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Biochemistry

SAX-HPLCを用いた異種植物由来の可溶性、放射性標識イノシトールポリリン酸塩の抽出と定量化

Published: June 26, 2020 doi: 10.3791/61495
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Plant Nutrition, Institute of Crop Science and Resource Conservation, University of Bonn

Summary

ここでは、植物中のイノシトールポリリン酸塩を検出し定量する高感度の方法である[3H]-ミオ-イノシトール標識苗の強力なアニオン交換高速液体クロマトグラフィーについて述べた。

Abstract

イノシトールのリン酸エステルは、イノシトールリン酸塩(InsPs)とも呼ばれますが、植物生理学において重要な役割を果たしている細胞レギュレータのクラスです。その負の電荷、低い存在量、加水分解活動への感受性が低いため、これらの分子の検出と定量は困難です。これは特に、イノシトールピロリン酸塩(PP-InsPs)と呼ぶ「高エネルギー」ジホスホ結合を含む高リン酸化形態の場合である。その高感度により、強いアニオン交換高速液体クロマトグラフィー(SAX-HPLC)を標識植物の[3H]-ミオ-イノシトールは、現在これらの分子を分析する選択の方法です。植物苗の放射標識に[3H]-ミオ-イノシトールを用いることで、いくつかの非異性体を含む様々なInsP種を検出し、高感度で識別することができる。ここでは、適切なSAX-HPLCシステムの設定について説明し、植物栽培、放射性標識およびInsP抽出からSAX-HPLCの実行とその後のデータ分析への完全なワークフローを説明します。ここで提示されるプロトコルは、いくつかの非異性体およびPP-InsP、InsP7およびInsP8を含む様々なInsP種の識別および定量化を可能にし、他の植物種に容易に適応することができる。例として、シロイヌナズナおよびロータスジャポニクス苗のSAX-HPLC分析が行われ、完全なInsPプロファイルが提示され、議論される。ここで説明する方法は、植物におけるInsPの生物学的役割をよりよく理解するための有望なツールを表しています。

Introduction

約40年前、イノシトールリン酸塩(InsP)は、Ins(1,4,5)P3(InsP3)が動物3細胞1,22におけるCa2+の受容体媒介放出を活性化する第二のメッセンジャーとして同定された後、シグナル1伝達分子として出現した。現在までに、植物ではInsP3受容体(IP3-R)が同定されておらず、植物細胞3におけるInsP3の直接的なシグナル伝達の役割を問う。いずれにせよ、InsP,3は、特定のシグナル経路,,33、4、5、6、7、84,5の調節を含む、いくつかの植物発生プロセスに関与する他のInsPの前駆体として機能する。678例えば、InsP5,9,10,11,3は、リン酸、ミオ-イノシトールおよびカチオンの主要な供給源を表す「フィチン酸」とも呼ばれるInsP6にさらにリン酸化することができ、病原体に対する植物防御において重要な役割を果たしていることが示された。6

イノシトールピロリン酸塩(PP-InsPs)は、動物細胞、アメーバおよび酵母において最初に同定された少なくとも1つの高エネルギージホスホ結合を含むInsPのクラスであり、そこでは、種々の細胞プロセス13、14、1514,15において重要な役割を果たす。13,植物,,16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26のPP-InsPに関する精力的な作業にもかかわらず、これらの分子の生物学的機能と異性体の同一性は依然としてほとんど謎のままです。16,17,18,1920,21,22,23,242526モデル植物のシロイヌナズナにおいて、細胞InsP8は、ASK1-COI1-JAZ受容体複合体17によるInsP8および活性ジャスモネートの一致検出を介して昆虫性草食動物および壊死性真菌に対する防御を調節することを提案した。さらに、エネルギー恒常性および栄養センシングにおけるInsP8および他のPP-InsPの役割、ならびにリン酸恒常性の役割が17、23、24、25、26に提案されている。17,23,24,25,26

採用されている生体システムに関係なく、InsPを研究する際の方法論的課題の1つは、これらの分子の信頼性の高い検出と正確な定量化でした。質量分析ベースの方法は、細胞抽出物からPP-InsPを含むInsPを検出するために使用されてきました。しかし、これらの研究は、異性体26,27,27を区別することができなかった。InsP を分析する別のアプローチは、TiO2ビーズを使用した細胞ライセートからの InsP のプルダウンを採用し、続いて溶出したインスプのポリアクリルアミドゲル電気泳動 (PAGE) を採用します。InsP は、トルイジン ブルー,または DAPI24、28、29のいずれかによって染色できます。しかし、この方法を用いて植物抽出物からInsP5より低いInsPを確実に検出することは今のところ不可能である。近年、InsPの核磁気共鳴(NMR)分析に[13C]-ミノシトールを用いた方法が、強力アニオン交換高速液体クロマトグラフィー(SAX-HPLC)30の代替手段として発表された30。この技術は、SAX-HPLCと比較して同様の感度を達成し、5-InsP7の検出を可能にし、細胞抽出物からの異なる非非異性体InsP5異性体の識別を可能にすることが報告されている。しかし、NMRベースの方法の実施は、化学的に合成され、市販されていない[13C]-ミオ-イノシトールを必要とする。したがって、ほとんどの場合に採用される方法は、サンプルに[3H]-ミオ-イノシトールを用いて放射性標識し、続いてSAX-HPLC31、32、3332,33を用いる。31この技術は、放射性ミオイノシトールを植物に取り込み、専用の細胞キナーゼとホスファターゼの組み合わせ活性によって異なるInsPへの変換に基づいています。

[33H]標識インスプは、次いで、SAX-HPLCを使用して酸抽出および分画化されます。負の電荷のため、InsPsはSAX-HPLCカラムの正に帯電した定常相と強く相互作用し、リン酸濃度を増加させるバッファー勾配で溶出して、カラムからInsPを上回ることができます。溶出時間は、このように分離されるInsP種の電荷と幾何学に依存する。キラル列がない場合、非異性体だけがこのプロトコルで分離することができます。ただし、放射ラベル規格は、特定のInsPピークの異性素性を割り当てる場合に使用できます。様々な研究所が、(バイオ)化学法でラベル付けされた非標識規格を生成したり、様々な細胞や生物から精製したりするための様々な取り組みは、特定の,InsP種にピークを割り当てるのに役立ち、また、個々のInsP種,55、7、21、34、35、36、37、38、39、40、4137,2142の43異性同一性を絞り込むのに役立ちました。34,35,36,37,38,39,40,41また、植物におけるPP-InsPの形成に至る酵素経路の最近の解明、ならびに特異的な1-フィターゼ活性を有する細菌型IIIエフェクターの発見は、これらの分析10、17、18、22、23に有用10,17,18,22,23な標準を生成する方法についての情報を提供する。

得られた分率は、トリチウム(3H)のβ崩壊による液体シンチレーションカウンターで測定することができる。標識時間が増加すると、定常同位体平衡に達し、その後、取得したInsPプロファイルはプラント31のInsPステータスを表す必要がある。他の利用可能な技術と比較して、このプロトコルの主な利点は、InsP用の直接前駆体の使用と放射性信号の測定によって達成される高感度です。

[3 H]-ミノシトール標識3植物または他の生物から抽出されたサンプルのSAX-HPLCは、一般的に、InsPの低い種からPP-InsPに至るまでのInsPの検出と定量化に使用され、InsPsの代謝、機能および作用様式をよりよく理解するための貴重なツールを表す。これまでのところ、この方法は、より低いInsP種に特別な関心を持つ研究者にとっても最も適切な選択肢です。ここで説明するプロトコルが構築されるこの手順の基本は、以前に77、21、31、34、,31,34植物由来のInsP、特にPP-InsPの分析に合わせた詳細なプロトコルがまだ欠落している。,以前の出版物は、低い豊富なPP-InsPを確実に検出する困難を報告しました。 特にInsP8は、植物材料の量が比較的少ない、植物材料の量が比較的少ない[3H]-ミオ-イノシトール(>20 Ci/mmol)、過塩素酸に基づいていないか、1Mより集中していない抽出バッファの使用、異なる中和緩衝液、ならびに3-検出器の[H-3]の検出因子に起因する。これらの研究と比較して、ここで提示されるプロトコルは、PP-InsPs,7、21、3421の信頼性の高い検出のために設計されています。734

ここでは、設備の設定から植物栽培とラベリング、InsP抽出、SAX-HPLC実行自体に至る詳細なワークフローを紹介します。この方法はモデル植物 A.タリアナに最適化されたが、モデルマメ科の最初の報告されたInsPプロファイルでここに示すように、他の植物種を研究するために容易に修正することができる 。異なる植物種の使用には何らかの最適化が必要かもしれませんが、それらは軽微であると想定し、このプロトコルは植物InsPのさらなる研究の出発点になります。可能な最適化を容易にするために、我々は、変更が可能なプロトコル内のすべてのステップ、および最初にメソッドを確立する際に困難な可能性のあるすべての重要なステップを示す。さらに、この方法で得られたデータを使用して特定のInsPを定量化する方法と、異なるサンプルを分析して比較する方法を報告します。

Protocol

1. HPLC システムのセットアップ

  1. 2つの独立したHPLCポンプ(バイナリポンプ)からなるシステムを設定します。両方のポンプは、それぞれのソフトウェアを搭載したコンピュータを介して、またはマスターポンプを持つことによって一緒に制御する必要があります。両方のポンプに対して、重力を介して、または第3の低圧ポンプを介して、ピストンシール洗浄を実施します。バッファ A (ポンプ A と呼ぶ) に対して 1 つのポンプと、バッファー B (ポンプ B と呼ぶ) に 1 つのポンプを指定します。
    注:両方とも、60バール(6 MPa)までの圧力と少なくとも0.5 mL /分の流量を生成できる必要があります。
  2. 両方のポンプをダイナミックミキサーに接続します。
  3. ミキサーを少なくとも 1 mL の容量のサンプル ループで注入バルブに接続します。
  4. 対応する端の継手を介して毛管で列に注入弁を接続します。
  5. 適切な長さのキャピラリーを使用して、列を分数コレクターに接続します。
    注: この記述は、新しい高度なシステムよりも多くの手動手順を必要とする HPLC システム ( 材料表を参照) に基づいています。当社のシステムは、すべてのコンポーネントの簡単なアクセスと変更を可能にします。第四級ポンプ(ここで説明するバイナリ勾配)も使用することができ、溶出プロファイルとバイナリポンプで達成されたものと同様の分析の全体的な品質につながります。

2. バッファー、カラム、HPLC システムの準備

  1. 可溶性インスプの抽出用バッファを準備します: 抽出バッファ (1 M HClO4) および中和バッファ (1 M K2CO3).超純度脱イオン水で両方のバッファーを準備します。彼らは数ヶ月間室温で安定しています。抽出の直前に、EDTAを両方の溶液に加え、最終的な濃度3 mM(例えば、250 mM EDTAストック溶液から)を加える。
    注意:HClO4( 過塩素酸)は強く腐食性である。
  2. SAX-HPLC 実行用のバッファーを準備します: バッファー A (1 mM EDTA) およびバッファー B (1 mM EDTA, 1.3 M (NH4)2HPO4;HH 3.8 と H3PO4)。超純イオン水を使用した後、0.2 μmの細孔サイズの膜フィルターを使用して真空ろ過を行います。これらは数ヶ月間室温で安定しています。
    注: EDTA は、InsP とのカチオンの相互作用を防ぐためにすべてのバッファーに含める必要があります。
  3. 次のようにグラデーションをプログラム: 0\u20122 分、0% バッファー B;2\u20127 分、最大 10% バッファー B。7\u201268 分、最大 84% バッファー B。68\u201282 分、最大 100% バッファ B。82\u2012100 分、100% バッファー B、100\u2012101 分、0% バッファー B まで下げる。101\u2012125 分、0% バッファー B。この勾配の最適な流量は 0.5 mL/min です。
    1. 実行中は、分 1 から分 96 まで、毎分分分の分数を収集します。勾配の残りの30分は、カラムとシステムを洗浄するのに役立ち、シンチレーションカウントのために収集する必要はありません。
  4. 可能であれば、HPLCポンプの緊急停止前に到達可能な最大圧力を80バール(8 MPa)に設定します。これにより、カラムの樹脂に 重大な損傷を与 えるのを防ぎます。
  5. 新しいSAX HPLCカラムを使用する場合は、最初の使用前に濾過された超純イオン化水で十分に洗浄してください(>50 mL)。
    注:これにより、含まれるメタノールの除去が保証され、後のステップで塩沈殿を防ぐことができます。可能であれば、別のHPLCポンプを使用してください。これが利用できない場合は、カラムを洗浄する前に、HPLCが水で洗い流されていることを確認してください。流量は2 mL/分を超えてはなりません。洗浄後、列は分析の準備が整い、適切に処理された場合は 20\u201240 の実行に使用できます。その後、解像度は連続して減少します。バッファー A (>1 時間) で長時間洗浄し、ステップ 2.6 を実行すると、カラムの寿命を延ばすことができます。解像度の低下が続く場合は、列を交換する必要があります。勾配は、特定のイノシトールポリリン酸種間の分離を増加させるか、または全体的なランタイムを減少させるために調整することができます。異なるHPLCシステム(異なるボイド体積またはキャピラリーの体積が異なる)を使用すると、保持時間に強く影響します。また、列の変更は、保持期間に影響を与えます。
  6. 「模擬実行」を実行します。抽出されたサンプルの代わりに、HPLCシステムに濾過された超純粋脱イオン水を注入し、標準の勾配を実行します。分数を収集する必要はありません。
    注: ステップ 2.6 はオプションです。ただし、次のいずれかの状況に該当する場合は、新しい列がインストールされている場合は実行する必要があります。HPLCシステムは、事前に別の方法のために使用されています。HPLCシステムは3日以上使用されていません。前の実行に問題がありました。

3. 植物栽培とラベリング[3H]-ミオ-イノシトール

注:次の手順は、ラジオラベルでの汚染から手を保護するために手袋を着用しながら、 滅菌部品 と 無菌条件下で実行する必要があります。植物培地は、特にスクロースを含む場合、微生物汚染を起こしやすい。

  1. 1 mL の A. タリアナ 種子を 1.2% 次亜塩素酸ナトリウム 3 分間殺菌し、その後 1 mL 70% エタノールを 3 分間殺菌します。その後、100%エタノールの1mLを追加し、エタノールと種子を円形のろ紙にピペットし、クリーンベンチ上の層流下で空気乾燥させます。
    1. L.ジャポニカスシードを使用する場合は、それらをモルタルに入れ、殺菌前にサンドペーパーで種子をスクラブして十分な発芽率を確保します。
  2. 半強度の村重とスクーグ(MS)塩溶液、1%のスクロース、0.7%のジェランガムをKOHでpH 5.7に調整し、少なくとも1日4°Cの暗闇の中で層化できるようにして、半強度のムラシゲとスクーグ(MS)塩溶液からなる固体成長培地で満たされた正方形のペトリ料理に1〜2列で シロイナナズナの 種をまき出し、少なくとも1日の階層化を可能にします。
    1. ロータス種子の場合は、脱イオン水で0.8%の細菌学的寒天からなる固体成長培地で満たされた正方形のペトリ皿に1列でそれらをまき出し、暗闇の中で4°Cで少なくとも3日間の層化を可能にします。
  3. 成長インキュベーターまたは気候室にプレートを垂直に置き、短い日の条件下で10〜12日間成長させます(22°Cで8 h光、20°Cで16時間暗く)。
  4. 10~20本の苗を、1%のスクロースを補った2mLの半強度MS塩溶液で満たされた12ウェルクリアフラットボトムの細胞培養プレートの1つのウェルに移し、pH 5.7に調整します。
  5. 45 μCiの[3H]-ミオイノシトール(30~80°C/mmol、90%エタノールに溶かして)を加え、穏やかな渦巻きで混ぜます。プレートに対応する蓋を覆い、マイクロポーラス手術テープ(例えば、マイクロポアまたはロイコポレテープ)で密封し、成長インキュベーターに戻します。
    注意:[3H]は、吸入、摂取、または素肌を介して吸収されたときに有害な放射線の危険を起こす可能性のある低エネルギーベータエミッタです。放射性物質や放射性物質と直接または間接的に接触する機器を取り扱う場合は、 必ず 手袋を着用してください。また、放射線化学物質の安全な取り扱いのためのローカルルールに従ってください(例えば、追加の保護服を着用し、線量計の使用、定期的に汚染のための表面の調査)。
  6. 5日間のラベリングの後、培地から苗を取り除き、脱イオン水で短時間洗います。ペーパータオルで乾燥させ、1.5 mLマイクロ遠心チューブに移します。チューブ をオーバーフィルせず 、約10\u201220 17日齢の苗に相当する100mgのFW/チューブを置かないでください。
    注:植物材料の過剰な抽出プロセス中に酸を希釈し、抽出効率を強く低下させます。
    1. 液体窒素でチューブをスナップフリーズし、抽出するまで-80°Cで保存します。
      注:サンプルの品質を損なうことなく、サンプルを数週間-80 °Cに保つことができます。成長条件(媒体、光、温度、時間)は、特定の実験または植物種のニーズに応じて変更することができる。しかし、定量化可能なSAX-HPLCの良好な品質を確実に行うためには、[3H]-ミオ-イノシトールを希釈する際には注意が必要です。したがって、ここで述べた[3H]-ミオ-イノシトール濃度で始まり、必要に応じて段階的に減らすことが推奨される。標識時には、植物は、グローバルなInsPに対するこれらの条件の影響を評価するために、異なる処理(例えば、環境ストレスや化学薬品)に提出することができます。定常標識に到達するには、プラントに少なくとも 5 日間のラベルを付けることをお勧めします。

4. 可溶性インスプスの抽出

注:抽出プロセス全体の間、サンプルと試薬を氷の上に保管してください。特に研削時には、放射性物質と接触する危険性が高いため、 常に手袋と保護メガネを着用 してください。サンプルと接触するすべてのものは 放射性廃棄物 とみなされ、放射性物質の安全な処分のための地元の規則に従って処分されるべきです。

  1. ステップ 2.1 のように抽出および中和バッファーの作業ソリューションを準備します。各サンプルには600 μLの抽出バッファと400 μLの中和バッファが必要です。バッファーを氷の上に保管します。
  2. サンプルを-80°Cの冷凍庫から採取し、さらに処理するまで液体窒素に保管してください。サンプルをマイクロ遠心分離チューブの害虫で粉砕し、解凍を開始し、500 μLの氷冷抽出バッファーを追加します。サンプルが完全に均質化され、溶液が深い緑色になるまで粉砕を続けます(葉がサンプルに存在する場合)。
  3. ≥18000 x gで4 °Cで10分間サンプルを遠心分離します。上清を1.5mLの新鮮なチューブに移します。抽出に使用されるチューブは、固体放射性廃棄物とみなされ、それに応じて処分する必要があることを覚えておいてください。
  4. 300 μLの中和バッファーを抽出物に慎重に加えます。タンパク質の沈殿とバブリングはすぐに開始されます。1分後にピペットチップで旋回して混ぜ、数秒待ってからpH紙に少量(5 μL)をピペット処理します(理想的にはpH6~9の範囲)。pH は最終的に pH 7 と 8 の間にする必要があります。
    1. 必要に応じて、目的のpHに達するまで、少量の中和バッファーまたは抽出バッファーを追加します(通常は 10 ~ 20 μL)。サンプルは開いた蓋で少なくとも1時間氷の上に置きます。
  5. 遠心分離器は、≥18,000 x gで4 °Cで10分間のサンプルを遠心分離します。上清を1.5mLの新鮮なチューブに移します。
    注:サンプルは、SAX-HPLCの実行で直接使用するか、氷上で保管するか(同じ日に後で使用する場合)、液体窒素で凍結し、2\u20124週間は-80°Cで保存することができます。再現性と比較性を高く保つため、その後直接使用する場合でも、常に液体窒素で5分間凍結することをお勧めします。抽出されたサンプルの長期保存-80 °Cは、サンプルが一度だけ解凍される限り可能です。凍結サンプルを解析に使用する場合は、解凍後にパーティクルが見 えないように します。それ以外の場合は、再び遠心分離機は≥18,000 x g で4°Cで10分間、新しい1.5 mLチューブに上清を移します。

5. HPLC 実行の実行

  1. 分数コレクターに96個の小さなシンチレーションバイアル(〜6mLの容量)を装備し、各バイアルに2mLの適切なシンチレーションカクテル(例えば、Ultima-Flo AP液体シンチレーションカクテル)を低pHおよび高リン酸アンモニウム濃度の緩衝液と互換性のある充填する( 表の材料を参照)。
    注:バイアルの数とバイアルのサイズは、使用される分数コレクタとシンチレーションカウンターによって異なります。ここで説明した勾配が使用される場合は、 少なくとも最初の90分を収集することが重要であり、完全なイノシトールポリリン酸プロファイルを得る。また、分数やサンプルの混入を防ぐために、すべてのバイアルとそれぞれの蓋に 適切にラベルを付 けることを確認してください。
  2. HPLCシステム/ポンプを起動し、それを実行する準備をします。ピストンシール洗浄を有効にし、全体の走行中に活性化し続けます。適切なシリンジを使用してステップ4.5(約750 μL)から完全な上澄みを手動で注入してサンプルをロードします( 材料表を参照)。自動注入が可能な場合は、対応するサンプルバイアルにサンプルを移します。バルブを「負荷」から「注入」位置に回し、勾配と分数コレクターを開始します。
    注: 使用する HPLC システムによっては、特に、古いシステム (ここで説明する) を完全にソフトウェア制御の新しいモデルと比較する場合、開始手順が異なる場合があります。勾配、サンプル注入、分数収集が同時に開始されるようにすることは非常に重要です。
  3. HPLCの実行が進行中である間、圧力を定期的に確認してください。開始圧力は18-24バー(1.8-2.4 MPa)前後で、100%バッファBに達すると50-60バール(5~6 MPa)までゆっくりと上昇する必要があります。
    注意: 圧力の低下はシステムのリークを示し、圧力の増加は閉塞を示す可能性があります。圧力変動(数秒で3バー≥)は、システム内の空気の存在を示すことができます。列を離れるすべてのものだけでなく、インジェクターまたはその後に発生するすべての漏出は 放射性である点に注意してください。
    注: 圧力は HPLC システムにも依存し、ここで述べたよりも低いまたは高い場合があります。約15~20回の実行後、徐々に増加します。ただし、これは必ずしも得られた実行の品質に影響を与えるわけではありません。
  4. 走った後、バイアルをしっかりと閉じ、激しく振ることによってシンチレーションカクテルと分数を混ぜます。測定を直接進めるか、理想的には暗闇の中で、アップライトの位置にバイアルを保ちます。
    注:シンチレーションカクテルと混合された分数は数週間安定しており、後で測定することができます。トリチウムの半減期は12.32年なので、信号損失はごくわずかです。
  5. その日の最後のサンプルの実行が終了したら、両方のHPLCポンプを停止します。
  6. (オプション)システムの寿命を延ばすため、特に定期的に使用されていない場合は、バッファBのキャピラリーをバッファAのボトルに入れてポンプBと毛細血管を洗浄し、ポンプを10〜15分間稼働させます。次の使用の前に、キャピラリーをバッファBに交換し、ミキサーからポンプBを切り離してバッファBで洗い流すことを 忘れないでください 。ポンプと毛細血管がバッファBで再び満たされたら、ミキサーと再接続して、システムを使用する準備が整いました。

6. 分数の測定

  1. シンチレーションカウンターラックにバイアルを挿入し、液体シンチレーションカウンターで5分間各バイアルを測定します。
  2. 理想的には、小さなバイアルに直接収まり、カウントエラーを減らすために大きな(例えば、20 mL)バイアルのバイアルに吊り下げを避けるラックを使用します。このプロトコルで使用されるソフトウェア設定を 補足図 1に示します。
    注:定期的に、非消しの[3H]規格を使用してSNC(自己正規化とキャリブレーション)プロトコルを実行します。より短いカウント時間(1-5分)は待ち時間を減らすために可能である。ただし、高いカウント再現性と精度を確保するために、5分をお勧めします。

7. データ分析

  1. シンチレーションカウンターから測定値をスプレッドシートファイルまたは互換性のある/変換可能なファイル形式としてエクスポートします。Excelまたは同様のソフトウェアを搭載したコンピュータと、Originのような適切な分析ソフトウェアでデータを評価します。
  2. 2-D 折れ線グラフを準備し、測定された分あたりの数 (cpm) が保持時間に対してプロットされます (図 1、図 2を参照)。
  3. サンプルを互いに比較するには、個々のサンプルごとに分 25 から 96 までの各溶出分数から cpm を合計して データを正規化 します。
    注:ミニッツ25は、分析から非法人[3H]-ミオ-イノシトール、InsP1 およびInsP2 を除外するためのカットオフとして使用され、それらは強く変動する傾向があり、(少なくともこのプロトコルで提案された勾配で)十分に分離することができず、したがって、その高い活性のために正規化因子を強く変化させる。
  4. cpm が最も低い cpm (分数 25\u201296) の最小 cpm を持つサンプルの合計 cpm を他のサンプルの cpm の合計 (分数 25 – 96) で除いて、すべてのデータをサンプルに正規化します。結果の係数を使用して、各分数の cpm を係数で乗算することで、各分数から cpm を正規化することができます。
    注: 最後に、分 25 から終わりまでの cpm 値の合計は、すべてのサンプルが互いに比較して等しい必要があります。正規化された実行のみが同じグラフ/図で表示されます (実際のプロファイルとして表示される場合)。補足図 2は、これらの計算ステップの例を示しています (単純化のために 2 つのサンプルの分数 25 ~ 35 のみを使用)。ただし、データを正規化する必要がない場合もあります。たとえば、ステップ 7.4 に従ってピークが定量化され、InsP 全体のパーセンテージとして表示される場合 (図 3Dに示すように)。前に述べたように、複数の分析をプロファイルとして並べて提示する場合、または実際の測定された活動が結論に使用される場合(例えば、治療a)は、対照と比較してInsP7をx%増加させ、両方のサンプルのInsP7のcpm値を参照し、合計InsPのパーセンテージに言及する)正規化が必要である。標識効率に対する遺伝子型または治療の違いの影響を分析するには、これらの違いを無効にするため、正規化しないことが重要です。しかし、この方法による絶対定量は、このプロトコルによる抽出効率が様々な理由で変化し、同じ遺伝子型および治療のレプリカが分析される場合にも観察されるため、困難です。分析に使用するHPLCシステム、カラム、勾配によっては、カットオフを変更する必要がある場合があります。
  5. 特定のイノシトールポリリン酸ピークの 相対的な定量を実行 し、その後、統計分析のための複製のデータを含む 棒グラフ を作成するには、クロマトグラムのピーク領域(例えば、起源)を計算できる特殊なソフトウェアで分析を継続します。 補足図 3を参照してください。
    注: ソフトウェア制御の HPLC システムのほとんどは、このタスクが可能なそれぞれのソフトウェアを提供します。ピークは、バックグラウンドの上に cpm 値がある分数 (実行の間に一定の割合に変化) と以前にパブリッシュされたデータと類似した保持時間として決定されます。特定のピークの保持時間は、スプレッドシートソフトウェア(例えば、Excel)で決定され、明確な積分(例えば、原点)の計算のためのピークを割り当てるのに使用されます。 補足図3 は、ピークの決定、背景減算およびピークの統合のこのプロセスを示す。

Representative Results

ここに示す結果は、技術的および生物学的レベルの変動に応じて得られる可能性のある結果を示すことを目的としています。最初の例は、新しいカラムと熟成カラム(図1)と新鮮なサンプルと保存されたサンプル(図3)を用いた分析で例示され、2つ目はA.thaliana(図1、図3)およびL.japonicus(図2)からの抽出物を評価することによって行う。

最適なSAX-HPLCランは、シンチレーションカウント後にA.タリアナ抽出物から得られた完全なイノシトールポリリン酸スペクトルを示す図1A\u2012Cに描かれています。ピークはうまく分離されており、前の5,,7で説明したクロマトグラフィーの移動に基づいて異性体(またはエアンチオマーペア)に割り当てることができます。

図2は、シロイヌナズナシの苗と同じ条件で成長し、標識されたL.ジャポニクス苗のSAX-HPLC分析の代表的な結果を示しています。おそらく、シロイヌナズナから知られているすべてのInsP種およびピークが見られるが、両方の種のプロファイルを比較する場合、特定のInsP異性体の相対的な量(例えば、異性体間の比率)に関して大きな違いがある。例えば、ロータス抽出物は、さらなる調査のための余地を残すシロイヌナプシスと比較して、増加したInsP3c、InsP4b、InsP5bおよび減少したInsP3a、InsP4a、InsP5aおよびInsP5cを示した。5c図2Dは、シロイヌナズナとロータスの間のInsP異性体間の異なる比率を示しています。

図 3 は、抽出後に分割されたサンプルの 2 つの InsP プロファイルを示しています。前半は、1日後に、-80°Cで保存した後、すぐに分析を行った。 サンプル間にはわずかな違い ( 図 3A\u2012C、図 3Dの黒線と赤線) しか見られないことに注意してください。これは、1 つのフリーズ解凍サイクルがサンプルに害を与えないこと、およびメソッド自体が再現可能な結果を生成することを示しています。

Figure 1
図1:このプロトコルで実行されたSAX-HPLC分析が成功し、失敗した典型的なInsPプロファイル。( \u2012C)A17日前の野生型のSAX-HPLCプロファイル(Col-0)[3H]-ミオ-イノシトールで3放射標識されたシロイヌナズナシス苗。グローバルInsP抽出およびSAX-HPLC実行は同日に行った。(A) 完全なスペクトル;(B, C)A に示すプロファイルのズームイン。すべての可視ピークがハイライト表示され、対応する InsP 種に割り当てられます。公開クロマトグラフィーモビリティ55、77に基づいて、InsP4aはイン(1,4,5,6)P 4またはIns(3,4,5,6)P4を表す可能性が高く、InsP5aはInsP5[2-OH]を表し、 InsP5bはInsP5[4-OH]またはそのエノミノマー形態InsP5[6-OH]を表し、InsP5cはInsP 5[1-OH]またはそのエノミノマー形態InsP4 5[3-OH]を表す。5InsP3a-c、InsP4b、InsP7、およびInsP8の異性体性は不明です。パネル (D) は、同じ成長した植物の SAX-HPLC プロファイルを示しますが、熟成カラムを使用します (>40 ラン)。他のInsP種と比較してInsP6の明確な減少とPP-InsPの欠如が見られます。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 2
図2:L.ジャポニクス植物の代表的なInsPプロファイル。SAX-HPLCプロファイル(17日前の野生型(岐阜)のX線型のC(A\u2012C)は、ラジオ標識[3H]-ミオ-イノシトールで放射状のジャポニクス苗を作成した。(A) 完全なスペクトル;(B, C)A に示すプロファイルのズームイン。すべての可視ピークがハイライト表示され、対応する InsP 種に割り当てられます。公開されたクロマトグラフィーモビリティ55、77に基づいて、InsP4aはIns(1,4,5,6)P 4またはIns(3,4,5,6)P4を表す可能性が高く、InsP5bはInsP 5 [4-OH]またはそのエンランチオマー形式InsP45[6-OH]を表す可能性が高い、 InsP5cは、インスポー 5 [1-OH] またはそのエノミオマー形式 InsP5 5 [3-OH] を表す可能性があります。InsP3a-c、InsP4b、InsP7、およびInsP8の異性体性は不明です。(D) A. タリアナの個々の InsP 種 (溶出による全活動の割合での割合 25\u201296) とL. japonicus (図 2A–Cからのデータ) の比較。A‒Cこの図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 3
図3:SAX-HPLC分析の再現性を示す分割サンプルのInsPプロファイル。( \u2012C)A17日前の野生型のSAX-HPLCプロファイル(Col-0)[3H]-ミオ-イノシトールで3放射標識されたシロイヌナズナシス苗。実行前に、サンプルを分割し、1つの半分をすぐに実行し、残りの半分は-80 °Cで保存した後、1日後に(A)完全なスペクトル;(B, C)A に示すプロファイルのズームイン。すべての可視ピークがハイライト表示され、対応する InsP 種に割り当てられます。公開クロマトグラフィーモビリティ55、77に基づいて、InsP4aはイン(1,4,5,6)P 4またはIns(3,4,5,6)P4を表す可能性が高く、InsP5aはInsP5[2-OH]を表し、 InsP5aはInsP5[2-OH]を表し、InsP5bはInsP5[4-OH]またはそのエノミオマー形態InsP5[6-OH]を表し、InsP5cはInsP 5[1-OH]またはそのエンミノマー形態InsP4 5[3-OH]を表す。5InsP3a-c、InsP4b、InsP7、およびInsP8の異性体性は不明です。パネルDは、両方の実行の InsP6と PP-InsP InsP7と InsP8の定量化を示しています。値は金額を表します (%)すべての InsP に対するそれぞれの InsP 種 (溶出による全活性 25-96)。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

補足図1:軽いシンチレーションカウンターを用いた液体シンチレーションカウントのソフトウェア設定。 ソフトウェアバージョンを示すスクリーンショットと、このプロトコルで実行される[3H]サンプルのシンチレーションカウントに使用される設定が描かれています。 こちらをダウンロードしてください。

補足図2:データの正規化の代表例。 ワークシートのスクリーンショットは、SAX-HPLC の実行を互いに正規化するために使用されるすべてのステップと数式を示しています。単純化のために、サンプルの分数 25 ~ 35 分のみが示されます。 こちらをダウンロードしてください。

補足図3:解析ソフトを用いたピーク判定、背景の減算、統合(A)SAX-HPLC分析のデータがソフトウェアにロードされ(分28~96分)、ピークアナライザツールが選択されます。(B\u2012E)ベースラインは、個々のピークと背景の間のポイントを設定することによって手動で定義されます。(F)ピークは、外観と公開クロマトグラフィーモビリティ55、7に基づいて手動で決定されます。(G) ピーク範囲は cpm 値で手動で定義されます。(H) ピークは統合され、すべてのピークの % として計算されます。こちらをダウンロードしてください。

Discussion

ここでは、植物抽出物のPP-InsPを含むInsPを定量化する汎用性と高感度な方法を提示し、この方法を確立する方法についての実用的なヒントを提供します。プロトコルは一般的に堅牢ですが、最適でない実行と分析が発生する可能性があります。ほとんどの場合、これらの実行は、強い減少または高リン酸化インスポース、特にPP-InsP種InsP7 およびInsP8の完全な損失によって識別することができる。考えられる理由は、植物材料の微生物汚染と抽出中の内因性植物PP-InsP水化酵素の不十分な不活性化であり、抽出バッファーとすぐに接触しない植物材料の不十分な粉砕および解凍が原因である可能性があります。更なる理由としては、中和緩衝液の不十分または過剰な添加による不正確なpH調整、または単に不十分なサンプル材料が含まれる。後者は、細胞内に非常に低い量で存在することが多いため、PP-InsPを検出することが困難になる可能性があります。ステップ3.5中に過剰なサンプル材料または非効率的な乾燥が発生すると、過塩素酸の希釈が生じる可能性があり、したがって、酵素の不活性化が不十分になり、InsP6 およびPP-InsPの特定の損失を招く可能性があります。このプロトコルで使用される放射性ラベルと同様に植物材料の量は、コストと性能に基づいて最適化されたため、最適な結果を提供するのにまだ十分な最低量に近い。また、カラム樹脂は徐々に分解能を失います。このプロセスの最初の兆候は、HPLCスペクトルにおけるPP-InsPのような高リン酸化InsP種の特定の損失(著者には完全には明らかではない)である。さらにエージングを行うと、InsP6 でさえ、カラム(図1D)によって適切に解決されません。したがって、適切なカラムの使用、およびサンプルの細心の注意を払った取り扱いとHPLCコンポーネントの適切なメンテナンスは、正確な結果を確保するために重要です。

サンプルとランを比較する場合、特に異なる機器(例えば、HPLCシステムとカラム)で生成された場合、または異なる日に、サンプルを互いに正規化し(ステップ7.3で説明)、それらを同じ方法で分析することが重要です。正規化を通してのみ、同じグラフに複数のサンプルを表示することが可能で正確です(図3)。合計 InsP または別の特定の InsP 種に対する個々の InsP の定量化では、相対値のみで絶対値以外の値が示されている限り、正規化する必要はありません。理想的には、InsP プロファイルと定量化の両方が示されています。ただし、同じグラフで 2 回以上の実行を適切に表示できない場合があります。保持時間やバックグラウンドアクティビティのレベルが異なっている場合、定量化されていないSAX-HPLCプロファイルを単独で比較することが困難になる可能性があります。多くのサンプルを比較する必要がある場合も同様です。このような場合には、個別のピーク定量のために追加のソフトウェア(例えば、Origin)を用いたさらなる評価が必要である。

著者らは、ここで説明するプロトコルは最適化可能であり、個々の研究問題に適応する必要があることを認識している。このプロトコルでは、シロイヌナズナズナの抽出物7、1717のために最適化されているが、この方法は汎用性が高く、同様に他の植物種のInsPプロファイルを決定するのに役立ちます。7ここでは、ラベル付け条件の変更を必要としなかったL.ジャポニクスのInsPプロファイルを初めて提示することによって、この可能性を例示します, InsP抽出またはSAX-HPLC実行 (図2)。特に、全体的に似ているが、L.ジャポニクスとシロイヌナズナズのInsPプロファイルの間に違いが観察される。例えば、L.ジャポニカスInsP5[4-OH]またはそのエノミノマー形態InsP5[6-OH]では、InsP 5[1-OH]またはそのエノミオマー形態InsP5 5 5[3-OH]よりも豊富であり、InsP5[1-OH]またはそのエノミオメリック形態Ins5P5P5同様に、培地組成[3H]-イノシトール濃度、植物年齢、環境条件(光と温度)、化学化合物の添加、または他の要因間の植物微生物相互作用の分析の変化をテストし、適応させる必要があると予想しています。

この方法の重要な欠点の1つは、ほとんどの陸上植物の生理的環境を表さない(無菌)液体培養で標識が行われるということです。また、[³H]-ミオ-イノシトールのコストが高いため、培養容器のラベリング液の体積やサイズが一般的に制限され、使用できる植物のサイズも制限される。液体培養における培養は、例えば土壌成長植物の葉を[³H]-ミオ−イノシトールで直接浸潤し、その後ここで説明したプロトコルに従うことによって、先に報告された10を回避できる。

このプロトコルには、TiO2プルダウン、ページまたは質量分析ベースの手法などの代替方法と比較して、いくつかの欠点があります。[3H]-ミオ-イノシトール標識により、放射性標識されたミオ-イノシトールに直接由来するInsP種のみが最終的に検出される。ここで説明する方法は、特定の植物44で同定されているスキュラ-イノシトールおよび他の異性体のような他のイン類性体に対して盲目である。さらに、他の経路から誘導されるmyo-InsPsは、グルコース-6-リン酸の異性化を介したミオ-イノシmyoトール-イノシトール-3-リン酸のデノボ合成によって合成されたものも含め、ミオ-イノシトール-3-リン酸(MIPS)タンパク質によって触媒される。[32P]または[33P]-直交-リン酸は代替ラベルとして使用できるが、その使用は大きな欠点をもたらし、豊富なヌクレオチドおよびその誘導体を含むすべてのリン酸含有分子が標識されることになる。これらの分子もこのプロトコルで抽出し、SAXカラムに結合することができ、これは、個々のInsPピーク5の同定を妨げる高レベルのバックグラウンド活性をもたらす。また、[32P]-または[33P]ラベル付きInsPおよびPP-InsPの定量化は、リン酸塩およびピロリン酸部分のターンオーバーの影響を強く受けることができ、イノシトール種の質量読み出しを報告しない可能性があります。

一方、[3H]-ミオ-イノシトールは、具体的にはミオ−イノシトール含有分子を標識する。インスプ、イノシトール含有脂質、ホスホイノシチン酸塩、およびガラクチノールなどがこの場合に標識される。しかし、脂質は抽出バッファーに不溶であり、ガラクチノールは SAX 列に結合しないため、InsP のみがこのプロトコルで分析されます。

これまでに、TiO2プルダウン/PAGEで決定されたものと比較して[3H]-ミオ-イノシトール標識によって生成された植物InsPプロファイルとの違いは、植物でそのような比較が行われていないので、不明のままである。2動物細胞の最近の研究は、この質問46に対処しました。その作業において、グルコース−6-リン酸に直接誘導されるべき[3H]-ミオ-イノシトール標識によって見えないInsP6のプールを、哺乳動物細胞株のPAGEゲルとSAX-HPLCプロファイルを比較することによって同定された。24時間のリン酸塩飢餓は、TiO2プルダウンを使用して精製されたInsPのPAGEゲルを定量化する際にInsP6の150%の増加をもたらした。同一に処理した[3H]-ミオ-イノシトール標識細胞のSAX-HPLC分析は[3H]-InsP6の15%の増加を示した6だけである。前述のように、InsP5より低い InsP は、ほとんどの場合 PAGE 分析では検出できません。XTROMetric プロトコルが非常に負の電荷を帯びた分子のこのグループを検出するように最適化されていない限り、SAX-HPLC に続く放射標識が選択方法であるように見えます。

もう一つの課題は、SAX-HPLC分析(またはInsP分析のための他の方法)でエアンチオマーを区別することです10,,17.この課題は、キラルセレクターの添加によって取り組むことができる、すなわち、L-アルギニンアミドのようなエナチオピュール化合物は、それぞれエランチオマー分子と相互作用して、10個分離することができるジアステレオマー複合体を形成する。我々の知る限り、このアプローチは、NMR分析10によってエナンチオマーInsP5異性体InsP 5[1-OH]およびInsP5[3-OH]を識別するためにのみ実施されている。 キラルSAX-HPLC分析またはキラルPAGEベースの方法による他のエアンチオマー対の差別またはエノミオマーの成功した差別はまだ報告されておらず、さらに開発されるべきである。リンの入手可能性によるPP-InsPの保存された合成と保存された調節を考慮すると、特にPAGEやMSベースの方法などの非放射性方法は、栄養分析と,共に、作物,17、18、24、25の栄養不足を診断するために設計されたリモートセンシングデータを較17,正するための根拠となる真実の努力に役立つことを想定しています。182425しかし、ここで提示される方法は、現在でもInsP分析のゴールドスタンダードと考えることができ、植物のこれらの興味深いメッセンジャーの新しい機能を発見するのに役立ちます。

Disclosures

著者らは開示するものは何もない。

Acknowledgments

この研究は、ドイツのエクセレンス戦略の下でドイツ・フォルシュングスゲミンシャフト(DFG、ドイツ研究財団)によって資金提供されました - EXC-2070 - 390732324(フェノロブ)、研究トレーニンググループGRK2064と個々の研究助成金SCHA1274/4-1とSCHA1274 /5-1からG.S.に。また、李シュリュターとブリジット・ウエーベルバッハの技術支援に感謝します。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Centrifuge Eppendorf AG model: 5430 R
Diammonium hydrogen phosphate, ≥97 % Carl Roth GmbH + Co. KG 0268.1
Ethylenediamine tetraacetic acid disodium salt dihydrate, ≥99 %, p.a., ACS Carl Roth GmbH + Co. KG 8043.2
Falcon 12-well clear flat bottom TC-treated multiwell cell culture plate, with lid, individually wrapped, sterile Corning Inc. 353043
Fraction collector LAMBDA Instruments GmbH model: OMNICOLL single channel collector
Growth incubator poly klima GmbH model: PK 520-LED
HPLC pumps Kontron Instruments model: 420
HPLC syringe for Rheodyne valves, 1 mL Hamilton Company 81365
Injector for HPLC Supelco model: Rheodyne 9725
Inositol, myo-[1,2-3H(N)] American Radiolabeled Chemicals Inc. ART 0261
Liquid nitrogen University, Chemistry Department
Liquid scintillation counter PerkinElmer Inc model: TRI-CARB 2900TR
Micro pestle Carl Roth GmbH + Co. KG CXH7.1
Mixed cellulose Eester filter, ME range (ME 24), plain, 0.2 µm pore size, 47 mm circle GE Healthcare Life Sciences 10401770
Mixer for HPLC Kontron Instruments model: M 800
Murashige & Skoog medium, salt mixture Duchefa Biochemie M0221
OriginPro software OriginLab Corp.
Orthophosphoric acid, ≥85 %, p.a., ISO Carl Roth GmbH + Co. KG 6366.1
Partisphere 5 µm SAX cartridge column, 125 x 4.6 mm Hichrom Limited 4621-0505
Perchloric acid, 70 %, 99.999 % trace metals basis Sigma-Aldrich 311421
Petri dish, square, PS, clear, 120/120/17 mm, sterile Greiner Bio One International GmbH 688161
pH-indicator paper pH 5.5 - 9.0, Neutralit Merck KGaA 109564
Phytagel Sigma-Aldrich P8169
Potassium carbonate Carl Roth GmbH + Co. KG P743.2
Safe-Lock tubes, 1.5 mL Eppendorf AG 30120086
Sample loop for 9725 injectors, volume 2 mL, PEEK Supelco 57648
SNAPTWIST scintillation vial, 6.5 mL Simport Scientific Inc. S207-5
Sterile bench LaboGene model: ScanLaf MARS 900
Sucrose, ≥99,5 %, p.a. Carl Roth GmbH + Co. KG 4621.1
Ultima-Flo AP liquid scintillation cocktail PerkinElmer Inc 6013599
Ultra-pure deionized water Milli-Q
Wrenchless WVS End Fitting Kit Hichrom Limited 4631-1001

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Gaugler, P., Gaugler, V., Kamleitner, M., Schaaf, G. Extraction and Quantification of Soluble, Radiolabeled Inositol Polyphosphates from Different Plant Species using SAX-HPLC. J. Vis. Exp. (160), e61495, doi:10.3791/61495 (2020).

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