Summary
Burada bitkilerdeki inositol polifosfatları tespit etmek ve ölçmek için son derece hassas bir yöntem olan[3H]-myo-inositol etiketli fidelerin güçlü aniyon değişimi yüksek performanslı sıvı kromatografisini tanımlıyoruz.
Abstract
Inositol fosfat (InsPs) olarak da adverilen miyo-inositolün fosfat esterleri, bitki fizyolojisinde önemli rol oynayan hücresel regülatörler sınıfıdır. Negatif yük, düşük bolluk ve hidrolitik aktivitelere yatkınlık nedeniyle bu moleküllerin saptanması ve ölçülmesi zordur. Bu durum özellikle inositol pirofosfat (PP-InsPs) olarak da adlandırılan 'yüksek enerjili' diphospho bağları içeren yüksek fosforlu formlar için geçerlidir. Yüksek hassasiyeti nedeniyle,[3H]-myo-inositol ile etiketlenmiş bitkilerin güçlü aiyon değişimi yüksek performanslı sıvı kromatografisi (SAX-HPLC) şu anda bu molekülleri analiz etmek için tercih edilen yöntemdir. [33H]-myo-inositol ile radiolabel bitki fideleri kullanılarak, çeşitli antiomerik izomerler de dahil olmak üzere çeşitli InsP türleri tespit edilebilir ve yüksek hassasiyetle ayırt edilebilir. Burada, uygun bir SAX-HPLC sisteminin kurulumu, yanı sıra bitki ekimi, radyolabeling ve SAX-HPLC çalıştırmak ve sonraki veri analizi için InsP çıkarma tam iş akışı açıklanmıştır. Burada sunulan protokol, çeşitli insp türlerinin, çeşitli antimekomerik izomerler ve PP-InsPs, InsP7 ve InsP8dahil olmak üzere ayrımcılığına ve nicelemesine olanak sağlar ve diğer bitki türlerine kolayca adapte edilebilir. Örnek olarak Arabidopsis thaliana ve Lotus japonicus fidelerinin SAX-HPLC analizleri yapılmalı ve tam InsP profilleri sunulmuş ve tartışılmıştır. Burada açıklanan yöntem, Bitkilerdeki InsP'lerin biyolojik rollerini daha iyi anlamak için umut verici bir aracı temsil etmektedir.
Introduction
Neredeyse kırk yıl önce, inositol fosfatlar (InsPs) sinyal molekülleri olarak ortaya çıktı, Ins sonra (1,4,5)P3 (InsP3) hayvan hücrelerinde Ca2 reseptör aracılı salınımını aktive ikinci bir haberci olarak tespit edildi1,2. Bugüne kadar, hiçbir InsP3 reseptörü (IP3-R) bitkilerde tespit edilmiştir, hangi bitki hücrelerinde InsP3 için doğrudan bir sinyal rolü sorular3. Ne olursa olsun, InsP,3 ,belirli sinyal yolları3,4,5,,6,,7,8düzenlenmesi de dahil olmak üzere, çeşitli bitki gelişim süreçlerinde yer alan diğer InsPs için bir öncü olarak hizmet vermektedir. Örneğin, InsP3 daha fazla insP6fosforile edilebilir , ayrıca fosfat önemli bir kaynağı temsil eden "fitik asit", myo-inositol ve katyonlar, ve patojenlere karşı bitki savunma önemli rol oynadığı gösterilmiştir, mRNA ihracat ve fosfat homeostasis5,9,10,11,12.
Inositol pirofosfatlar (PP-InsPs) en az bir yüksek enerjili di-fosfo bağı içeren insps bir sınıftır, başlangıçta hayvan hücrelerinde tanımlanan, amip ve maya, onlar çeşitli hücresel süreçlerde kritik rol oynamaknerede 13,14,15. Bitkilerde PP-InsPs üzerinde ufuk açıcı çalışmalara rağmen16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26, bu moleküllerin biyolojik fonksiyonları ve izomer kimliği hala büyük ölçüde esrarengiz kalır. Model bitki Arabidopsis thaliana, hücresel InsP8 insPtesadüf-algılama yoluyla böcek otobur ve nekrotrofik mantarlara karşı savunma düzenlemek için önerilmiştir 8 ve ASK1-COI1-JAZ reseptör kompleksi tarafından aktif jasmonate17. Ayrıca, Enerji homeostaz ve besin algılama in InsProlleri 8 ve diğer PP-InsPs, yanı sıra fosfat homeostazönerilmiştir 17,23,24,25,26.
Kullanılan biyolojik sistem ne olursa olsun, InsPs çalışırken önemli bir metodolojik sorun bu moleküllerin güvenilir tespiti ve hassas nicelleştirilmesi olmuştur. Hücre ekstrelerinden PP-InsPs dahil insp'leri tespit etmek için kütle spektrometresi tabanlı yöntemler kullanılmıştır. Ancak, bu çalışmalar farklı izomerleri ayırt etmek için başarısızoldu 26,27. InsPs'i analiz etmek için başka bir yaklaşım, TiO2 boncuklarını kullanarak hücre lizatlarından InsP'lerin çekilmesini, ardından eluted InsPs'in poliakrilamid jel elektroforezini (PAGE) kullanır. InsPs sonra ya toluidin mavi veya DAPI24,,28,,29tarafından boyanmış olabilir. Ancak, bu yöntemi kullanarak bitki özlerinden InsP5'ten daha düşük InsPs'leri güvenilir bir şekilde tespit etmek mümkün değildir. Son zamanlarda, insps nükleer manyetik rezonans (NMR) analizi için [13C]-myo-inositol kullanarak bir yöntem güçlü aniyon değişimi yüksek performanslı sıvı kromatografisi (SAX-HPLC)30alternatif olarak yayınlandı. Bu teknik SAX-HPLC ile karşılaştırıldığında benzer bir duyarlılık elde etmek ve 5-InsP7tespiti sağlamak için bildirilmiştir , hücre özlerinden farklı antimekomerik InsP5 izomerleri ayrımcılık. Ancak, NMR tabanlı yöntemin uygulanması kimyasal olarak sentezlenmiş ve ticari olarak mevcut değildir [13C]-myo-inositol gerektirir. Bu nedenle, çoğu durumda kullanılan yöntem [3H]-myo-inositol, SAX-HPLC31,32,33takip ile örnekleri radyoetiketleme olduğunu.33 Bu teknik, bitkiiçine radyoaktif miyo-inositol alımı ve özel hücresel kinaz ve fosfatazların kombine aktivitesi ile farklı InsPs içine dönüşüm dayanmaktadır.
[33H] etiketli InsPs sonra asit ayıklanır ve SAX-HPLC kullanılarak fraksiyona alınır. Negatif yüklerinden dolayı, InsPs'ler SAX-HPLC sütununun pozitif yüklü sabit fazı ile güçlü bir şekilde etkileşime girerek, kolondaki InsPs'leri aşacak şekilde artan fosfat konsantrasyonları içeren bir tampon degrade ile eluted olabilir. Böylece elüsyon süreleri ayrılacak Olan InsP türünün yük ve geometrisine bağlıdır. Chiral sütunların yokluğunda, sadece non-enantiomerik izomerler bu protokol ile ayrılmış olabilir. Ancak, radiolabeled standartları belirli bir InsP tepe izomrik doğasını atamak için kullanılabilir. Geçmişte çeşitli laboratuvarlar tarafından (biyo)kimyasal yöntemlerle etiketlenmiş ve etiketlenmemiş standartlar oluşturmak veya onları çeşitli hücre ve organizmalardan arındırmak için yapılan birden fazla çaba, belirli InsP türlerine zirveler atamaya yardımcı oldu ve ayrıca bireysel InsPtürlerinin5,7,21,34,,35,36,37,38,39,40,41,42,43. Ayrıca, bitkilerde PP-InsPs oluşumuna yol açan enzimatik yolların son açıklaması, hem de belirli bir 1-phytase aktivitesi ile bir bakteriyel tip III efektör keşfi, bu analizler için yararlı standartlar oluşturmak için nasıl bilgi sağlamak10,17,18,22,23.
Ortaya çıkan kesirler, trityumun(3H) β çürümesi nedeniyle sıvı bir sintilasyon sayacında ölçülebilir. Artan etiketleme süresi ile, sabit durum izotopik denge ulaşılır, sonra elde edilen InsP profilleri bitkinin InsP durumunu temsil etmelidir31. Bu protokolün diğer mevcut tekniklere kıyasla en büyük avantajı, InsP'lerin doğrudan öncülünün kullanılması ve radyoaktif sinyalin ölçülmesi ile elde edilen yüksek hassasiyettir.
[3H]-myo-inositol etiketli bitkilerden veya diğer organizmalardan elde edilen örneklerin SAX-HPLC'si, insp'lerin metabolizmasını, işlevini ve eylem modlarını daha iyi anlamak için değerli bir aracı temsil eden, alt InsP türlerinden PP-InsP'lere kadar insp'lerin saptanması ve ölçülmesi için yaygın olarak kullanılır. Şimdiye kadar, bu yöntem aynı zamanda düşük InsP türlerine özel ilgi ile araştırmacılar için en uygun seçimdir. Bu prosedürün temelleri, hangi protokol burada inşa, daha önceaçıklanan 7,21,31,34, bitki kaynaklı InsPs analizi için özel ayrıntılı bir protokol ve özellikle PP-InsPs hala eksik. Önceki yayınlar, düşük bol PP-InsP'leri güvenilir bir şekilde tespit etmede güçlükler rapor özellikle InsP8, aşağıdaki faktörlerden biri veya daha fazlası nedeniyle: nispeten düşük miktarda bitki materyali, [3H]- düşük spesifik aktivite (> 20 Ci/mmol) ilemyo-inositol), perklorik asit temel olmayan veya 1 M'den daha az konsantre olan ekstraksiyon tamponlarının kullanımı, farklı nötralize tamponlar, ayrıca [3 H] alt-optimal gradyan veya algılama[3H] bir-line dedektörü ile. Bu çalışmalara göre, burada sunulan protokol PP-InsPs7,21,,34güvenilir tespiti için tasarlanmıştır.
Burada, ekipmanın tesis ekimi ve etiketleme, InsP ekstraksiyonu ve SAX-HPLC'nin kendi kendine çalışmasına kadar ayrıntılı bir iş akışı salıyoruz. Yöntem model bitki A. thalianaoptimize edilmiş olmasına rağmen , kolayca diğer bitki türlerini incelemek için değiştirilebilir, burada model baklagil Lotus japonicusilk bildirilen InsP profili ile gösterildiği gibi . Farklı bir bitki türünün kullanımı bazı optimizasyon gerektirebilir rağmen, bu küçük olacağını öngörüyoruz, bu protokol bitki InsPs daha fazla araştırma için iyi bir başlangıç noktası yapma. Olası optimizasyonları kolaylaştırmak için, protokolün içinde değişikliklerin mümkün olduğu her adımı ve yöntemi ilk kez oluştururken zor olabilecek tüm kritik adımları belirtiriz. Ayrıca, bu yöntemle elde edilen verilerin belirli InsP'lerin nicelleştirilmesi nde nasıl kullanılabileceğini ve farklı örneklerin nasıl analiz edilip karşılaştırılabildiğini de rapor ediyoruz.
Protocol
1. HPLC sisteminin kurulması
- Her tampon için bir adet olmak üzere iki bağımsız HPLC pompasından (ikili pompa) oluşan bir sistem ayarlayın. Her iki pompa birlikte ilgili yazılım ile bir bilgisayar aracılığıyla kontrol edilmesi gerekir ya da bir ana pompa sahip. Her iki pompa için de yerçekimi kuvveti veya üçüncü bir alçak basınç pompası ile pistonlu conta yıkama uygulayın. Tampon A (a terimi pompa) için bir pompa ve tampon B (b pompa sı denir) için bir pompa belirleyin.
NOT: Her ikisi de 60 bara (6 MPa) kadar basınç ve en az 0,5 mL/dk akış hızları oluşturabilmeli. - Her iki pompayı da dinamik bir miksere bağlayın.
- Mikseri en az 1 mL kapasiteli bir numune halkası ile bir enjeksiyon valfine bağlayın.
- Enjeksiyon valfini ilgili uç bağlantı parçaları aracılığıyla kılcal bir şekilde kolona bağlayın.
- Uygun uzunlukta bir kılcal kullanarak sütunu kesir toplayıcısına bağlayın.
NOT: Bu açıklama, daha yeni ve daha gelişmiş sistemlerden daha fazla manuel adım gerektiren HPLC sistemimize (Bkz. Malzemeler Tablosu)dayanmaktadır. Sistemimiz tüm bileşenlere kolay erişim ve modifikasyon sağlar. Kuaternary pompalar (burada açıklanan ikili degrade ile) de kullanılabilir ve elüsyon profilleri ve ikili pompalar ile elde benzer analizlerin genel kalitesiyol açacaktır.
2. Tampon, kolon ve HPLC sisteminin hazırlanması
- Çözünür InsPs çıkarma için arabellek hazırlayın: çıkarma tampon (1 M HClO4) ve nötralizasyon tampon (1 M K2CO3). Ultra saf deiyonize su ile her iki tampon hazırlayın. Onlar birkaç ay oda sıcaklığında kararlıdır. Çıkarmadan hemen önce, her iki çözeltiye de 3 mM'lik son konsantrasyona EDTA ekleyin (örn. filtrelenmiş 250 mM EDTA stok çözeltisinden).
DİkKAT: HClO4 (perklorik asit) güçlü aşındırıcıdır. - Arabellekleri SAX-HPLC çalışması için hazırlayın: arabellek A (1 mM EDTA) ve tampon B (1 mM EDTA, 1,3 M (NH4)2HPO4;pH 3.8 H3PO4ile). Her ikisini de ultra saf deiyonize su kullanarak hazırlayın ve ardından 0,2 m gözenek büyüklüğünde membran filtreli vakum filtrasyonu uygulayın. Bunlar birkaç ay oda sıcaklığında sabittir.
NOT: EDTA, InsPs ile katyon etkileşimini önlemek için tüm arabelleklere eklenmelidir, bu da insp yükünün değiştirilmesine ve hatta çözünmez InsP tuz komplekslerine neden olabilir. - Program degrade aşağıdaki gibi: 0\u20122 dk, 0% tampon B; 2\u20127 dk, %10'a kadar tampon B; 7\u201268 dk, %84'e kadar tampon B; 68\u201282 dk, %100'e kadar tampon B; 82\u2012100 dk, %100 tampon B, 100\u2012101 dk, %0 tampon B'ye kadar; 101\u2012125 dk, %0 tampon B. Bu degrade için en uygun akış hızı 0,5 mL/dk'dır.
- Çalışma sırasında, dakika 1 dakika 96 başlayarak, her dakika kesirler toplamak. Degrade kalan 30 dakika sütun ve sistem yıkamak için hizmet ve scintillation sayma için toplanması gerekmez.
- Mümkünse, HPLC pompalarının acil kapanmadan önce maksimum ulaşılabilir basıncı 80 bara (8 MPa) ayarlayın. Bu, sütunun reçinesinde kritik hasar oluşmasını önler.
- Yeni bir SAX HPLC kolon kullanırken, ilk kullanımdan önce filtrelenmiş ultra saf deiyonize su ile iyice yıkayın (>50 mL).
NOT: Bu, içerdiği metanolün çıkarılmasını sağlayacak ve daha sonraki adımlarda tuz yağışını önleyecektir. Mümkünse, ayrı bir HPLC pompası kullanın. Bu mevcut değilse, HPLC sütun yıkamadan önce su ile floş olduğundan emin olun. Akış hızı 2 mL/dk'yı geçmemelidir. Yıkadıktan sonra, sütun analiz için hazırdır ve düzgün bir şekilde işlendiğinde 20\u201240 çalışır için kullanılabilir. Bundan sonra, çözünürlük art arda azalacaktır. Arabellek A (>1 h) ile uzun süre yıkama ve adım 2.6 gerçekleştirmek sütunun ömrünü artırmaya yardımcı olabilir. Çözünürlükteki düşüş devam ederse, sütunun değiştirilmesi gerekir. Degrade, spesifik inositol polifosfat türleri arasındaki ayrımı artırmak veya genel çalışma süresini azaltmak için ayarlanabilir. Farklı HPLC sistemlerinin kullanılması (farklı boşluk hacmi veya kılcal damarların farklı hacmi ile) tutma sürelerini kuvvetle etkileyecektir. Ayrıca, sütun değişikliklerinin bekletme süreleri üzerinde küçük etkileri vardır. - Bir "mock run" gerçekleştirin. Çıkarılan bir numune yerine, HPLC sistemine filtrelenmiş ultra saf deiyonize su enjekte edin ve standart degradeyi çalıştırın. Kesirlerin toplanması gerekmez.
NOT: Adım 2.6 isteğe bağlıdır. Ancak, aşağıdaki durumlardan biri geçerliyse yapılmalıdır: Yeni bir sütun yüklenir; HPLC sistemi önceden farklı bir yöntem için kullanılmıştır; HPLC sistemi 3 günden uzun süredir kullanılmamıştır; Önceki çalışmaile ilgili bir sorun vardı.
3. Bitki yetiştiriciliği ve etiketleme [3H]-myo-inositol
NOT: Aşağıdaki adımlar steril bileşenlerle ve steril koşullaraltında , radyolabel ile kirlenmeden elleri korumak için eldiven giyerken yapılmalıdır. Bitki ortamları, özellikle sakaroz içerdiğinde mikrobik kontaminasyona yatkındır.
- Sterilize A. thaliana tohumları ile 1 mL 1.2% sodyum hipoklorit ile 3 dk ve 3 dakika için% 70 etanol 1 mL izledi. Daha sonra 1 mL%100 etanol ekleyin, etanollü tohumları dairesel bir filtre kağıdına ekleyin ve temiz bir tezgahta laminar akış altında havaların kurumasını bekleyin.
- L. japonicus tohumları kullanırken, yeterli çimlenme oranı sağlamak için sterilizasyon dan önce bir harç ve zımpara ile tohumları ovmak yerleştirin.
- Yarım mukavemetli Murashige ve Skoog (MS) tuz çözeltisi, %1 sakaroz, %0.7 mm'lik deiyonize sudaki katı büyüme ortamı yla dolu kare Petri kaplarında 1-2 sıra Arabidopsis tohumu ekin ve karanlıkta 4 °C'de en az 1 gün boyunca tabakalaşmalarını bekleyin.
- Lotus tohumları için, deiyonize suda %0,8 bakteriyolojik agardan oluşan katı büyüme ortamıyla dolu kare Petri kaplarında 1 sıra halinde ekin ve karanlıkta 4 °C'de en az 3 gün tabakalaşmalarını bekleyin.
- Plakaları dikey olarak bir büyüme kuluçka veya iklim odasına yerleştirin ve kısa gün koşullarında (22 °C'de 8 saat ışık, 20 °C'de 16 saat karanlık) 10-12 gün boyunca büyümelerini bekleyin.
- 10-20 fideyi % 1 sakaroz ile desteklenmiş ve pH 5.7'ye ayarlanmış, 2 mL yarı güçlü MS tuz çözeltisi ile dolu 12 kuyulu düz dipli hücre kültür plakasının bir kuyuya aktarın.
- [3 H]-3myo-inositol (30-80 Ci/mmol, %90 etanolde çözünmüş) ekleyin ve hafif girdap ile karıştırın. Plakayı ilgili kapakla kapatın ve mikrogözenekli cerrahi bantla (örn. mikropore veya leucopore bant) kapatın ve büyüme kuluçka makinesine geri yerleştirin.
DİkKAT:[3H] solunduğunda, yutulduğunda veya çıplak deri yoluyla emildiğinde zararlı bir radyasyon tehlikesi ne kadar az enerjili bir beta yayıcısıdır. Radyoaktif maddeyi veya radyoaktif maddeyle doğrudan veya dolaylı temas eden ekipmanları kullanırken her zaman eldiven takın. Ayrıca radyokimyasalların güvenli kullanımı için yerel kurallara uyun (örn. ek koruyucu giysiler giymek, dosimetre kullanımı ve kontaminasyonlar için yüzeylerin düzenli olarak incelenmesi). - Etiketleme 5 gün sonra, medyadan fide kaldırmak ve deiyonize su ile kısa bir süre yıkayın. Kağıt havlu ile kurulayın ve 1,5 mL mikrosantrifüj tüp içine aktarın. Tüpü fazla doldurmayın ve yaklaşık 10\u201220 17 günlük fidelere karşılık gelen en fazla 100 mg FW/tüp yerleştirmeyin.
NOT: Bitki materyalinin fazlalığı ekstraksiyon işlemi sırasında asidi seyreltecek ve ekstraksiyon verimliliğini güçlü bir şekilde azaltacaktır.- Tüpü sıvı nitrojende tutturun ve ekstraksiyona kadar -80 °C'de saklayın.
NOT: Numuneler -80 °C'de numune kalitesinden ödün vermeden birkaç hafta saklanabilir. Büyüme koşulları (ortam, ışık, sıcaklık, zaman) belirli bir deney veya bitki türünün ihtiyaçlarına göre değiştirilebilir. Ancak, iyi kalitede ölçülebilir SAX-HPLC çalışır sağlamak için [3H]-myo-inositol seyreltme zaman dikkat edilmelidir. Bu nedenle burada belirtilen[3H]-myo-inositol konsantrasyonları ile başlayıp istenirse adım adım azaltılması tavsiye edilir. Etiketleme süresi boyunca, bitkiler bu koşulların küresel InsP'ler üzerindeki etkisini değerlendirmek için farklı tedavilere (örn. çevresel gerilmeler veya kimyasal maddeler) sunulabilir. Sabit durum etiketlemeulaşmak için, en az 5 gün boyunca bitkileri etiketlemenizi öneririz.
- Tüpü sıvı nitrojende tutturun ve ekstraksiyona kadar -80 °C'de saklayın.
4. Çözünür InsPs çıkarma
NOT: Tüm ekstraksiyon işlemi sırasında numuneleri ve reaktifleri buz üzerinde saklayın. Özellikle taşlama sırasında radyoaktif maddeile temas riski yüksek olduğu için her zaman eldiven ve koruyucu gözlük takın. Numunelerle temas eden her şey radyoaktif atık olarak kabul edilir ve radyoaktif maddelerin güvenli bir şekilde bertaraf edilmesi için yerel kurallara göre bertaraf edilmelidir.
- Adım 2.1'deki gibi çıkarma ve nötralizasyon arabelleği için çalışma çözümlerini hazırlayın. Her numune 600 μL çıkarma tamponu ve 400 μL nötralizasyon tamponu gerektirir. Tamponları buzüzerinde saklayın.
- -80 °C'lik dondurucudan numuneleri alın ve daha fazla işleme konana kadar sıvı nitrojende saklayın. Numuneleri erimeye başlayana kadar mikrosantrifüj tüp havaneli ile öğütün ve 500 μL buz gibi ekstraksiyon tamponu ekleyin. Numune tamamen homojenize olana ve çözelti derin yeşil bir renge sahip olana kadar taşlama devam edin (örnekte yapraklar varsa).
- 18000 x g≥ 4 °C'de 10 dk için numuneleri santrifüj edin. Supernatant'ı 1,5 mL'lik taze bir tüpe aktarın. Ekstraksiyon için kullanılan tüplerin katı radyoaktif atık olarak kabul edilir ve buna göre atılması gerektiğini unutmayın.
-
Ekstre 300 μL nötralizasyon tamponunu dikkatlice ekleyin. Proteinlerin yağışı ve köpürme hemen başlayacaktır. Bir dakika sonra bir pipet ucu ile girdap ile karıştırın ve pH kağıt üzerinde küçük bir miktar (5 μL) pipetleme önce birkaç saniye bekleyin (ideal pH 6-9 aralığı). PH sonunda pH 7 ve 8 arasında olmalıdır.
- Gerekirse, istenilen pH'a ulaşılıncaya kadar nötralizasyon arabelleği veya çıkarma arabelleği küçük miktarlarda (genellikle 10-20 μL) ekleyin. Örnekler açık bir kapak ile en az 1 saat buz üzerinde dinlenme sağlar.
- Numuneleri 18.000 x g≥ 4 °C'de 10 dk için santrifüj edin. Supernatant'ı 1,5 mL'lik taze bir tüpe aktarın.
NOT: Numuneler doğrudan Bir SAX-HPLC çalışmasında kullanılabilir veya buzda tutulabilir (aynı gün daha sonra kullanılırsa) sıvı nitrojende dondurulabilir ve -80 °C'de 2\u20124 hafta boyunca saklanabilir. Yüksek tekrarlanabilirlik ve karşılaştırılabilirlik sağlamak için, her zaman sıvı azot içinde numuneler dondurmak için tavsiye edilir 5 dakika, onlar doğrudan daha sonra kullanılacak olsa bile. -80 °C'de çıkarılan numunelerin uzun süreli depolanması, numuneler sadece bir kez çözüldüğü sürece mümkündür. Analiz için dondurulmuş numuneler kullanılıyorsa, çözüldükten sonra parçacık görünmediğinden emin olun. Aksi takdirde, 18.000 x g ≥ 4 °C'de 10 dakika boyunca tekrar santrifüj ve supernatant taze bir 1,5 mL tüp içine aktarın.
5. HPLC çalışmasını gerçekleştirmek
- Fraksiyon kolektörü 96 küçük sintillasyon şişeleri (~ 6 mL kapasite) ile donatın ve her şişeyi 2 mL uygun bir sintillasyon kokteyli (örneğin, Ultima-Flo AP sıvı sintillasyon kokteyli) Table of Materialsile doldurun.
NOT: Şişe lerin sayısı ve şişelerin büyüklüğü kullanılan kesir toplayıcıve ışıltı sayacına bağlıdır. En azından ilk 90 kesirleritoplamak önemlidir , burada açıklanan degrade kullanılırsa, tam bir inositol polifosfat profili elde etmek için. Ayrıca, kesirlerin veya örneklerin karışmasını önlemek için her şişeyi ve ilgili kapağı düzgün bir şekilde etiketlediğinden emin olun. - HPLC sistemini/pompalarını çalıştırın ve çalışmaya hazır hale getirmek için hazır olun. Piston contasını çalıştırın ve tüm çalışma boyunca aktif tutun. Numuneyi, uygun bir şırınga kullanarak adım 4.5'ten (yaklaşık 750°L) tam süpernatantı elle enjekte ederek yükleyin (Bkz. Malzeme Tablosu). Otomatik enjeksiyon mümkünse, numuneyi ilgili numune şişesine aktarın. Valfi "yük"ten "enjekte" konumuna çevirin ve degradeyi ve kesir toplayıcısını çalıştırın.
NOT: Kullanılan HPLC sistemine bağlı olarak, özellikle eski sistemleri (burada açıklandığı gibi) tam yazılım kontrollü yeni bir modelle karşılaştırırken başlangıç prosedürü farklı olabilir. Degradenin, numune enjeksiyonunun ve kesir toplamanın aynı anda başlatılmasını sağlamak çok önemlidir. - HPLC çalışması devam ederken, basıncı düzenli olarak kontrol edin. Başlangıç basıncı 18-24 bar (1.8-2.4 MPa) civarında olmalı ve %100 tampon B'ye ulaşılınca yavaş yavaş 50-60 bara (5-6 MPa) yükselmelidir.
DİkKAT: Basınç azalması sistemde bir sızıntıya işaret ederken, artan basınç tıkantıya işaret eder. Basınç dalgalanmaları (birkaç saniye içinde ≥ 3 çubuk) sistemde hava varlığını gösterebilir. Sütundan çıkan her şeyin yanı sıra enjektörde veya sonrasında meydana gelen her sızıntının radyoaktifolduğunu unutmayın.
NOT: Basınç da HPLC sistemine bağlıdır ve burada belirtilenden daha düşük veya daha yüksek olabilir. Yaklaşık 15-20 koşudan sonra yavaş yavaş artacaktır. Ancak, bu mutlaka elde edilen çalışır kalitesini etkilemez. - Koşudan sonra, şişeleri sıkıca kapatın ve kesirleri güçlü bir şekilde sallayarak sintillasyon kokteyli ile karıştırın. Doğrudan ölçüme devam edin veya şişeleri ideal olarak karanlıkta dik bir konumda tutun.
NOT: Sintillasyon kokteyli ile karıştırılan kesirler haftalarca stabildir ve daha sonra ölçülebilir. Trityumun yarı ömrü 12.32 olduğundan sinyal kaybı ihmal edilebilir. - Günün son örneğinin çalışması tamamlandıktan sonra, her iki HPLC pompasını da durdurun.
- (İsteğe bağlı) Sistemin uzun ömürlü artırmak için, özellikle düzenli olarak kullanılmadığı zaman, tampon A ile bir şişe içine tampon B kılcal yerleştirerek pompa B ve kılcal yıkama ve pompa 10-15 dakika çalışmasına izin. Bir sonraki kullanımdan önce, tampon B içine kapiller değiştirmeyi unutmayın ve tampon B ile floş için mikser b pompa ayırmak için. Pompa ve kılcal damarlar tekrar tampon B ile doldurulduğunda, mikser ile yeniden bağlayın ve sistem kullanıma hazırdır.
6. Kesirlerin ölçülmesi
- Şişeleri sintillasyon tezgahı raflarına yerleştirin ve her şişeyi sıvı bir sintillasyon tezgahında 5 dakika ölçün.
- İdeal olarak, küçük şişelere doğrudan uyan raflar kullanın ve sayım hatalarını azaltmak için daha büyük (örneğin, 20 mL) şişelerde şişelerde asılı kalmaktan kaçının. Bu protokolde kullanılan yazılım ayarları Ek Şekil 1'degösterilmiştir.
NOT: Sönmemiş[3H] standartlarını kullanarak düzenli olarak bir SNC (kendi kendine normalleştirme ve kalibrasyon) protokolü uygulayın. Bekleme süresini kısaltmak için daha kısa sayım süreleri (1-5 dk) mümkündür. Ancak, yüksek sayma tekrarlanabilirlik ve doğruluk sağlamak için, 5 dakika önerilir.
7. Veri analizi
- Ölçümleri sintillation sayacından elektronik tablo dosyası veya uyumlu/dönüştürülebilir dosya biçimi olarak dışa aktarın. Verileri Excel veya benzeri yazılımlarla donatılmış bir bilgisayar ve Origin gibi uygun bir analiz yazılımıyla değerlendirin.
- Dakika başına ölçülen sayıların (cpm) bekletme süresine göre çizildiği 2-B çizgi grafiği hazırlayın (Bkz. Şekil 1, Şekil 2).
- Örnekleri birbiriyle karşılaştırmak için, her bir örnek için 25 ila 96 dakika dan her eluted kesirden cpm özetleyerek verileri normalleştirin.
NOT: Minute 25, analizden[3H]-myo-inositol, InsP1 ve InsP2'yi dışlamak için kesilme olarak kullanılır, çünkü bunlar güçlü bir şekilde dalgalanma eğilimindedir ler ve iyi ayrılamazlar (en azından bu protokolde önerilen degrade ile) ve böylece yüksek aktivitenedeniyle normalleşme faktörünü güçlü bir şekilde değiştirirler. - Tüm verileri en düşük toplam cpm ile (kesirler 25\u201296) ile örnekteki toplam cpm'yi diğer örneklerin toplam cpm'sine (25-96 kesirlerde) en düşük cpm ile bölerek normalleştirin. Elde edilen faktör daha sonra faktör ile her kesir cpm çarparak her kesir cpm normalleştirmek için kullanılabilir.
NOT: Sonunda, 25. Yalnızca normalleştirilmiş çalıştırmalar aynı grafik/şekil içinde sunulmalıdır (gerçek profiller olarak sunulduğunda). Ek Şekil 2, bu hesaplama adımlarının nasıl yapıldığına bir örnek gösterir (basitleştirme için iki örneğin yalnızca kesirleri kullanılarak 25-35). Ancak, bazı durumlarda verileri normalleştirmek gerekli değildir. Örneğin, zirveler adım 7.4'e göre sayısallaştırıldığında ve toplam InsPs yüzdeleri olarak sunulduğunda (Şekil 3D'degösterildiği gibi). Daha önce de belirtildiği gibi, profil olarak yan yana birden fazla analiz sunarken veya gerçek ölçülen aktivite sonuç olarak kullanıldığında (örneğin, tedavi a) insp7%x% kontrol göre, her iki örnek ve toplam InsPs yüzdesine değil InsP7 cpm değerleri atıfta artar normalleştirme gereklidir. Genotip veya tedavi farklılıklarının etiketleme verimliliği üzerindeki etkisini analiz not etmek için, bu farklılıkları geçersiz kacağı için normalleşmemekönemlidir. Ancak, bu protokol ile çıkarma verimliliği çeşitli nedenlerle değişken olabilir ve hatta bazen aynı genotip ve tedavi nin kopyaları analiz edildiğinde gözlenen bu yöntem ile mutlak nicelik zordur. Analizler için kullanılan HPLC sistemine, sütuna ve degradeye bağlı olarak, kesmenin değiştirilmesi gerekebileceğini unutmayın. - Belirli inositol polifosfat zirvelerinin göreceli niceliklerini gerçekleştirmek ve daha sonra istatistiksel analizler için replikasyonverilerini içeren çubuk grafikler oluşturmak için, analize kromatografilerin en yüksek alanlarını hesaplayabilen özel bir yazılımla devam edin (örn. Origin). Bkz. Ek Şekil 3.
NOT: Yazılım denetiminde olan Çoğu HPLC sistemi, bu görevi yapabilecek ilgili bir yazılımla birlikte verilir. Tepeler, arka plan üzerinde cpm değerleri olan kesirler (çalıştırmalar arasında belirli bir dereceye kadar değişir) ve daha önce yayımlanmış verilere benzer bekletme süreleri olarak belirlenir. Belirli bir tepenin bekletme süresi elektronik tablo yazılımında (örneğin, Excel) belirlenir ve belirli integrallerin hesaplanması için zirveler atamak için kullanılır (örneğin, Origin'de). Ek Şekil 3, tepe belirleme, arka plan çıkarma ve zirvelerin entegrasyonu bu süreci göstermektedir.
Representative Results
Burada gösterilen sonuçlar, teknik ve biyolojik düzeylerdeki değişimlere göre elde edilen olası sonuçları göstermeyi amaçlamaktadır. Bunlardan ilki, yeni ve yaşlı sütunlar(Şekil 1)ve taze ve depolanmış numuneler(Şekil 3)kullanılarak yapılan analizlerle örneklenirken, ikincisi iki farklı bitki sisteminden alınan ekstreler değerlendirilerek, A. thaliana (Şekil 1, Şekil 3) ve L. japonicus (Şekil 2).
Optimal Bir SAX-HPLC çalıştırmak Şekil 1A\u2012Ctasvir edilir , Hangi scintillation sayma sonra A. thaliana özleri elde edilen tam bir inositol polifosfat spektrumgösterir. Zirvelerin güzelce ayrılmış olduğunu ve daha önce açıklanan kromatografik mobilitelere göre farklı izomerlere (veya enantiomer çiftlerine) atanabileceğini unutmayın5,7.
Şekil 2, Arabidopsis fideleri ile aynı koşullarda yetiştirilen ve etiketlenen L. japonicus fidelerinin SAX-HPLC analizinin temsili sonucunu göstermektedir. Arabidopsis'ten bilinen tüm InsP türleri ve zirveleri görülebilirken, her iki türün profillerini karşılaştırırken belirli InsP izomerlerinin göreceli (örneğin, izomerler arasındaki oranlar) miktarı ile ilgili önemli farklılıklar vardır. Örneğin, Lotus özleri artmış InsP3cgösterdi , InsP4b, InsP5b ve azaltılmış InsP3a, InsP4a, InsP5a ve InsP5c arabidopsis ile karşılaştırıldığında hangi daha fazla araştırma için yer bırakır. Şekil 2D Arabidopsis ve Lotusarasındaki InsP izomerleri arasındaki farklı oranları göstermektedir.
Şekil 3, çıkarmadan sonra bölünen bir örneğin iki InsP profilini gösterir. İlk yarısı hemen analiz edildi ve ikinci yarısı bir gün sonra, -80 °C'de depolandıktan sonra. Farklı örnekler (şekil 3A\u2012Cve Şekil 3D'dekisiyah ve kırmızı çizgiler) arasında yalnızca küçük farklar gözlendiğini unutmayın. Bu, bir donma-çözülme döngüsünün örneğe zarar vermediğini ve yöntemin kendisinin tekrarlanabilir sonuçlar ürettiğini gösterir.
Şekil 1: Bu protokol ile gerçekleştirilen başarılı ve başarısız bir SAX-HPLC analizinin tipik InsP profili. (A\u2012C) SAX-HPLC profili 17 günlük yabani tip (Col-0) Arabidopsis fidesi radiolabeled [3H]-myo-inositol. Global InsP ekstraksiyonu ve SAX-HPLC çalışması aynı gün gerçekleştirildi. (A) Tam spektrum; (B, C) A'da gösterilen profilin yakınlaştırır. Tüm görünür zirveler vurgulanır ve ilgili InsP türlerine atanır. Yayınlanan kromatografik mobilitelere5 dayanarak5,7, InsP4a büyük olasılıkla Ins(1,4,5,6)P4 veya Ins(3,4,5,6)P4, InsP5a insP5 [2-OH] temsil eder, InsP5b, InsP5 [4-OH] veya enantiomerik formunu insP5 [6-OH], InsP5c ise InsP5 [1-OH] veya enantiomerik formunu temsil eder. InsP3a-c,InsP4b, InsP7ve InsP8'in izobik doğası hala bilinmemektedir. Panel(D),aynı şekilde yetiştirilen bitkilerin SAX-HPLC profilini ancak yaşlı bir sütun (>40 çalışır) kullanarak gösterir. InsP6'da diğer InsP türlerine göre net bir azalma ve PP-InsP yokluğu görülebilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: L. japonicus bitkilerin Temsilci InsP profili. SAX-HPLC profili (A\u2012C) 17 günlük yabani tip (Gifu) L. japonicus fideleri radiolabeled [3H]-myo-inositol. (A) Tam spektrum; (B, C) A'da gösterilen profilin yakınlaştırır. Tüm görünür zirveler vurgulanır ve ilgili InsP türlerine atanır. Yayınlanan kromatografik mobilitelere dayanarak5,7, InsP4a büyük olasılıkla Ins(1,4,5,6)P4 veya Ins(3,4,5,6)P4, InsP5b büyük olasılıkla InsP5 [4-OH] veya enantiomerik formu InsP5 [6-OH], ve InsP5c büyük olasılıkla InsP5 [1-OH] veya enantiomerik formu InsP5 [3-OH] temsil eder. InsP3a-c,InsP4b, InsP7ve InsP8'in izobik doğası bilinmemektedir. (D) A. thaliana 'nın (Şekil 1A\u2012C'denelde edilen veriler) ve L. japonicus'un (Şekil2A-C'denelde edilen veriler) bireysel InsP türleri (elüsyondan kaynaklanan toplam aktivitenin %25'inde) karşılaştırması). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: SAX-HPLC analizlerinin tekrarlanabilirliğini gösteren bölünmüş bir numunenin InsP profilleri. (A\u2012C) 17 günlük yabani tip (Col-0) Arabidopsis fidelerinin SAX-HPLC profilleri [3H]-myo-inositol ile etiketlenmiştir. Çalışmadan önce, numune ikiye bölündü ve bir yarısı hemen, diğer yarısı ise birAgün sonra -80 °C.'de depolandıktan sonra tam spektrum; (B, C) A'da gösterilen profilin yakınlaştırır. Tüm görünür zirveler vurgulanır ve ilgili InsP türlerine atanır. Yayınlanan kromatografik mobilitelere dayanarak5,7, InsP4a büyük olasılıkla Ins(1,4,5,6)P4 veya Ins(3,4,5,6)P4, InsP5a insP5 [2-OH] temsil eder, InsP5a InsP5 [2-OH], InsP5b InsP5 [4-OH] veya enantiomerik formu InsP5 [6-OH] temsil eder ve InsP5c insP5 [1-OH] veya enantiomerik formu InsP5 [3-OH]. InsP3a-c,InsP4b, InsP7ve InsP8'in izobik doğası hala bilinmemektedir. Panel D, Her iki çalıştırmanın InsP6 ve PP-InsPs InsP7 ve InsP8'inin niceliğini gösterir. Değerler miktarı temsil ediyor (% içinde) ilgili InsP türlerinin tüm InsP'ye göre (elüsyondan toplam aktivite 25-96). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil 1: Hafif bir sintillasyon sayacı kullanarak sıvı sintillasyon için yazılım ayarları. Yazılım sürümünü gösteren ekran görüntüleri ve bu protokolle gerçekleştirilen[3H] örneklerinin sintilasyon sayımı için kullanılan ayarlar gösterilmiştir. Bu rakamı indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Şekil 2: Veri normalleştirmenin temsili örneği. Çalışma sayfasının ekran görüntüsü, SAX-HPLC'yi normalleştirmek için kullanılan tüm adımları ve formülleri gösterir. Basitleştirme için örneklerin yalnızca 25-35 kesirleri gösterilir. Bu rakamı indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Şekil 3: Analiz yazılımı kullanılarak tepe belirleme, arka plan çıkarma ve entegrasyon. (A) SAX-HPLC analizinden elde edilen veriler yazılıma yüklenir (dakika 28-96) ve tepe analiz aracı seçilir. (B\u2012E) Taban çizgisi, tek tek zirveler arasındaki noktaları ayarlayarak el ile tanımlanır ve arka plan çıkarılır. (F) Tepeler görünüme göre manuel olarak belirlenir ve yayınlanan kromatografik mobiliteler5,7. (G) Tepe aralıkları cpm değerleri ile el ile tanımlanır. (H) Zirveler tüm tepelerin %'si olarak entegre edilir ve hesaplanır. Bu rakamı indirmek için lütfen tıklayınız.
Discussion
Burada bitki özlerinde PP-InsPs dahil InsPs ölçmek ve bu yöntemin nasıl kurulabilir pratik ipuçları sağlamak için çok yönlü ve hassas bir yöntem salıyoruz. Protokol genellikle sağlam olsa da, suboptimal çalışır ve analizler oluşabilir. Çoğu durumda, bu çalışır güçlü bir azalma ya da yüksek fosforiile InsPs, özellikle PP-InsP türleri InsP7 ve InsP8tam kaybı ile tespit edilebilir. Olası nedenler, bitki materyalinin mikrobiyal kontaminasyonları ve endojen bitki PP-InsP hidrolazlarının yetersiz öğütme ve ekme tamponu ile hemen temas etmeyecek bitki materyalinin erimesi nedeniyle ekstraksiyon sırasında yetersiz deaktivasyonu olabilir. Diğer nedenler arasında nötralizasyon arabelleği yetersiz veya aşırı ilave sayılarak yanlış pH ayarı veya sadece yetersiz numune materyali sayılabilir. Bu genellikle hücrelerde çok düşük miktarlarda mevcut olduğundan ikincisi, PP-InsPs tespit etmek zor yapabilirsiniz. Adım 3.5 sırasında numune materyalinin fazlalığı veya verimsiz kuruma perklorik asitin seyreltilmesine neden olabilir, bu nedenle yetersiz enzim deaktivasyonuna ve insP6 ve PP-InsP'lerin özel kaybına da yol açabilir. Bu protokolde kullanılan tesis malzemesi ve radyoetiketi nin miktarı maliyet ve performansa göre optimize edilebilmiş ve bu nedenle en iyi sonuçları sağlamak için hala yeterli olan en düşük tutara yakındır. Buna ek olarak, sütun reçine yavaş yavaş çözünürlük kapasitesini kaybeder. Bu sürecin ilk işareti (yazarlar için tamamen açık olmayan nedenlerle) HPLC spektrumundaki PP-InsPs gibi yüksek fosforlu InsP türlerinin belirli bir kaybıdır. Daha fazla yaşlanma ile, hatta InsP6 sütun(Şekil 1D)tarafından düzgün çözülmüş olmayacaktır. Bu nedenle, yeterli bir sütunun kullanımının yanı sıra numunenin titizlikle taşınması ve HPLC bileşenlerinin doğru bakımı doğru sonuçların sağlanması için çok önemlidir.
Numuneleri ve çalıştırmaları karşılaştırırken, özellikle farklı ekipmanlarla (örneğin, HPLC sistemleri ve sütunları) veya farklı günlerde oluşturulduğunda, numunelerin birbirleriyle normalleştirilmesi (adım 7.3'te açıklandığı gibi) ve bunları aynı şekilde analiz etmek çok önemlidir. Sadece normalleştirme yoluyla aynı grafikte birden fazla örnek göstermek mümkündür (Şekil 3). Toplam InsPs'e veya başka bir InsP türüne göre tek tek InsPs'lerin sayısallaştırılması için, yalnızca göreli değerler ve mutlak değerler gösterilmedikçe normale dönmek gerekmez. İdeal olarak, hem InsP profilleri hem de nicelikselleştirmeler gösterilir. Ancak, bazı durumlarda aynı grafikte iki veya daha fazla çalıştırmayı yeterli şekilde göstermek mümkün değildir. Farklı saklama süreleri veya farklı arka plan aktivitesi düzeyleri, tek başına ölçülmemiş SAX-HPLC profillerini karşılaştırmayı zorlaştırabilir. Birçok örnek karşılaştırılmak gerektiğinde aynı doğrudur. Bu gibi durumlarda, bireysel tepe ölçme için ek bir yazılım (örneğin, Origin) kullanılarak daha fazla değerlendirme gereklidir.
Yazarlar burada açıklanan protokolün optimize edilebildiğini ve her bir araştırma sorusuna uyarlanması gerektiğinin farkındadırlar. Arabidopsis özleri için optimize edilmiş olmasına rağmen7,17 Bu protokolde, bu yöntem çok yönlüdür ve diğer bitki türlerinin InsP profillerinin belirlenmesine de yardımcı olabilir. Burada ilk kez l. japonicusiçin bir InsP profili sunarak bu olasılığı örneklemektedir , hangi etiketleme koşulları hiçbir değişiklik gerekli, InsP çıkarma veya SAX-HPLC çalıştırmak (Şekil 2). Özellikle, genel olarak benzer olmakla birlikte, L. japonicus ve Arabidopsis InsP profilleri arasında farklılıklar gözlenmektedir. Örneğin, L. japonicus InsP5 [4-OH] veya enantiomerik formu InsP5 [6-OH] daha fazla InsP5 [1-OH] veya enantiomerik formu InsP5 [3-OH] Arabidopsisgöre , nerede InsP5 [1-OH] veya enomerantiic formu InsP5 [3-OH] daha fazla dır Baskın InsP türleridir.5 Aynı şekilde, medya bileşimindeki değişikliklerin, [3H]- myo -inositolkonsantrasyonu,bitki yaşı, çevre koşulları (örneğin, ışık ve sıcaklık), kimyasal bileşiklerin eklenmesi veya diğer faktörler arasındaki bitki-mikrobiyal etkileşimlerin analizlerinin test edilmesi ve uyarlanabileceği öngörüyoruz.
Bu yöntemin dikkate alınması gereken önemli bir dezavantajı etiketleme çoğu kara bitkileri için fizyolojik bir ortam temsil etmez (steril) sıvı kültür, yapılır olmasıdır. Buna ek olarak, [³H]-myo-inositol yüksek maliyetler nedeniyle, etiketleme çözeltisi hacmi ve kültür kabının boyutu genellikle sınırlıdır, hangi da kullanılabilir bitkilerin boyutunu kısıtlar. Sıvı kültürde ekimi doğrudan örneğin toprakta yetiştirilen bitkilerin yaprakları [³H]-myo-inositol ve daha sonra burada açıklanan protokolü izleyerek sızma önlenebilir, daha önce bildirilen10.
Bu protokolün, TiO2 pull-down ve ardından PAGE veya kütle spektrometresi teknikleri gibi alternatif yöntemlerle karşılaştırıldığında çeşitli dezavantajları vardır. [3H]-myo-inositol etiketlemesi nedeniyle, sonunda sadece radyoetiketli myo-inositol'den kaynaklanan InsP türleri tespit edilir. Burada açıklanan yöntem scyllo-inositol ve diğer izomerleri bazı bitkilerde tespit edilmiştir gibi diğer Ins izomerleri kör44. Ayrıca, diğer yollardan elde edilen myo-InsPs, miyo-inositol ve myo-inositol-3-fosfat isomerizasyonu yoluyla miyo-6-fosfat, miyo-inositol-3-fosfat sintaz (MIPS) proteinleri45de novo sentezi ile sentezlenenler de dahil olmak üzere dışlanacaktır. [32P] veya[33P]-orto-fosfat alternatif etiket olarak kullanılabilse de, bunların kullanımı büyük bir dezavantaj teşkil eder, çünkü bol nükleotitler ve türevleri de dahil olmak üzere her fosfat içeren molekül etiketlenecektir. Bu moleküller de bu protokol ile ayıklanabilir ve SAX sütununa bağlanabilir, hangi bireysel InsP zirveleri belirlenmesi ile müdahale edecek arka plan aktivitesi yüksek düzeyde neden olacak5. Buna ek olarak,[32P]- veya [33P] -etiketli InsPs ve PP-InsPs'lerin sayısallaştırılması fosfat ve pirofosfat moiety cirosundan güçlü bir şekilde etkilenebilir ve inositol türleri için kitlesel bir okuma rapor olmayabilir.
Diğer taraftan, [3H]-myo-inositol özellikle myo-inositol içeren molekülleri etiketler. InsPs, inositol içeren lipidler, fosfoinositititler gibi, ve galactinol bu durumda etiketli. Ancak, lipidler ekstraksiyon tamponunda çözünmez olduğundan ve galactinol SAX sütununa bağlanmadığından, sadece InsPs bu protokol ile analiz edilecektir.
Şimdiye kadar, tio2 pulldown/PAGE tarafından belirlenen bir etiketle karşılaştırıldığında [3H]-myo-inositol etiketlemesi tarafından oluşturulan bir bitki InsP profilinden farklar bilinmemektedir, çünkü bu tür karşılaştırmalar bitkilerde yapılmamıştır. Hayvan hücreleri üzerinde yapılan yeni bir çalışmada bu soru46ele alınmıştır. Bu çalışmada, glukoz-6-fosfattan doğrudan türetilmiş olması gereken [3H]-myo-inositol etiketleme tarafından görülemeyen insP6 havuzu, SAX-HPLC profilleri nin memeli hücre hatlarının PAGE jelleri ile karşılaştırılması yla tanımlanmıştır. 24 saat fosfat açlığı, TiO2 pulldown kullanılarak saflaştırılan InsPs PAGE jellerini ölçerken InsP6'da %150'lik bir artışa yol açtı. [3 H]-myo3-inositol etiketli hücrelerin sax-HPLC analizleri aynı şekilde tedavi edilen hücrelerin sadece %15 oranında bir artış gösterdiğini[3H]-InsP6. Daha önce de belirtildiği gibi, InsP5'ten daha düşük InsPs çoğu durumda PAGE analizi ile tespit edilemez. SAX-HPLC'nin ardından gelen radyoetiketleme, kütle spektrometrik protokolleri bu negatif yüklü molekül grubunu tespit etmek için optimize edilmedikçe tercih edilen yöntem gibi görünmaktadır.
Kalan bir diğer zorluk sax-HPLC analizlerinde (veya InsP analizi için başka bir yöntemde)10,,17enantiomerleri ayırt etmektir. Bu sorun chiral seçiciler eklenmesi ile ele alınabilir, yani, L-arginin amid gibi enantiopure bileşiklerin ilgili enantiomerik moleküller ile etkileşim e-diyanjiyom kompleksleri oluşturmak için10. Bildiğimiz kadarıyla, bu yaklaşım sadece enantiomerik InsP5 izomerleri InsP5 [1-OH] ve InsP5 [3-OH] NMR analizleri10tarafından ayırt etmek için uygulanmıştır. Diğer enantiomerik çiftlerin ayrımcılığı veya chiral SAX-HPLC analizi veya chiral PAGE tabanlı yöntemlerle enantiomerlerin başarılı bir şekilde ayrımcılığı henüz rapor edilmemiştir ve daha da geliştirilmelidir. Korunmuş sentezi ve pp-InsPs korunmuş düzenleme fosfor kullanılabilirliği ile göz önüne alındığında, biz page veya MS tabanlı yöntemler gibi özellikle radyoaktif olmayan yöntemler, besin analizleri ile birlikte, bitkileri besin eksiklikleri teşhis etmek için tasarlanmış uzaktan algılama verileri kalibre etmek için zemin doğrulayıcı çabaları yardımcı olacağını öngörüyoruz17,18,24,25. Ancak, burada sunulan yöntem şu anda hala InsP analizleri için altın standart olarak kabul edilebilir ve bitkilerde bu ilginç haberciler yeni işlevleri keşfetmek için etkili olacaktır.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu çalışma Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Alman Araştırma Vakfı) tarafından Almanya'nın Mükemmellik Stratejisi kapsamında finanse edilmiştir - EXC-2070 - 390732324 (PhenoRob), Araştırma Eğitim Grubu GRK2064 ve bireysel araştırma hibe SCHA1274/4-1 ve SCHA1274/5-1 G.S.'e. Li Schlüter ve Brigitte Ueberbach'a da teknik yardımları için teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Centrifuge | Eppendorf AG | model: 5430 R | |
| Diammonium hydrogen phosphate, ≥97 % | Carl Roth GmbH + Co. KG | 0268.1 | |
| Ethylenediamine tetraacetic acid disodium salt dihydrate, ≥99 %, p.a., ACS | Carl Roth GmbH + Co. KG | 8043.2 | |
| Falcon 12-well clear flat bottom TC-treated multiwell cell culture plate, with lid, individually wrapped, sterile | Corning Inc. | 353043 | |
| Fraction collector | LAMBDA Instruments GmbH | model: OMNICOLL single channel collector | |
| Growth incubator | poly klima GmbH | model: PK 520-LED | |
| HPLC pumps | Kontron Instruments | model: 420 | |
| HPLC syringe for Rheodyne valves, 1 mL | Hamilton Company | 81365 | |
| Injector for HPLC | Supelco | model: Rheodyne 9725 | |
| Inositol, myo-[1,2-3H(N)] | American Radiolabeled Chemicals Inc. | ART 0261 | |
| Liquid nitrogen | University, Chemistry Department | ||
| Liquid scintillation counter | PerkinElmer Inc | model: TRI-CARB 2900TR | |
| Micro pestle | Carl Roth GmbH + Co. KG | CXH7.1 | |
| Mixed cellulose Eester filter, ME range (ME 24), plain, 0.2 µm pore size, 47 mm circle | GE Healthcare Life Sciences | 10401770 | |
| Mixer for HPLC | Kontron Instruments | model: M 800 | |
| Murashige & Skoog medium, salt mixture | Duchefa Biochemie | M0221 | |
| OriginPro software | OriginLab Corp. | ||
| Orthophosphoric acid, ≥85 %, p.a., ISO | Carl Roth GmbH + Co. KG | 6366.1 | |
| Partisphere 5 µm SAX cartridge column, 125 x 4.6 mm | Hichrom Limited | 4621-0505 | |
| Perchloric acid, 70 %, 99.999 % trace metals basis | Sigma-Aldrich | 311421 | |
| Petri dish, square, PS, clear, 120/120/17 mm, sterile | Greiner Bio One International GmbH | 688161 | |
| pH-indicator paper pH 5.5 - 9.0, Neutralit | Merck KGaA | 109564 | |
| Phytagel | Sigma-Aldrich | P8169 | |
| Potassium carbonate | Carl Roth GmbH + Co. KG | P743.2 | |
| Safe-Lock tubes, 1.5 mL | Eppendorf AG | 30120086 | |
| Sample loop for 9725 injectors, volume 2 mL, PEEK | Supelco | 57648 | |
| SNAPTWIST scintillation vial, 6.5 mL | Simport Scientific Inc. | S207-5 | |
| Sterile bench | LaboGene | model: ScanLaf MARS 900 | |
| Sucrose, ≥99,5 %, p.a. | Carl Roth GmbH + Co. KG | 4621.1 | |
| Ultima-Flo AP liquid scintillation cocktail | PerkinElmer Inc | 6013599 | |
| Ultra-pure deionized water | Milli-Q | ||
| Wrenchless WVS End Fitting Kit | Hichrom Limited | 4631-1001 |
References
- Berridge, M. J., Irvine, R. F. Inositol Phosphates and Cell Signaling. Nature. 341 (6239), 197-205 (1989).
- Streb, H., Irvine, R. F., Berridge, M. J., Schulz, I. Release of Ca-2+ from a Nonmitochondrial Intracellular Store in Pancreatic Acinar-Cells by Inositol-1,4,5-Trisphosphate. Nature. 306 (5938), 67-69 (1983).
- Krinke, O., Novotna, Z., Valentova, O., Martinec, J. Inositol trisphosphate receptor in higher plants: is it real. Journal of Experimental Botany. 58 (3), 361-376 (2007).
- Kuo, H. F., et al. Arabidopsis inositol pentakisphosphate 2-kinase, AtIPK1, is required for growth and modulates phosphate homeostasis at the transcriptional level. Plant Journal. 80 (3), 503-515 (2014).
- Kuo, H. F., et al. Arabidopsis inositol phosphate kinases IPK1 and ITPK1 constitute a metabolic pathway in maintaining phosphate homeostasis. Plant Journal. 95 (4), 613-630 (2018).
- Gillaspy, G. E. Lipid-mediated Protein Signaling. Capelluto, D. G. S. , Springer. Netherlands. 141-157 (2013).
- Stevenson-Paulik, J., Bastidas, R. J., Chiou, S. T., Frye, R. A., York, J. D. Generation of phytate-free seeds in Arabidopsis through disruption of inositol polyphosphate kinases. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (35), 12612-12617 (2005).
- Lemtiri-Chlieh, F., MacRobbie, E. A. C., Brearley, C. A. Inositol hexakisphosphate is a physiological signal regulating the K+-inward rectifying conductance in guard cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (15), 8687-8692 (2000).
- Lee, H. S., et al. InsP6-sensitive variants of the Gle1 mRNA export factor rescue growth and fertility defects of the ipk1 low-phytic-acid mutation in Arabidopsis. Plant Cell. 27 (2), 417-431 (2015).
- Blüher, D., et al. A 1-phytase type III effector interferes with plant hormone signaling. Nature Communications. 8, (2017).
- Murphy, A. M., Otto, B., Brearley, C. A., Carr, J. P., Hanke, D. E. A role for inositol hexakisphosphate in the maintenance of basal resistance to plant pathogens. Plant Journal. 56 (4), 638-652 (2008).
- Poon, J. S. Y., Le Fevre, R. E., Carr, J. P., Hanke, D. E., Murphy, A. M. Inositol hexakisphosphate biosynthesis underpins PAMP-triggered immunity to Pseudomonas syringae pv. tomato in Arabidopsis thaliana but is dispensable for establishment of systemic acquired resistance. Molecular Plant Pathology. 21 (3), 376-387 (2020).
- Wild, R., et al. Control of eukaryotic phosphate homeostasis by inositol polyphosphate sensor domains. Science. 352 (6288), 986-990 (2016).
- Shears, S. B. Inositol pyrophosphates: Why so many phosphates. Advances in Biological Regulation. 57, 203-216 (2015).
- Shears, S. B. Intimate connections: Inositol pyrophosphates at the interface of metabolic regulation and cell signaling. Journal of Cellular Physiology. 233 (3), 1897-1912 (2018).
- Desai, M., et al. Two inositol hexakisphosphate kinases drive inositol pyrophosphate synthesis in plants. Plant Journal. 80 (4), 642-653 (2014).
- Laha, D., et al. VIH2 Regulates the Synthesis of Inositol Pyrophosphate InsP8 and Jasmonate-Dependent Defenses in Arabidopsis. Plant Cell. 27 (4), 1082-1097 (2015).
- Laha, D., et al. Arabidopsis ITPK1 and ITPK2 Have an Evolutionarily Conserved Phytic Acid Kinase Activity. Acs Chemical Biology. 14 (10), 2127-2133 (2019).
- Dorsch, J. A., et al. Seed phosphorus and inositol phosphate phenotype of barley low phytic acid genotypes. Phytochemistry. 62 (5), 691-706 (2003).
- Flores, S., Smart, C. C. Abscisic acid-induced changes in inositol metabolism in Spirodela polyrrhiza. Planta. 211 (6), 823-832 (2000).
- Brearley, C. A., Hanke, D. E. Inositol phosphates in barley (Hordeum vulgare L) aleurone tissue are stereochemically similar to the products of breakdown of InsP(6) in vitro by wheat-bran phytase. Biochemical Journal. 318, 279-286 (1996).
- Laha, N. P., et al. ITPK1-Dependent Inositol Polyphosphates Regulate Auxin Responses in Arabidopsis thaliana. bioRxiv. , (2020).
- Laha, D., et al. Inositol Polyphosphate Binding Specificity of the Jasmonate Receptor Complex. Plant Physiology. 171 (4), 2364-2370 (2016).
- Dong, J. S., et al. Inositol Pyrophosphate InsP(8) Acts as an Intracellular Phosphate Signal in Arabidopsis. Molecular Plant. 12 (11), 1463-1473 (2019).
- Zhu, J., et al. Two bifunctional inositol pyrophosphate kinases/phosphatases control plant phosphate homeostasis. Elife. 8, (2019).
- Couso, I., et al. Synergism between Inositol Polyphosphates and TOR Kinase Signaling in Nutrient Sensing, Growth Control, and Lipid Metabolism in Chlamydomonas. Plant Cell. 28 (9), 2026-2042 (2016).
- Ito, M., et al. Hydrophilic interaction liquid chromatography-tandem mass spectrometry for the quantitative analysis of mammalian-derived inositol poly/pyrophosphates. Journal of Chromatography A. 1573, 87-97 (2018).
- Wilson, M. S. C., Saiardi, A. Inositol Phosphates Purification Using Titanium Dioxide Beads. Bio-Protocol. 8 (15), (2018).
- Loss, O., Azevedo, C., Szijgyarto, Z., Bosch, D., Saiardi, A. Preparation of Quality Inositol Pyrophosphates. Jove-Journal of Visualized Experiments. (55), e3027 (2011).
- Harmel, R. K., et al. Harnessing C-13-labeled myo-inositol to interrogate inositol phosphate messengers by NMR Electronic supplementary information (ESI) available. Chemical Science. 10 (20), 5267-5274 (2019).
- Azevedo, C., Saiardi, A. Extraction and analysis of soluble inositol polyphosphates from yeast. Nature Protocols. 1 (5), 2416-2422 (2006).
- Shears, S. B. Inositol Phosphates: Methods and Protocols. Miller, G. J. , Springer US. 1-28 (2020).
- Wilson, M. S. C., Saiardi, A. Importance of Radioactive Labelling to Elucidate Inositol Polyphosphate Signalling. Topics in Current Chemistry. 375 (1), (2017).
- Stevenson-Paulik, J., et al. Inositol phosphate metabolomics: Merging genetic perturbation with modernized radiolabeling methods. Methods. 39 (2), 112-121 (2006).
- Liu, C., Riley, A. M., Yang, X., Shears, S. B., Potter, B. V. L. Synthesis and Biological Activity of d- and l-chiro-Inositol 2,3,4,5-Tetrakisphosphate: Design of a Novel and Potent Inhibitor of Ins(3,4,5,6)P4 1-Kinase/Ins(1,3,4)P3 5/6-Kinase. Journal of Medicinal Chemistry. 44 (18), 2984-2989 (2001).
- Hughes, P. J., Hughes, A. R., Putney, J. W., Shears, S. B. The regulation of the phosphorylation of inositol 1,3,4-trisphosphate in cell-free preparations and its relevance to the formation of inositol 1,3,4,6-tetrakisphosphate in agonist-stimulated rat parotid acinar cells. Journal of Biological Chemistry. 264 (33), 19871-19878 (1989).
- Shears, S. B., Kirk, C. J., Michell, R. H. The pathway of myo-inositol 1,3,4-trisphosphate dephosphorylation in liver. The Biochemical journal. 248 (3), 977-980 (1987).
- Stevenson-Paulik, J., Odom, A. R., York, J. D. Molecular and Biochemical Characterization of Two Plant Inositol Polyphosphate 6-/3-/5-Kinases. Journal of Biological Chemistry. 277 (45), 42711-42718 (2002).
- Stephens, L. R., Hawkins, P. T., Downes, C. P. An analysis of myo-[3H]inositol trisphosphates found in myo-[3H]inositol prelabelled avian erythrocytes. The Biochemical journal. 262 (3), 727-737 (1989).
- Saiardi, A., et al. Mammalian inositol polyphosphate multikinase synthesizes inositol 1,4,5-trisphosphate and an inositol pyrophosphate. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98 (5), 2306 (2001).
- Azevedo, C., Burton, A., Bennett, M., Onnebo, S. M. N., Saiardi, A. Inositol Phosphates and Lipids: Methods and Protocols. Barker, C. J. , Humana Press. 73-85 (2010).
- Saiardi, A., Caffrey, J. J., Snyder, S. H., Shears, S. B. The Inositol Hexakisphosphate Kinase Family: CATALYTIC FLEXIBILITY AND FUNCTION IN YEAST VACUOLE BIOGENESIS. Journal of Biological Chemistry. 275 (32), 24686-24692 (2000).
- Brearley, C. A., Hanke, D. E. Inositol phosphates in the duckweed Spirodela polyrhiza L. Biochemical Journal. 314, 215-225 (1996).
- Pollard, J. K., Steward, F. C., Shantz, E. M. Hexitols in Coconut Milk - Their Role in Nurture of Dividing Cells. Plant Physiology. 36 (4), 492 (1961).
- Donahue, J. L., et al. The Arabidopsis thaliana Myo-inositol 1-phosphate synthase1 gene is required for Myo-inositol synthesis and suppression of cell death. Plant Cell. 22 (3), 888-903 (2010).
- Desfougeres, Y., Wilson, M. S. C., Laha, D., Miller, G. J., Saiardi, A. ITPK1 mediates the lipid-independent synthesis of inositol phosphates controlled by metabolism. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (49), 24551-24561 (2019).
