Summary
在这里，我们描述了强抗离子交换高性能液相色谱的[3H]-肌醇标记幼苗，这是一种高度敏感的方法，用于检测和量化植物中的肌醇聚磷酸盐。
Abstract
肌醇的磷酸盐酯，也称为肌醇磷酸盐（InsPs），是细胞调节剂的一类，在植物生理学中起着重要的作用。由于其负电荷、低丰度和易感性水解活性，这些分子的检测和定量具有挑战性。对于含有"高能"二磷键的高磷酸酯，也被称为肌醇热磷酸盐（PP-InsPs），情况尤其如此。由于其高灵敏度，强性离子交换高性能液相色谱（SAX-HPLC）的植物标记为+3H+-肌醇目前是分析这些分子的首选方法。通过使用[3H]-肌醇到放射性标签植物幼苗，各种 InsP 物种，包括几个非抗质异构体可以检测和区分与高灵敏度。在这里，介绍了合适的 SAX-HPLC 系统的设置，以及从植物栽培、放射性标记和 InsP 提取到 SAX-HPLC 运行和后续数据分析的完整工作流程。此处提出的协议允许对各种 InsP 物种进行歧视和定量，包括几种非抗异构体和 PP-InsP、InsP7和 InsP8，并且可以很容易地适应其他植物物种。例如，对阿拉比多普西沙利亚Arabidopsis thaliana纳和莲花贾皮奥尼乌斯幼苗进行SAX-HPLC分析，并介绍和讨论了完整的因SP配置文件。此处描述的方法是更好地了解 InsP 在植物中生物作用的一个有希望的工具。
Introduction
大约四十年前，肌醇磷酸盐（InsPs）成为信号分子，在因斯（1，4，5）P3（InsP 3）被确定为第二个信使后，在动物细胞1，2中激活Ca2+的受体调节释放。迄今为止，在植物中尚未发现 InsP 3 受体（IP3-R），这质疑了 InsP 3 在植物细胞3中的直接信号作用。无论如何，InsP3是参与多个植物发育过程的其他 InsP 的前体，包括调节特定的信号通路 3、4、5、6、7、8。3,4,5,6,7,8例如，InsP3可以进一步磷酸化到 InsP6，也称为"植物酸"，它代表磷酸盐、肌醇和青酸的主要来源，并被证明在植物防御病原体、mRNA出口和磷酸盐平衡 5、9、10、11、125,9,10,11等方面起着关键作用。
肌醇热磷酸盐（PP-InsSp）是一类 InsSp，它至少含有一种高能二磷键，最初在动物细胞、阿米巴和酵母中鉴定，它们在各种细胞过程13、14、15,14,中发挥着至关重要的作用。,尽管在植物,,,,,,16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26的PP-InsP上进行了开创性的工作，但这些分子的生物功能和异构体特性仍然在很大程度上仍然神秘。16,1719,20182122232425在示范植物阿拉比多普斯塔利亚纳，细胞因SP8被提出，通过巧合检测因SP8和活性茉莉花酸盐的S ASK1-COI1-JAZ受体复合17，以调节对昆虫食草动物和坏死真菌的防御。此外，InsP8和其他PP-InsP在能量平衡和营养感，以及磷酸盐,平衡的作用被提出17，23，24，25，26。24,25,2617,23
无论采用哪种生物系统，研究 InsSp 时的主要方法挑战是这些分子的可靠检测和精确定量。基于质谱的方法已用于检测来自细胞提取物的 InsP，包括 PP-InsP。然而，这些研究未能区分不同的异构体26，27。,27另一种分析 InsP 的方法使用 TiO2珠子从细胞解质中下拉，然后是洗出的 InsP 的多丙烯酰胺凝胶电泳 （PAGE）。然后，InsP 可以通过托卢丁蓝色或 DAPI24、 28、29来染色。但是，到目前为止，使用此方法无法可靠地检测低于 InsP5的 InsP。最近，一种使用[13C]-肌醇对因斯普斯进行核磁共振（NMR）分析的方法被公布为强性离子交换高性能液相色谱（SAX-HPLC）30的替代品。据报道，这项技术与SAX-HPLC相比具有类似的灵敏度，并允许检测5-InsP7，以及从细胞提取物中区分不同的非抗性因斯P5异构体。然而，实施基于核磁共振的方法需要化学合成和商用上不可用的[13C]-肌醇。因此，在大多数情况下采用的方法是用+3H+-肌醇对样品进行放射性标记，其次是SAX-HPLC 31、32、33。31,32,33该技术基于放射性肌醇吸收到植物中，并通过专用细胞激酶和磷酸盐的结合活动将其转化为不同的 InsP。
然后，使用 SAX-HPLC 对 +3个 H+ 标记 InsP 进行酸提取和分馏。由于其负电荷，InsP 与 SAX-HPLC 柱的正电荷固定相强烈相互作用，并且可以使用含有不断增加的磷酸盐浓度的缓冲梯度进行洗涤，以超过柱中的 InsSp。因此，洗脱时间取决于要分离的 InsP 物种的电荷和几何形状。在没有奇性柱的情况下，只有非抗异构体才能通过本协议进行分离。但是，无线电标记标准可用于分配特定 InsP 峰值的异构性质。过去，各种实验室多次努力用（生物）化学方法生成有标签和未标记的标准，或从各种细胞和生物体中净化这些标准，这有助于为某些 InsP 物种分配峰值， 并缩小个别 InsP 物种的异构体特性55、7、21、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43。7,21,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43此外，最近解释的酶通路导致在植物中形成PP-InsSp，以及发现具有特定1-植物活性的细菌III型效应器，提供了如何为这些分析生成有用的标准的信息10，17，18，22，23。,17,18,22,23
由于钛（3H）的衰变，所得β在液体闪烁计数器中测量。随着贴标时间的增加，达到稳定状态同位素平衡，之后获得的 InsP 配置文件应表示工厂31的 InsP 状态。与其他现有技术相比，本议定书的主要优点是，使用 InsSp 的直接前体和测量放射性信号实现了高灵敏度。
SAX-HPLC 从[3H]-肌醇标记的植物或其他生物体中提取的样本通常用于检测和定量 InsP，范围从较低的 InsP 物种到 PP-InsP，是更好地了解 InsP 的代谢、功能和作用模式的宝贵工具。到目前为止，这种方法也是对低 InsP 物种特别感兴趣的研究人员最合适的选择。虽然本文所述协议所基于的这一程序的基础知识先前已描述7、21、31、34，,21,31但为分析植物源性 InsP，特别是 PP-InsP 而定制的详细协议仍然缺失。,34以前的出版物报告难以可靠地检测低丰量的PP-Insp， 特别是 InsP8，由于以下一种或多种因素： 相对较低的植物材料量， [3H]-肌醇与低特定活性 （> 20 Ci/mmol）， 使用不基于高氯酸或浓度小于 1 M 的萃取缓冲液， 不同的中和缓冲液， 以及低于最佳梯度或检测 [3H] 与在线探测器.与这些研究相比，此处提出的协议旨在可靠地检测PP-InsPs 7、21、34。7,21,34
在这里，我们提出了一个详细的工作流程，从设备的设置到植物的种植和标签，InsP提取和SAX-HPLC运行本身。虽然该方法已经优化的模型植物 A. thaliana，它可以很容易地修改， 以研究其他植物物种， 如这里显示的模型豆类莲花 japonicus的 InsP 配置文件.虽然使用不同的植物物种可能需要一些优化，我们设想这些将是次要的，使该协议成为进一步研究植物 InsPs 的好起点。为了便于进行可能的优化，我们指明了协议中可能修改的每个步骤，以及首次建立方法时可能具有挑战性的所有关键步骤。此外，我们报告如何使用此方法获得的数据进行特定 InsSp 的量化，以及如何分析和比较不同的样本。
Protocol
1. 设置 HPLC 系统
- 设置一个由两个独立的 HPLC 泵（二进制泵）组成的系统，每个缓冲器一个。两个泵都需要通过计算机与各自的软件或有一个主泵一起控制。通过重力或通过第三个低压泵为两个泵安装活塞密封清洗。为缓冲器 A（指定泵 A）指定一个泵，为缓冲器 B（指定泵 B）指定一个泵。
注：两者必须能够产生高达 60 bar （6 MPa） 的压力和至少 0.5 mL/min 的流速。 - 将两个泵连接到动态混合器。
- 将搅拌机连接到具有至少 1 mL 容量的样品回路的喷射阀。
- 通过相应的端部接头，用毛细管将喷射阀连接到柱上。
- 使用长度适当的毛细管将柱连接到分数收集器。
注：此描述基于我们的 HPLC 系统（参见 材料表），它比更新和更复杂的系统需要更多的手动步骤。我们的系统允许轻松访问和修改所有组件。第四纪泵（与此处描述的二进制梯度）也可以使用，并将导致洗脱配置文件和分析的整体质量类似于那些实现二进制泵。
2. 准备缓冲器、柱和 HPLC 系统
- 准备提取可溶性无溶性物质的缓冲液：萃取缓冲液（1 M HClO4）和中和缓冲液（1 M K2CO3）。使用超纯脱水准备两个缓冲液。它们在室温下稳定了几个月。在萃取之前，立即将 EDTA 添加到两种溶液中，最终浓度为 3 mM（例如，从过滤的 250 mM EDTA 库存溶液中）。
注意：HClO4（ 高氯酸）具有很强的腐蚀性。 - 为 SAX-HPLC 运行准备缓冲区：缓冲区 A （1 mM EDTA） 和缓冲区 B （1 mM EDTA， 1.3 M （NH4）2HPO4; pH 3.8 与 H3PO4.使用超纯脱压水，然后使用 0.2 μm 孔径的膜过滤器进行真空过滤。这些在室温下稳定了几个月。
注意：EDTA 应包含在所有缓冲区中，以防止与 InsP 的 ces 相互作用，这可能导致 InsP 电荷改变，甚至不溶性 InsP 盐复合物。 - 编程梯度如下：0\u20122分钟，0%缓冲区B;2\u20127分钟，高达10%的缓冲器B;7\u201268分钟，高达84%的缓冲B;68\u201282 分钟，高达 100% 缓冲器 B;82\u2012100 分钟，100% 缓冲区 B，100\u2012101 分钟，低至 0% 缓冲区 B;101\u2012125 分钟，0% 缓冲区 B。此梯度的最佳流速为 0.5 mL/min。
- 在运行过程中，每分钟收集分数，从第 1 分钟到第 96 分钟。其余 30 分钟的梯度用于清洗柱和系统，并且不必收集闪烁计数。
- 如果可能，在 HPLC 泵紧急停机之前，将最大可达到压力设置为 80 bar（8 MPa）。这样可防止 对柱 树脂造成严重损坏。
- 使用新的 SAX HPLC 柱时， 在第 一次使用 前用过滤 过的超纯脱水彻底清洗（>50 mL）。
注：这将确保去除含有的甲醇，从而防止盐沉淀在以后的步骤。如果可能，请使用单独的 HPLC 泵。如果不可用，请确保 HPLC 在清洗柱前已用水冲洗。流量不应超过 2 mL/min。洗涤后，列已准备好进行分析，如果处理得当，可用于 20\u201240 运行。之后，决议将陆续减少。使用缓冲液 A （>1 h） 和执行步骤 2.6 进行长时间清洗有助于延长列的生存期。如果分辨率的降低仍然存在，则需要交换列。梯度可以调整，以增加特定肌醇多磷酸盐物种之间的分离或减少整体运行时间。使用不同的 HPLC 系统（具有不同的空隙体积或毛细血管的体积不同）将严重影响保留时间。此外，列更改对保留时间的影响很小。 - 执行"模拟运行"。在 HPLC 系统中注入过滤过的超纯脱压水，而不是提取的样品，然后运行标准梯度。不必收集分数。
注：步骤 2.6 是可选的。但是，如果适用以下情况之一：安装新列，则应执行该操作：HPLC 系统已事先用于其他方法;HPLC 系统使用时间不超过 3 天;前一次运行有问题。
3. 植物栽培和标签与[3H]-肌醇 - 肌醇
注：以下步骤应用无菌 组件和无菌 条件下 执行，同时戴手套保护手免受放射性标签的污染。植物介质，尤其是含有蔗糖时，容易受到微生物污染。
- 用1 mL 1.2%次氯酸钠消毒 A. thaliana 种子 3 分钟，然后用 1 mL 70% 乙醇消毒 3 分钟。然后加入1 mL的100%乙醇，用乙醇将种子移液到圆形滤纸上，让种子在干净的长凳上用层流进行空气干燥。
- 使用 L.japonicus种子 时，将它们放在砂浆中，并在灭菌前用砂纸擦洗种子，以确保足够的发芽率。
- 在方 培养皿 上播种1~2排，里面装满了固体生长介质，包括半强度的Murashige和Skoog（MS）盐溶液、1%蔗糖、0.7%的凝胶胶在去维水中调整为pH 5.7与KOH，并允许它们在黑暗中4°C下至少分层1天。
- 对于 莲花 种子，在方培养皿上播种，用固体生长介质在去维化水中由0.8%的细菌性芳分剂组成，并允许它们在黑暗中4°C下分层至少3天。
- 将板垂直放在生长培养箱或气候室中，并允许它们在短日条件下生长10-12天（22°C下为8小时光，在20°C下为16小时暗）。
- 将 10~20 株幼苗转移到 12 井清澈平底细胞培养板的一个井中，该培养板中填充了 2 mL 的半强度 MS 盐溶液，并辅以 1% 蔗糖，并调整为 pH 5.7。
- 加入45μCi的+ 3H+-肌醇（30×80 Ci/mmol，溶解在90%乙醇中），通过温和的涡旋混合。用相应的盖子盖住盘子，用微孔手术胶带（如微孔或利孔胶带）密封，将其放回生长培养箱中。
注意：[3H] 是一种低能β发射器，在通过裸露的皮肤吸入、摄入或吸收时，可能会造成有害的辐射危害。 处理 与放射性物质有直接或间接接触的放射性物质或设备时，请戴上手套。还要遵守当地关于安全处理放射化学品的规则（例如，穿着额外的防护服、使用剂量计和定期对表面进行污染调查）。 - 贴标签5天后，从介质上取出幼苗，用去维水短暂清洗。用纸巾擦干，然后转移到1.5 mL微离心管中。 不要过度填充管子 ，放置不超过100毫克FW/管，这相当于大约10\u20120 17天大的幼苗。
注：过量的植物材料在萃取过程中会稀释酸，并显著降低萃取效率。- 将管子在液氮中捕捉冻结，并将其储存在-80°C，直到提取。
注：样品可保持在-80°C，不影响样品质量。生长条件（介质、光、温度、时间）可根据特定实验或植物物种的需要进行修改。但是，在稀释{3H}-肌醇时应小心，以确保可量化的 SAX-HPLC 运行质量良好。因此，建议从此处所述的 +3H+-肌醇浓度开始，如果需要，可逐步减少。在贴标期间，工厂可以接受不同的处理（例如，环境应力或化学剂），以评估这些条件对全球 InsP 的影响。为了达到稳定状态标签，我们建议给植物贴上至少5天的标签。
- 将管子在液氮中捕捉冻结，并将其储存在-80°C，直到提取。
4. 可溶性不溶性不法药物的萃取
注：整个提取过程中，将样品和试剂放在冰上。 由于与放射性物质接触的风险 很高，尤其是在磨削过程中，请始终戴上手套和防护眼镜。与样品接触的所有东西都被视为 放射性废物 ，应根据当地安全处置放射性材料的规则进行处置。
- 准备提取和中和缓冲器的工作解决方案，如步骤 2.1 中。每个样品都需要 600 μL 的萃取缓冲液和 400 μL 的中和缓冲液。将缓冲液存放在冰上。
- 从-80°C冷冻室采集样品，并放在液氮中，直到进一步处理。用微离心管对样品进行研磨，直到它们开始解冻，并加入500μL的冰冷萃取缓冲液。继续研磨，直到样品完全均匀且溶液具有深绿色（如果样品中存在叶子）。
- 在 18000 x g的温度下，在 4 °C 下≥ 10 分钟。将上一液转移到新鲜的 1.5 mL 管中。请记住，用于萃取的管子被视为固体放射性废物，需要相应地处理。
-
小心 地向萃取器中加入 300 μL 的中和缓冲液。蛋白质的沉淀和冒泡将立即开始。一分钟后，通过旋涡与移液器尖端混合，等待几秒钟，然后移液在 pH 纸上（理想范围内为 pH 6+9）。最终 pH 应在 pH 7 和 8 之间。
- 如有必要，添加少量（通常为 10~20 μL）的中和缓冲液或萃取缓冲液，直到达到所需的 pH 值。让样品在冰上休息至少1小时，盖开盖子。
- 在 18，000 x g的温度下，在 4 °C 下≥ 10 分钟。将上一液转移到新鲜的 1.5 mL 管中。
注：样品可以直接在SAX-HPLC运行中使用，也可以保存在冰上（如果在同一天晚些时候使用），也可以冷冻在液氮中，在-80°C中储存2\u20124周。为确保高可重复性和可比性，建议始终将样品冷冻在液氮中 5 分钟，即使随后直接使用。只要样品仅解冻一次，就有可能在-80°C下长期储存提取样品。如果冻结样品用于分析，请确保解冻 后 没有颗粒可见。否则，在 4 °C 下再次离心 10 ≥ 18，000 x g， 然后将上最后一代转移到新鲜的 1.5 mL 管中。
5. 执行 HPLC 运行
- 为小瓶收集器配备 96 个小闪烁小瓶（容量为 +6 mL），并为每个小瓶填充 2 mL 的合适闪烁鸡尾酒（例如，Ultima-Flo AP 液体闪烁鸡尾酒），与低 pH 值和高磷酸铵浓度的缓冲液兼容（参见材料 表）。
注：小瓶的数量和小瓶的大小取决于使用的分数收集器和闪烁计数器。重要的是至少收集前 90个分数，如果使用此处描述的梯度，以获得一个完整的肌醇多磷酸盐配置文件。还要确保正确 标记 每个小瓶及其各自的盖子，以防止混淆分数或样品。 - 启动 HPLC 系统/泵，并准备好运行。激活活塞密封清洗，并保持其激活，整个运行。使用合适的注射器从步骤 4.5（约 750 μL）手动注射完整的上上液（参见 材料表）来加载样品。如果可以自动注射，将样品转移到相应的样品瓶中。将阀从"负载"转向"注入"位置，然后启动梯度和分数收集器。
注：根据使用的 HPLC 系统，启动过程可能会有所不同，尤其是在将较旧的系统（如此处所述）与完全由软件控制的较新的型号进行比较时。确保梯度、样本注入和分数收集同时启动非常重要。 - 当 HPLC 运行正在进行时，请定期检查压力。起始压力应在 18~24 bar （1.8–2.4 MPa） 左右，一旦达到 100% 缓冲 B，起始压力应缓慢上升到 50~60 bar （5~6 MPa）。
注意：压力降低可能表示系统泄漏，而压力增加则表示堵塞。压力波动（≥秒内 3 bar）可以指示系统中存在空气。请记住，离开柱的所有，以及在喷油器或之后发生的每一个泄漏都是 放射性的。
注：压力还取决于 HPLC 系统，并且可能低于此处所述或更高。在大约 15~20 次运行后，它会慢慢增加。但是，这并不一定影响获取的运行的质量。 - 跑步后，紧密地合上小瓶，通过剧烈的摇晃将小瓶与闪烁的鸡尾酒混合。直接进行测量或保持小瓶直立位置，最好是在黑暗中。
注：与闪烁鸡尾酒混合的分数稳定数周，可稍后测量。由于钛的半寿命为12.32年，信号损耗可以忽略不计。 - 一旦当天最后一个样本的运行完成，停止两个 HPLC 泵。
- （可选）为了延长系统的使用寿命，尤其是在不经常使用时，请将缓冲器 B 中的毛细管放入带缓冲器 A 的瓶子中，让泵运行 10-15 分钟，以清洗泵 B 和毛细管。在下次使用之前， 请记住 将毛细管更换到缓冲器 B 中，并取消将泵 B 与混合器耦合，以将其与缓冲器 B 齐平。泵和毛细管再次充满缓冲器 B 后，请重新与混合器连接，系统即可使用。
6. 测量分数
- 将小瓶插入闪烁计数器机架，并在液体闪烁计数器中测量每个小瓶 5 分钟。
- 理想情况下，使用直接适合小小瓶的机架，避免挂在大瓶（例如 20 mL）小瓶中，以减少计数误差。此协议中使用的软件设置显示在补充 图 1 中。
注：使用未挤压的 +3H + 标准定期执行 SNC（自规范化和校准）协议。可缩短计数时间（1~5 分钟），以减少等待时间。但是，为了确保高计数的可重复性和准确性，建议使用 5 分钟。
7. 数据分析
- 将闪烁计数器中的测量值导出为电子表格文件或兼容/可转换文件格式。使用配备 Excel 或类似软件的计算机以及合适的分析软件（如 Origin）评估数据。
- 准备一个二元线图，其中根据保留时间绘制每分钟（cpm）的测量计数（参见图 1，图2）。
- 要相互比较样本，请 通过汇总 每个样本从 25 分钟到 96 的分条的 cpm 来规范化数据。
注：第25分钟用作截止值，从分析中排除未合并的 [3H+- myo-inositol， InsP1和 InsP2），因为这些倾向于剧烈波动， 不能很好地分离 （至少与本协议中建议的梯度）， 因此由于其高活性而强烈改变规范化因子。myo - 通过将总 cpm（分数 25+96）与最低 cpm 的样本（分数 25+96）除以其他样本的总 cpm（分数 25–96）将总 cpm 与样本中的总 cpm（以分数 25+96）将所有数据规范化。然后，通过将每个分数的 cpm 与因子相乘，可以使用结果因子来使每个分数的 cpm 规范化。
注：最后，所有样本的 cpm 值从分钟 25 到结束的总和应相等。只有规范化的运行应在同一图形/图形中显示（当作为实际配置文件显示时）。补充图 2显示了如何执行这些计算步骤的示例（仅使用两个样本中的 25-35 分数进行简化）。但是，在某些情况下，没有必要对数据进行规范化。例如，如果峰值根据步骤 7.4 进行量化，并且显示为 InsP 总数的百分比（如图3D 所示）。如前所述，当将多个分析并排呈现为配置文件时，或当实际测量的活动用于结论时（例如，治疗 a） 与控制相比，InsP7增加 x%，因此需要参考两个样本中的 InsP7的 cpm 值，而不是其占总 InsP 的百分比）规范化。要分析基因型或治疗差异对标签效率的影响，重要的是不要正常化，因为这将使这些差异无效。然而，使用这种方法的绝对定量是具有挑战性的，因为由于各种原因，使用这种协议的提取效率可能是可变的，有时甚至在分析同一基因型和治疗的复制品时被观察到。请记住，根据用于分析的 HPLC 系统、列和梯度，可能需要更改截止时间。 - 要对某些肌醇多磷酸盐峰执行相对定量，并随后创建包含复制数据的条形bar graphs图进行统计分析，请使用可计算色谱峰区（例如原点）的专用软件继续分析。参见补充图 3。
注：大多数受软件控制的 HPLC 系统都随附一个能够完成此任务的软件。峰值确定为背景以上 cpm 值的分数（在运行之间会因一定程度而变化）和保留时间，与以前发布的数据类似。特定峰值的保留时间在电子表格软件（例如 Excel）中确定，并用于分配峰值以计算确定积分（例如，在原点中）。 补充图 3 说明了峰值确定、背景减法和峰值集成的过程。
Representative Results
此处显示的结果旨在说明根据技术和生物学水平的变化获得的可能的结果。第一个示例是使用新列与老化列（图 1）和新鲜与存储样本（图 3）进行分析，第二个示例是评估来自两种不同植物系统的提取物，A. thaliana（图1，图3）和L. japonicus（图 2）。
图 1A+u2012C中描述了最佳的 SAX-HPLC 运行，该图显示了在闪烁计数后从 A. thaliana 提取物获得的完整肌醇多磷酸盐光谱。请注意，峰值是很好的分离，并可以分配给不同的异构体（或异构体对）基于上文所述的色谱动能5，7。
图 2显示了 SAX-HPLC 对L. japonicus幼苗的分析的代表性结果，这些幼苗是在与阿拉伯幼苗相同的条件下生长和标记的。虽然从阿拉伯植物中可以看见所有InsP物种和峰值，但比较两种物种的轮廓时，在特定 InsP 异构体的相对（例如，异构体之间的比率）数量方面存在显著差异。例如，莲花提取物显示增加 InsP3c，InsP4b，InsP5b 和减少 InsP3a，InsP4a，InsP5a和 Insp5c相比， 留给进一步调查的空间.图2D说明了 InsP 异构体之间阿拉比多普西斯和莲花之间的不同比率。
图 3 显示了提取后拆分的样本的两个 InsP 配置文件。前半部分立即分析，后半后，储存在-80°C。 请注意，不同样本之间只观察到细微的差异（即图 3A+u2012C上的黑线和红线和图 3D）。这说明一个冻结-解冻周期不会损害样品，并且该方法本身会产生可重现的结果。
图 1：使用该协议成功和未成功的 SAX-HPLC 分析的典型 InsP 配置文件。（A+u2012C）SAX-HPLC 17 天大野生类型 （Col -0）阿拉伯幼苗的配置文件用 +3H+ - myo -inositol无线电标记。在同一天执行了全局 InsP 提取和 SAX-HPLC 运行。（A） 全光谱;（B， C）放大 A 中显示的配置文件。所有可见峰都高亮显示并分配给相应的 InsP 物种。根据已公布的色谱移动5、7、InsP4a可能表示 Ins （1，4，5，6）P4或 Ins（3，4，5，6）P4，InsP5a表示 InsP5 [2-OH]， InsP5b表示 InsP5 [4-OH] 或其异构形式 InsP5 [6-OH]， InsP5c 表示InsP5 [1-OH] 或其异构形式 InsP5 [3-OH]。InsP3a-c、InsP4b、InsP7 和 InsP8的异构性质仍然未知。面板 （D） 显示相同生长的植物的 SAX-HPLC 配置文件，但使用老化列（>40 运行）。与其他 InsP 物种相比， Insp6明显减少， 并且没有 PP - Insp 是可见的。请单击此处查看此图的较大版本。
图2：L.japonicus工厂的代表性 InsP配置文件。SAX-HPLC 配置文件 （A[u2012C）17 天大野生类型 （Gifu） L. japonicus幼苗用+3H+-myo-inositol 无线电标记。myo（A） 全光谱;（B， C）放大 A 中显示的配置文件。所有可见峰都高亮显示并分配给相应的 InsP 物种。根据已发表的色谱运动5，7， InsP4a可能代表 Ins （1， 4， 5， 6） P4或 Ins （3， 4， 5， 6） P4， InsP5b 可能表示 InsP5 [4-OH] 或其异构形式 InsP5 [6-OH]， 和 Insp5c可能表示 Insp5 [1 - OH] 或其异构形式 Insp5 [3 - oh] 。InsP3a-c、InsP4b、InsP7和 InsP8的异构性质是未知的。（D） A. thaliana 的个别 InsP 物种（占 25+u201296 总活动的百分比）（图 1A+u2012C的数据）和L. japonicus（图2 Figure 2A+C 的数据） 之间的比较。请单击此处查看此图的较大版本。
图 3：拆分样本的 InsP 配置文件，说明 SAX-HPLC 分析的可重复性。（A+u2012C）SAX-HPLC 17 天大野生类型 （Col -0）阿拉伯幼苗的配置文件用 +3H+- myo -inositol无线电标记。运行前，样品被分割，一半立即运行，另一半在-80°C储存后一天后储存在-80°C. （A） 全光谱;（B， C）放大 A 中显示的配置文件。所有可见峰都高亮显示并分配给相应的 InsP 物种。根据已公布的色谱移动5、7、InsP4a可能表示 Ins （1，4，5，6）P4或 Ins（3，4，5，6）P4，InsP5a表示 InsP5 [2-OH]， InsP5a表示 InsP5 [2-OH]， InsP5b 表示InsP5 [4-OH] 或其异构形式 Insp5 [6-OH]， InsP5c 表示InsP5 [1-OH] 或其异构形式 InsP5 [3-OH]。InsP3a-c、InsP4b、InsP7 和 InsP8的异构性质仍然未知。面板D显示两个运行中的 InsP6和 PP-InsP InsPInsP 7和 InsP8的量化。值表示金额（以百分比为单位）相对于所有 InsP 的各 InsP 物种（从洗脱 25–96 起的总活动）。请单击此处查看此图的较大版本。
补充图1：使用光闪烁计数器进行液体闪烁计数的软件设置。 描述了显示软件版本的屏幕截图，以及用于使用该协议执行的{3H} 样本的闪烁计数设置。 请点击这里下载此图。
补充图 2：数据规范化的代表性示例。 工作表的屏幕截图显示用于使 SAX-HPLC 相互运行规范化的所有步骤和公式。对于简化，仅显示 25~35 个样本的分数。 请点击这里下载此图。
补充图3：使用分析软件确定峰值、背景减法和集成。 （A） SAX-HPLC 分析的数据加载到软件中（第 28-96 分钟），并选择了峰值分析器工具。（B\u2012E）通过设置单个峰值之间的点来手动定义基线，并减去背景。（F） 峰值根据外观和公布的色谱动数5、7手动确定。（G） 峰值范围由 cpm 值手动定义。（H） 峰值被整合并计算为所有峰值的百分比。 请点击这里下载此图。
Discussion
在这里，我们提出了一个通用和敏感的方法，以量化 InsP，包括植物提取物中的PP-InsP，并提供了有关如何建立这种方法的实用提示。即使协议通常是健壮的，但可能会进行次优的运行和分析。在大多数情况下，这些运行可以通过强烈减少甚至完全损失高磷酸化 InsP 来识别，特别是 PP-InsP 物种 InsP7 和 InsP8。可能的原因是植物材料的微生物污染和内源性植物PP-InsP水解质在萃取过程中未充分停用，原因是植物材料的研磨和解冻不足，不会立即与萃取缓冲液接触。进一步的原因包括由于中和缓冲液的不足或过量添加而不准确的pH调整，或者样品材料仅仅不足。后者可能使其难以检测PP-InsP，因为这些通常存在于细胞中的非常低的量。在步骤 3.5 期间，样品材料过多或干燥效率低下可能导致高氯酸稀释，因此也会导致酶失活不足和 InsP6 和 PP-InsP 的特定损失。本协议中使用的植物材料量以及放射性标签量根据成本和性能进行了优化，因此接近了仍然足以提供最佳结果的最低量。此外，柱树脂将逐渐失去其分辨率。这个过程的第一个迹象是（原因不完全清楚的作者）一个特定的损失高磷酸化的 InsP 物种，如PP-InsP在HPLC频谱。随着进一步老化，即使 InsP6 也无法由列正确解析（图 1D）。因此，使用适当的列，以及对样品的精心处理和正确维护 HPLC 组件对于确保准确结果至关重要。
在比较样品和运行时，尤其是在使用不同设备（例如 HPLC 系统和列）或不同天生成时，必须将样本彼此标准化（如步骤 7.3 中所述）并使用相同的方法对其进行分析。只有通过规范化，才能在同一图形中显示多个样本（图3）。对于相对于总 InsP 或其他特定 InsP 物种的单个 InsP 的量化，只要只显示相对值而不是绝对值，就没有必要进行规范化。理想情况下，同时显示 InsP 配置文件和定量。但是，在某些情况下，无法在同一图形中充分显示两个或多个运行。不同的保留时间或不同级别的后台活动可能使得单独比较未量化的 SAX-HPLC 配置文件变得困难。当需要比较许多样本时，情况也是如此。在这种情况下，有必要使用附加软件（例如，原产地）进行进一步评估，以进行单个峰值定量。
作者知道，这里描述的协议可以进行优化，需要适应每个单独的研究问题。虽然在此协议中针对 Arabidopsis 提取物 7，,17进行了优化， 但此方法是通用的， 可以帮助确定其他植物物种的 InsP 配置文件。在这里，我们举例说明了这种可能性，首次为L.japonicus提供了一个 InsP 配置文件，无需修改标签条件、InsP 提取或 SAX-HPLC 运行（图2）。值得注意的是，虽然总体情况相似，但L.japonicus和阿拉伯因SP配置文件之间存在差异。例如，在L 中。 japonicus Insp5 [4 - oh] 或其异构形式 Insp5 [6 - oh] 比 Insp5 [1 - oh] 或其异构形式 Insp 更丰富5 [3-OH]相比，阿拉伯，其中因SP5 [1-OH] 或其异构形式 InsP5 [3-OH] 是占主导地位的 InsP5物种。同样，我们预计，介质成分的改变，[3H]-肌醇浓度，植物年龄，环境条件（如光和温度），添加化合物或分析植物-微生物相互作用等因素，可能需要测试和调整。
这种方法的一个重要缺点是，标签是用（无菌的）液体培养，这不代表大多数陆地植物的生理环境。此外，由于 [3H]-肌醇成本高，标签溶液的体积和培养容器的大小通常有限，这也限制了可使用的植物的大小。液体培养的栽培可以通过直接渗透，例如土壤生长的植物的叶子与[3H]-肌醇，随后遵循这里描述的协议，如前面报道的10。
与替代方法（如 TiO2下拉后，PAGE 或基于质谱法的技术）相比，此协议有几个缺点。由于[3H]-肌醇标签，最终只能检测到直接来自放射性标记肌醇的InsP 物种。这里描述的方法是盲目的其他因异构体，如西洛-肌醇和其他异构体，其中一些已经在某些植物44。此外，从其他途径衍生的肌-InsSp将被排除在外，包括那些通过葡萄糖-6-磷de novo酸盐异构化合成的肌醇-肌醇myo-肌醇和肌醇-3-磷酸盐的再合成，由肌-肌醇-3-磷酸盐合成酶（MIPS）蛋白45催化。 myo虽然[32P] 或[33P]-正交磷酸盐可以用作替代标签，但其使用构成重大劣势，因为每个含磷酸盐的分子，包括丰富的核苷酸及其衍生物，都会被贴上标签。这些分子也可以提取与该协议，并绑定到SAX列，这将导致高水平的背景活动，这将干扰识别个别的因SP峰5。此外，[32P]-或[33P] 标记的 InsP 和 PP-InsP 的定量可能受到磷酸盐和磷酸莫伊蒂周转率的严重影响，并且可能不会报告肌醇物种的质量读出。
另一方面， [3H]-肌醇特别标记 肌醇 - 含肌醇分子。在这种情况下，InsP、含肌醇脂质（如磷脂）和甘油醇都标有。但是，只有 InsPs 将分析此协议，因为脂质不溶于提取缓冲液，且加拉奇诺不绑定到 SAX 列。
到目前为止，与由 +3H+-肌醇标签生成的植物 InsP 配置文件与 TiO2下拉/PAGE 确定的植物 InsP 配置文件之间的差异仍然未知，因为此类比较尚未在工厂中进行。最近一项有关动物细胞的研究解决了这个问题46。在这项工作中，通过将SAX-HPLC型材与哺乳动物细胞系的PAP凝胶进行比较，识别出由[3H]-肌醇-肌醇标签不可见的因SSP6池，因此应直接从葡萄糖-6-磷酸盐中提取。24 h 磷酸盐饥饿导致 InsP6增加 150% 时， 量化 PAGE 凝胶的 Insp 纯化使用 TiO2下拉。SAX-HPLC对3H+-肌醇标记myo细胞的分析只显示3H+-InsP6的15%增加。3如前所述，在大多数情况下，在 PAGE 分析中，低于 InsP5的 InsP 是检测不到的。只要质量光谱协议没有经过优化，以检测这组高负电的分子，SAX-HPLC 的辐射标记似乎是首选的方法。
另一个仍然存在的挑战是区分SAX-HPLC分析（或任何其他方法的因SP分析）10，17,中的抗性体。这一挑战可以通过添加奇性选择器来解决，即，包括L-精氨酸阿米德等与各自的抗性分子相互作用的表层化合物，形成可分离的二维聚复合物。据我们所知，这种方法只是通过 NMR 分析10来区分异构体 InsP5 [1-OH]和 InsP5 [3-OH] 。尚未报告其他抗原对的歧视或通过手性SAX-HPLC分析或基于手性 PAGE的方法成功歧视异体或成功歧视异体。考虑到PPP-InsP的保存合成和通过磷的可得性进行保存，我们设想，特别是非放射性方法，如PED或MS为基础的方法，加上营养分析，将有助于地面努力校准遥感数据，旨在诊断作物的营养缺乏症17，18，24，25。,18,24,25然而，这里介绍的方法目前仍然可以被认为是 InsP 分析的黄金标准，并且将有助于发现这些有趣的信使在植物中的新功能。
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作由德国德国基金会（DFG，德国研究基金会）在德国卓越战略- EXC-2070 – 390732324 （PhenoRob），研究培训组GK2064和个人研究赠款SCHA1274/4-1和SCHA1274/5-1到G.S..我们还感谢李·施勒特和布里吉特·乌伯巴赫的技术援助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Centrifuge | Eppendorf AG | model: 5430 R | |
| Diammonium hydrogen phosphate, ≥97 % | Carl Roth GmbH + Co. KG | 0268.1 | |
| Ethylenediamine tetraacetic acid disodium salt dihydrate, ≥99 %, p.a., ACS | Carl Roth GmbH + Co. KG | 8043.2 | |
| Falcon 12-well clear flat bottom TC-treated multiwell cell culture plate, with lid, individually wrapped, sterile | Corning Inc. | 353043 | |
| Fraction collector | LAMBDA Instruments GmbH | model: OMNICOLL single channel collector | |
| Growth incubator | poly klima GmbH | model: PK 520-LED | |
| HPLC pumps | Kontron Instruments | model: 420 | |
| HPLC syringe for Rheodyne valves, 1 mL | Hamilton Company | 81365 | |
| Injector for HPLC | Supelco | model: Rheodyne 9725 | |
| Inositol, myo-[1,2-3H(N)] | American Radiolabeled Chemicals Inc. | ART 0261 | |
| Liquid nitrogen | University, Chemistry Department | ||
| Liquid scintillation counter | PerkinElmer Inc | model: TRI-CARB 2900TR | |
| Micro pestle | Carl Roth GmbH + Co. KG | CXH7.1 | |
| Mixed cellulose Eester filter, ME range (ME 24), plain, 0.2 µm pore size, 47 mm circle | GE Healthcare Life Sciences | 10401770 | |
| Mixer for HPLC | Kontron Instruments | model: M 800 | |
| Murashige & Skoog medium, salt mixture | Duchefa Biochemie | M0221 | |
| OriginPro software | OriginLab Corp. | ||
| Orthophosphoric acid, ≥85 %, p.a., ISO | Carl Roth GmbH + Co. KG | 6366.1 | |
| Partisphere 5 µm SAX cartridge column, 125 x 4.6 mm | Hichrom Limited | 4621-0505 | |
| Perchloric acid, 70 %, 99.999 % trace metals basis | Sigma-Aldrich | 311421 | |
| Petri dish, square, PS, clear, 120/120/17 mm, sterile | Greiner Bio One International GmbH | 688161 | |
| pH-indicator paper pH 5.5 - 9.0, Neutralit | Merck KGaA | 109564 | |
| Phytagel | Sigma-Aldrich | P8169 | |
| Potassium carbonate | Carl Roth GmbH + Co. KG | P743.2 | |
| Safe-Lock tubes, 1.5 mL | Eppendorf AG | 30120086 | |
| Sample loop for 9725 injectors, volume 2 mL, PEEK | Supelco | 57648 | |
| SNAPTWIST scintillation vial, 6.5 mL | Simport Scientific Inc. | S207-5 | |
| Sterile bench | LaboGene | model: ScanLaf MARS 900 | |
| Sucrose, ≥99,5 %, p.a. | Carl Roth GmbH + Co. KG | 4621.1 | |
| Ultima-Flo AP liquid scintillation cocktail | PerkinElmer Inc | 6013599 | |
| Ultra-pure deionized water | Milli-Q | ||
| Wrenchless WVS End Fitting Kit | Hichrom Limited | 4631-1001 |
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