Summary
Her beskriver vi stærk anionudveksling højtydende væskekromatografi af [3H]- myo-inositol-mærkede planter, som er en meget følsom metode til at detektere og kvantificere inositolpolyphosphater i planter.myo
Abstract
Fosfat estere af myo-inositol, også kaldet inositol fosfater (InsPs), er en klasse af cellulære regulatorer spiller vigtige roller i plantefysiologi. myo På grund af deres negative ladning, lav forekomst og modtagelighed for hydrolytiske aktiviteter er detektion og kvantificering af disse molekyler udfordrende. Dette er især tilfældet for stærkt fosforholdige former, der indeholder diphospho-bindinger med "høj energi", også kaldet inositolpyophosphater (PP-Insp'er). På grund af sin høje følsomhed, stærk anion udveksling højtydende flydende kromatografi (SAX-HPLC) af planter mærket med [3H]- myo-inositol er i øjeblikket den foretrukne metode til at analysere disse molekyler.myo Ved at bruge [3H]- myo-inositol til radiolabel plante planter, forskellige InsP arter, herunder flere ikke-enantiomeriske isomerer kan påvises og diskrimineres med høj følsomhed.myo Her beskrives opsætningen af et egnet SAX-HPLC-system samt hele arbejdsgangen fra plantedyrkning, radiomærkning og InsP-udvinding til SAX-HPLC-kørslen og efterfølgende dataanalyse. Den protokol, der præsenteres her, gør det muligt at diskriminere og kvantificere forskellige InsP-arter, herunder flere ikke-enantiomeriske isomerer og af PP-InsPs, InsP7 og InsP8, og kan let tilpasses andre plantearter. Som eksempler, SAX-HPLC analyser af Arabidopsis thaliana og Lotus japonicus planter udføres og komplet InsP profiler præsenteres og diskuteres. Den metode, der er beskrevet her, repræsenterer et lovende redskab til bedre at forstå insps' biologiske roller i planter.
Introduction
Næsten fire årtier siden, inositol fosfater (InsPs) frem som signalering molekyler, efter Ins (1,4,5)P3 (InsP3)blev identificeret som en anden budbringer, der aktiverer receptor-medieret frigivelse af Ca2 + i dyreceller1,2. Til dato er der ikke identificeret nogen InsP3-receptor (IP3-R) i planter, hvilket sætter spørgsmålstegn ved en direkte signalrolle for InsP3 i planteceller3. Uanset hvad, InsP3 fungerer som en forløber for andre InsP involveret i flere anlæg udviklingsprocesser, herunder regulering af specifikke signalering veje3,4,5, 6,6,7,8. For eksempel kan InsP3 yderligere fosforyleret til InsP6, også kendt som "fytinsyre", som repræsenterer en vigtig kilde til fosfat, myo-inositol og kationer, og viste sig at spille centrale roller i planteforsvar mod patogener, mRNA eksport og fosfat homøostase5,9,10,11,12. myo
Inositol pyrophosphater (PP-InsPs) er en klasse af InsP'er, der indeholder mindst én højenergi di-fosforbinding, der oprindeligt blev identificeret i dyreceller, amøbe og gær, hvor de spiller en afgørende rolle i forskellige cellulæreprocesser 13,14,15. Trods skelsættende arbejde med PP-InsP'er iplanterne 16,17,18,19,20,21,22,23,2424,25,26, er disse molekylers biologiske funktioner og isomeridentitet stadig stadig stort set gådefulde. I modellen plante Arabidopsis thaliana, cellulære InsP8 blev foreslået at regulere forsvar mod insekt planteædere og nekrotrofiske svampe via tilfældighed-påvisning af InsP8 og aktiv jasmonat af ASK1-COI1-JAZ receptor kompleks17. Desuden er der foreslået roller for InsP8 og andre PP-InsPs inden for homøostase og næringsstoffølning samt fosfathomostase17,23,24,25,26.
Uanset det anvendte biologiske system har en stor metodologisk udfordring ved studier af InsPs været den pålidelige detektion og præcise kvantificering af disse molekyler. Massespektrometri-baserede metoder er blevet brugt til at opdage InsPs, herunder PP-InsPs, fra celleekstrakter. Men disse undersøgelser har undladt at skelne særskilte isomerer26,27. En anden tilgang til at analysere InsPs beskæftiger pull-down af InsPs fra celle lysater ved hjælp af TiO2 perler, efterfulgt af polyarylamid gel elektroforese (PAGE) af eluterede InsPs. InsP'erne kan derefter farves af enten toluidinblå eller DAPI24,28,29. Det er dog indtil videre ikke muligt at påvise InsPs, der er lavere end InsP5, fra planteekstrakter ved hjælp af denne metode. For nylig, en metode ved hjælp af [13C]- myo-inositol for nuklear magnetisk resonans (NMR) analyse af InsPs blev offentliggjort som et alternativ til stærk anion udveksling højtydende flydende kromatografi (SAX-HPLC)myo30. Denne teknik er blevet rapporteret for at opnå en lignende følsomhed i forhold til SAX-HPLC og for at gøre det muligt at detektere 5-InsP7samt forskelsbehandling af forskellige ikke-enantiomeriske InsP5 isomerer fra celleekstrakter. Gennemførelsen af NMR-baserede metode kræver imidlertid kemisk syntetiseret og kommercielt ikke tilgængelig [13C]- myo-inositol.myo Derfor er den metode, der anvendes i de fleste tilfælde radiomærkning prøver med [3H]- myo-inositol, efterfulgt af SAX-HPLC31,32,33.myo Denne teknik er baseret på optagelsen af radioaktive myo-inositol i anlægget og dens omdannelse til forskellige InsPs ved den kombinerede aktivitet af dedikerede cellulære kinaser og fosfataser. myo
De [3H]-mærkede InsP'er ekstraheres derefter og fraktioneres ved hjælp af SAX-HPLC. På grund af deres negative ladning interagerer InsP'erne stærkt med den positivt ladede stationære fase af SAX-HPLC-kolonnen og kan elueres med en buffergradient, der indeholder stigende fosfatkoncentrationer for at udkonkurrere InsP'er fra kolonnen. Elution gange afhænger således af ladning og geometri af InsP arter, der skal adskilles. I mangel af chiral kolonner, kun ikke-enantiomeric isomerer kan ved adskilt af denne protokol. Men, radioaktivt mærkede standarder kan bruges til at tildele den isomeric karakter af en bestemt InsP peak. Forskellige laboratorier har tidligere gjort en større indsats for at generere mærkede og ikke-mærkede standarder med (bio)kemiske metoder eller rense dem fra forskellige celler og organismer, har bidraget til at tildele toppe til visse InsP-arter og også at indsnævre den isomeric identitet af de enkelte InsP-arter5,7,21,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43. Den nylige belysning af enzymatiske veje, der fører til dannelsen af PP-InsP'er i planter, samt opdagelsen af en bakteriel type III-effektor med en specifik 1-fytaseaktivitet, giver også oplysninger om, hvordan der kan genereres nyttige standarder for disseanalyser 10,17,18,22,23.
De resulterende fraktioner kan måles i en flydende scintillation tæller på grund β af tritium (3H). Med stigende mærkningstid opnås en stabil isotoplige ligevægt, hvorefter de opnåede InsP-profiler skal repræsentere anlæggets InsP-status31. Den største fordel ved denne protokol i forhold til andre tilgængelige teknikker er den høje følsomhed, der opnås ved at anvende den direkte forløber for InsP'er og målingen af et radioaktivt signal.
SAX-HPLC af prøver udvundet af [3H]- myo-inositol-mærkede planter eller andre organismer er almindeligt anvendt til påvisning og kvantificering af InsP-arter lige fra lavere InsP-arter til PP'er, hvilket udgør et værdifuldt redskab til bedre at forstå insp'ernes stofskifte, funktion og virkningsmåder.myo Hidtil, denne metode er også den mest hensigtsmæssige valg for forskere med særlig interesse i lavere InsP arter. Mens det grundlæggende i denne procedure, som den protokol, der er beskrevet her bygger på, tidligere er blevetbeskrevet 7,21,31,34, mangler der stadig en detaljeret protokol, der er skræddersyet til analysen af plantebaserede insp'er og især af OPP-insP'er. Tidligere publikationer rapporterede om vanskeligheder med pålideligt at opdage de lavt rigelige OPP-insP'er, især InsP8, på grund af en eller flere af følgende faktorer: relativt små mængder plantemateriale, [3H]-myo-inositol med lav specifik aktivitet (> 20 Ci/mmol), brug af ekstraktionsbuffere, der enten ikke er baseret på perchlorsyre eller er mindre koncentreret end 1 M, forskellige neutraliserende buffere samt suboptimale gradienter eller påvisning af [3H] med en onlinedetektor. I forhold til disse undersøgelser er den protokol , der præsenteres her , beregnet til pålidelig påvisning af PP-InsP7,21,34.
Her præsenterer vi en detaljeret arbejdsgang, der starter fra opsætningen af udstyret til plantedyrkning og mærkning, InsP-udvinding og selve SAX-HPLC-løbet. Selv om metoden blev optimeret til modellen plante A. thaliana, kan det nemt ændres til at studere andre plantearter, som vist her med den første rapporterede InsP profil af modellen bælgplanter Lotus japonicus. Selv om brugen af en anden planteart kan kræve en vis optimering, vi forestiller os, at disse vil være mindre, hvilket gør denne protokol et godt udgangspunkt for yderligere forskning i plante InsPs. For at lette mulige optimeringer angiver vi alle trin i den protokol, hvor ændringer er mulige, samt alle kritiske trin, der kan være udfordrende, når metoden etableres for første gang. Derudover rapporterer vi, hvordan data, der er indhentet ved denne metode, kan bruges til kvantificering af specifikke InsP'er, og hvordan forskellige prøver kan analyseres og sammenlignes.
Protocol
1. Opsætning af HPLC-systemet
- Opret et system bestående af to uafhængige HPLC-pumper (binær pumpe), et for hver buffer. Begge pumper skal styres sammen via en computer med respektive software eller ved at have en master pumpe. Implementer en stempelforseglingsvask til begge pumper, enten via tyngdekraften eller gennem en tredje lavtrykspumpe. Angiv en pumpe til buffer A (den 2. 2000% pumpe) og en for buffer B (den 2. 2000% pumpe B).
BEMÆRK: Begge skal kunne generere tryk på op til 60 bar (6 MPa) og strømningshastigheder på mindst 0,5 ml/min. - Tilslut begge pumper til en dynamisk mixer.
- Tilslut mixeren til en injektionsventil med en prøveløkke med en kapacitet på mindst 1 ml.
- Tilslut injektionsventilen til kolonnen med en kapillær via de tilsvarende endefittings.
- Tilslut kolonnen til brøkopsamleren ved hjælp af en kapillær med en passende længde.
BEMÆRK: Denne beskrivelse er baseret på vores HPLC-system (se materialetabellen),som kræver flere manuelle trin end nyere og mere avancerede systemer. Vores system giver nem adgang til og ændring af alle komponenter. Kvatnære pumper (med den binære gradient beskrevet her) kan også anvendes og vil føre til elution profiler og den overordnede kvalitet af analyserne svarende til dem, der opnås med binære pumper.
2. Udarbejdelse af buffere, søjle- og HPLC-system
- Puffere til udvinding af opløselige insPs: ekstraktionsbuffer (1 M HClO4) og neutraliseringsbuffer (1 M K2CO3). Forbered begge buffere med ultra-rent deioniseret vand. De er stabile ved stuetemperatur i flere måneder. Umiddelbart før ekstraktion tilsættes EDTA til begge opløsninger til en endelig koncentration på 3 mM (f.eks. fra en filtreret 250 mM EDTA-lageropløsning).
FORSIGTIG: HClO4 (perchlorsyre) er stærkt ætsende. - Puffere til SAX-HPLC-kørslen: buffer A (1 mM EDTA) og buffer B (1 mM EDTA, 1,3 M (NH4)2HPO4; pH 3,8 med H3PO4). Forbered begge ved hjælp af ultra-rent deioniseret vand efterfulgt af vakuumfiltrering med 0,2 μm pore-størrelse membranfiltre. Disse er stabile ved stuetemperatur i flere måneder.
BEMÆRK: EDTA bør indgå i alle buffere for at forhindre interaktioner mellem kationer med InsP'er, hvilket kan resultere i ændret InsP-opladning eller endog uopløselige InsP-saltkomplekser. - Programmer forløbet på følgende måde: 0\u20122 min, 0% buffer B; 2\u20127 min, op til 10% buffer B; 7\u201268 min, op til 84% buffer B; 68\u201282 min, op til 100% buffer B; 82\u2012100 min, 100% buffer B, 100\u2012101 min, ned til 0% buffer B; 101\u2012125 min, 0% buffer B. Den optimale strømningshastighed for denne gradient er 0,5 ml/min.
- Under løbet indsamles brøker hvert minut fra minut 1 til minut 96. De resterende 30 min af gradienten tjener til at vaske kolonnen og systemet, og behøver ikke at blive indsamlet til scintillation optælling.
- Hvis det er muligt, skal du indstille det maksimale tilgængelige tryk før nødstop af HPLC-pumperne til 80 bar (8 MPa). Dette forhindrer kritisk skade på kolonnens harpiks.
- Når du bruger en ny wash SAX HPLC-kolonne, skal den vaskes grundigt (>50 ml) med filtreret ultra rent deioniseret vand før første brug.
BEMÆRK: Dette vil sikre fjernelse af den indesluttede methanol, hvilket forhindrer salt nedbør i senere trin. Hvis det er muligt, skal du bruge en separat HPLC-pumpe. Hvis dette ikke er tilgængeligt, skal du sørge for, at HPLC er skyllet med vand, før du vasker kolonnen. Strømningshastigheden må ikke overstige 2 ml/min. Efter vask er kolonnen klar til analysen og kan, når den håndteres korrekt, bruges til 20\u201240-kørsler. Derefter vil beslutningen falde successivt. Langvarig vask med buffer A (>1 h) og udførelse af trin 2.6 kan bidrage til at øge kolonnens levetid. Hvis opløsningsnedgangen fortsætter, skal kolonnen udskiftes. Gradienten kan justeres for at øge adskillelsen mellem specifikke inositolpolyfosfatarter eller for at reducere den samlede kørselstid. Brug af forskellige HPLC-systemer (med forskellige ugyldige volumen eller forskellige volumen af kapillærer) vil kraftigt påvirke opbevaring gange. Kolonneændringer har også mindre effekt på opbevaringstiderne. - Udfør en "mock run". I stedet for en ekstraheret prøve skal filtreret ultra rent deioniseret vand i HPLC-systemet og køre standardgradienten. Brøkene behøver ikke at blive indsamlet.
BEMÆRK: Trin 2.6 er valgfrit. Den skal dog udføres, hvis en af følgende situationer gør sig gældende: Der installeres en ny kolonne. HPLC-systemet er blevet brugt til en anden metode på forhånd. HPLC-systemet har ikke været brugt i mere end 3 dage. Der opstod et problem med det foregående løb.
3. Plantedyrkning og mærkning med [3H]- myo-inositolmyo
BEMÆRK: Følgende trin skal udføres med sterile komponenter og under sterile forhold, mens du bærer handsker for at beskytte hænderne mod forurening med radiomærket. Plantemedier, især når de indeholder saccharose, er tilbøjelige til mikrobiel forurening.
- Steriliser A. thaliana frø med 1 ml 1,2% natriumhypochlorit i 3 min. efterfulgt af 1 ml 70% ethanol i 3 min. Derefter tilsættes 1 ml 100% ethanol, pipette frøene med ethanol på et cirkulært filterpapir og give dem mulighed for at lufttørre under en laminar-flow på en ren bænk.
- Når du bruger L. japonicus frø, placere dem i en morter og krat frø med sandpapir før sterilisation for at sikre en tilstrækkelig spiring sats.
- Så ud Arabidopsis frø i 1-2 rækker på firkantede petriskåle fyldt med solid vækst medier bestående af halv styrke Murashige og Skoog (MS) saltopløsning, 1% saccharose, 0,7% gellan gummi i deioniseret vand justeret til pH 5,7 med KOH og give dem mulighed for at stratificere i mindst 1 dag ved 4 °C i mørke.
- For Lotus frø, så dem ud i 1 række på firkantede petriskåle fyldt med solid vækst medier bestående af 0,8% bakteriologisk agar i deioniseret vand og give dem mulighed for at stratificere i mindst 3 dage ved 4 °C i mørke.
- Pladerne sættes lodret i en vækstinkubator eller klimakammer, og de kan vokse i 10-12 dage under korte dagsforhold (8 h lys ved 22 °C, 16 timer mørkt ved 20 °C).
- Overfør 10-20 kimplanter til en brønd af en 12-godt klar fladbundet cellekulturplade fyldt med 2 ml halvstyrke MS saltopløsning suppleret med 1% saccharose og justeret til pH 5,7.
- Der tilsættes 45 μCi af [3H]-myo-inositol (30-80 Ci/mmol, opløst i 90% ethanol) og blandes ved blid hvirvlende. Dæk pladen med det tilsvarende låg og forsegle den med mikroporøs kirurgisk tape (f.eks. mikropor eller leucoporetape), og anbring den tilbage i vækstkubvøsen.
FORSIGTIG: [3H] er en betaudleder med lav energi, som kan være en skadelig strålingsfare ved indånding, indtagelse eller absorberes gennem bar hud. Bær altid handsker ved håndtering af radioaktivt materiale eller udstyr, der har direkte eller indirekte kontakt med radioaktivt materiale. Følg også de lokale regler for sikker håndtering af radiokemikalier (f.eks. iført ekstra beskyttelsestøj, brug af et dosimeter og jævnligt undersøgelser af overflader til forurening). - Efter 5 dages mærkning fjernes planter fra medierne og vaskes kortvarigt med deioniseret vand. Tør dem med papirservietter og overføre dem til en 1,5 ml mikrocentrifuge rør. Overfyld ikke røret, og placer ikke mere end 100 mg FW/rør, hvilket svarer til ca. 10\u201220 17 dage gamle frøplanter.
BEMÆRK: Et overskud af plantemateriale vil fortynde syren under ekstraktionsprocessen og vil i høj grad nedsætte ekstraktionseffektiviteten.- Fastfrys røret i flydende nitrogen og opbevar det ved -80 °C, indtil det udsugning.
BEMÆRK: Prøver kan opbevares ved -80 °C i flere uger uden at gå på kompromis med prøvekvaliteten. Vækstbetingelserne (medier, lys, temperatur, tid) kan ændres i henhold til behovene i et bestemt eksperiment eller plantearter. Der skal dog være forsigtighed ved fortynding af [3H]- myo-inositol for at sikre kvantificerbare SAX-HPLC-kørsler af god kvalitet.myo Derfor anbefales det at starte med [3H]- myo-inositol koncentrationer angivet her og reducere det trinvist, hvis det ønskes.myo I mærkningstiden kan planter underkastes forskellige behandlinger (f.eks. miljømæssige belastninger eller kemiske agenser) for at vurdere disse forholds indvirkning på globale insp'er. For at nå steady-state mærkning, anbefaler vi at mærke planter i mindst 5 dage.
- Fastfrys røret i flydende nitrogen og opbevar det ved -80 °C, indtil det udsugning.
4. Udvinding af opløselige insp'er
BEMÆRK: Hold prøver og reagenser på is under hele ekstraktionsprocessen. Bær altid handsker og beskyttelsesbriller på grund af høj risiko for kontakt med radioaktivt materiale, især under slibning. Alt, hvad der kommer i kontakt med prøver, betragtes som radioaktivt affald og bør bortskaffes i henhold til de lokale regler for sikker bortskaffelse af radioaktivt materiale.
- Forbered arbejdsløsningerne til udtræknings- og neutraliseringsbufferen som i trin 2.1. Hver prøve kræver 600 μL ekstraktionsbuffer og 400 μL neutraliseringsbuffer. Opbevar bufferne på is.
- Prøverne fra -80 °C fryser og hold dem i flydende nitrogen indtil videre forarbejdning. Prøverne slibes med en mikrocentrifugerørs støder, indtil de begynder at optø og tilsættes 500 μL iskold ekstraktionsbuffer. Fortsæt slibningen, indtil prøven er fuldstændig homogeniseret, og opløsningen har en dyb grøn farve (hvis der er blade til stede i prøven).
- Prøverne centrifugeres i 10 min. ved 4 °C ved ≥ 18000 x g. Overfør supernatanten til et frisk 1,5 ml rør. Husk, at de rør, der anvendes til udvinding, betragtes som fast radioaktivt affald og skal bortskaffes i overensstemmelse hermed.
-
Tilsæt forsigtigt 300 μL neutraliseringsbuffer til ekstraktet. Nedbør af proteiner og boblende vil starte med det samme. Bland ved at hvirvle med en pipettespids efter et minut og vent i et par sekunder, før du pipettere en lille mængde (5 μL) på pH-papir (ideelt interval af pH 6-9). PH skal være mellem pH 7 og 8 i sidste ende.
- Hvis det er nødvendigt, tilsættes små mængder (typisk 10-20 μL) af enten neutraliseringsbuffer eller ekstraktionsbuffer, indtil den ønskede pH-pH-pc er nået. Lad prøverne hvile på is i mindst 1 time med et åbent låg.
- Proemplet centrifugeres i 10 min ved 4 °C ved ≥ 18 000 x g. Overfør supernatanten til et frisk 1,5 ml rør.
BEMÆRK: Prøverne kan enten anvendes direkte i en SAX-HPLC-kørsel eller opbevares på is (hvis de anvendes senere samme dag) eller fryses i flydende nitrogen og opbevares ved -80 °C i 2\u20124 uger. For at sikre en høj reproducerbarhed og sammenlignelighed anbefales det altid at fryse prøverne i flydende nitrogen i 5 min. Langtidsopbevaring af ekstraudpakkede prøver ved -80 °C er mulig, så længe prøverne kun optøes én gang. Hvis der anvendes frosne prøver til analysen, skal du sørge for, at der ikke er synlige partikler efter optøning. Ellers centrifugeres igen i 10 minutter ved 4 °C ved ≥ 18.000 x g og overføres supernatanten til et frisk 1,5 ml rør.
5. Udførelse af HPLC-løbetur
- Udstyre fraktionsopsamleren med 96 små scintillationsglas (kapacitet på ~6 ml) og fyld hvert hætteglas med 2 ml af en egnet scintillationscocktail (f.eks. Ultima-Flo AP væskescintillationscocktail), der er kompatibel med buffere med lav pH-hætte og høj ammoniumphosphatkoncentration (se materialetabel).
BEMÆRK: Antallet af hætteglas og hætteglassenes størrelse afhænger af den anvendte fraktionsopsamler og scintillationstæller. Det er vigtigt at mindst indsamle de første 90 fraktioner,hvis gradienten beskrevet her bruges, for at opnå en fuld inositol polyphosphat profil. Sørg også for at mærke hvert hætteglas og dets respektive låg korrekt for at forhindre sammenblanding af fraktioner eller prøver. - Start HPLC-systemet/pumperne, og hav det klar til at køre. Aktivér stempelforseglingsvasken, og hold den aktiveret under hele løbet. Prøven indlæses manuelt ved manuel indsprøjtning af det komplette supernatant fra trin 4.5 (ca. 750 μL) med en egnet sprøjte (se Tabel over materialer). Hvis automatisk injektion er mulig, overføres prøven til det tilsvarende prøvehætteglas. Drej ventilen fra "belastning" til "injicer" position og start gradienten og fraktionsamleren.
BEMÆRK: Afhængigt af det anvendte HPLC-system kan startproceduren variere, især når ældre systemer (som beskrevet her) sammenlignes med en fuldt softwarestyret nyere model. Det er meget vigtigt at sikre, at gradienten, prøveinjektionen og fraktionsindsamlingen starter samtidigt. - Mens HPLC-løbet er i gang, skal du kontrollere trykket regelmæssigt. Starttrykket skal være omkring 18-24 bar (1,8-2,4 MPa) og bør langsomt stige til 50-60 bar (5-6 MPa) når 100% buffer B er nået.
FORSIGTIG: Nedsat tryk kan indikere en lækage i systemet, mens øget tryk indikerer en blokering. Trykudsving (≥ 3 bar på få sekunder) kan indikere tilstedeværelsen af luft i systemet. Husk, at alt, hvad der forlader kolonnen, samt hver lækage, der opstår på injektoren eller bagefter erradioaktivt .
BEMÆRK: Trykket afhænger også af HPLC-systemet og kan være lavere eller højere end angivet her. Det vil langsomt stige efter ca 15-20 kører. Dette påvirker dog ikke nødvendigvis kvaliteten af de opnåede kørsler. - Efter løbet lukkes hætteglassene tæt og blandes fraktionerne med scintillationscocktailen ved kraftig omrystning. Fortsæt direkte med målingen, eller hold hætteglassene i opretstående stilling, helst i mørke.
BEMÆRK: Fraktioner blandet med scintillationscocktail er stabile i ugevis og kan måles senere. Da halveringstiden for tritium er 12,32 år, signaltabet er ubetydeligt. - Når løbet af dagens sidste prøve er afsluttet, skal du stoppe begge HPLC-pumper.
- (Valgfrit) For at øge systemets levetid, især når det ikke anvendes regelmæssigt, skal du vaske pumpe B og kapillærer ved at placere kapillæren fra buffer B i en flaske med buffer A og lade pumpen køre i 10-15 min. Før næste brug skal du huske at udskifte kapillæren i buffer B og at frakoble pumpe B fra mixeren for at skylle den med buffer B. Når pumpen og kapillærerne er fyldt igen med buffer B, skal du tilslutte den igen med mixeren, og systemet er klar til brug.
6. Måling af brøker
- Sæt hætteglassene i scintillation tæller stativer og måle hvert hætteglas i 5 min i en flydende scintillation tæller.
- Brug ideelt set stativer, der passer direkte til små hætteglas, og undgå at hænge i hætteglassene i større (f.eks. 20 ml) hætteglas for at reducere tællefejl. De softwareindstillinger, der bruges i denne protokol, vises i supplerende figur 1.
BEMÆRK: Udfør regelmæssigt en SNC-protokol (selvnormalisering og kalibrering) ved hjælp af ubrugte [3H]-standarder. Kortere optællingstider (1-5 min) er mulige for at reducere ventetiden. Men for at sikre en høj tælle reproducerbarhed og nøjagtighed, 5 min anbefales.
7. Dataanalyse
- Eksporter målingerne fra scintillationstælleren som en regnearksfil eller et kompatibelt/konvertibelt filformat. Vurder dataene med en computer udstyret med Excel eller lignende software og en passende analysesoftware som Origin.
- Forbered et 2D-kurvediagram, hvor de målte antal pr. minut (cpm) afbildes i forhold til retentionstiden (se figur 1, Figur 2).
- For at sammenligne prøver med hinanden, normalisere dataene ved at opsummere cpm fra hver eluted fraktion fra minut 25 til 96 for hver enkelt prøve.
BEMÆRK: Minut 25 bruges som cut-off til at udelukke personliggjorte [3H]- myo-inositol, InsP1 og InsPmyo2 fra analysen, da de har tendens til at svinge kraftigt og ikke kan være godt adskilt (i det mindste med gradient foreslået i denne protokol) og dermed stærkt ændre normalisering faktor på grund af deres høje aktivitet. - Normaliser alle data for stikprøven med den laveste samlede cpm (i fraktioner 25\u201296) ved at dividere den samlede cpm fra prøven med den laveste cpm (i fraktioner 25-96) med den samlede cpm (i fraktioner 25-96) af de andre prøver. Den resulterende faktor kan derefter bruges til at normalisere cpm fra hver fraktion ved at gange cpm af hver fraktion med faktoren.
BEMÆRK: I sidste ende skal summen af cpm-værdierne fra minut 25 til slutningen være ens for alle prøver sammenlignet med hinanden. Kun normaliserede kørsler skal præsenteres i samme graf/figur (når de præsenteres som faktiske profiler). Supplerende figur 2 viser et eksempel på, hvordan disse beregningstrin foretages (kun ved hjælp af brøker 25-35 af to prøver til forenkling). I nogle tilfælde er det dog ikke nødvendigt at normalisere data. For eksempel, når toppe kvantificeres i henhold til trin 7.4 og præsenteres som procenter af de samlede InsP'er (som vist i figur 3D). Som nævnt før, når der præsenteres flere analyser side om side som profiler, eller når den faktiske målte aktivitet bruges til konklusioner (f.eks behandling a) øger InsP7 med x% i forhold til kontrol, med henvisning til cpm værdier insP7 af begge prøver og ikke til deres procentdel af den samlede InsPs) normalisering er nødvendig. For at analysere effekten af genotype eller behandlingsforskelle på mærkning effektivitet, er det vigtigt ikke at normalisere, da dette ville ugyldiggøre disse forskelle. Men absolut kvantificering med denne metode er udfordrende, fordi ekstraktion effektivitet med denne protokol kan være variabel af forskellige årsager og er undertiden endda observeret, når replika af samme genotype og behandling analyseres. Husk, at afhængigt af det HPLC-system, den kolonne og det forløb, der bruges til analyserne, skal afskæringen muligvis ændres. - For at udføre relative kvantificeringer af visse inositolpolyphosphattoppe og efterfølgende oprette søjlediagrammer, der indeholder data om replikatiseringer til statistiske analyser, skal du fortsætte analysen med en specialiseret software, der kan beregne spidsbelastningsområder for kromatogrammer (f.eks. Se Supplerende figur 3.
BEMÆRK: De fleste HPLC-systemer, der er softwarestyrede, leveres med en respektive software, der kan udføre denne opgave. Toppe bestemmes som brøker med cpm-værdier over baggrunden (som varierer til en vis grad mellem kørsler) og opbevaringstider, der svarer til tidligere offentliggjorte data. Retentionstiden for en bestemt spids er bestemt i regnearkssoftware (f.eks. Supplerende figur 3 illustrerer denne proces med spidsbestemmelse, baggrundsindtraktion og integration af toppe.
Representative Results
De resultater, der vises her, har til formål at illustrere mulige resultater opnået i henhold til variationer på teknisk og biologisk plan. Den første eksemplificeres ved analyser ved hjælp af nye kontra gamle søjler (figur 1) og friske kontralagrede prøver (figur 3) og den anden ved at evaluere ekstrakter fra to forskellige plantesystemer, A. thaliana (Figur 1, Figur 3) og L. japonicus (Figur 2).
En optimal SAX-HPLC køre er afbildet på figur 1A\u2012C, som viser en komplet inositol polyphosphat spektrum opnået fra A. thaliana ekstrakter efter scintillation optælling. Bemærk, at toppe er pænt adskilt og kan tildeles forskellige isomerer (eller enantiomer-par) baseret på kromatiske mobiliteter beskrevettidligere 5,7.
Figur 2 viser det repræsentative resultat af en SAX-HPLC-analyse af L. japonicus-planter, der blev dyrket og mærket under de samme betingelser som de arabiske frøplanter. Mens formentlig alle InsP arter og toppe, der er kendt fra Arabidopsis kan ses, der er betydelige forskelle med hensyn til den relative (f.eks forholdet mellem isomerer) mængden af specifikke InsP isomerer, når man sammenligner profiler af begge arter. For eksempel, Lotus ekstrakter viste øget InsP3c, InsP4b, InsP5b og reduceret InsP3a, InsP4a, InsP5a og InsP5c i forhold til Arabidopsis, som giver plads til yderligere undersøgelser. Figur 2D illustrerer de forskellige forhold mellem InsP isomerer mellem Arabidopsis og Lotus.
Figur 3 viser to InsP-profiler af en prøve, der blev opdelt efter ekstraktionen. Den første halvdel blev straks analyseret og den anden halvdel en dag senere, efter opbevaring ved -80 °C. Bemærk, at der kun observeres mindre forskelle mellem de forskellige prøver (dvs. sorte og røde linjer i figur 3A\u2012Cog figur 3D). Dette illustrerer, at en fryseoptøningscyklus ikke skader prøven, og at selve metoden giver reproducerbare resultater.
Figur 1: Typisk InsP-profil for en vellykket og mislykket SAX-HPLC-analyse, der udføres med denne protokol. (A\u2012C) SAX-HPLC profil af 17-dages gamle vilde-type (Col-0) Arabidopsis planter radioaktivt mærket med [3H]- myo-inositol.myo Global InsP-udvinding og SAX-HPLC-kørsel blev udført samme dag. a) fuld spektre bB, c) Zoom-ins af den profil, der vises i A. Alle synlige toppe er fremhævet og tildelt de tilsvarende InsP arter. Baseret på offentliggjorte kromatografiskemobiliteter 5,7, InsP4a sandsynligvis repræsenterer Ins(1,4,5,6)P4 eller Ins(3,4,5,6)P4, InsP5a repræsenterer InsP5 [2-OH], InsP5b repræsenterer InsP5 [4-OH] eller dens enantiomeric form InsP5 [6-OH], og InsP5c repræsenterer InsP5 [1-OH] eller dens enantiomeric form InsP5 [3-OH]. Den isomeric karakter af InsP3a-c, InsP4b, InsP7, og InsP8 er stadig ukendt. Panel (D) viser en SAX-HPLC-profil af ensvoksne planter, men ved hjælp af en ældet kolonne (>40 kørsler). En klar reduktion af InsP6 sammenlignet med andre InsP-arter og fraværet af OPP-insp'er er synlig. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Repræsentativ InsP-profil af L. japonicus-planter. SAX-HPLC profil (A\u2012C) af 17-dages gamle vilde-type (Gifu) L. japonicus planter radioaktivt mærket med [3H]- myo-inositol.myo a) fuld spektre bB, c) Zoom-ins af den profil, der vises i A. Alle synlige toppe er fremhævet og tildelt de tilsvarende InsP arter. Baseret på offentliggjorte kromatografiskemobiliteter 5,7, InsP4a sandsynligvis repræsenterer Ins(1,4,5,6)P4 eller Ins(3,4,5,6)P4, InsP5b sandsynligvis repræsenterer InsP5 [4-OH] eller dens enantiomeriske form InsP5 [6-OH], og InsP5c repræsenterer sandsynligvis InsP5 [1-OH] eller dens enantiomeric form InsP5 [3-OH]. Den isomeric karakter af InsP3a-c, InsP4b, InsP7, og InsP8 er ukendt. d)Sammenligning mellem de enkelte InsP-arter (i % af den samlede aktivitet fra elution 25-u201296) af A. thaliana (data fra figur 1A\u2012C) og L. japonicus (data fra figur 2A-C). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: InsP-profiler for en opdelt prøve, der illustrerer reproducerbarheden af SAX-HPLC-analyser. (A\u2012C) SAX-HPLC profiler af 17-dages gamle wild-type (Col-0) Arabidopsis planter radioaktivt mærket med [3H]- myo-inositol.myo Inden forsketet blev prøven straks opdelt og den ene halvdel kørt med det samme og den anden halvdel en dag senere efter oplagring ved -80 °C.A) Fuld spektre. bB, c) Zoom-ins af den profil, der vises i A. Alle synlige toppe er fremhævet og tildelt de tilsvarende InsP arter. Baseret på offentliggjorte kromatografiskemobiliteter 5,7, InsP4a sandsynligvis repræsenterer Ins(1,4,5,6)P4 eller Ins(3,4,5,6)P4, InsP5a repræsenterer InsP5 [2-OH], InsP5a repræsenterer InsP5 [2-OH], InsP5b repræsenterer InsP5 [4-OH] eller dens enantiomeric form InsP5 [6-OH], og InsP5c repræsenterer InsP5 [1-OH] eller dens enantiomeric form InsP5 [3-OH]. Den isomeric karakter af InsP3a-c, InsP4b, InsP7, og InsP8 er stadig ukendt. Panel D viser kvantificeringen af InsP6 og PP-InsPs InsP7 og InsP8 i begge kørsler. Værdierne repræsenterer beløbet (i %) af de respektive InsP-arter i forhold til alle InsP (samlet aktivitet fra 25-96). Klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende figur 1: Softwareindstillinger for væskescintillationstælling ved hjælp af en let scintillationstæller. Skærmbilleder, der viser softwareversionen, samt indstillinger, der bruges til scintillation optælling af [3H] prøver udført med denne protokol er afbildet. Klik her for at downloade dette tal.
Supplerende figur 2: Repræsentativt eksempel på datanedalisering. Et skærmbillede af et regneark viser alle trin og formler, der bruges til at normalisere SAX-HPLC, kører til hinanden. Til forenkling er det kun fraktioner, der viser 25-35 prøver. Klik her for at downloade dette tal.
Supplerende figur 3: Spidsbelastning, baggrundsindtraktion og integration ved hjælp af analysesoftware. (A) Data fra SAX-HPLC analyse indlæses i softwaren (minutter 28-96), og peak analysator værktøj er valgt. (B\u2012E) Basislinjen defineres manuelt ved at angive punkter mellem individuelle toppe, og baggrunden trækkes fra. (F) Spidsbelastninger bestemmes manuelt på grundlag af udseende og offentliggjorte kromatografiske mobiliteter5,7. (G) Spidsbelastningsområder defineres manuelt ved hjælp af cpm-værdier. HH) Spidsbelastninger integreres og beregnes som % af alle toppe. Klik her for at downloade dette tal.
Discussion
Her præsenterer vi en alsidig og følsom metode til at kvantificere InsPs herunder OPP-InsPs i planteekstrakter og give praktiske tips om, hvordan man får denne metode etableret. Selvom protokollen generelt er robust, kan der forekomme suboptimale kørsler og analyser. I de fleste tilfælde kan disse kørsler identificeres ved en kraftig reduktion eller endog fuldstændig tab af stærkt fosforylerede InsP'er, især PP-InsP-arterne InsP7 og InsP8. Mulige årsager kan være mikrobielle kontamineringer af plantematerialet og utilstrækkelig deaktivering af endogene plante PP-InsP hydrolaser under udvinding på grund af utilstrækkelig slibning og optøning af plantemateriale, som ikke vil være i umiddelbar kontakt med udvindingsbuffer. Yderligere årsager omfatter unøjagtig pH-justering ved utilstrækkelig eller overdreven tilsætning af neutralisering buffer, eller simpelthen utilstrækkelig prøvemateriale. Sidstnævnte kan gøre det vanskeligt at påvise PP-InsPs, da disse ofte er til stede i meget lave mængder i cellerne. Et overskud af prøvemateriale eller ineffektiv tørring under trin 3.5 kan forårsage fortynding af perchlorsyren, hvilket derfor også fører til utilstrækkelig enzymaktivering og et specifikt tab af InsP6 og PP-InsP. Mængden af plantemateriale samt det radiomærke, der anvendes i denne protokol, blev optimeret baseret på omkostninger og ydeevne og er derfor tæt på den laveste mængde, der stadig er tilstrækkelig til at give optimale resultater. Desuden vil kolonne harpiksen gradvist miste sin opløsningskapacitet. Det første tegn på denne proces er (af grunde, der ikke er helt klart for forfatterne) et specifikt tab af højere fosforylerede InsP arter som PP-InsPs i HPLC spektrum. Med yderligere aldring, vil selv InsP6 ikke blive løst korrekt af kolonnen (Figur 1D). Derfor er brugen af en passende kolonne samt omhyggelig håndtering af prøven og korrekt vedligeholdelse af HPLC-komponenterne afgørende for at sikre nøjagtige resultater.
Når man sammenligner prøver og kørsler, især når de genereres med forskelligt udstyr (f.eks. HPLC-systemer og kolonner) eller på forskellige dage, er det afgørende at normalisere prøverne med hinanden (som beskrevet i trin 7.3) og analysere dem på samme måde. Kun gennem normalisering er det muligt og nøjagtigt at vise flere prøver i samme graf (Figur 3). Ved kvantificering af individuelle InsP'er i forhold til de samlede InsP-arter eller til en anden specifik InsP-art er det ikke nødvendigt at normalisere, så længe der kun vises relative værdier og ikke absolutte værdier. Ideelt set vises både InsP-profilerne og kvantificeringerne. I nogle tilfælde er det dog ikke muligt i tilstrækkelig grad at vise to eller flere kørsler i samme graf. Forskellige opbevaringstider eller forskellige niveauer af baggrundsaktivitet kan gøre det vanskeligt at sammenligne ikke-kvantificerede SAX-HPLC-profiler alene. Det samme gælder, når mange prøver skal sammenlignes. I sådanne tilfælde er det nødvendigt med en yderligere evaluering ved hjælp af en yderligere software (f.eks.
Forfatterne er klar over, at den protokol, der er beskrevet her, kan optimeres og skal tilpasses hvert enkelt forskningsspørgsmål. Selv om der optimeres for Arabidopsis ekstrakter 7,17 i denne protokol, denne metode er alsidig og kan hjælpe med at bestemme InsP profiler af andre plantearter samt. Her er vi et eksempel på denne mulighed ved for første gang at præsentere en InsP-profil for L. japonicus, som ikke krævede ændringer af mærkningsbetingelserne, InsP-ekstraktionen eller SAX-HPLC-kørslen (Figur 2). Især, mens den samlede lignende, forskelle er observeret mellem L. japonicus og Arabidopsis InsP profiler. For eksempel i L. japonicus InsP5 [4-OH] eller dens enantiomeric form InsP5 [6-OH] er mere rigelige end InsP5 [1-OH] eller dens enantiomeric form InsP5 [3-OH] i forhold til Arabidopsis, hvor InsP5 [1-OH] eller dets enantiomeriske form InsP5 [3-OH] er den dominerende InsP5-art. På samme måde forventer vi, at ændringer i mediesammensætningen, [3H]- myo-inositol koncentration, plantealder, miljøforhold (f.eks lys og temperatur), tilsætning af kemiske forbindelser eller analyser af plantemikrobielle interaktioner blandt andre faktorer, kan være nødvendigt at teste og tilpasse.myo
En vigtig ulempe ved denne metode, der skal overvejes, er, at mærkningen sker i en (steril) flydende kultur, som ikke repræsenterer et fysiologisk miljø for de fleste jordplanter. På grund af de høje omkostninger ved [³H]- myo-inositol er mærkningsopløsningens volumen og kulturbeholderens størrelse desuden generelt begrænset, hvilket også begrænser størrelsen af de planter, der kan anvendes.myo Dyrkning i flydende kultur kan undgås ved direkte at infiltrere for eksempel blademyoaf jorddyrkede planter med [³H]- myo-inositol og efterfølgende efter den protokol, der er beskrevet her, som tidligere rapporteret10.
Der er flere ulemper ved denne protokol i forhold til alternative metoder, såsom TiO2 pull-down efterfulgt af PAGE eller massespektrometri baserede teknikker. På grund af [3H]- myo-inositol mærkning, kun InsP arter, der direkte stammer fra radioaktivt mærket myo-inositolvil blive opdaget i sidste ende.myo Den metode, der er beskrevet her, er blind for andre Ins isomerer såsom scyllo-inositol og andre isomerer hvoraf nogle er blevet identificeret i visse planter44. Endvidere, myo-InsPsstammer fra andre veje vil blive udelukket, herunder dem syntetiseret af de novo syntese af myo-inositol og myo-inositol-3-fosfatvia isomerisering af glukose-6-fosfat, katalyseret af myo-inositol-3-phosphatsyntase (MIPS) proteiner45. myo Selv om [32P] eller [33P]- ortho-fosfat kan bruges som alternative etiketter, deres anvendelse udgør en stor ulempe, da hver fosfat-holdige molekyle, herunder de rigelige nukleotider og derivater heraf, vil blive mærket.ortho Disse molekyler kan også udvindes med denne protokol og binde sig til SAX kolonne, hvilket vil resultere i et højt niveau af baggrundsaktivitet, der vil forstyrre identifikationen af individuelle InsP toppe5. Desuden kan kvantificering af [32P] - eller [33P] -mærket InsP og P-InsPs være stærkt påvirket af fosfat og pyrophosphat moiety omsætning og kan ikke rapportere en masse udlæsning for inositol arter.
På den anden side, [3H]- myo-inositol specifikt etiketter myo-inositol-holdigemolekyler.myo InsPs, inositol-holdige lipider, såsom fosforinositider, og galactinol er i dette tilfælde mærket. Det er dog kun InsPs, der analyseres med denne protokol, da lipider er uopløselige i ekstraktionsbufferen, og galactinol ikke binder sig til SAX-kolonnen.
Hidtil er forskellene fra en plante InsP profil genereret af [3H]- myo-inositol mærkning sammenlignet med en bestemt af TiO2 pulldown / PAGE er fortsat ukendt, da sådanne sammenligninger ikke er blevet udført i planter.myo En nylig undersøgelse i dyreceller behandlet dette spørgsmål46. I dette værk blev en pulje af InsP6, der er usynlig ved [3H]- myo-inositol mærkning, som derved skulle være direkte afledt af glukose-6-fosfat, identificeret ved at sammenligne SAX-HPLC profiler med PAGE geler af pattedyr cellelinjer.myo 24 h fosfatsultelse resulterede i en 150% stigning i InsP6 ved kvantificering af PAGE geler af InsPs renset ved hjælp af TiO2 pulldown. SAX-HPLC-analyser af [3H]- myo-inositol-mærkede celler, der blev behandlet ens, viste kun en stigning på 15 % af [3H]-InsPmyo6. Som tidligere nævnt, InsPs lavere end InsP5 er målbart med PAGE analyse i de fleste tilfælde. Radiolabeling efterfulgt af SAX-HPLC synes at være den foretrukne metode, så længe massespektrometriske protokoller ikke er optimeret til at detektere denne gruppe af meget negativt ladede molekyler.
En anden tilbageværende udfordring er at skelne mellem enantiomere i SAX-HPLC-analyser (eller i enhver anden metode til InsP-analyse)10,17. Denne udfordring kan løses ved tilsætning af chiral selektorer, dvs enantiopure forbindelser som L-arginin midt, der interagerer med de respektive enantiomeriske molekyler til at danne diastereomeric komplekser, der kan adskilles10. Så langtviden er denne fremgangsmåde kun blevet gennemført for at diskriminere den enantiomeriske InsP5 isomerer InsP5 [1-OH] og InsP5 [3-OH] ved NMR-analyser10. Der er endnu ikke rapporteret om forskelsbehandling af andre enantiomeriske par eller vellykket forskelsbehandling af enantiomere ved hjælp af chiral SAX-HPLC-analyse eller chiral PAGE-baserede metoder, som bør videreudvikles. I betragtning af den bevarede syntese og den bevarede regulering af PP-InsP'er ved hjælp af fosfortilgængelighed forestiller vi os, at især ikke-radioaktive metoder såsom PAGE- eller MS-baserede metoder sammen med næringsstofanalyser vil hjælpe med at justere deektionsdata, der er beregnet til at diagnosticere næringsstofmangleriafgrøderne 17,18,24,25. Men den metode, der præsenteres her, kan i øjeblikket stadig betragtes som guldstandarden for InsP-analyser og vil være medvirkende til at opdage nye funktioner i disse spændende budbringere i planter.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev finansieret af Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, German Research Foundation) under Tysklands excellencestrategi - EXC-2070 – 390732324 (PhenoRob), forskningsuddannelsesgruppen GRK2064 og individuelle forskningsbevillinger SCHA1274/4-1 og SCHA1274/5-1 til G.S.. Vi takker også Li Schlüter og Brigitte Ueberbach for teknisk bistand.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Centrifuge | Eppendorf AG | model: 5430 R | |
| Diammonium hydrogen phosphate, ≥97 % | Carl Roth GmbH + Co. KG | 0268.1 | |
| Ethylenediamine tetraacetic acid disodium salt dihydrate, ≥99 %, p.a., ACS | Carl Roth GmbH + Co. KG | 8043.2 | |
| Falcon 12-well clear flat bottom TC-treated multiwell cell culture plate, with lid, individually wrapped, sterile | Corning Inc. | 353043 | |
| Fraction collector | LAMBDA Instruments GmbH | model: OMNICOLL single channel collector | |
| Growth incubator | poly klima GmbH | model: PK 520-LED | |
| HPLC pumps | Kontron Instruments | model: 420 | |
| HPLC syringe for Rheodyne valves, 1 mL | Hamilton Company | 81365 | |
| Injector for HPLC | Supelco | model: Rheodyne 9725 | |
| Inositol, myo-[1,2-3H(N)] | American Radiolabeled Chemicals Inc. | ART 0261 | |
| Liquid nitrogen | University, Chemistry Department | ||
| Liquid scintillation counter | PerkinElmer Inc | model: TRI-CARB 2900TR | |
| Micro pestle | Carl Roth GmbH + Co. KG | CXH7.1 | |
| Mixed cellulose Eester filter, ME range (ME 24), plain, 0.2 µm pore size, 47 mm circle | GE Healthcare Life Sciences | 10401770 | |
| Mixer for HPLC | Kontron Instruments | model: M 800 | |
| Murashige & Skoog medium, salt mixture | Duchefa Biochemie | M0221 | |
| OriginPro software | OriginLab Corp. | ||
| Orthophosphoric acid, ≥85 %, p.a., ISO | Carl Roth GmbH + Co. KG | 6366.1 | |
| Partisphere 5 µm SAX cartridge column, 125 x 4.6 mm | Hichrom Limited | 4621-0505 | |
| Perchloric acid, 70 %, 99.999 % trace metals basis | Sigma-Aldrich | 311421 | |
| Petri dish, square, PS, clear, 120/120/17 mm, sterile | Greiner Bio One International GmbH | 688161 | |
| pH-indicator paper pH 5.5 - 9.0, Neutralit | Merck KGaA | 109564 | |
| Phytagel | Sigma-Aldrich | P8169 | |
| Potassium carbonate | Carl Roth GmbH + Co. KG | P743.2 | |
| Safe-Lock tubes, 1.5 mL | Eppendorf AG | 30120086 | |
| Sample loop for 9725 injectors, volume 2 mL, PEEK | Supelco | 57648 | |
| SNAPTWIST scintillation vial, 6.5 mL | Simport Scientific Inc. | S207-5 | |
| Sterile bench | LaboGene | model: ScanLaf MARS 900 | |
| Sucrose, ≥99,5 %, p.a. | Carl Roth GmbH + Co. KG | 4621.1 | |
| Ultima-Flo AP liquid scintillation cocktail | PerkinElmer Inc | 6013599 | |
| Ultra-pure deionized water | Milli-Q | ||
| Wrenchless WVS End Fitting Kit | Hichrom Limited | 4631-1001 |
References
- Berridge, M. J., Irvine, R. F. Inositol Phosphates and Cell Signaling. Nature. 341 (6239), 197-205 (1989).
- Streb, H., Irvine, R. F., Berridge, M. J., Schulz, I. Release of Ca-2+ from a Nonmitochondrial Intracellular Store in Pancreatic Acinar-Cells by Inositol-1,4,5-Trisphosphate. Nature. 306 (5938), 67-69 (1983).
- Krinke, O., Novotna, Z., Valentova, O., Martinec, J. Inositol trisphosphate receptor in higher plants: is it real. Journal of Experimental Botany. 58 (3), 361-376 (2007).
- Kuo, H. F., et al. Arabidopsis inositol pentakisphosphate 2-kinase, AtIPK1, is required for growth and modulates phosphate homeostasis at the transcriptional level. Plant Journal. 80 (3), 503-515 (2014).
- Kuo, H. F., et al. Arabidopsis inositol phosphate kinases IPK1 and ITPK1 constitute a metabolic pathway in maintaining phosphate homeostasis. Plant Journal. 95 (4), 613-630 (2018).
- Gillaspy, G. E. Lipid-mediated Protein Signaling. Capelluto, D. G. S. , Springer. Netherlands. 141-157 (2013).
- Stevenson-Paulik, J., Bastidas, R. J., Chiou, S. T., Frye, R. A., York, J. D. Generation of phytate-free seeds in Arabidopsis through disruption of inositol polyphosphate kinases. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (35), 12612-12617 (2005).
- Lemtiri-Chlieh, F., MacRobbie, E. A. C., Brearley, C. A. Inositol hexakisphosphate is a physiological signal regulating the K+-inward rectifying conductance in guard cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (15), 8687-8692 (2000).
- Lee, H. S., et al. InsP6-sensitive variants of the Gle1 mRNA export factor rescue growth and fertility defects of the ipk1 low-phytic-acid mutation in Arabidopsis. Plant Cell. 27 (2), 417-431 (2015).
- Blüher, D., et al. A 1-phytase type III effector interferes with plant hormone signaling. Nature Communications. 8, (2017).
- Murphy, A. M., Otto, B., Brearley, C. A., Carr, J. P., Hanke, D. E. A role for inositol hexakisphosphate in the maintenance of basal resistance to plant pathogens. Plant Journal. 56 (4), 638-652 (2008).
- Poon, J. S. Y., Le Fevre, R. E., Carr, J. P., Hanke, D. E., Murphy, A. M. Inositol hexakisphosphate biosynthesis underpins PAMP-triggered immunity to Pseudomonas syringae pv. tomato in Arabidopsis thaliana but is dispensable for establishment of systemic acquired resistance. Molecular Plant Pathology. 21 (3), 376-387 (2020).
- Wild, R., et al. Control of eukaryotic phosphate homeostasis by inositol polyphosphate sensor domains. Science. 352 (6288), 986-990 (2016).
- Shears, S. B. Inositol pyrophosphates: Why so many phosphates. Advances in Biological Regulation. 57, 203-216 (2015).
- Shears, S. B. Intimate connections: Inositol pyrophosphates at the interface of metabolic regulation and cell signaling. Journal of Cellular Physiology. 233 (3), 1897-1912 (2018).
- Desai, M., et al. Two inositol hexakisphosphate kinases drive inositol pyrophosphate synthesis in plants. Plant Journal. 80 (4), 642-653 (2014).
- Laha, D., et al. VIH2 Regulates the Synthesis of Inositol Pyrophosphate InsP8 and Jasmonate-Dependent Defenses in Arabidopsis. Plant Cell. 27 (4), 1082-1097 (2015).
- Laha, D., et al. Arabidopsis ITPK1 and ITPK2 Have an Evolutionarily Conserved Phytic Acid Kinase Activity. Acs Chemical Biology. 14 (10), 2127-2133 (2019).
- Dorsch, J. A., et al. Seed phosphorus and inositol phosphate phenotype of barley low phytic acid genotypes. Phytochemistry. 62 (5), 691-706 (2003).
- Flores, S., Smart, C. C. Abscisic acid-induced changes in inositol metabolism in Spirodela polyrrhiza. Planta. 211 (6), 823-832 (2000).
- Brearley, C. A., Hanke, D. E. Inositol phosphates in barley (Hordeum vulgare L) aleurone tissue are stereochemically similar to the products of breakdown of InsP(6) in vitro by wheat-bran phytase. Biochemical Journal. 318, 279-286 (1996).
- Laha, N. P., et al. ITPK1-Dependent Inositol Polyphosphates Regulate Auxin Responses in Arabidopsis thaliana. bioRxiv. , (2020).
- Laha, D., et al. Inositol Polyphosphate Binding Specificity of the Jasmonate Receptor Complex. Plant Physiology. 171 (4), 2364-2370 (2016).
- Dong, J. S., et al. Inositol Pyrophosphate InsP(8) Acts as an Intracellular Phosphate Signal in Arabidopsis. Molecular Plant. 12 (11), 1463-1473 (2019).
- Zhu, J., et al. Two bifunctional inositol pyrophosphate kinases/phosphatases control plant phosphate homeostasis. Elife. 8, (2019).
- Couso, I., et al. Synergism between Inositol Polyphosphates and TOR Kinase Signaling in Nutrient Sensing, Growth Control, and Lipid Metabolism in Chlamydomonas. Plant Cell. 28 (9), 2026-2042 (2016).
- Ito, M., et al. Hydrophilic interaction liquid chromatography-tandem mass spectrometry for the quantitative analysis of mammalian-derived inositol poly/pyrophosphates. Journal of Chromatography A. 1573, 87-97 (2018).
- Wilson, M. S. C., Saiardi, A. Inositol Phosphates Purification Using Titanium Dioxide Beads. Bio-Protocol. 8 (15), (2018).
- Loss, O., Azevedo, C., Szijgyarto, Z., Bosch, D., Saiardi, A. Preparation of Quality Inositol Pyrophosphates. Jove-Journal of Visualized Experiments. (55), e3027 (2011).
- Harmel, R. K., et al. Harnessing C-13-labeled myo-inositol to interrogate inositol phosphate messengers by NMR Electronic supplementary information (ESI) available. Chemical Science. 10 (20), 5267-5274 (2019).
- Azevedo, C., Saiardi, A. Extraction and analysis of soluble inositol polyphosphates from yeast. Nature Protocols. 1 (5), 2416-2422 (2006).
- Shears, S. B. Inositol Phosphates: Methods and Protocols. Miller, G. J. , Springer US. 1-28 (2020).
- Wilson, M. S. C., Saiardi, A. Importance of Radioactive Labelling to Elucidate Inositol Polyphosphate Signalling. Topics in Current Chemistry. 375 (1), (2017).
- Stevenson-Paulik, J., et al. Inositol phosphate metabolomics: Merging genetic perturbation with modernized radiolabeling methods. Methods. 39 (2), 112-121 (2006).
- Liu, C., Riley, A. M., Yang, X., Shears, S. B., Potter, B. V. L. Synthesis and Biological Activity of d- and l-chiro-Inositol 2,3,4,5-Tetrakisphosphate: Design of a Novel and Potent Inhibitor of Ins(3,4,5,6)P4 1-Kinase/Ins(1,3,4)P3 5/6-Kinase. Journal of Medicinal Chemistry. 44 (18), 2984-2989 (2001).
- Hughes, P. J., Hughes, A. R., Putney, J. W., Shears, S. B. The regulation of the phosphorylation of inositol 1,3,4-trisphosphate in cell-free preparations and its relevance to the formation of inositol 1,3,4,6-tetrakisphosphate in agonist-stimulated rat parotid acinar cells. Journal of Biological Chemistry. 264 (33), 19871-19878 (1989).
- Shears, S. B., Kirk, C. J., Michell, R. H. The pathway of myo-inositol 1,3,4-trisphosphate dephosphorylation in liver. The Biochemical journal. 248 (3), 977-980 (1987).
- Stevenson-Paulik, J., Odom, A. R., York, J. D. Molecular and Biochemical Characterization of Two Plant Inositol Polyphosphate 6-/3-/5-Kinases. Journal of Biological Chemistry. 277 (45), 42711-42718 (2002).
- Stephens, L. R., Hawkins, P. T., Downes, C. P. An analysis of myo-[3H]inositol trisphosphates found in myo-[3H]inositol prelabelled avian erythrocytes. The Biochemical journal. 262 (3), 727-737 (1989).
- Saiardi, A., et al. Mammalian inositol polyphosphate multikinase synthesizes inositol 1,4,5-trisphosphate and an inositol pyrophosphate. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98 (5), 2306 (2001).
- Azevedo, C., Burton, A., Bennett, M., Onnebo, S. M. N., Saiardi, A. Inositol Phosphates and Lipids: Methods and Protocols. Barker, C. J. , Humana Press. 73-85 (2010).
- Saiardi, A., Caffrey, J. J., Snyder, S. H., Shears, S. B. The Inositol Hexakisphosphate Kinase Family: CATALYTIC FLEXIBILITY AND FUNCTION IN YEAST VACUOLE BIOGENESIS. Journal of Biological Chemistry. 275 (32), 24686-24692 (2000).
- Brearley, C. A., Hanke, D. E. Inositol phosphates in the duckweed Spirodela polyrhiza L. Biochemical Journal. 314, 215-225 (1996).
- Pollard, J. K., Steward, F. C., Shantz, E. M. Hexitols in Coconut Milk - Their Role in Nurture of Dividing Cells. Plant Physiology. 36 (4), 492 (1961).
- Donahue, J. L., et al. The Arabidopsis thaliana Myo-inositol 1-phosphate synthase1 gene is required for Myo-inositol synthesis and suppression of cell death. Plant Cell. 22 (3), 888-903 (2010).
- Desfougeres, Y., Wilson, M. S. C., Laha, D., Miller, G. J., Saiardi, A. ITPK1 mediates the lipid-independent synthesis of inositol phosphates controlled by metabolism. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (49), 24551-24561 (2019).
