. Ruotare la valvola da "carico" alla posizione "inietta" e avviare il gradiente e il collettore di frazione.
NOTA: a seconda del sistema HPLC utilizzato, la procedura di partenza potrebbe differire, soprattutto quando si confrontano i sistemi meno recenti (come descritto di seguito) con un modello più recente completamente controllato dal software. È molto importante assicurarsi che il gradiente, l'iniezione del campione e la raccolta delle frazioni inizino contemporaneamente. - Mentre l'HPLC è in corso, controllare regolarmente la pressione. La pressione iniziale dovrebbe essere di circa 18-24 bar (1.8–2.4 MPa) e dovrebbe lentamente salire a 50-60 bar (5-6 MPa) una volta raggiunto il 100% buffer B.
CAUTION: La diminuzione della pressione potrebbe indicare una perdita nel sistema, mentre una maggiore pressione indica un blocco. Le fluttuazioni ≥ 3 bar in pochi secondi possono indicare la presenza di aria nel sistema. Tenete a mente che tutto ciò che lascia la colonna, così come ogni perdita che si verifica presso l'iniettore o successivamente è radioattivo.
NOTA: La pressione dipende anche dal sistema HPLC e può essere inferiore o superiore a quella indicata qui. Aumenterà lentamente dopo circa 15-20 corse. Tuttavia, questo non influenza necessariamente la qualità delle corse ottenute. - Dopo la corsa, chiudere le fiale e mescolare le frazioni con il cocktail scintillante agitando vigorosamente. Procedere direttamente con la misurazione o mantenere le fiale in posizione eretta, idealmente al buio.
NOTA: Le frazioni mescolate con cocktail scintillazione sono stabili per settimane e possono essere misurate in un secondo momento. Poiché l'emita di trizio è di 12,32 anni, la perdita del segnale è trascurabile. - Una volta terminata la corsa dell'ultimo campione della giornata, arrestare entrambe le pompe HPLC.
- (Facoltativo) Per aumentare la longevità del sistema, soprattutto quando non viene utilizzato regolarmente, lavare la pompa B e i capillari mettendo il capillare dal buffer B in una bottiglia con buffer A e lasciare che la pompa funzioni per 10-15 min. Prima dell'uso successivo, ricordarsi di sostituire il capillare nel buffer B e di disaccoppiare la pompa B dal mixer per scaricarlo con il buffer B. Una volta che la pompa e capillari sono riempiti di nuovo con buffer B, ricollegarlo con il mixer e il sistema è pronto per l'uso.
6. Misurazione delle frazioni
- Inserire le fiale nei rack del contatore scintillazione e misurare ogni fiala per 5 min in un contatore di scintillazione liquido.
- Idealmente, utilizzare rack che si adattano direttamente piccole fiale ed evitare di appendere nelle fiale in fiale più grandi (ad esempio, 20 mL) fiale per ridurre gli errori di conteggio. Le impostazioni software utilizzate in questo protocollo sono illustrate nella Figura 1 .
NOTA: eseguire regolarmente un protocollo SNC (auto-normalizzazione e calibrazione) utilizzando standard[3H] non inquenched. Sono possibili tempi di conteggio più brevi (da 1 a 5 minuti) per ridurre i tempi di attesa. Tuttavia, per garantire un'elevata riproducibilità e precisione di conteggio, si consigliano 5 min.
7. Analisi dei dati
- Esportare le misurazioni dal contatore scintillazione come un file di foglio di calcolo o un formato di file compatibile/convertibile. Valutare i dati con un computer dotato di Excel o software simile, e un software di analisi adatto come Origin.
- Preparare un grafico a linee 2D in cui i conteggi misurati per minuto (cpm) vengono tracciati rispetto al tempo di conservazione (vedere la Figura 1, Figura 2).
- Per confrontare i campioni tra loro, normalizzare i dati sommando il cpm da ogni frazione eldata dal minuto 25 al 96 per ogni singolo campione.
NOTA: il minuto 25 viene utilizzato come cut-off per escludere non incorporata [3H]-myo-inositol, InsP1 e InsP2 dall'analisi, in quanto quelle tendono a fluttuare fortemente e non possono essere ben separate (almeno con il gradiente proposto in questo protocollo) e quindi modificare fortemente il fattore di normalizzazione a causa della loro elevata attività. - Normalizzare tutti i dati al campione con il cpm totale più basso (in frazioni 25-u201296) dividendo il cpm totale dal campione con il cpm più basso (in frazioni 25-96) per il cpm totale (in frazioni 25-96) degli altri campioni. Il fattore risultante può quindi essere utilizzato per normalizzare il cpm da ogni frazione moltiplicando il cpm di ogni frazione con il fattore.
NOTA: Alla fine, la somma dei valori cpm dal minuto 25 alla fine deve essere uguale per tutti i campioni confrontati tra loro. Solo le esecuzioni normalizzate devono essere presentate nello stesso grafico/figura (se presentate come profili effettivi). La Figura supplementare 2 mostra un esempio di come vengono effettuati questi passaggi di calcolo (utilizzando solo frazioni 25–35 di due campioni per la semplificazione). Tuttavia, in alcuni casi non è necessario normalizzare i dati. Ad esempio, quando i picchi sono quantificati in base al punto 7.4 e presentati come percentuali del totale Degli InsP (come mostrato nella figura 3D). Come detto in precedenza, quando si presentano più analisi fianco a fianco come profili, o quando l'attività misurata effettiva viene utilizzata per le conclusioni (ad esempio, il trattamento a) aumenta InsP7 di x% rispetto al controllo, riferendosi ai valori cpm di InsP7 di entrambi i campioni e non alla loro percentuale di InsPs totali) è necessaria la normalizzazione. Per analizzare l'effetto del genotipo o delle not differenze di trattamento sull'efficienza di etichettatura, è importante non normalizzare, in quanto ciò invaliderebbe queste differenze. Tuttavia, la quantificazione assoluta con questo metodo è difficile perché l'efficienza di estrazione con questo protocollo può essere variabile per vari motivi e talvolta si osserva anche quando viene analizzata la replica dello stesso genotipo e il trattamento. Tenere presente che, a seconda del sistema HPLC, della colonna e del gradiente utilizzati per le analisi, potrebbe essere necessario modificare il cut-off. - Per eseguire quantificazioni relative di alcuni picchi di polifosfato inositolo e successivamente creare grafici a barre che contengono dati di repliche per analisi statistiche, continuare l'analisi con un software specializzato in grado di calcolare le aree di picco dei cromatogrammi (ad esempio, Origine). Vedere la Figura supplementare 3.
NOTA: la maggior parte dei sistemi HPLC controllati dal software sono forniti con un rispettivo software in grado di eseguire questa attività. I picchi vengono determinati come le frazioni con valori cpm sopra lo sfondo (che varia in un certo grado tra le esecuzioni) e i tempi di conservazione simili ai dati pubblicati in precedenza. Il tempo di conservazione di un picco specifico viene determinato nel software per fogli di calcolo (ad esempio, Excel) e utilizzato per assegnare picchi per il calcolo di integrali definiti (ad esempio, in Origin). La Figura supplementare 3 illustra questo processo di determinazione di picco, sottrazione di fondo e integrazione dei picchi.
Representative Results
I risultati qui mostrati mirano a illustrare i possibili risultati ottenuti in base alle variazioni a livello tecnico e biologico. Il primo è esemplificato dalle analisi utilizzando colonne nuove e invecchiate (Figura 1) e campioni freschi rispetto a quelli memorizzati (Figura 3) e il secondo valutando gli estratti da due diversi sistemi vegetali, A. thaliana (Figura 1, Figura 3) e L. japonicus (Figura 2).
Un'esecuzione ottimale di SAX-HPLC è illustrata nella Figura 1A- u2012C, che mostra uno spettro di polifosfato inositolo completo ottenuto da A. estratti di taltano dopo il conteggio scintillazione. Si noti che i picchi sono ben separati e possono essere assegnati a diversi isomers (o enantiomer-pairs) in base alle mobilitazioni cromatografiche descrittein precedenza 5,7.
La figura 2 mostra il risultato rappresentativo di un'analisi SAX-HPLC delle piantine L. japonicus che sono state coltivate ed etichettate nelle stesse condizioni delle piantine Arabidopsis. Mentre presumibilmente tutte le specie e picchi InsP che sono noti da Arabidopsis possono essere visti, ci sono differenze sostanziali per quanto riguarda la quantità relativa (ad esempio, rapporti tra isormi) di isomi InsP specifici, quando si confrontano i profili di entrambe le specie. Ad esempio, gli estratti di Lotus hanno mostrato un aumento di InsP3c, InsP4b, InsP5b e ridotto InsP3a, InsP4a, InsP5a e InsP5c rispetto a Arabidopsis che lascia spazio a ulteriori indagini. Nella figura 2D vengono illustrati i diversi rapporti tra gli iimi InsP tra Arabidopsis e Lotus.
Figura 3 Mostra due profili InsP di un campione che è stato diviso dopo l'estrazione. Il primo tempo è stato immediatamente analizzato e la seconda metà un giorno dopo, dopo lo stoccaggio a -80 gradi centigradi. Si noti che vengono osservate solo piccole differenze tra i diversi campioni (ad esempio, le linee nere e rosse nella figura 3A-u2012Ce la figura 3D). Ciò dimostra che un ciclo di congelamento-disgelo non danneggia il campione e che il metodo stesso genera risultati riproducibili.
Figura 1: profilo InsP tipico di un'analisi SAX-HPLC riuscita e non riuscita eseguita con questo protocollo. (A- U2012C) SaX-HPLC profilo di 17-day-old wild-type (Col-0) Arabidopsis piantine radiolabeld con [3H]-myo-inositol. L'estrazione Globale InsP e l'esecuzione di SAX-HPLC sono state eseguite nello stesso giorno. (A) Spettri completi; (B, C) Ingrandimento del profilo mostrato in A. Tutti i picchi visibili vengono evidenziati e assegnati alle specie InsP corrispondenti. Sulla base delle mobilitazioni cromatografichepubblicate 5,7, InsP4a rappresenta probabilmente Ins(1,4,5,6)P4 o Ins(3,4,5,6)P4, InsP5a rappresenta InsP5 [2-OH], InsP5b rappresenta InsP5 [4-OH] o la sua forma enantiomerica InsP5 [6-OH], e InsP5c rappresenta InsP5 [1-OH] o la sua forma enantiomerica InsP5 [3-OH]. Le nature isomeric di InsP3a-c, InsP4b, InsP7e InsP8 sono ancora sconosciute. Il pannello (D) mostra un profilo SAX-HPLC di piante coltivate in modo identico, ma utilizzando una colonna invecchiata (>40 corse). È visibile una netta riduzione dell'InsP6 rispetto ad altre specie InsP e l'assenza di PP-InsPs. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Profilo Rappresentante InsP delle piante di L. japonicus. Profilo SAX-HPLC (As.u2012C) di 17 giorni di tipo selvaggio (Gifu) L. japonicus piantine radiolabeled con [3H]-myo-inositol. (A) Spettri completi; (B, C) Ingrandimento del profilo mostrato in A. Tutti i picchi visibili vengono evidenziati e assegnati alle specie InsP corrispondenti. Sulla base delle mobilitazioni cromatografichepubblicate 5,7, InsP4a rappresenta probabilmente Ins(1,4,5,6)P4 o Ins(3,4,5,6)P4, InsP5b probabilmente rappresenta InsP5 [4-OH] o la sua forma enantimerica InsP5 [6-OH], e InsP5c probabilmente rappresenta InsP5 [1-OH] o la sua forma enantiomerica InsP5 [3-OH]. Le nature isomeric di InsP3a-c, InsP4b, InsP7e InsP8 sono sconosciute. (D) Confronto tra le singole specie InsP (in % dell'attività totale da eluizione 25-u201296) di A. thaliana (dati della Figura 1A- u2012C) e L. japonicus (dati della Figura 2A–C). Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: profili InsP di un campione diviso che illustrano la riproducibilità delle analisi SAX-HPLC. (A- U2012C) Profili SAX-HPLC di 17 giorni di tipo selvatico (Col-0) piantine Arabidopsis radiolabeled con [3H]-myo-inositol. Prima della corsa, il campione è stato diviso e una metà viene eseguito immediatamente e l'altra metà un giorno dopo dopo lo stoccaggio a -80 gradi centigradi (A) spettri completi; (B, C) Ingrandimento del profilo mostrato in A. Tutti i picchi visibili vengono evidenziati e assegnati alle specie InsP corrispondenti. Sulla base delle mobilitazioni cromatografichepubblicate 5,7, InsP4a rappresenta probabilmente Ins(1,4,5,6)P4 o Ins(3,4,5,6)P4, InsP5a rappresenta InsP5 [2-OH], InsP5a rappresenta InsP5 [2-OH], InsP5b rappresenta InsP5 [4-OH] o la sua forma enantiomerica InsP5 [6-OH], e InsP5c rappresenta InsP5 [1-OH] o la sua forma enantiomerica InsP5 [3-OH]. Le nature isomeric di InsP3a-c, InsP4b, InsP7e InsP8 sono ancora sconosciute. Il gruppo D mostra la quantificazione dell'InsP6 e del PP-InsP InsP7 e InsP8 di entrambe le corse. I valori rappresentano l'importo (in %) delle rispettive specie InsP rispetto a tutte le InsP (attività totale da eluizione 25-96). Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura supplementare 1: Impostazioni software per il conteggio delle scintillie liquide utilizzando un contatore di scintillazione leggera. Vengono mostrate le schermate che mostrano la versione del software, nonché le impostazioni utilizzate per il conteggio degli esempi[3H] eseguiti con questo protocollo. Si prega di fare clic qui per scaricare questa figura.
Figura supplementare 2: esempio rappresentativo di normalizzazione dei dati. Uno screenshot di un foglio di lavoro mostra tutti i passaggi e le formule utilizzati per normalizzare saX-HPLC viene eseguito l'uno all'altro. Per la semplificazione, vengono visualizzate solo le frazioni 25-35 dei campioni. Si prega di fare clic qui per scaricare questa figura.
Figura supplementare 3: determinazione di picco, sottrazione di fondo e integrazione utilizzando software di analisi. (A) I dati dell'analisi SAX-HPLC vengono caricati nel software (minuti 28-96) e viene selezionato lo strumento di analisi dei picchi. (B-u2012E) La linea di base viene definita manualmente impostando i punti tra i singoli picchi e lo sfondo viene sottratto. (F) I picchi vengono determinati manualmente in base all'aspetto e alle mobilitazioni cromatografichepubblicate 5,7. (G) Gli intervalli di picco sono definiti manualmente dai valori cpm. (H) I picchi sono integrati e calcolati come % di tutti i picchi. Si prega di fare clic qui per scaricare questa figura.
Discussion
Qui presentiamo un metodo versatile e sensibile per quantificare gli InsP, tra cui PP-InsPs negli estratti vegetali, e forniamo consigli pratici su come stabilire questo metodo. Anche se il protocollo è generalmente robusto, possono verificarsi esecuzioni e analisi non ottimali. Nella maggior parte dei casi, tali corse possono essere identificate da una forte riduzione o addirittura da una perdita completa di InsP altamente fosforati, in particolare le specie PP-InsP InsP7 e InsP8. Le possibili ragioni possono essere le contaminazioni microbiche del materiale vegetale e l'insufficiente disattivazione delle idrolase PP-InsP delle piante endogene durante l'estrazione a causa di un'insufficiente macinazione e scongelamento di materiale vegetale che non sarà in contatto immediato con il tampone di estrazione. Ulteriori motivi includono la regolazione imprecisa del pH mediante aggiunta insufficiente o in eccesso di buffer di neutralizzazione o semplicemente insufficiente materiale campione. Quest'ultimo può rendere difficile rilevare PP-InsPs, dal momento che quelli sono spesso presenti in quantità molto basse nelle cellule. Un eccesso di materiale campione o un'essiccazione inefficiente durante il punto 3.5 può causare la diluizione dell'acido perclorico, portando quindi anche a una disattivazione enzimatica insufficiente e ad una perdita specifica di InsP6 e PP-InsPs. La quantità di materiale vegetale, così come la radiolabel utilizzata in questo protocollo sono stati ottimizzati in base ai costi e alle prestazioni, ed è quindi vicino alla quantità più bassa che è ancora sufficiente per fornire risultati ottimali. Inoltre, la resina colonna perderà gradualmente la sua capacità di risoluzione. Il primo segno di questo processo è (per ragioni non del tutto chiare agli autori) una perdita specifica di specie InsP fosforilate più elevate come i PP-InsPs nello spettro HPLC. Con un ulteriore invecchiamento, anche InsP6 non verrà risolto correttamente dalla colonna (Figura 1D). Pertanto, l'uso di una colonna adeguata, nonché la gestione meticolosa del campione e la corretta manutenzione dei componenti HPLC è fondamentale per garantire risultati accurati.
Quando si confrontano campioni e corse, soprattutto se generati con apparecchiature diverse (ad esempio, sistemi e colonne HPLC) o in giorni diversi, è fondamentale normalizzare i campioni tra loro (come descritto al punto 7.3) e analizzarli allo stesso modo. Solo attraverso la normalizzazione è possibile e preciso visualizzare più campioni nello stesso grafico (Figura 3). Per la quantificazione di singoli InsP rispetto al totale insPs, o ad un'altra specie InsP specifica, non è necessario normalizzare, purché siano visualizzati solo valori relativi e non assoluti. Idealmente, vengono visualizzati sia i profili Inp che le quantificazioni. Tuttavia, in alcuni casi non è possibile mostrare in modo adeguato due o più esecuzioni nello stesso grafico. Tempi di conservazione diversi o diversi livelli di attività in background possono rendere difficile il confronto solo dei profili SAX-HPLC non quantificati. Lo stesso vale quando molti campioni devono essere confrontati. In questi casi, è necessaria un'ulteriore valutazione utilizzando un software aggiuntivo (ad esempio Origin) per la quantificazione individuale di picco.
Gli autori sono consapevoli del fatto che il protocollo qui descritto può essere ottimizzato e deve essere adattato a ogni singola domanda di ricerca. Sebbene sia ottimizzato per gli estratti arabidopsi 7,17 in questo protocollo, questo metodo è versatile e può aiutare a determinare i profili InsP di altre specie vegetali pure. Qui esemplificamo questa possibilità presentando per la prima volta un profilo InsP per L. japonicus, che non richiedeva modifiche alle condizioni di etichettatura, estrazione InsP o esecuzione SAX-HPLC (Figura 2). In particolare, sebbene nel complesso simili, si osservano differenze tra i profili L. japonicus e Arabidopsis InsP. Per esempio, in L. japonicus InsP5 [4-OH] o la sua forma enantiomerica InsP5 [6-OH] sono più abbondanti di InsP5 [1-OH] o la sua forma enantiomerica InsP5 [3-OH] rispetto all'Arabidopsis, dove l'InsP5 [1-OH] o la sua forma enantiomerica InsP5 [3-OH] sono le specie dominanti di InsP5. Allo stesso modo, prevediamo che le alterazioni nella composizione dei media,[3H]- concentrazione di mio-inositol, età delle piante, condizioni ambientali (ad esempio, luce e temperatura), aggiunta di composti chimici o analisi delle interazioni pianta-microbiche tra altri fattori, potrebbero dover essere testate e adattate.myo
Un importante svantaggio di questo metodo che deve essere considerato è che l'etichettatura viene effettuata in una coltura liquida (sterile), che non rappresenta un ambiente fisiologico per la maggior parte delle piante terrestri. Inoltre, a causa degli elevati costi di [3H]-myo-inositol, il volume della soluzione di etichettatura e le dimensioni del recipiente di coltura sono generalmente limitati, il che limita anche le dimensioni delle piante che possono essere utilizzate. La coltivazione in coltura liquida può essere evitata infiltrandosi direttamente, ad esempio, nelle foglie delle piantecoltivatenel suolo con [3H]- myo-inositol e successivamente seguendo il protocollo qui descritto, come precedentemente riportato10.
Ci sono diversi inconvenienti di questo protocollo rispetto a metodi alternativi, come TiO2 pull-down seguita da PAGE o tecniche basate sulla spettrometria di massa. A causa dell'etichettatura [3H]-myo-inositol, solo le specie InsP che provengono direttamente da myo-inositol etichettate radio- alla fine. myo Il metodo qui descritto è cieco ad altri immetori Ins come il scillo-inositol e altri iosters alcuni dei quali sono stati identificati in alcune piante44. Inoltre, myo-InsPs derivati da altri percorsi saranno esclusi, compresi quelli sintetizzati da sintesi de novo di myo-inositol e myo-inositol-3-fosfato tramite isomerizzazione del glucosio-6-fosfato, catalizzato da myo-inositol-3-fosphate synthase (MIPS) proteine45. Anche se [32P] o [33P]-orto-fosfato può essere utilizzato come etichette alternative, il loro uso rappresenta un grave svantaggio, poiché ogni molecola contenente fosfati, compresi i nucleotidi abbondanti e i suoi derivati, sarà etichettata. Queste molecole possono anche essere estratte con questo protocollo e legarsi alla colonna SAX, che si tradurrà in un alto livello di attività in background che interferirà con l'identificazione dei singoli picchi InsP5. Inoltre, la quantificazione di [32P]- o[33P] -etichettando InsPs e PP-InsPs può essere fortemente influenzata dal fosfato e dal pirofosfato e potrebbe non segnalare una lettura di massa per le specie di inossuoli.
D'altra parte, [3H]-myo-inositol etichetta specificamente le molecolecontenenti mio-inositol. In questo caso vengono etichettati gli insps, i lipidi contenenti inositoli, come i fosfonositidi e i galactinol. Tuttavia, solo gli Insp verranno analizzati con questo protocollo, poiché i lipidi sono insolubili nel buffer di estrazione e
Finora, le differenze rispetto a un profilo InsP generato da [3H]-myo-inositol etichettatura rispetto a uno determinato da TiO2 pulldown/ PAGE rimane sconosciuto, dal momento che tali confronti non sono stati eseguiti nelle piante. Un recente studio sulle cellule animali ha affrontato la questione46. In tale lavoro, è stato identificato un pool di InsP6 invisibile da [3H]- myo-inositol labeling, che dovrebbe quindi essere direttamente derivato dal glucosio-6-fosfato, confrontando i profili SAX-HPLC con i gel PAGE delle linee cellulari dei mammiferi.myo 24 h di fame di fosfato hanno provocato un aumento del 150% dell'InsP6 quando la quantificazione dei gel PAGE degli InsPs ha purificato con il pulldown TiO2. Le analisi SAX-HPLC di [3H]-myo-inositol-labeled cells che sono state trattate in modo identico hanno mostrato solo un aumento del 15% di [3H]-InsP6. Come accennato in precedenza, gli InsP inferiori all'InsP5 non sono rilevabili con l'analisi PAGE nella maggior parte dei casi. L'etichettatura radio seguita da SAX-HPLC sembra essere il metodo preferito, purché i protocolli spettrometrici di massa non siano ottimizzati per rilevare questo gruppo di molecole altamente cariche negativamente.
Un'altra sfida rimane è distinguere gli enantiomi nelle analisi SAX-HPLC (o in qualsiasi altro metodo per l'analisi InsP)10,17. Questa sfida può essere affrontata con l'aggiunta di selettori chirali, cioè composti enantioure come L-arginina amide che interagiscono con le rispettive molecole enantiomerici per formare complessi diastereomerici che possono essereseparati 10. A nostra conoscenza, questo approccio è stato implementato solo per discriminare l'enantiomerico InsP5 Isomers InsP5 [1-OH] e InsP5 [3-OH] dalle analisi NMR10. La discriminazione di altre coppie enantiomeriche o la discriminazione di successo degli enantiomi da parte dell'analisi chirale SAX-HPLC o dei metodi chirali basati su PAGE non sono ancora stati segnalati e dovrebbero essere ulteriormente sviluppati. Considerando la sintesi conservata e la regolazione conservata dei PP-InsPs mediante la disponibilità di fosforo, immaginiamo che in particolare i metodi non radioattivi come i metodi basati su PAGE o MS, insieme alle analisi dei nutrienti, aiuteranno gli sforzi di verità a terra per calibrare i dati di telerilevamento progettati per diagnosticare le carenze nutritive nellecolture 17,18,24,25. Tuttavia, il metodo qui presentato può ancora essere considerato il gold standard per le analisi InsP e sarà strumentale per scoprire nuove funzioni di questi intriganti messaggeri nelle piante.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato finanziato dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, German Research Foundation) nell'ambito della strategia tedesca excellence - EXC-2070 – 390732324 (PhenoRob), dal Gruppo di formazione per la ricerca GRK2064 e dalle sovvenzioni individuali alla ricerca SCHA1274/4-1 e SCHA1274/5-1 a G.S. Ringraziamo anche Li Schlàter e Brigitte Ueberbach per l'assistenza tecnica.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Centrifuge | Eppendorf AG | model: 5430 R | |
| Diammonium hydrogen phosphate, ≥97 % | Carl Roth GmbH + Co. KG | 0268.1 | |
| Ethylenediamine tetraacetic acid disodium salt dihydrate, ≥99 %, p.a., ACS | Carl Roth GmbH + Co. KG | 8043.2 | |
| Falcon 12-well clear flat bottom TC-treated multiwell cell culture plate, with lid, individually wrapped, sterile | Corning Inc. | 353043 | |
| Fraction collector | LAMBDA Instruments GmbH | model: OMNICOLL single channel collector | |
| Growth incubator | poly klima GmbH | model: PK 520-LED | |
| HPLC pumps | Kontron Instruments | model: 420 | |
| HPLC syringe for Rheodyne valves, 1 mL | Hamilton Company | 81365 | |
| Injector for HPLC | Supelco | model: Rheodyne 9725 | |
| Inositol, myo-[1,2-3H(N)] | American Radiolabeled Chemicals Inc. | ART 0261 | |
| Liquid nitrogen | University, Chemistry Department | ||
| Liquid scintillation counter | PerkinElmer Inc | model: TRI-CARB 2900TR | |
| Micro pestle | Carl Roth GmbH + Co. KG | CXH7.1 | |
| Mixed cellulose Eester filter, ME range (ME 24), plain, 0.2 µm pore size, 47 mm circle | GE Healthcare Life Sciences | 10401770 | |
| Mixer for HPLC | Kontron Instruments | model: M 800 | |
| Murashige & Skoog medium, salt mixture | Duchefa Biochemie | M0221 | |
| OriginPro software | OriginLab Corp. | ||
| Orthophosphoric acid, ≥85 %, p.a., ISO | Carl Roth GmbH + Co. KG | 6366.1 | |
| Partisphere 5 µm SAX cartridge column, 125 x 4.6 mm | Hichrom Limited | 4621-0505 | |
| Perchloric acid, 70 %, 99.999 % trace metals basis | Sigma-Aldrich | 311421 | |
| Petri dish, square, PS, clear, 120/120/17 mm, sterile | Greiner Bio One International GmbH | 688161 | |
| pH-indicator paper pH 5.5 - 9.0, Neutralit | Merck KGaA | 109564 | |
| Phytagel | Sigma-Aldrich | P8169 | |
| Potassium carbonate | Carl Roth GmbH + Co. KG | P743.2 | |
| Safe-Lock tubes, 1.5 mL | Eppendorf AG | 30120086 | |
| Sample loop for 9725 injectors, volume 2 mL, PEEK | Supelco | 57648 | |
| SNAPTWIST scintillation vial, 6.5 mL | Simport Scientific Inc. | S207-5 | |
| Sterile bench | LaboGene | model: ScanLaf MARS 900 | |
| Sucrose, ≥99,5 %, p.a. | Carl Roth GmbH + Co. KG | 4621.1 | |
| Ultima-Flo AP liquid scintillation cocktail | PerkinElmer Inc | 6013599 | |
| Ultra-pure deionized water | Milli-Q | ||
| Wrenchless WVS End Fitting Kit | Hichrom Limited | 4631-1001 |
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