Summary
هنا نحن وصف قوية anion تبادل عالية الأداء الكروماتوغرافيا السائلة من [3H]-ميو-الإينوزيتول- التسمية الشتلات التي هي طريقة حساسة للغاية للكشف عن وقياس البولي فوسفات إينوزيتول في النباتات.
Abstract
استرات الفوسفات من ميو-إينوزيتول, كما يطلق عليه الفوسفات إينوزيتول (InsPs), هي فئة من المنظمين الخلويين تلعب أدوارا هامة في فسيولوجيا النبات. بسبب الشحنة السلبية، وانخفاض وفرة والتعرض للأنشطة المائية، والكشف عن وكمية هذه الجزيئات أمر صعب. وهذا هو الحال بشكل خاص بالنسبة للأشكال ذات الفوسفور الشديد التي تحتوي على سندات ثنائي فوسفو "عالية الطاقة" ، التي يطلق عليها أيضًا الإينوزيتول pyrophosphates (PP-InsPs). نظرا لحساسية عالية، قوية anion تبادل عالية الأداء الكروماتوغرافيا السائل (ساكس-HPLC) من النباتات المسمى مع [3H]-ميو-إينوزيتول حاليا هو الأسلوب المفضل لتحليل هذه الجزيئات.myo باستخدام [3H]-ميو-إينوزيتول إلى شتلات النباتات radiolabel, مختلف أنواع InsP بما في ذلك العديد من الأيزومرات غير المضادة للانانياتية يمكن الكشف عنها والتمييز مع حساسية عالية. هنا ، يتم وصف إعداد نظام SAX -HPLC مناسب ، بالإضافة إلى سير العمل الكامل من زراعة النباتات ، واستخراج الأشعة والـ InsP إلى SAX -HPLC وتحليل البيانات اللاحقة. البروتوكول المعروض هنا يسمح بالتمييز والكمية لمختلف أنواع InsP، بما في ذلك العديد من الايزومرات غير الأنانتية وPP-InsPs، InsP7 و InsP8،ويمكن تكييفها بسهولة مع أنواع نباتية أخرى. وكمثال على ذلك، يتم إجراء تحليلات SAX-HPLC لـ Arabidopsis thaliana و Lotus japonicus و يتم عرض ملفات تعريف InsP الكاملة ومناقشتها. وتمثل الطريقة الموصوفة هنا أداة واعدة لفهم أفضل للأدوار البيولوجية للـ InsPs في النباتات.
Introduction
منذ أربعة عقود تقريباً، ظهر الفوسفات الإينوزيتول (InsPs) كجزيئات إشارة، بعد أن تم تحديد Ins(1,4,5) P3 (InsP3)كرسول ثان ينشط إطلاق سراح Ca2+ بوساطة المستقبلات في الخلايا الحيوانية1،2. حتى الآن، لم يتم تحديد مستقبلات InsP3 (IP3-R) في النباتات، والتي الأسئلة دور إشارة مباشرة ل InsP3 في الخلايا النباتية3. بغض النظر عن ذلك ، InsP3 بمثابة مقدمة ل InsPs الأخرى المشاركة في العديد من العمليات التنموية النباتية ، بما في ذلك تنظيم مسارات إشارة محددة3،4،5،6،7،8. على سبيل المثال، InsP3 يمكن أن يكون مزيد من الفوسفور إلى InsP6، المعروف أيضا باسم "حمض فيتيك"، الذي يمثل مصدرا رئيسيا للفوسفات، ميو-إينوزيتولوالاتيات، وكان أظهرت للعب أدوار رئيسية في الدفاع النباتي ضد مسببات الأمراض، تصدير مرنا والفوسفات5،9,10،11،12.
Inositol pyrophosphates (PP-InsPs) هي فئة من InsPs التي تحتوي على واحد على الأقل من السندات دي فوسفو عالية الطاقة، التي تم تحديدها في البداية في الخلايا الحيوانية، الأميبا والخميرة، حيث أنها تلعب أدوارا حاسمة في مختلف العمليات الخلوية13،14،15. على الرغم من العمل المنوي على PP-InsPs في النباتات16,17,18,19,21,,22,23,24,25,26, الوظائف البيولوجية والهوية الايزومر من هذه الجزيئات لا تزال غامضة إلى حد كبير.21 في مصنع نموذج Arabidopsis thaliana، تم اقتراح InsPالخلوية 8 لتنظيم الدفاعات ضد الحيوانات العاشبة الحشرات والفطريات necrotrophic عن طريق الكشف عن صدفة من InsP8 و jasmonate النشطة من قبل مجمع مستقبلات ASK1-COI1-JAZ17. وعلاوة على ذلك، وقد اقترحت أدوار InsP8 وغيرها PP-InsPs في التوازن الطاقة واستشعار المغذيات، وكذلك هووستاسيس الفوسفات17،23،24،25،26.
وبغض النظر عن النظام البيولوجي المستخدم، فإن أحد التحديات المنهجية الرئيسية عند دراسة الـ InsPs هو الكشف الموثوق والدقيق لهذه الجزيئات. وقد استخدمت الأساليب المستندة إلى قياس الطيف الكتلي للكشف عن InsPs، بما في ذلك PP-InsPs، من مستخلصات الخلايا. ومع ذلك، فشلت تلك الدراسات في التفريق بين ايزومرات متميزة26،27. نهج آخر لتحليل InsPs توظف سحب لأسفل من InsPs من lysates الخلية باستخدام حبات TiO2 ، تليها polyacrylamide هلام الكهرباء (PAGE) من InsPs مائل. ويمكن أن تكون الملطخة InsPs من قبل إما الأزرق toluidine أو DAPI24،28،29. ومع ذلك، فإنه حتى الآن من غير الممكن للكشف بشكل موثوق InsPs أقل من InsP5 من مستخلصات النباتات باستخدام هذا الأسلوب. في الآونة الأخيرة، تم نشر طريقة باستخدام [13C]-ميو-إينوزيتول للرنين المغناطيسي النووي (NMR) تحليل InsPs كبديل لتبادل قوي anion عالية الأداء الكروماتوغرافيا السائلة (SAX-HPLC)30. وقد أبلغ عن هذه التقنية لتحقيق حساسية مماثلة بالمقارنة مع SAX -HPLC والسماح للكشف عن 5-InsP7، فضلا عن التمييز بين مختلف غير enantiomeric InsP5 ايزومرات من مقتطفات الخلية. ومع ذلك، يتطلب تنفيذ طريقة NMR القائم على كيميائيا توليفها وتجاريا لا تتوفر [13C] -ميو-إينوزيتول. ولذلك، فإن الطريقة المستخدمة في معظم الحالات هي عينات radiolabeling مع [3H]-ميو-إينوزيتول، تليها SAX-HPLC31،32،33. ويستند هذا الأسلوب على امتصاص ميوالمشع -إينوزيتول في المصنع وتحويلها إلى InsPs مختلفة من خلال النشاط المشترك من كينازات الخلوية المكرسة والفوسفاتات.
ثم يتم استخراج الـ [3H] المسمى InsPs وتجزئة الحمض باستخدام SAX-HPLC. وبسبب الشحنة السلبية الخاصة بهم، يتفاعل InsPs بقوة مع المرحلة الثابتة المشحونة بشكل إيجابي من عمود SAX-HPLC ويمكن أن يتم االلتقم بتدرج عازل يحتوي على زيادة تركيزات الفوسفات لاتوام InsPs من العمود. يعتمد أزهون أوقات لذلك على شحن وهندسة من ال إنسب أنواع أن يكون فصلت. في حالة عدم وجود أعمدة الشيرال، يمكن فقط الايزومرات غير المضادة للانتينية بواسطة فصل بواسطة هذا البروتوكول. ومع ذلك، يمكن استخدام المعايير ذات علامة إشعاعية لتعيين الطبيعة الأيزوميرتية لذروة InsP محددة. وقد ساعدت الجهود المتعددة في الماضي من قبل مختبرات مختلفة لتوليد معايير وصفت وغير المسمى مع (البيولوجية) الأساليب الكيميائية أو لتنقيتها من مختلف الخلايا والكائنات الحية تعيين قمم لبعض أنواع InsP، وأيضا لتضييق الهوية الأيزوميرية الفردية InsP الأنواع5،7،21،34،35،36،37،38،39،40،4141،42،43. أيضا ، فإن توضيح مؤخرا من مسارات انزيمية مما يؤدي إلى تشكيل PP - InsPs في النباتات ، فضلا عن اكتشاف البكتيريا من النوع الثالث effector مع نشاط محدد 1 -phytase ، وتوفير معلومات عن كيفية توليد معايير مفيدة لهذه التحليلات10،17،18،22،23.
ويمكن قياس الكسور الناتجة في عداد التلألؤ السائل بسبب β اضمحلال التريتيوم(3H). مع زيادة الوقت وضع العلامات، يتم التوصل إلى توازن النظائر ثابت الحالة، وبعد ذلك ينبغي أن تمثل التشكيلات InsP التي تم الحصول عليها حالة InsP من المصنع31. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذا البروتوكول بالمقارنة مع التقنيات الأخرى المتاحة في الحساسية العالية التي يحققها استخدام السلائف المباشرة للانبس وقياس الإشارة المشعة.
SAX-HPLC من العينات المستخرجة من [3H]-ميو-النباتات المسماة الإينوزيتول أو الكائنات الحية الأخرى يستخدم عادة للكشف عن وتكميم InsPs تتراوح بين أقل الأنواع InsP PP-InsPs, تمثل أداة قيمة لفهم أفضل لعملية التمثيل الغذائي, وظيفة وأساليب عمل InsPs. حتى الآن، هذه الطريقة هي أيضا الخيار الأنسب للباحثين ذوي الاهتمام الخاص في أقل الأنواع InsP. في حين أن أساسيات هذا الإجراء ، الذي يستند إليه البروتوكول الموصوف هنا ، تم وصفه سابقًا7،21،31،34، لا يزال هناك بروتوكول مفصل مصمم خصيصًا لتحليل InsPs المشتقة من النباتات وخاصة PP-InsPs مفقود. المنشورات السابقة ذكرت صعوبات في الكشف عن موثوق بها في وفرة PP -InsPs ، وخاصة InsP8، بسبب واحد أو أكثر من العوامل التالية : كميات منخفضة نسبيا من المواد النباتية ، [3H]-ميو-إينوزيتول مع نشاط محدد منخفض (> 20 Ci/mmol)، واستخدام مخازن الاستخراج التي إما لا تستند إلى حمض البيركلوريك أو أقل تركيزا من 1 M، ومخازن مختلفة تحييد، فضلا عن التدرجات دون الأمثل أو الكشف عن [3H] مع كاشف على الخط. بالمقارنة مع تلك الدراسات ، تم تصميم البروتوكول المقدم هنا للكشف الموثوق بها من PP - InsPs7،21،34.
هنا نقدم سير عمل مفصل، بدءا من إعداد المعدات لزراعة النباتات ووضع العلامات، استخراج InsP وتشغيل SAX-HPLC نفسها. على الرغم من أن الطريقة كانت الأمثل لنموذج النبات A. thaliana، فإنه يمكن تعديلها بسهولة لدراسة الأنواع النباتية الأخرى ، كما هو مبين هنا مع أول تقرير InsP لمحة عن نموذج البقولية لوتس japonicus. على الرغم من أن استخدام أنواع نباتية مختلفة قد يتطلب بعض التحسين ، فإننا نتصور أن تكون هذه الأنواع طفيفة ، مما يجعل هذا البروتوكول نقطة انطلاق جيدة لمزيد من الأبحاث في InsPs النباتية. من أجل تسهيل التحسينات الممكنة، فإننا نشير إلى كل خطوة في البروتوكول الذي يمكن إجراء تعديلات فيه، وكذلك جميع الخطوات الهامة التي قد تكون صعبة عند إنشاء الأسلوب للمرة الأولى. بالإضافة إلى ذلك، فإننا نبلغ عن كيفية استخدام البيانات التي تم الحصول عليها بواسطة هذه الطريقة في تحديد كمية InsPs معينة وكيفية تحليل عينات مختلفة ومقارنتها.
Protocol
1. إعداد نظام HPLC
- إعداد نظام يتكون من مضختين HPLC مستقلة (مضخة ثنائية)، واحدة لكل عازلة. كلا مضخة تحتاج إلى أن تسيطر معا عن طريق جهاز كمبيوتر مع البرامج المعنية أو من خلال وجود مضخة رئيسية. تنفيذ غسل الختم المكبس لكلا المضخات، إما عن طريق قوة الجاذبية أو من خلال مضخة الضغط المنخفض الثالثة. تعيين مضخة واحدة للمخزن A (يطلق عليه مضخة A) واحد لـ B العازلة (يطلق عليه مضخة B).
ملاحظة: يجب أن يكون كلاهما قادرًا على توليد ضغط يصل إلى 60 بارًا (6 MPa) ومعدلات تدفق لا تقل عن 0.5 مل/دقيقة. - توصيل كل من مضخات إلى خلاط ديناميكي.
- قم بتوصيل الخلاط بصمام حقن مع عينة من حلقة قدرة 1 مل على الأقل.
- قم بتوصيل صمام الحقن بالعمود مع الشعيرات الدموية عبر تركيبات النهاية المقابلة.
- قم بتوصيل العمود بمجمّع الكسور باستخدام شعرية ذات طول مناسب.
ملاحظة: يستند هذا الوصف إلى نظام HPLC (انظر جدول المواد)،والذي يتطلب خطوات يدوية أكثر من الأنظمة الأحدث والأكثر تطوراً. يسمح نظامنا بسهولة الوصول والتعديل لجميع المكونات. ويمكن أيضا أن تستخدم مضخات الرباعية (مع التدرج الثنائي المذكورة هنا) وسوف يؤدي إلى لمحات elution والجودة الشاملة للتحليلات مماثلة لتلك التي تحققت مع مضخات ثنائية.
2. إعداد المخازن المؤقتة، العمود ونظام HPLC
- إعداد المخازن المؤقتة لاستخراج InsPs القابلة للذوبان: استخراج العازلة (1 M HClO4)ومخزن الإبطال (1 م ك2CO3). إعداد كل من المخازن المؤقتة مع المياه ديوند فائقة النقاء. وهي مستقرة في درجة حرارة الغرفة لعدة أشهر. مباشرة قبل الاستخراج، إضافة EDTA إلى كلا الحلين إلى تركيز النهائي من 3 mM (على سبيل المثال، من 250 mM EDTA حل الأسهم).
تنبيه: HClO4 (حمض البيروكلوريك) هو تآكل بقوة. - إعداد المخازن المؤقتة لتشغيل SAX-HPLC: العازلة A (1 mM EDTA) والمخزن B (1 mM EDTA، 1.3 M (NH4)2HPO4؛ pH 3.8 مع H3PO4). إعداد كل من استخدام المياه غير المؤينة فائقة الصرفة تليها الترشيح فراغ مع 0.2 μm المسام الحجم مرشحات الغشاء. هذه هي مستقرة في درجة حرارة الغرفة لعدة أشهر.
ملاحظة: يجب تضمين EDTA في كافة المخازن المؤقتة لمنع تفاعلات الكاتيونات مع InsPs، والتي قد تؤدي إلى تبديل الشحن InsP أو حتى مجمعات الملح InsP غير قابلة للذوبان. - برنامج التدرج على النحو التالي: 0\u20122 دقيقة، 0% العازلة باء؛ 2\u20127 دقيقة، ما يصل إلى 10٪ المخزن المؤقت B؛ 7\u201268 دقيقة، ما يصل إلى 84٪ المخزن المؤقت B؛ 68\u201282 دقيقة، ما يصل إلى 100٪ المخزن المؤقت B؛ 82\u2012100 دقيقة، 100٪ المخزن المؤقت B، 100\u2012101 دقيقة، وصولا الى 0٪ المخزن المؤقت B؛ 101\u2012125 دقيقة، 0% المخزن المؤقت B. معدل التدفق الأمثل لهذا التدرج هو 0.5 مل / دقيقة.
- خلال المدى، وجمع الكسور كل دقيقة، بدءا من الدقيقة 1 إلى الدقيقة 96. المتبقية 30 دقيقة من التدرج تخدم لغسل العمود والنظام، وليس من المقرر أن يتم جمعها للعد التلألؤ.
- إذا كان ذلك ممكناً، قم بتعيين أقصى ضغط يمكن الوصول إليه قبل إيقاف التشغيل في حالات الطوارئ لمضخات HPLC إلى 80 بار (8 MPa). وهذا يمنع تلف خطير لراتنج العمود.
- عند استخدام عمود HPLC جديد من SAX، قم بغسله بشكل كامل (> 50 مل) مع مياه غير نقية للغاية مفلترة قبل الاستخدام الأول.
ملاحظة: سيضمن هذا إزالة الميثانول المحتوي، وبالتالي منع هطول الأمطار الملحية في خطوات لاحقة. إذا كان ذلك ممكنا، استخدم مضخة HPLC منفصلة. إذا لم يكن هذا متوفراً، تأكد من أن HPLC قد مسح بالماء قبل غسل العمود. يجب أن لا يتجاوز معدل التدفق 2 مل / دقيقة. بعد الغسيل، العمود جاهز للتحليل، وعندما يتم التعامل معها بشكل صحيح، يمكن استخدامها ل 20\u201240 يعمل. وبعد ذلك، سينخفض القرار تباعا. يمكن أن يساعد الغسيل المطول مع المخزن المؤقت A (> 1 h) وتنفيذ الخطوة 2.6 في زيادة عمر العمود. إذا استمر النقصان في الدقة، يجب تبادل العمود. ويمكن تعديل التدرج لزيادة الفصل بين أنواع معينة من البولي فوسفات إينوزيتول أو لتقليل وقت التشغيل الكلي. إن استخدام أنظمة HPLC مختلفة (مع حجم فراغ مختلف أو حجم مختلف من الشعيرات الدموية) سيؤثر بشدة على أوقات الاحتفاظ. أيضاً، تغييرات العمود لها تأثيرات طفيفة على أوقات الاحتفاظ. - تنفيذ "تشغيل وهمية". بدلاً من عينة المستخرجة، حقن المياه غير المؤينة فائقة الصرفة في نظام HPLC وتشغيل التدرج القياسي. لا يجب جمع الكسور.
ملاحظة: الخطوة 2.6 اختيارية. ومع ذلك، يجب أن يتم تنفيذ إذا تطبيق إحدى الحالات التالية: يتم تثبيت عمود جديد; تم استخدام نظام HPLC لأسلوب مختلف مسبقاً; لم يتم استخدام نظام HPLC لأكثر من 3 أيام; حدثت مشكلة في التشغيل السابق.
3. زراعة النباتات ووضع العلامات مع [3H]-ميو-إينوزيتول
ملاحظة: ينبغي أن يتم تنفيذ الخطوات التالية مع مكونات معقمة وتحت ظروف معقمة، في حين يرتدي قفازات لحماية اليدين من التلوث مع radiolabel. وسائل الإعلام النباتية، وخاصة عندما تحتوي على السكروز، هي عرضة للتلوث الميكروبي.
- تعقيم بذور A. الثاليانا مع 1 مل من 1.2٪ هيبوكلوريت الصوديوم لمدة 3 دقائق تليها 1 مل من 70٪ الإيثانول لمدة 3 دقائق. ثم إضافة 1 مل من الإيثانول 100٪ ، والماصات البذور مع الإيثانول على ورقة مرشح دائري والسماح لهم بالهواء الجاف تحت تدفق اللامينار على مقعد نظيف.
- عند استخدام L. japonicus البذور، ووضعها في قذائف الهاون والبذور فرك مع الصنفرة قبل التعقيم لضمان معدل الإنبات كافية.
- زرع خارج بذور Arabidopsis في 1-2 صفوف على أطباق بيتري مربع مليئة وسائل الإعلام النمو الصلبة التي تتكون من نصف قوة Murashige وSkoog (MS) حل الملح، 1٪ السكروز، 0.7٪ علكة جيلان في المياه الأيونية المعدلة إلى درجة حز 5.7 مع كوه والسماح لهم لالطبقات لا يقل عن 1 يوم في 4 درجة مئوية في الظلام.
- لبذور لوتس، زرع بها في صف واحد على أطباق بيتري مربع مليئة وسائط النمو الصلبة التي تتكون من 0.8٪ الأجار البكتريولوجية في المياه ديوند والسماح لهم بتكتل لمدة 3 أيام على الأقل في 4 درجة مئوية في الظلام.
- ضع اللوحات عمودياً في حاضنة النمو أو غرفة المناخ واسمح لها بالنمو لمدة 10-12 يومًا في ظروف قصيرة اليوم (8 ساعات ضوئية عند 22 درجة مئوية، 16 ساعة داكنة عند 20 درجة مئوية).
- نقل 10-20 شتلة في بئر واحد من 12-جيدا واضحة مسطح القاع لوحة ثقافة الخلية مليئة 2 مل من محلول ملح MS نصف قوة تكملها 1٪ السكروز وتعديلها إلى درجة حُكم 5.7.
- إضافة 45 μCi من [3H]-ميو-إينوزيتول(30-80 Ci/mmol, حل في 90% الإيثانول) ومزيج من دوامة لطيف. غطي اللوحة بالغطاء المقابل وختمها بشريط جراحي صغير (على سبيل المثال، ميكروبور أو شريط ليوكوبور)، مما يضعها مرة أخرى في حاضنة النمو.
تنبيه:[3H] هو مصدر بيتا منخفض الطاقة يمكن أن يكون خطر إشعاع ضار عند استنشاقه أو تناوله أو امتصاصه من خلال الجلد العاري. ارتداء القفازات دائمًا عند التعامل مع المواد المشعة أو المعدات التي لها اتصال مباشر أو غير مباشر بالمواد المشعة. اتبع أيضا القواعد المحلية من أجل التعامل الآمن من المواد الكيميائية الإشعاعية (مثل ارتداء ملابس واقية إضافية، واستخدام مقياس الجرعات ومسوح الأسطح للتلوث على أساس منتظم). - بعد 5 أيام من وضع العلامات ، وإزالة الشتلات من وسائل الإعلام وغسلها لفترة وجيزة مع المياه ديوند. جففها بمناشف ورقية ونقلها إلى أنبوب ميكروسنتريفوغي 1.5 مل. لا تعبئة الأنبوب، ومكان لا يزيد عن 100 ملغ FW / أنبوب، والذي يتوافق مع ما يقرب من 10\u201220 17-day-17-شتلات من العمر.
ملاحظة: زيادة المواد النباتية سوف تضعف الحمض أثناء عملية الاستخراج وسوف تقلل بقوة من كفاءة الاستخراج.- قم بتجميد الأنبوب في النيتروجين السائل وتخزينه عند -80 درجة مئوية حتى الاستخراج.
ملاحظة: يمكن الاحتفاظ بالعينات عند -80 درجة مئوية لعدة أسابيع دون المساس بجودة العينة. يمكن تعديل ظروف النمو (الوسائط، الضوء، درجة الحرارة، الوقت) وفقا لاحتياجات تجربة محددة أو أنواع نباتية. ومع ذلك، ينبغي توخي الحذر عند تخفيف [3H]-ميو-إينوزيتول، من أجل ضمان كميا SAX-HPLC يعمل من نوعية جيدة. ولذلك, فمن المستحسن أن تبدأ مع [3H]-ميو-الإينوزيتول التركيزات المذكورة هنا والحد من ذلك خطوة إذا رغبت في ذلك. خلال فترة وضع العلامات، يمكن أن تُعرض النباتات على علاجات مختلفة (مثل الضغوط البيئية أو العوامل الكيميائية) لتقييم تأثير تلك الظروف على InsPs العالمية. للوصول إلى وضع العلامات الثابتة الحالة، نوصي بتسمية النباتات لمدة 5 أيام على الأقل.
- قم بتجميد الأنبوب في النيتروجين السائل وتخزينه عند -80 درجة مئوية حتى الاستخراج.
4. استخراج InsPs القابلة للذوبان
ملاحظة: احتفظ بالعينات والكواشف على الجليد أثناء عملية الاستخراج بأكملها. دائما ارتداء القفازات والنظارات الواقية نظرا لارتفاع خطر ملامسة المواد المشعة، وخاصة أثناء الطحن. ويعتبر كل ما يتصل بالعينات من النفايات المشعة وينبغي التخلص منه وفقا للقواعد المحلية للتخلص الآمن من المواد المشعة.
- تحضير حلول العمل لـ المخزن المؤقت الاستخراج و تحييد كما في الخطوة 2.1. وسوف تتطلب كل عينة 600 ميكرولتر من العازلة استخراج و 400 ميكرولتر من عازلة تحييد. تخزين المخازن المؤقتة على الجليد.
- خذ العينات من -80 درجة مئوية والفريزر والاحتفاظ بها في النيتروجين السائل حتى مزيد من المعالجة. طحن العينات مع أنبوب microcentrifuge الآفات حتى تبدأ في الذوبان وإضافة 500 ميكرولتر من الجليد الباردة استخراج العازلة. استمر في الطحن حتى يتم تجانس العينة تمامًا، كما أن الحل له لون أخضر عميق (إذا كانت الأوراق موجودة في العينة).
- الطرد المركزي العينات لمدة 10 دقيقة في 4 ° C في ≥ 18000 x ز. نقل ناظر إلى أنبوب 1.5 مل جديدة. نضع في اعتبارنا أن الأنابيب المستخدمة لاستخراج تعتبر النفايات المشعة الصلبة وتحتاج إلى التخلص منها وفقا لذلك.
-
إضافة بعناية 300 μL من تحييد العازلة إلى استخراج. هطول البروتينات ومحتدما سيبدأ على الفور. تخلط من قبل دوامة مع طرف ماصة بعد دقيقة وانتظر لبضع ثوان قبل الأنابيب كمية صغيرة (5 ميكرولتر) على ورقة درجة اله (من الناحية المثالية مجموعة من درجة الH 6-9). وينبغي أن يكون بين pH 7 و 8 في نهاية المطاف.
- إذا لزم الأمر، إضافة كميات صغيرة (عادة 10-20 ميكرولتر) إما تحييد العازلة أو استخراج العازلة حتى يتم الوصول إلى درجة الH المطلوبة. دع العينات ترتاح على الثلج لمدة ساعة على الأقل مع غطاء مفتوح.
- أجهزة الطرد المركزي العينات لمدة 10 دقيقة في 4 ° C في ≥ 18000 x ز. نقل ناظر إلى أنبوب 1.5 مل جديدة.
ملاحظة: يمكن استخدام العينات مباشرة في تشغيل SAX-HPLC أو الاحتفاظ بها على الجليد (إذا استخدمت في وقت لاحق في نفس اليوم) أو تجميدها في النيتروجين السائل وتخزينها في -80 درجة مئوية لمدة 2\u20124 أسابيع. لضمان قابلية التكاثر العالية والقابلية للمقارنة ، يوصى دائمًا بتجميد العينات في النيتروجين السائل لمدة 5 دقائق ، حتى لو سيتم استخدامها مباشرة بعد ذلك. التخزين على المدى الطويل للعينات المستخرجة في -80 درجة مئوية ممكن طالما يتم إذابة العينات مرة واحدة فقط. إذا تم استخدام العينات المجمدة للتحليل، تأكد من عدم وجود جزيئات مرئية بعد الذوبان. خلاف ذلك، الطرد المركزي مرة أخرى لمدة 10 دقيقة في 4 درجة مئوية في ≥ 18000 × ز ونقل عظمى إلى أنبوب 1.5 مل الطازجة.
5. تنفيذ تشغيل HPLC
- تجهيز جامع الكسور مع 96 قنينة صغيرة متألقة (قدرة ~ 6 مل) وملء كل قارورة مع 2 مل من كوكتيل التبلور مناسبة (على سبيل المثال، Ultima-FLO AP كوكتيل التبلور السائل) متوافق مع مخازن مع انخفاض درجة ح O والتركيز الفوسفات الأمونيوم عالية (انظر جدول المواد).
ملاحظة: يعتمد عدد القنينات وحجم القنينات على جامع الكسر وعداد التلألؤ المستخدم. من المهم على الأقل جمع الكسور 90 الأولى, إذا تم استخدام التدرج الموضح هنا, للحصول على التشكيل الجانبي إينوزيتول متعدد الفوسفات الكامل. تأكد أيضاً من وضع علامة على كل قارورة وغطاء لها، لمنع الخلط بين الكسور أو العينات. - بدء تشغيل نظام HPLC / مضخات ويكون عليه استعداد لتشغيل. تفعيل الختم المكبس غسل والحفاظ على تنشيطها خلال المدى كله. قم بتحميل العينة عن طريق حقن المُنَاط الكامل يدوياً من الخطوة 4.5 (حوالي 750 ميكرولتر) باستخدام حقنة مناسبة (انظر جدول المواد). إذا كان الحقن التلقائي ممكنًا، قم بنقل العينة إلى قارورة العينة المقابلة. تحويل صمام من "تحميل" إلى "حقن" الموقف وبدء التدرج وجامع الكسر.
ملاحظة: استناداً إلى نظام HPLC المستخدمة، قد تختلف إجراءات البدء، خاصة عند مقارنة الأنظمة القديمة (كما هو موضح هنا) مع طراز أحدث يتم التحكم فيه بالكامل من قبل البرامج. من المهم جدا التأكد من أن التدرج، حقن العينة وجمع كسر تبدأ في وقت واحد. - أثناء تشغيل HPLC مستمر، تحقق من الضغط بانتظام. يجب أن يكون ضغط البداية حوالي 18-24 بار (1.8-2.4 MPa) ويجب أن يرتفع ببطء إلى 50-60 بار (5-6 MPa) بمجرد الوصول إلى المخزن المؤقت 100٪B.
تنبيه: قد يشير انخفاض الضغط إلى تسرب في النظام بينما يشير الضغط المتزايد إلى انسداد. يمكن أن تشير تقلبات الضغط (≥ 3 بار في بضع ثوان) إلى وجود الهواء في النظام. نضع في اعتبارنا أن كل ما يترك العمود، وكذلك كل تسرب يحدث في حاقن أو بعد ذلك هو المشعة.
ملاحظة: الضغط يعتمد أيضاً على نظام HPLC ويمكن أن يكون أقل أو أعلى من مذكور هنا. وسوف تزداد ببطء بعد ما يقرب من 15-20 أشواط. ومع ذلك، هذا لا يؤثر بالضرورة على نوعية عمليات الحصول عليها. - بعد المدى، وإغلاق قوارير بإحكام وخلط الكسور مع كوكتيل التلألؤ عن طريق هز قوية. المضي مباشرة مع قياس أو الحفاظ على قارورة في وضع مستقيم، من الناحية المثالية في الظلام.
ملاحظة: الكسور الممزوجة بكوكتيل التلألؤ مستقرة لأسابيع ويمكن قياسها لاحقًا. وبما أن نصف عمر التريتيوم هو 12.32 سنة، فإن فقدان الإشارة لا يكاد يذكر. - بمجرد الانتهاء من تشغيل آخر عينة من اليوم، إيقاف كل من مضخات HPLC.
- (اختياري) لزيادة طول عمر النظام، وخصوصا عندما لا يتم استخدامه بانتظام، وغسل مضخة B والشعيرات الدموية عن طريق وضع الشعيرات الدموية من المخزن المؤقت باء في زجاجة مع المخزن المؤقت A والسماح لتشغيل مضخة لمدة 10-15 دقيقة. قبل الاستخدام التالي، تذكر أن تحل محل الشعيرات الدموية في المخزن المؤقت B وإلى فك مضخة B من الخلاط إلى مسحه مع المخزن المؤقت B. مرة واحدة يتم تعبئة المضخة والشعيرات الدموية مرة أخرى مع المخزن المؤقت B، إعادة الاتصال مع خلاط والنظام جاهز للاستخدام.
6. قياس الكسور
- أدخل القنينات في رفوف مضادة التلألؤ و قم بقياس كل قارورة لمدة 5 دقائق في عداد متألق سائل.
- من الناحية المثالية، استخدم رفوف تناسب قوارير صغيرة مباشرة وتجنب الشنق في القنينات في قنينات أكبر (على سبيل المثال، 20 مل) للحد من أخطاء العد. تظهر إعدادات البرامج المستخدمة في هذا البروتوكول في الشكل الإضافي 1.
ملاحظة: تنفيذ بروتوكول SNC (التطبيع الذاتي والمعايرة) بانتظام باستخدام معايير[3H] غير مطفأة. من الممكن تقليل وقت الانتظار في أوقات العد الأقصر (1-5 دقائق). ومع ذلك، لضمان تكرار العد عالية والدقة، ويوصى 5 دقيقة.
7 - تحليل البيانات
- تصدير القياسات من عداد التلألؤ كملف جدول بيانات أو تنسيق ملف متوافق/قابل للتحويل. قم بتقييم البيانات باستخدام كمبيوتر مجهز ببرنامج Excel أو برنامج مشابه، وبرنامج تحليل مناسب مثل Origin.
- إعداد مخطط خطي 2-D حيث يتم رسم عدد الدقائق المقاسة في مقابل وقت الاحتفاظ (انظر الشكل 1، الشكل 2).
- لمقارنة العينات مع بعضها البعض، تطبيع البيانات عن طريق تلخيص كل جزء من جزء من كل من 25 إلى 96 دقيقة لكل عينة على حدة.
ملاحظة: الدقيقة 25 يستخدم كقطع لاستبعاد غير مدمج[3H]-ميو-إينوزيتول, InsP1 و InsP2 من التحليل, كما أن تلك تميل إلى التقلب بقوة ولا يمكن فصل جيدا (على الأقل مع التدرج المقترح في هذا البروتوكول) وبالتالي تغيير بقوة عامل التطبيع بسبب نشاطها العالي. - تطبيع جميع البيانات إلى العينة مع أدنى الكلي في الدقيقة (في الكسور 25\u201296) عن طريق تقسيم مجموع cpm من العينة مع أدنى في الدقيقة (في الكسور 25-96) على مجموع في الدقيقة (في الكسور 25-96) من العينات الأخرى. ويمكن بعد ذلك استخدام العامل الناتج لتطبيع cpm من كل كسر بضرب cpm من كل كسر مع العامل.
ملاحظة: في النهاية، يجب أن يكون مجموع القيم cpm من الدقيقة 25 إلى النهاية يساوي كافة العينات مقارنة مع بعضها البعض. يجب أن يتم عرض عمليات التشغيل التي تمت تسويتها فقط في نفس الرسم البياني/الشكل (عند تقديمها على هيئة ملفات تعريف فعلية). يوضح الشكل الإضافي 2 مثالاً على كيفية إجراء خطوات الحساب هذه (باستخدام الكسور 25-35 فقط من عينتين للتبسيط). ومع ذلك، في بعض الحالات ليس من الضروري تطبيع البيانات. على سبيل المثال، عندما يتم تحديد حجم القمم وفقا للخطوة 7.4 وعرضها كنسبة مئوية من مجموع InsPs (كما هو مبين في الشكل 3D). وكما ذكر من قبل، عند تقديم تحليلات متعددة جنباً إلى جنب كملامح، أو عند استخدام النشاط المقيّم الفعلي للاستنتاجات (على سبيل المثال، المعالجة أ) يزيد من نسبة InsP7 بنسبة x% مقارنة بـ"التحكم"، في إشارة إلى قيم الـ cpm لـ InsP7 من كلتا العينتين وليس إلى نسبتها المئوية من إجمالي InsPs) التطبيع مطلوب. لتحليل تأثير النمط الجيني أو الاختلافات العلاجية على كفاءة وضع العلامات، من المهم عدم تطبيع، لأن هذا من شأنه أن يبطل هذه الاختلافات. ومع ذلك ، فإن القياس الكمي المطلق مع هذه الطريقة يمثل تحديًا لأن كفاءة الاستخراج مع هذا البروتوكول يمكن أن تكون متغيرة لأسباب مختلفة ، ويتم ملاحظتها أحيانًا عند تحليل النسخة المتماثلة من نفس النمط الجيني والعلاج. ضع في اعتبارك أنه قد يلزم تغيير القطع وفقًا لنظام HPLC والعمود والتدرج المستخدم في التحليلات. - لتنفيذ القياسات النسبية لبعض قمم البولي فوسفات إينوزيتول، ثم إنشاء الرسوم البيانية شريط التي تحتوي على بيانات من النسخ المتماثل للتحليلات الإحصائية، مواصلة التحليل مع البرامج المتخصصة التي يمكن حساب مناطق الذروة من الكروماتوجرام (على سبيل المثال، الأصل). انظر الشكل التكميلي 3.
ملاحظة: يتم توفير معظم أنظمة HPLC التي يتم التحكم في البرامج مع برنامج ذات الصلة قادرة على هذه المهمة. يتم تحديد القمم ككسور مع قيم cpm أعلاه الخلفية (التي تختلف إلى درجة معينة بين تشغيل) وأوقات الاحتفاظ التي تشبه البيانات المنشورة سابقاً. يتم تحديد وقت الاحتفاظ بذرة محددة في برامج جداول البيانات (مثل Excel) ويستخدم لتعيين الذروات لحساب تكاملات محددة (على سبيل المثال، في Origin). ويوضح الشكل التكميلي 3 هذه العملية المتمثلة في تحديد الذروة، والطرح في الخلفية، وتكامل القمم.
Representative Results
وتهدف النتائج المبينة هنا إلى توضيح النتائج المحتملة التي تم الحصول عليها وفقاً للتغيرات على المستويين التقني والبيولوجي. يتمثل الأول في التحليلات باستخدام أعمدة جديدة مقابل أعمدة مسنة(الشكل 1)وعينات جديدة مقابل عينات مخزنة (الشكل 3)، والثانية من خلال تقييم مقتطفات من نظامين نباتيين مختلفين هما A. thaliana (الشكل 1، الشكل 3) وL. japonicus (الشكل 2).
يتم تصوير تشغيل SAX-HPLC الأمثل على الشكل 1A\u2012C, الذي يظهر كامل الاينوزيتول متعدد الفوسفات الطيف التي تم الحصول عليها من مقتطفات A. ثاليانا بعد عد التلألؤ. لاحظ أن القمم يتم فصلها بشكل جيد ويمكن تعيينها إلى الأيزومرات المختلفة (أو أزواج اانتائي) على أساس التنقل الكروماتوغرافي الموصوفة في وقت سابق5،7.
ويبين الشكل 2 النتيجة التمثيلية لتحليل SAX-HPLC لشتلات L. japonicus التي نمت وتوصف في ظل نفس الظروف مثل شتلات Arabidopsis. في حين يفترض أن جميع الأنواع والذروات InsP التي تعرف من Arabidopsis يمكن أن ينظر إليها، هناك اختلافات كبيرة فيما يتعلق النسبية (على سبيل المثال، النسب بين ايزومر) كمية من ايزومرات InsP محددة، عند مقارنة ملامح كلا النوعين. على سبيل المثال، أظهرت مقتطفات لوتس زيادة InsP3c،InsP4b،InsP5b، وخفض InsP3a،InsP4a،InsP5a و InsP5c مقارنة Arabidopsis مما يترك مجالا لمزيد من التحقيقات. يوضح الشكل 2D النسب المختلفة بين ايزومرات InsP بين Arabidopsis و Lotus.
ويبين الشكل 3 اثنين من ملامح InsP من عينة التي تم تقسيمها بعد الاستخراج. تم تحليل النصف الأول على الفور والنصف الثاني بعد يوم واحد، بعد التخزين في -80 درجة مئوية. لاحظ أن الاختلافات الطفيفة فقط لوحظت بين العينات المختلفة (أي خطوط سوداء وحمراء على الشكل 3A\u2012C، والشكل 3D). وهذا يوضح أن دورة التجميد-ذوبان واحدة لا تضر العينة وأن الطريقة نفسها تولد نتائج قابلة للاستنساخ.
الشكل 1: التشكيل الجانبي InsP نموذجي من ناجحة وتحليل SAX HPLC غير ناجحة تنفيذها مع هذا البروتوكول. (A\u2012C) SAX-HPLC الشخصية من 17 يوما من نوع البرية (كول-0) شتلات Arabidopsis radiolabeled مع [3H]-ميو-إينوزيتول. تم تنفيذ استخراج InsP العالمية وتشغيل SAX-HPLC في نفس اليوم. (A) الأطياف الكاملة؛ (B, C) تكبير/تصغير ملف التعريف المعروض في A. يتم تمييز جميع القمم المرئية وتعيينها لأنواع InsP المقابلة. استنادا إلى نشر التنقل الكروماتوغرافي5,7, InsP4a يمثل المرجح Ins(1,4,5,6)P4 أو Ins(3,4,5,6)P4, InsP5a يمثل InsP5 [2] -OH], InsP5b يمثل InsP5 [4-OH] أو نموذجها enantiomeric InsP5 [6-OH] ، و InsP5c يمثل InsP5 [1-OH] أو شكله enantiomeric InsP5 [3-OH]. لا تزال طبائع isomeric InsP3a-c، InsP4b، InsP7، و InsP8 غير معروفة. لوحة (D) يعرض SAX-HPLC ملف تعريف من النباتات التي نمت بشكل متطابق ولكن باستخدام عمود العمر (> 40 أشواط). وهناك انخفاض واضح من InsP6 بالمقارنة مع الأنواع الأخرى InsP وعدم وجود PP-InsPs مرئية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: نبذة عن InsP التمثيلية لمحطات L. japonicus. SAX-HPLC الشخصي (A\u2012C) من 17 يوما من نوع البرية (Gifu) L. japonicus الشتلات radiolas مع [3H]-ميو -إينوزيتول.myo (A) الأطياف الكاملة؛ (B, C) تكبير/تصغير ملف التعريف المعروض في A. يتم تمييز جميع القمم المرئية وتعيينها لأنواع InsP المقابلة. استنادا إلى نشر التنقلات الكروماتوغرافي5,7, InsP4a يمثل المرجح Ins(1,4,5,6)P4 أو Ins(3,4,5,6)P4, InsP5b المرجح يمثل InsP5 [4-OH] أو شكله enantiomeric InsP5 [6-OH] ، و InsP5c يمثل على الأرجحInsP 5 [1-OH] أو شكله enantiomeric InsP5 [3-OH]. طبائع isomeric من InsP3a-c، InsP4b، InsP7، و InsP8 غير معروفة. (D) مقارنة بين الأنواع InsP الفردية (في ٪ من إجمالي النشاط من elution 25\u201296) من A. الثاليانا (بيانات من الشكل 1A\u2012C) وL. japonicus (البيانات من الشكل 2A-C). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: لمحات InsP لعينة مقسمة توضح إمكانية استنساخ تحليلات SAX-HPLC. (A\u2012C) SAX-HPLC من 17 يوما من نوع البرية (كول-0) شتلات Arabidopsis radiolabeled مع [3H]-ميو-إينوزيتول. قبل المدى، تم تقسيم العينة ونصف تشغيل على الفور ونصف واحد واحد في وقت لاحق بعد يوم واحد بعد التخزين في -80 درجة مئوية (A) كامل الأطياف؛ (B, C) تكبير/تصغير ملف التعريف المعروض في A. يتم تمييز جميع القمم المرئية وتعيينها لأنواع InsP المقابلة. استنادا إلى نشر التنقلات الكروماتوغرافي5,7, InsP4a يمثل المرجح Ins(1,4,5,6)P4 أو Ins(3,4,5,6)P4, InsP5a يمثل InsP5 [2-OH], InsP5a يمثل InsP5 [2-OH], InsP5b يمثل InsP5 [4-OH] أو نموذجها enantiomeric InsP5 [6-OH], و InsP5c يمثل InsP5 [1-OH] أو شكله enantiomeric InsP5 [3-OH]. لا تزال طبائع isomeric InsP3a-c، InsP4b، InsP7، و InsP8 غير معروفة. يعرض اللوحة D القياس الكمي لـ InsP6 و PP-InsPs InsP7 و InsP8 من كلا التشغيلين. تمثل القيم المبلغ (في%) من الأنواع InsP المعنية بالنسبة لجميع InsP (النشاط الكلي من elution 25-96). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل التكميلي 1: إعدادات البرامج للمسح السائل باستخدام عداد التلألؤ الخفيف. لقطات تظهر إصدار البرنامج، وكذلك الإعدادات المستخدمة في عد التلألؤ من [3ح] يتم تصوير العينات التي تم تنفيذها مع هذا البروتوكول. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الرقم.
الشكل التكميلي 2: مثال تمثيلي لتطبيع البيانات. لقطة شاشة لورقة عمل تعرض جميع الخطوات والصيغ المستخدمة لتطبيع عمليات SAX-HPLC مع بعضها البعض. للتبسيط، يتم عرض الكسور فقط 25-35 من العينات. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الرقم.
الشكل التكميلي 3: تحديد الذروة، والطرح الخلفية والتكامل باستخدام برامج التحليل. (أ)يتم تحميل البيانات من تحليل SAX-HPLC في البرنامج (دقائق 28-96) ويتم تحديد أداة محلل الذروة. (B\u2012E) يتم تعريف الخط الأساسي يدوياً عن طريق تعيين النقاط بين القمم الفردية ويتم طرح الخلفية. (F) يتم تحديد القمم يدويا على أساس المظهر ونشر التنقلات الكروماتوغرافية5,7. (G) يتم تعريف نطاقات الذروة يدويًا بواسطة قيم cpm. (H) يتم دمج القمم وحسابها كنسبة مئوية من جميع القمم. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الرقم.
Discussion
هنا نقدم طريقة متعددة وحساسية لقياس Insps بما في ذلك PP-InsPs في المستخلصات النباتية وتقديم نصائح عملية حول كيفية الحصول على هذه الطريقة المنشأة. على الرغم من أن البروتوكول هو قوي عموما، يمكن أن يحدث تشغيل دون المستوى الأمثل والتحليلات. في معظم الحالات، يمكن تحديد تلك أشواط من قبل تخفيض قوي أو حتى خسارة كاملة من InsPs الفوسفورية للغاية، وخاصة الأنواع PP-InsPInsP 7 و INSP8. ويمكن أن تكون الأسباب المحتملة هي التلوث الميكروبي للمواد النباتية وعدم كفاية تعطيل المياه النباتية المنشأة من نوع PP-InsP أثناء الاستخراج بسبب عدم كفاية طحن وذوبان المواد النباتية التي لن تكون على اتصال فوري مع حاجز الاستخراج. وتشمل الأسباب الأخرى عدم دقة ضبط الـ PH بإضافة غير كافية أو زائدة من عازلة التحييد، أو ببساطة عدم كفاية مواد العينة. ويمكن أن تجعل هذه الأخيرة من الصعب الكشف عن PP-InsPs، لأن تلك غالبا ما تكون موجودة بكميات منخفضة جدا في الخلايا. قد يؤدي فائض مادة العينة أو التجفيف غير الفعال خلال الخطوة 3.5 إلى تخفيف حمض البيركلوريك، مما يؤدي أيضاً إلى عدم كفاية تعطيل الإنزيم وفقدان محدد لـ InsP6 و PP-InsPs. وقد تم تحسين كمية المواد النباتية، وكذلك الشعاعي المستخدمة في هذا البروتوكول على أساس التكاليف والأداء، وبالتالي فهي قريبة من أقل كمية لا تزال كافية لتوفير أفضل النتائج. وبالإضافة إلى ذلك، فإن الراتنج العمود تدريجيا فضفاضة قدرتها على حل. أول علامة على هذه العملية (لأسباب ليست واضحة تماما للمؤلفين) خسارة محددة من أعلى الفوسفورية InsP الأنواع مثل PP-InsPs في الطيف HPLC. مع مزيد من الشيخوخة، وحتى InsP6 لن يتم حلها بشكل صحيح من قبل العمود (الشكل 1D). لذلك، فإن استخدام عمود مناسب، فضلا عن التعامل الدقيق مع العينة والصيانة السليمة لمكونات HPLC أمر بالغ الأهمية لضمان نتائج دقيقة.
عند مقارنة العينات وتشغيل، وخصوصا عندما ولدت مع معدات مختلفة (على سبيل المثال، أنظمة HPLC والأعمدة) أو في أيام مختلفة، فمن الأهمية بمكان تطبيع العينات لبعضها البعض (كما هو موضح في الخطوة 7.3) وتحليلها بنفس الطريقة. فقط من خلال التطبيع من الممكن ودقيقة لإظهار عينات متعددة في نفس الرسم البياني (الشكل 3). بالنسبة لتحديد كمية الـ InsPs الفردية بالنسبة إلى إجمالي InsPs أو أنواع معينة أخرى من InsP ، ليس من الضروري تطبيعها ، طالما يتم عرض القيم النسبية فقط وليس القيم المطلقة. من الناحية المثالية ، يتم عرض كل من ملفات InsP والكمية. ومع ذلك، في بعض الحالات لا يمكن إظهار تشغيلين أو أكثر بشكل مناسب في نفس الرسم البياني. يمكن أن تجعل أوقات الاحتفاظ المختلفة أو مستويات مختلفة من نشاط الخلفية من الصعب مقارنة ملفات تعريف SAX-HPLC غير المُحصَّنة وحدها. نفس الشيء هو الصحيح عندما العديد من العينات تحتاج إلى مقارنة. وفي مثل هذه الحالات، يلزم إجراء تقييم آخر باستخدام برنامج حاسوبي إضافي (مثل الأصل) من أجل تحديد مقدار الذروة الفردية.
يدرك المؤلفون أن البروتوكول الموصوف هنا يمكن أن يكون الأمثل ويحتاج إلى تكييفه مع كل سؤال بحثي فردي. على الرغم من أن يجري الأمثل لعربيدوبسيس مقتطفات7،17 في هذا البروتوكول ، وهذا الأسلوب هو تنوعا ويمكن أن تساعد في تحديد ملامح InsP من الأنواع النباتية الأخرى أيضا. هنا نحن مثال على هذا الاحتمال من خلال تقديم لأول مرة ملف InsP لL. japonicus، والتي تتطلب أي تعديلات على شروط وضع العلامات ، استخراج InsP أو تشغيل SAX -HPLC (الشكل 2). وتجدر الإشارة إلى أنه في حين أن التشابه العام، لوحظ وجود اختلافات بين ملفات تعريف L. japonicus و Arabidopsis InsP. على سبيل المثال، في L. japonicus InsP5 [4-OH] أو شكله enantiomericInsP 5 [6-OH] أكثر وفرة من InsP5 [1-OH] أو شكله enantiomeric InsP5 [3-OH] بالمقارنة مع Arabidopsis، حيث InsP5 [1-OH] أو شكله enantiomeric InsP5 [3-OH] هي الأنواع المهيمنة InsP5. وبالمثل، فإننا نتوقع أن التغييرات في تكوين وسائل الإعلام،[3H]- ميو-الإينوزيتول التركيز، عمر النبات، الظروف البيئية (على سبيل المثال، الضوء ودرجة الحرارة)، إضافة المركبات الكيميائية أو تحليلات التفاعلات النباتية الميكروبية من بين عوامل أخرى، قد تحتاج إلى اختبار وتكييفها.myo
أحد العيوب الهامة لهذه الطريقة التي يجب النظر فيها هو أن يتم وضع العلامات في ثقافة سائلة (عقيمة) ، والتي لا تمثل بيئة فسيولوجية لمعظم النباتات الأرضية. بالإضافة إلى ذلك ، نظرًا لارتفاع تكاليف [ΟH] -ميو- إينوزيتول ، فإن حجم محلول وضع العلامات وحجم الوعاء الثقافي محدود بشكل عام ، مما يحد أيضًا من حجم النباتات التي يمكن استخدامها. ويمكن تجنب زراعة في الثقافة السائلة عن طريق التسلل مباشرة على سبيل المثال أوراق النباتات التي تزرع التربة مع [³H]-ميو-إينوزيتول وبعد ذلك بعد البروتوكول الموصوف هنا، كما ذكرت سابقا10.
هناك عدة عيوب لهذا البروتوكول بالمقارنة مع الطرق البديلة، مثل تيو2 سحب لأسفل متبوعة بالتقنيات المستندة إلى PAGE أو قياس الطيف الكتلي. نظرا ل [3H]-ميو-اينوزيتول وضع العلامات, فقط الأنواع InsP التي تنشأ مباشرة من ميو-الإينوزيتول سيتم الكشف عنها في نهاية المطاف. myo الطريقة الموصوفة هنا هي عمياء عن ايزومرات Ins الأخرى مثل scyllo-إينوزيتول وغيرها من الايزومرات التي تم تحديد بعض منها في بعض النباتات44. وعلاوة على ذلك، سيتم استبعاد ميو-InsPsالمستمدة من مسارات أخرى، بما في ذلك تلك التي تم تصنيعها من قبل دي نوفو توليف ميو-إينوزيتول وميو-إينوزيتول-3-الفوسفات عن طريق الأيزوميري من الجلوكوز-6-الفوسفات، حفزت من قبل ميو-إينوزيتول-3-فوسفات سينثاز (MIPS) البروتينات45. myo على الرغم من أن [32P] أو [33P] -ortho-phosphateيمكن استخدامها كتسميات بديلة ، فإن استخدامها يشكل عيبًا كبيرًا ، حيث سيتم تسمية كل جزيء يحتوي على الفوسفات ، بما في ذلك النيوكليوتيدات الوفيرة ومشتقاته. ويمكن أيضا استخراج تلك الجزيئات مع هذا البروتوكول وربط عمود SAX، والتي سوف تؤدي إلى مستوى عال من النشاط الخلفية التي سوف تتداخل مع تحديد الفردية InsP قمم5. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن تتأثر بشدة القياس الكمي ل [32ف] - أو [33P] - المسمى Insps وPP-InsPs من قبل الفوسفات و pyrophosphate مويتي دوران وقد لا الإبلاغ عن قراءات الشامل لأنواع إينوزيتول.
من ناحية أخرى, [3H]-ميو-إينوزيتول تسميات ميوعلى وجه التحديد -الجزيئات المحتوية على إينوزيتول. InsPs, الدهنيات المحتوية على الإينوزيتول, مثل فوسفينوسيتيديس, وغالاكتينول هي في هذه الحالة وصفت. ومع ذلك، سيتم تحليل InsPs فقط مع هذا البروتوكول، منذ الدهون غير قابلة للذوبان في العازلة استخراج وgalctinol لا يرتبط عمود SAX.
حتى الآن، فإن الاختلافات من مصنع InsP التشكيل الجانبي التي تم إنشاؤها بواسطة [3H]-ميو -إينوزيتول وضع العلامات مقارنة مع واحد يحددها تيو2 الإنزال / PAGE لا تزال غير معروفة، لأن هذه المقارنات لم يتم تنفيذها في النباتات.myo تناولت دراسة حديثة في الخلايا الحيوانية هذا السؤال46. في هذا العمل، تم تحديد مجموعة من InsP6 غير مرئية من قبل [3H]-ميو-وضع العلامات الإينوزيتول، والتي ينبغي بالتالي أن تكون مشتقة مباشرة من الجلوكوز-6-الفوسفات، من خلال مقارنة SAX-HPLC ملامح مع جلية الصفحة من خطوط خلايا الثدييات. 24 ساعة من الفوسفات المجاعة أدى إلى زيادة 150٪ من InsP6 عند تحديد كمي جلي الصفحة من InsPs تنقيتها باستخدام تيو2 الانسحاب. SAX-HPLC تحليلات [3H]-ميو-إينوزيتول- تسمية الخلايا التي تم التعامل معها بشكل متطابق فقط أظهرت زيادة بنسبة 15٪ من [3H]-InsP6. كما ذكر سابقاً، InsPs أقل منInsP 5 غير قابل للكشف مع تحليل PAGE في معظم الحالات. يبدو أن التسمية الراديوية تليها SAX-HPLC هي الطريقة المفضلة، طالما لم يتم تحسين بروتوكولات الطيف الشامل للكشف عن هذه المجموعة من الجزيئات المشحونة بشكل سلبي للغاية.
وثمة تحد آخر المتبقي هو التمييز بين enantiomers في تحليلات SAX -HPLC (أو في أي طريقة أخرى لتحليل InsP)10،17. ويمكن معالجة هذا التحدي من خلال إضافة محددات chiral، أي، مركبات enantiopure مثل L-أرجينين أميد التي تتفاعل مع الجزيئات enantiomeric على حده لتشكيل مجمعات diastereomeric التي يمكنفصلها 10. على حد علمنا ، تم تنفيذ هذا النهج فقط للتمييز بين enantiomeric InsP5 ايزومر InsP5 [1-OH] و INSP5 [3-OH] من قبل NMR تحليلات10. ولم يتم الإبلاغ بعد عن التمييز في أزواج أخرى من أشكال الجنسين أو التمييز الناجح ضد الأناتيومرات بواسطة تحليل الـ chiral SAX-HPLC أو الأساليب القائمة على شبكة "تشيرال" PAGE، وينبغي مواصلة تطويرها. وبالنظر إلى التوليف المحفوظة والقواعد المحفوظة PP-InsPs من قبل توافر الفوسفور، ونحن نتصور أن أساليب غير مشعة خاصة مثل PAGE أو الأساليب القائمة على MS، جنبا إلى جنب مع تحليلات المغذيات، وسوف تساعد على الأرض الحقيقة الجهود لمعايرة بيانات الاستشعار عن بعد المصممة لتشخيص أوجه القصور في المواد الغذائية في المحاصيل17،18،24،25. ومع ذلك، الطريقة المعروضة هنا لا يزال يمكن اعتبارها في الوقت الراهن المعيار الذهبي لتحليلات InsP وسوف تكون مفيدة لاكتشاف وظائف جديدة لهذه الرسل مثيرة للاهتمام في النباتات.
Disclosures
ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
تم تمويل هذا العمل من قبل دويتشه فورشونججسماينشافت (DFG، مؤسسة البحوث الألمانية) في إطار استراتيجية التميز في ألمانيا - EXC-2070 - 390732324 (PhenoRob)، ومجموعة التدريب البحثية GRK2064 ومنح البحوث الفردية SCHA1274/4-1 و SCHA1274/5-1 إلى G.S.. كما نشكر لي شلوتر وبريجيت أويبرباخ على المساعدة التقنية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Centrifuge | Eppendorf AG | model: 5430 R | |
| Diammonium hydrogen phosphate, ≥97 % | Carl Roth GmbH + Co. KG | 0268.1 | |
| Ethylenediamine tetraacetic acid disodium salt dihydrate, ≥99 %, p.a., ACS | Carl Roth GmbH + Co. KG | 8043.2 | |
| Falcon 12-well clear flat bottom TC-treated multiwell cell culture plate, with lid, individually wrapped, sterile | Corning Inc. | 353043 | |
| Fraction collector | LAMBDA Instruments GmbH | model: OMNICOLL single channel collector | |
| Growth incubator | poly klima GmbH | model: PK 520-LED | |
| HPLC pumps | Kontron Instruments | model: 420 | |
| HPLC syringe for Rheodyne valves, 1 mL | Hamilton Company | 81365 | |
| Injector for HPLC | Supelco | model: Rheodyne 9725 | |
| Inositol, myo-[1,2-3H(N)] | American Radiolabeled Chemicals Inc. | ART 0261 | |
| Liquid nitrogen | University, Chemistry Department | ||
| Liquid scintillation counter | PerkinElmer Inc | model: TRI-CARB 2900TR | |
| Micro pestle | Carl Roth GmbH + Co. KG | CXH7.1 | |
| Mixed cellulose Eester filter, ME range (ME 24), plain, 0.2 µm pore size, 47 mm circle | GE Healthcare Life Sciences | 10401770 | |
| Mixer for HPLC | Kontron Instruments | model: M 800 | |
| Murashige & Skoog medium, salt mixture | Duchefa Biochemie | M0221 | |
| OriginPro software | OriginLab Corp. | ||
| Orthophosphoric acid, ≥85 %, p.a., ISO | Carl Roth GmbH + Co. KG | 6366.1 | |
| Partisphere 5 µm SAX cartridge column, 125 x 4.6 mm | Hichrom Limited | 4621-0505 | |
| Perchloric acid, 70 %, 99.999 % trace metals basis | Sigma-Aldrich | 311421 | |
| Petri dish, square, PS, clear, 120/120/17 mm, sterile | Greiner Bio One International GmbH | 688161 | |
| pH-indicator paper pH 5.5 - 9.0, Neutralit | Merck KGaA | 109564 | |
| Phytagel | Sigma-Aldrich | P8169 | |
| Potassium carbonate | Carl Roth GmbH + Co. KG | P743.2 | |
| Safe-Lock tubes, 1.5 mL | Eppendorf AG | 30120086 | |
| Sample loop for 9725 injectors, volume 2 mL, PEEK | Supelco | 57648 | |
| SNAPTWIST scintillation vial, 6.5 mL | Simport Scientific Inc. | S207-5 | |
| Sterile bench | LaboGene | model: ScanLaf MARS 900 | |
| Sucrose, ≥99,5 %, p.a. | Carl Roth GmbH + Co. KG | 4621.1 | |
| Ultima-Flo AP liquid scintillation cocktail | PerkinElmer Inc | 6013599 | |
| Ultra-pure deionized water | Milli-Q | ||
| Wrenchless WVS End Fitting Kit | Hichrom Limited | 4631-1001 |
References
- Berridge, M. J., Irvine, R. F. Inositol Phosphates and Cell Signaling. Nature. 341 (6239), 197-205 (1989).
- Streb, H., Irvine, R. F., Berridge, M. J., Schulz, I. Release of Ca-2+ from a Nonmitochondrial Intracellular Store in Pancreatic Acinar-Cells by Inositol-1,4,5-Trisphosphate. Nature. 306 (5938), 67-69 (1983).
- Krinke, O., Novotna, Z., Valentova, O., Martinec, J. Inositol trisphosphate receptor in higher plants: is it real. Journal of Experimental Botany. 58 (3), 361-376 (2007).
- Kuo, H. F., et al. Arabidopsis inositol pentakisphosphate 2-kinase, AtIPK1, is required for growth and modulates phosphate homeostasis at the transcriptional level. Plant Journal. 80 (3), 503-515 (2014).
- Kuo, H. F., et al. Arabidopsis inositol phosphate kinases IPK1 and ITPK1 constitute a metabolic pathway in maintaining phosphate homeostasis. Plant Journal. 95 (4), 613-630 (2018).
- Gillaspy, G. E. Lipid-mediated Protein Signaling. Capelluto, D. G. S. , Springer. Netherlands. 141-157 (2013).
- Stevenson-Paulik, J., Bastidas, R. J., Chiou, S. T., Frye, R. A., York, J. D. Generation of phytate-free seeds in Arabidopsis through disruption of inositol polyphosphate kinases. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (35), 12612-12617 (2005).
- Lemtiri-Chlieh, F., MacRobbie, E. A. C., Brearley, C. A. Inositol hexakisphosphate is a physiological signal regulating the K+-inward rectifying conductance in guard cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (15), 8687-8692 (2000).
- Lee, H. S., et al. InsP6-sensitive variants of the Gle1 mRNA export factor rescue growth and fertility defects of the ipk1 low-phytic-acid mutation in Arabidopsis. Plant Cell. 27 (2), 417-431 (2015).
- Blüher, D., et al. A 1-phytase type III effector interferes with plant hormone signaling. Nature Communications. 8, (2017).
- Murphy, A. M., Otto, B., Brearley, C. A., Carr, J. P., Hanke, D. E. A role for inositol hexakisphosphate in the maintenance of basal resistance to plant pathogens. Plant Journal. 56 (4), 638-652 (2008).
- Poon, J. S. Y., Le Fevre, R. E., Carr, J. P., Hanke, D. E., Murphy, A. M. Inositol hexakisphosphate biosynthesis underpins PAMP-triggered immunity to Pseudomonas syringae pv. tomato in Arabidopsis thaliana but is dispensable for establishment of systemic acquired resistance. Molecular Plant Pathology. 21 (3), 376-387 (2020).
- Wild, R., et al. Control of eukaryotic phosphate homeostasis by inositol polyphosphate sensor domains. Science. 352 (6288), 986-990 (2016).
- Shears, S. B. Inositol pyrophosphates: Why so many phosphates. Advances in Biological Regulation. 57, 203-216 (2015).
- Shears, S. B. Intimate connections: Inositol pyrophosphates at the interface of metabolic regulation and cell signaling. Journal of Cellular Physiology. 233 (3), 1897-1912 (2018).
- Desai, M., et al. Two inositol hexakisphosphate kinases drive inositol pyrophosphate synthesis in plants. Plant Journal. 80 (4), 642-653 (2014).
- Laha, D., et al. VIH2 Regulates the Synthesis of Inositol Pyrophosphate InsP8 and Jasmonate-Dependent Defenses in Arabidopsis. Plant Cell. 27 (4), 1082-1097 (2015).
- Laha, D., et al. Arabidopsis ITPK1 and ITPK2 Have an Evolutionarily Conserved Phytic Acid Kinase Activity. Acs Chemical Biology. 14 (10), 2127-2133 (2019).
- Dorsch, J. A., et al. Seed phosphorus and inositol phosphate phenotype of barley low phytic acid genotypes. Phytochemistry. 62 (5), 691-706 (2003).
- Flores, S., Smart, C. C. Abscisic acid-induced changes in inositol metabolism in Spirodela polyrrhiza. Planta. 211 (6), 823-832 (2000).
- Brearley, C. A., Hanke, D. E. Inositol phosphates in barley (Hordeum vulgare L) aleurone tissue are stereochemically similar to the products of breakdown of InsP(6) in vitro by wheat-bran phytase. Biochemical Journal. 318, 279-286 (1996).
- Laha, N. P., et al. ITPK1-Dependent Inositol Polyphosphates Regulate Auxin Responses in Arabidopsis thaliana. bioRxiv. , (2020).
- Laha, D., et al. Inositol Polyphosphate Binding Specificity of the Jasmonate Receptor Complex. Plant Physiology. 171 (4), 2364-2370 (2016).
- Dong, J. S., et al. Inositol Pyrophosphate InsP(8) Acts as an Intracellular Phosphate Signal in Arabidopsis. Molecular Plant. 12 (11), 1463-1473 (2019).
- Zhu, J., et al. Two bifunctional inositol pyrophosphate kinases/phosphatases control plant phosphate homeostasis. Elife. 8, (2019).
- Couso, I., et al. Synergism between Inositol Polyphosphates and TOR Kinase Signaling in Nutrient Sensing, Growth Control, and Lipid Metabolism in Chlamydomonas. Plant Cell. 28 (9), 2026-2042 (2016).
- Ito, M., et al. Hydrophilic interaction liquid chromatography-tandem mass spectrometry for the quantitative analysis of mammalian-derived inositol poly/pyrophosphates. Journal of Chromatography A. 1573, 87-97 (2018).
- Wilson, M. S. C., Saiardi, A. Inositol Phosphates Purification Using Titanium Dioxide Beads. Bio-Protocol. 8 (15), (2018).
- Loss, O., Azevedo, C., Szijgyarto, Z., Bosch, D., Saiardi, A. Preparation of Quality Inositol Pyrophosphates. Jove-Journal of Visualized Experiments. (55), e3027 (2011).
- Harmel, R. K., et al. Harnessing C-13-labeled myo-inositol to interrogate inositol phosphate messengers by NMR Electronic supplementary information (ESI) available. Chemical Science. 10 (20), 5267-5274 (2019).
- Azevedo, C., Saiardi, A. Extraction and analysis of soluble inositol polyphosphates from yeast. Nature Protocols. 1 (5), 2416-2422 (2006).
- Shears, S. B. Inositol Phosphates: Methods and Protocols. Miller, G. J. , Springer US. 1-28 (2020).
- Wilson, M. S. C., Saiardi, A. Importance of Radioactive Labelling to Elucidate Inositol Polyphosphate Signalling. Topics in Current Chemistry. 375 (1), (2017).
- Stevenson-Paulik, J., et al. Inositol phosphate metabolomics: Merging genetic perturbation with modernized radiolabeling methods. Methods. 39 (2), 112-121 (2006).
- Liu, C., Riley, A. M., Yang, X., Shears, S. B., Potter, B. V. L. Synthesis and Biological Activity of d- and l-chiro-Inositol 2,3,4,5-Tetrakisphosphate: Design of a Novel and Potent Inhibitor of Ins(3,4,5,6)P4 1-Kinase/Ins(1,3,4)P3 5/6-Kinase. Journal of Medicinal Chemistry. 44 (18), 2984-2989 (2001).
- Hughes, P. J., Hughes, A. R., Putney, J. W., Shears, S. B. The regulation of the phosphorylation of inositol 1,3,4-trisphosphate in cell-free preparations and its relevance to the formation of inositol 1,3,4,6-tetrakisphosphate in agonist-stimulated rat parotid acinar cells. Journal of Biological Chemistry. 264 (33), 19871-19878 (1989).
- Shears, S. B., Kirk, C. J., Michell, R. H. The pathway of myo-inositol 1,3,4-trisphosphate dephosphorylation in liver. The Biochemical journal. 248 (3), 977-980 (1987).
- Stevenson-Paulik, J., Odom, A. R., York, J. D. Molecular and Biochemical Characterization of Two Plant Inositol Polyphosphate 6-/3-/5-Kinases. Journal of Biological Chemistry. 277 (45), 42711-42718 (2002).
- Stephens, L. R., Hawkins, P. T., Downes, C. P. An analysis of myo-[3H]inositol trisphosphates found in myo-[3H]inositol prelabelled avian erythrocytes. The Biochemical journal. 262 (3), 727-737 (1989).
- Saiardi, A., et al. Mammalian inositol polyphosphate multikinase synthesizes inositol 1,4,5-trisphosphate and an inositol pyrophosphate. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98 (5), 2306 (2001).
- Azevedo, C., Burton, A., Bennett, M., Onnebo, S. M. N., Saiardi, A. Inositol Phosphates and Lipids: Methods and Protocols. Barker, C. J. , Humana Press. 73-85 (2010).
- Saiardi, A., Caffrey, J. J., Snyder, S. H., Shears, S. B. The Inositol Hexakisphosphate Kinase Family: CATALYTIC FLEXIBILITY AND FUNCTION IN YEAST VACUOLE BIOGENESIS. Journal of Biological Chemistry. 275 (32), 24686-24692 (2000).
- Brearley, C. A., Hanke, D. E. Inositol phosphates in the duckweed Spirodela polyrhiza L. Biochemical Journal. 314, 215-225 (1996).
- Pollard, J. K., Steward, F. C., Shantz, E. M. Hexitols in Coconut Milk - Their Role in Nurture of Dividing Cells. Plant Physiology. 36 (4), 492 (1961).
- Donahue, J. L., et al. The Arabidopsis thaliana Myo-inositol 1-phosphate synthase1 gene is required for Myo-inositol synthesis and suppression of cell death. Plant Cell. 22 (3), 888-903 (2010).
- Desfougeres, Y., Wilson, M. S. C., Laha, D., Miller, G. J., Saiardi, A. ITPK1 mediates the lipid-independent synthesis of inositol phosphates controlled by metabolism. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (49), 24551-24561 (2019).
