Summary
Aqui descrevemos a forte cromatografia líquida de alta performance de [3H]- mio-inositol-labelelings que é um método altamente sensível para detectar e quantificar polifosfatos inositol em plantas.myo
Abstract
Os ésteres fosfatos do mio-inositol, também denominados fosfatos inositol (InsPs), são uma classe de reguladores celulares desempenhando papéis importantes na fisiologia vegetal. Devido à sua carga negativa, baixa abundância e suscetibilidade às atividades hidrolíticas, a detecção e quantificação dessas moléculas é desafiadora. Este é particularmente o caso de formas altamente fosfoiladas contendo ligações difosfo 'de alta energia', também denominadas pirofosfatos inositol (PP-InsPs). Devido à sua alta sensibilidade, a forte cromatografia líquida de alto desempenho (SAX-HPLC) de plantas rotuladas com [3H]-myo-inositol é atualmente o método de escolha para analisar essas moléculas. Usando [3H]-myo-inositol para radiolabel planta mudas, várias espécies insP incluindo vários isômeros não-etéreoricos podem ser detectados e discriminados com alta sensibilidade. Aqui, descreve-se a configuração de um sistema SAX-HPLC adequado, bem como o fluxo de trabalho completo desde o cultivo da planta, a rotulagem de radiolabeling e a extração insP até a execução sax-HPLC e a análise subsequente de dados. O protocolo aqui apresentado permite a discriminação e quantificação de várias espécies do InsP, incluindo vários isômeros não enantióricos e das PP-InsPs, InsP7 e InsP8, e pode ser facilmente adaptado a outras espécies vegetais. Como exemplos, são realizadas e discutidas análises sax-HPLC de arabidopsis thaliana e lotus japonicus e perfis insP completos são apresentados e discutidos. O método aqui descrito representa uma ferramenta promissora para entender melhor os papéis biológicos dos InsPs nas plantas.
Introduction
Há quase quatro décadas, fosfatos inositol (InsPs) emergiram como moléculas de sinalização, depois que o Ins(1,4,5)P3 (InsP3) foi identificado como um segundo mensageiro que ativa a liberação mediada por receptores de Ca2+ em células animais1,,2. Até o momento, nenhum receptor InsP3 (IP3-R) foi identificado nas plantas, o que questiona um papel de sinalização direta para o InsP3 nas células vegetais3. Independentemente disso, o INSP3 serve como precursor para outros InsPs envolvidos em diversos processos de desenvolvimento de plantas, incluindo a regulamentação de vias de sinalização específicas3,,4,,5,,6,,7,,8. Por exemplo, o InsP3 pode ser ainda mais fosfoilado ao InsP6, também conhecido como "ácido fítico", que representa uma grande fonte de fosfato, mio-inositol e cáations, e foi mostrado para desempenhar papéis-chave na defesa vegetal contra patógenos, exportação de mRNA e homeostase fosfato5,9,,10,11,12.
Pirofosfatos inositol (PP-InsPs) são uma classe de InsPs que contêm pelo menos uma ligação di-fosfo de alta energia, inicialmente identificada em células animais, ameba e levedura, onde desempenham papéis críticos em diversos processos celulares13,,14,,15. Apesar do trabalho seminal em PP-InsPs nas plantas16,,17,,18,,19,20,21,22,23,,24,,25,,26,as funções biológicas e a identidade isômera dessas moléculas ainda permanecem em grande parte enigmáticas. Na planta modelo Arabidopsis thaliana, o InsP8 celular foi proposto para regular defesas contra herbívoros de insetos e fungos necrotróficos através da detecção de coincidência do InsP8 e jasmonato ativo pelo complexo receptor ASK1-COI1-JAZ17. Além disso, foram propostos papéis do INSP8 e de outras PP-InsPs em homeostase energética e sensoriamento de nutrientes, bem como homeostase fosfato17,23,24,,25,26.
Independentemente do sistema biológico empregado, um grande desafio metodológico ao estudar insPs tem sido a detecção confiável e quantificação precisa dessas moléculas. Métodos baseados em espectrometria de massa têm sido usados para detectar InsPs, incluindo PP-InsPs, a partir de extratos celulares. No entanto, esses estudos não conseguiram diferenciar isômeros distintos26,27. Outra abordagem para analisar o InsPs emprega a retirada de InsPs de lises celulares usando contas TiO2, seguida de eletroforese de gel de poliacrilamida (PAGE) dos InsPs elucidos. Os InsPs podem então ser manchados por azul toluidina ou DAPI24,28,29. No entanto, até agora não é possível detectar insPs de forma confiável inferior ao InsP5 a partir de extratos vegetais usando este método. Recentemente, um método queutilizavaa análise de ressonância magnética nuclear (RMR) de ressonância magnética nuclear (RMN) foi publicado como alternativa à forte cromatografia líquida de alto desempenho (SAX-HPLC)30.myo Esta técnica tem sido relatada para alcançar uma sensibilidade semelhante em relação ao SAX-HPLC e permitir a detecção de 5-InsP7, bem como a discriminação de diferentes isômeros insp5 não enantiomericos de extratos celulares. No entanto, a implementação do método baseado em RMN requer quimicamente sintetizado e comercialmente não disponível [13C]-myo-inositol. Portanto, o método empregado na maioria dos casos é a radiolabelagem de amostras com [3H]-myo-inositol, seguido por SAX-HPLC31,32,33. Esta técnica baseia-se na myoabsorção de mio-inositol radioativo na planta e sua conversão em diferentes InsPs pela atividade combinada de quinases celulares dedicadas e fosfattases.
Os InsPs com etiqueta de3H são então extraídos com ácido e fracionados usando SAX-HPLC. Devido à sua carga negativa, os InsPs interagem fortemente com a fase estacionária positivamente carregada da coluna SAX-HPLC e podem ser elucidadas com um gradiente tampão contendo concentrações crescentes de fosfato para superar InsPs da coluna. Assim, os tempos de eluição dependem da carga e geometria das espécies insp a serem separadas. Na ausência de colunas quirais, apenas isômeros não enantióricos podem se separar por este protocolo. No entanto, os padrões de radiolabeled podem ser usados para atribuir a natureza isomeric de um pico insp específico. Múltiplos esforços no passado por vários laboratórios para gerar padrões rotulados e não rotulados com métodos (bio)químicos ou para purificá-los de várias células e organismos ajudaram a atribuir picos a determinadas espécies insP, e também reduzir a identidade isomerica das espécies insp individuais5,,7,21,34,35,36,37,38,,39,40,,41,42,43. Além disso, a recente elucidação de vias enzimáticas que levam à formação de PP-InsPs nas plantas, bem como a descoberta de um efeito bacteriano tipo III com uma atividade específica de 1-phytase, fornecem informações sobre como gerar padrões úteis para essas análises10,,17,,18,,22,,23.
As frações resultantes podem ser medidas em um contador de cintilação líquida devido à β-decadência do trítio(3H). Com o aumento do tempo de rotulagem, é alcançado um equilíbrio isotópico de estado estável, após o qual os perfis insP obtidos devem representar o status insP da planta31. A maior vantagem deste protocolo em comparação com outras técnicas disponíveis é a alta sensibilidade alcançada pelo uso do precursor direto para InsPs e a medição de um sinal radioativo.
Sax-HPLC de amostras extraídas de [3H]- plantas rotuladas de mio-inositol ou outros organismos é comumente usado para a detecção e quantificação de InsPs que vão desde espécies insP mais baixas até PP-InsPs, representando uma ferramenta valiosa para entender melhor o metabolismo, função e modos de ação do InsPs.myo Até agora, este método também é a escolha mais apropriada para pesquisadores com especial interesse em espécies insP mais baixas. Embora o básico deste procedimento, no qual o protocolo aqui descrito se baseia, tenha sido previamente descrito7,21,31,34, um protocolo detalhado adaptado à análise de InsPs derivados de plantas e especialmente de PP-InsPs ainda está faltando. Publicações anteriores relataram dificuldades para detectar de forma confiável as PP-InsPs baixas abundantes, especialmente o InsP8,devido a um ou mais dos seguintes fatores: quantidades relativamente baixas de material vegetal, [3H]-myo-inositol com baixa atividade específica (> 20 Ci/mmol), uso de buffers de extração que não são baseados em ácido polemónico ou são menos concentrados que 1 M, diferentes tampões neutralizantes, bem como gradientes sub-ideais ou detecção de [3H] com um detector on-line. Em comparação com esses estudos, o protocolo aqui apresentado destina-se à detecção confiável das PP-InsPs7,,21,34.
Aqui apresentamos um fluxo de trabalho detalhado, desde a configuração do equipamento até o cultivo e rotulagem da planta, extração insP e o próprio SAX-HPLC. Embora o método tenha sido otimizado para a planta modelo A. thaliana,ele pode ser facilmente modificado para estudar outras espécies vegetais, como mostrado aqui com o perfil insP relatado pela primeira vez do modelo leguminosa Lotus japonicus. Embora o uso de uma espécie de planta diferente possa exigir alguma otimização, prevemos que elas serão menores, tornando este protocolo um bom ponto de partida para novas pesquisas em InsPs vegetais. Para facilitar possíveis otimizações, indicamos cada passo dentro do protocolo em que as modificações são possíveis, bem como todas as etapas críticas que podem ser desafiadoras ao estabelecer o método pela primeira vez. Além disso, relatamos como os dados obtidos por este método podem ser utilizados para a quantificação de InsPs específicos e como diferentes amostras podem ser analisadas e comparadas.
Protocol
1. Configuração do sistema HPLC
- Configure um sistema composto por duas bombas HPLC independentes (bomba binária), uma para cada buffer. Ambas as bombas precisam ser controladas juntas através de um computador com o respectivo software ou por ter uma bomba mestre. Implemente uma lavagem de vedação de pistão para ambas as bombas, seja via força gravitacional ou através de uma terceira bomba de baixa pressão. Designe uma bomba para tampão A (bomba A denominada) e outra para tampão B (bomba B denominada B).
NOTA: Ambos devem ser capazes de gerar pressões de até 60 bar (6 MPa) e taxas de fluxo de pelo menos 0,5 mL/min. - Conecte ambas as bombas a um misturador dinâmico.
- Conecte a batedeira a uma válvula de injeção com um laço amostral de pelo menos 1 mL de capacidade.
- Conecte a válvula de injeção à coluna com um capilar através dos encaixes finais correspondentes.
- Conecte a coluna ao coletor de frações usando um capilar com um comprimento apropriado.
NOTA: Esta descrição é baseada no nosso sistema HPLC (ver a Tabela de Materiais),que requer mais etapas manuais do que sistemas mais novos e mais sofisticados. Nosso sistema permite fácil acesso e modificação de todos os componentes. As bombas quaternárias (com o gradiente binário descrito aqui) também podem ser utilizadas e levarão a perfis de elução e qualidade geral das análises semelhantes às obtidas com bombas binárias.
2. Preparação de buffers, coluna e sistema HPLC
- Preparem os buffers para a extração de InsPs solúveis: tampão de extração (1 M HClO4) e tampão de neutralização (1 M K2CO3). Prepare os dois tampões com água deionizada ultra-pura. Eles estão estáveis à temperatura ambiente por vários meses. Imediatamente antes da extração, adicione EDTA a ambas as soluções a uma concentração final de 3 mM (por exemplo, a partir de uma solução filtrada de estoque EDTA de 250 mM).
ATENÇÃO: O HClO4 (ácido polemóico) é fortemente corrosivo. - Prepare os buffers para a corrida SAX-HPLC: tampão A (1 mM EDTA) e tampão B (1 mM EDTA, 1,3 M (NH4)2HPO4; pH 3.8 com H3PO4). Prepare ambos usando água deionizada ultra-pura seguida de filtragem de vácuo com filtros de membrana do tamanho de poros de 0,2 μm. Estes estão estáveis à temperatura ambiente por vários meses.
NOTA: O EDTA deve ser incluído em todos os buffers para evitar interações de caations com InsPs, o que pode resultar em alteração da carga insP ou mesmo complexos de sal InsP insolúveis. - Programe o gradiente da seguinte forma: 0\u20122 min, 0% tampão B; 2\u20127 min, até 10% tampão B; 7\u201268 min, até 84% tampão B; 68\u201282 min, até 100% tampão B; 82\u2012100 min, 100% tampão B, 100\u2012101 min, até 0% tampão B; 101\u2012125 min, 0% tampão B. A taxa de fluxo ideal para este gradiente é de 0,5 mL/min.
- Durante a corrida, colete frações a cada minuto, começando do minuto 1 ao minuto 96. Os 30 minutos restantes do gradiente servem para lavar a coluna e o sistema, e não devem ser coletados para a contagem de cintilação.
- Se possível, defina a pressão máxima alcançável antes do desligamento de emergência das bombas HPLC para 80 bar (8 MPa). Isso evita danos críticos à resina da coluna.
- Ao usar uma nova coluna SAX HPLC, lave-a bem (>50 mL) com água deionizada ultra-pura filtrada antes do primeiro uso.
NOTA: Isso garantirá a remoção do metanol contido, evitando assim a precipitação do sal em etapas posteriores. Se possível, use uma bomba HPLC separada. Se isso não estiver disponível, certifique-se de que o HPLC tenha lavado com água antes de lavar a coluna. A vazão não deve exceder 2 mL/min. Após a lavagem, a coluna está pronta para a análise e, quando manuseada corretamente, pode ser usada para 20\u201240 runs. Depois disso, a resolução diminuirá sucessivamente. Lavagem prolongada com tampão A (>1 h) e realizar a etapa 2.6 podem ajudar a aumentar a vida útil da coluna. Se a diminuição da resolução persistir, a coluna precisa ser trocada. O gradiente pode ser ajustado para aumentar a separação entre espécies específicas de polifosfato inositol ou para diminuir o tempo de execução geral. O uso de diferentes sistemas HPLC (com volume vazio diferente ou volume diferente dos capilares) afetará fortemente os tempos de retenção. Além disso, as alterações de coluna têm efeitos menores nos tempos de retenção. - Faça uma "corrida simulada". Em vez de uma amostra extraída, injete água deionizada ultra-pura filtrada no sistema HPLC e execute o gradiente padrão. As frações não devem ser coletadas.
NOTA: A etapa 2.6 é opcional. No entanto, deve ser realizado se uma das seguintes situações se aplicar: Uma nova coluna é instalada; O sistema HPLC foi usado para um método diferente de antemão; O sistema HPLC não é usado há mais de 3 dias; Houve um problema com a corrida anterior.
3. Cultivo e rotulagem vegetal com [3H]-myo-inositol
NOTA: As seguintes etapas devem ser realizadas com componentes estéreis e em condições estéreis,enquanto usam luvas para proteger as mãos da contaminação com o rótulo de rádio. Os meios vegetais, especialmente quando contêm sacarose, são propensos à contaminação microbiana.
- Esterilizar as sementes de A. thaliana com 1 mL de hipoclorito de sódio de 1,2% por 3 min seguidos por 1 mL de 70% de etanol por 3 min. Em seguida, adicione 1 mL de 100% de etanol, pipeta as sementes com o etanol em um papel filtro circular e deixe-as secar no ar sob um fluxo laminar em um banco limpo.
- Ao usar sementes L. japonicus, coloque-as em uma argamassa e esfregue sementes com lixa antes da esterilização para garantir uma taxa de germinação suficiente.
- Semear sementes de Arabidopsis em 1-2 linhas em pratos de Petri quadrados cheios de mídia de crescimento sólido consistindo de meia-força murashige e skoog (MS) solução salgada, 1% de sacarose, 0,7% de goma de gellan em água deionizada ajustada para pH 5.7 com KOH e permitir que eles estratifiquem por pelo menos 1 dia a 4 °C no escuro.
- Para as sementes de Lótus, semeie-as em uma fileira em pratos de Petri quadrados cheios de mídia de crescimento sólido consistindo de 0,8% de ágar bacteriológico em água desionizada e permitem que elas estratifiquem por pelo menos 3 dias a 4 °C no escuro.
- Coloque as placas verticalmente em uma incubadora de crescimento ou câmara climática e permita que elas cresçam por 10 a 12 dias em condições de curto prazo (luz de 8h a 22 °C, 16h escura a 20 °C).
- Transfira 10-20 mudas para um poço de uma placa de cultura de célula de fundo plano de 12 bem clara preenchida com 2 mL de solução de sal MS de meia resistência complementada com 1% de sacarose e ajustada para pH 5.7.
- Adicione 45 μCi de [3H]-myo-inositol (30-80 Ci/mmol, dissolvido em 90% de etanol) e misture por redemoinho suave. Cubra a placa com a tampa correspondente e seque-a com fita cirúrgica microporosa (por exemplo, micropore ou fita leucopore), colocando-a de volta na incubadora de crescimento.
ATENÇÃO: [3H] é um emissor beta de baixa energia que pode ser um risco de radiação prejudicial quando inalado, ingerido ou absorvido através da pele nua. Use sempre luvas ao manusear material ou equipamento radioativo que tenha contato direto ou indireto com material radioativo. Siga também as regras locais para o manuseio seguro de radioquímicos (por exemplo, usando roupas de proteção adicionais, uso de um dosímetro e levantamentos de superfícies para contaminações regularmente). - Após 5 dias de rotulagem, remova as mudas da mídia e lave-as brevemente com água deionizada. Seque-os com toalhas de papel e transfira-as para um tubo de microcentrifutura de 1,5 mL. Não enchee demais o tubo e coloque não mais do que 100 mg FW/tube, o que corresponde a aproximadamente 10\u201220 mudas de 17 dias de idade.
NOTA: Um excesso de material vegetal diluirá o ácido durante o processo de extração e diminuirá fortemente a eficiência de extração.- Congele o tubo em nitrogênio líquido e armazene-o a -80 °C até a extração.
NOTA: As amostras podem ser mantidas a -80 °C por várias semanas sem comprometer a qualidade da amostra. As condições de crescimento (mídia, luz, temperatura, tempo) podem ser modificadas de acordo com as necessidades de um experimento específico ou espécies vegetais. No entanto, deve-se tomar cuidado ao diluir o [3H]-myo-inositol, a fim de garantir corridas de SAX-HPLC quantificáveis de boa qualidade. Portanto, recomenda-se começar com as concentrações de myo-inositol de3H, aqui indicadas e reduzi-la stepwise, se desejar.myo Durante o período de rotulagem, as plantas podem ser submetidas a diferentes tratamentos (por exemplo, estresses ambientais ou agentes químicos) para avaliar o impacto dessas condições nos InsPs globais. Para alcançar a rotulagem de estado estável, recomendamos rotular plantas por pelo menos 5 dias.
- Congele o tubo em nitrogênio líquido e armazene-o a -80 °C até a extração.
4. Extração de InsPs solúveis
NOTA: Mantenha amostras e reagentes no gelo durante todo o processo de extração. Use sempre luvas e óculos de proteção devido ao alto risco de contato com material radioativo, especialmente durante a moagem. Tudo o que entra em contato com as amostras é considerado como lixo radioativo e deve ser descartado de acordo com as regras locais para descarte seguro de material radioativo.
- Prepare as soluções de trabalho para o buffer de extração e neutralização como na etapa 2.1. Cada amostra exigirá 600 μL de tampão de extração e 400 μL de tampão de neutralização. Guarde os buffers no gelo.
- Pegue as amostras do congelador de -80 °C e mantenha-as em nitrogênio líquido até que sejam processadas. Triture as amostras com um pilão de tubo de microcentrifuge até que comecem a descongelar e adicione 500 μL de tampão de extração gelada. Continue moendo até que a amostra esteja completamente homogeneizada e a solução tenha uma cor verde profunda (se as folhas estiverem presentes na amostra).
- Centrifugar as amostras por 10 min a 4 °C a ≥ 18000 x g. Transfira o supernatante para um tubo fresco de 1,5 mL. Tenha em mente que os tubos utilizados para extração são considerados resíduos radioativos sólidos e precisam ser descartados em conformidade.
-
Adicione cuidadosamente 300 μL de tampão de neutralização ao extrato. A precipitação de proteínas e borbulhamento começará imediatamente. Misture girando com uma ponta de pipeta após um minuto e espere por alguns segundos antes de pipetar uma pequena quantidade (5 μL) em papel pH (idealmente faixa de pH 6-9). O pH deve ser entre pH 7 e 8 no final.
- Se necessário, adicione pequenas quantidades (tipicamente de 10 a 20 μL) de tampão de neutralização ou tampão de extração até que o pH desejado seja atingido. Deixe as amostras descansarem no gelo por pelo menos 1h com uma tampa aberta.
- Centrifugar as amostras por 10 min a 4 °C a ≥ 18.000 x g. Transfira o supernatante para um tubo fresco de 1,5 mL.
NOTA: As amostras podem ser usadas diretamente em uma corrida SAX-HPLC ou mantidas no gelo (se usadas mais tarde no mesmo dia) ou congeladas em nitrogênio líquido e armazenadas a -80 °C por 2\u20124 semanas. Para garantir uma alta reprodutibilidade e comparabilidade, recomenda-se congelar sempre as amostras em nitrogênio líquido por 5 minutos, mesmo que sejam usadas diretamente depois. O armazenamento a longo prazo de amostras extraídas a -80 °C é possível desde que as amostras só sejam descongeladas uma vez. Se as amostras congeladas forem usadas para a análise, certifique-se de que nenhuma partícula seja visível após o descongelamento. Caso contrário, centrífuga novamente por 10 min a 4 °C a ≥ 18.000 x g e transfira o supernante para um tubo fresco de 1,5 mL.
5. Executando a execução do HPLC
- Equipar o coletor de frações com 96 pequenos frascos de cintilação (capacidade de ~6 mL) e encher cada frasco com 2 mL de um coquetel de cintilação adequado (por exemplo, coquetel de cintilação líquida Ultima-Flo AP) compatível com tampões com pH baixo e alta concentração de fosfato de amônio (ver Tabela de Materiais).
NOTA: O número de frascos e o tamanho dos frascos dependem do coletor de frações e do contador de cintilação utilizados. É importante pelo menos coletar as primeiras 90 frações,se o gradiente descrito aqui for utilizado, para obter um perfil completo de polifosfato inositol. Certifique-se também de rotular adequadamente cada frasco e sua respectiva tampa, para evitar a mistura de frações ou amostras. - Inicie o sistema/bombas HPLC e tenha-no pronto para funcionar. Ative a lavagem da vedação do pistão e mantenha-a ativada durante toda a execução. Carregue a amostra injetando manualmente o supernanato completo a partir da etapa 4.5 (aproximadamente 750 μL) usando uma seringa adequada (ver Tabela de Materiais). Se for possível a injeção automática, transfira a amostra para o frasco de amostra correspondente. Gire a válvula de "carga" para "injetar" posição e inicie o gradiente e o coletor de frações.
NOTA: Dependendo do sistema HPLC utilizado, o procedimento de partida pode ser diferente, especialmente quando comparado com sistemas mais antigos (como descrito aqui) com um modelo mais recente totalmente controlado por software. É muito importante garantir que o gradiente, a injeção de amostra e a coleta de frações comecem simultaneamente. - Enquanto a corrida do HPLC estiver em andamento, verifique a pressão regularmente. A pressão inicial deve ser em torno de 18-24 bar (1.8-2.4 MPa) e deve subir lentamente para 50-60 bar (5-6 MPa) uma vez que 100% tampão B é atingido.
ATENÇÃO: A diminuição da pressão pode indicar um vazamento no sistema, enquanto o aumento da pressão indica um bloqueio. Flutuações de pressão (≥ 3 barras em poucos segundos) podem indicar a presença de ar no sistema. Tenha em mente que tudo o que sai da coluna, bem como cada vazamento que ocorre no injetor ou posteriormente é radioativo.
NOTA: A pressão também depende do sistema HPLC e pode ser menor ou maior do que aqui indicada. Ele aumentará lentamente depois de aproximadamente 15-20 corridas. No entanto, isso não influencia necessariamente a qualidade das corridas obtidas. - Após a corrida, feche bem os frascos e misture as frações com o coquetel de cintilação por um tremendo vigoroso. Proceda diretamente com a medição ou mantenha os frascos em uma posição vertical, idealmente no escuro.
NOTA: As frações misturadas com coquetel de cintilação são estáveis por semanas e podem ser medidas posteriormente. Como a meia-vida do trítio é de 12,32 anos, a perda de sinal é insignificante. - Uma vez que a execução da última amostra do dia esteja concluída, pare ambas as bombas HPLC.
- (Opcional) Para aumentar a longevidade do sistema, especialmente quando ele não é usado regularmente, lave a bomba B e os capilares colocando o capilar do tampão B em uma garrafa com tampão A e deixe a bomba funcionar por 10-15 min. Antes do próximo uso, lembre-se de substituir o capilar no tampão B e de desacoplar a bomba B da batedeira para lavá-la com o tampão B. Uma vez que a bomba e os capilares estejam preenchidos novamente com o buffer B, reconecte-o com a batedeira e o sistema esteja pronto para usar.
6. Medir as frações
- Insira os frascos em racks de contador de cintilação e meça cada frasco por 5 minutos em um contador de cintilação líquida.
- O ideal é usar racks que se encaixem diretamente em frascos pequenos e evitar pendurar nos frascos em frascos maiores (por exemplo, 20 mL) para reduzir os erros de contagem. As configurações de software utilizadas neste protocolo são mostradas na Figura Suplementar 1.
NOTA: Realize regularmente um protocolo SNC (auto-normalização e calibração) usando padrões não saciados [3H]. Tempos de contagem mais curtos (1-5 min) são possíveis para reduzir o tempo de espera. No entanto, para garantir uma reprodutibilidade e precisão de alta contagem, 5 min são recomendados.
7. Análise de dados
- Exporte as medidas do contador de cintilação como um arquivo de planilha ou um formato de arquivo compatível/conversível. Avalie os dados com um computador equipado com Excel ou software semelhante, e um software de análise adequado como o Origin.
- Prepare um gráfico de linha 2D onde as contagens medidas por minutos (cpm) são traçadas contra o tempo de retenção (ver Figura 1, Figura 2).
- Para comparar amostras entre si, normalize os dados somando o cpm de cada fração eluvada do minuto 25 ao 96 para cada amostra individual.
NOTA: O minuto 25 é usado como corte para excluir não incorporados [3H]-myo-inositol, InsP1 e InsP2 da análise, pois esses tendem a flutuar fortemente e não podem ser bem separados (pelo menos com o gradiente proposto neste protocolo) e, portanto, alterar fortemente o fator de normalização devido à sua alta atividade. - Normalize todos os dados para a amostra com o menor cpm total (em frações 25\u201296) dividindo o cpm total da amostra com o cpm menor (em frações 25-96) pelo cpm total (em frações 25-96) das demais amostras. O fator resultante pode então ser usado para normalizar o cpm de cada fração multiplicando o cpm de cada fração com o fator.
NOTA: No final, a soma dos valores do CPM do minuto 25 até o final deve ser igual para todas as amostras em comparação entre si. Apenas as corridas normalizadas devem ser apresentadas no mesmo gráfico/figura (quando apresentadas como perfis reais). A Figura Suplementar 2 mostra um exemplo de como essas etapas de cálculo são feitas (usando apenas frações 25-35 de duas amostras para simplificação). No entanto, em alguns casos não é necessário normalizar os dados. Por exemplo, quando os picos são quantificados de acordo com a etapa 7.4 e apresentados como percentuais do total de InsPs (como mostrado na Figura 3D). Como dito anteriormente, ao apresentar múltiplas análises lado a lado como perfis, ou quando a atividade medida real é utilizada para conclusões (por exemplo, tratamento a) aumenta o InsP7 por x% em relação ao controle, referindo-se aos valores do CPM de InsP7 de ambas as amostras e não ao seu percentual de normalização total do InsPs. Para analisar o efeito das diferenças genótipos ou de tratamento na eficiência da rotulagem, é importante não normalizar,pois isso invalidaria essas diferenças. No entanto, a quantificação absoluta com este método é desafiadora porque a eficiência de extração com este protocolo pode ser variável por várias razões e às vezes são até observadas quando réplicas do mesmo genótipo e tratamento são analisadas. Tenha em mente que, dependendo do sistema HPLC, coluna e gradiente utilizados para as análises, o corte pode precisar ser alterado. - Para realizar quantificações relativas de certos picos de polifosfato inositol e, posteriormente, criar gráficos de barras que contenham dados de replicações para análises estatísticas, continue a análise com um software especializado que possa calcular áreas de pico de cromatógramas (por exemplo, Origem). Ver Figura Suplementar 3.
NOTA: A maioria dos sistemas HPLC controlados por software são fornecidos com um software respectivo capaz dessa tarefa. Os picos são determinados como as frações com valores cpm acima do plano de fundo (que variam a um certo grau entre as corridas) e os tempos de retenção semelhantes aos dados publicados anteriormente. O tempo de retenção de um pico específico é determinado em software de planilha (por exemplo, Excel) e usado para atribuir picos para cálculo de integrais definidas (por exemplo, em Origem). Figura Suplementar 3 ilustra esse processo de determinação de pico, subtração de fundo e integração de picos.
Representative Results
Os resultados aqui apresentados visam ilustrar possíveis desfechos obtidos de acordo com variações nos níveis técnico e biológico. A primeira é exemplificada por análises utilizando colunas novas versus envelhecidas(Figura 1) e amostras frescas versus armazenadas(Figura 3),e a segunda pela avaliação de extratos de dois sistemas vegetais diferentes, A. thaliana (Figura 1, Figura 3) e L. japonicus (Figura 2).
Uma execução SAX-HPLC ideal é retratada na Figura 1A\u2012C,que mostra um espectro de polifosfato inositol completo obtido a partir de extratos de A. thaliana após a contagem de cintilação. Observe que os picos são bem separados e podem ser atribuídos a diferentes isômeros (ou pares de enantiomer) com base em mobilidades cromatográficas descritas anteriormente5,,7.
A Figura 2 mostra o resultado representativo de uma análise sax-hplc das mudas L. japonicus que foram cultivadas e rotuladas nas mesmas condições das mudas arabidopsis. Embora, presumivelmente, todas as espécies insp e picos que são conhecidos a partir de Arabidopsis possam ser vistos, há diferenças substanciais em relação à quantidade relativa (por exemplo, entre isômeros isômeros específicos do InsP), ao comparar os perfis de ambas as espécies. Por exemplo, os extratos de Lótus apresentaram aumento do InsP3c, InsP4b, InsP5b e reduzido InsP3a, InsP4a,InsP5a e InsP5c em comparação com Arabidopsis, o que deixa espaço para novas investigações. A Figura 2D ilustra as diferentes proporções entre isômeros insp entre Arabidopsis e Lotus.
A Figura 3 mostra dois perfis insp de uma amostra que foi dividida após a extração. O primeiro tempo foi imediatamente analisado e o segundo tempo um dia depois, após armazenamento a -80 °C. Observe que apenas pequenas diferenças são observadas entre as diferentes amostras (ou seja, linhas pretas e vermelhas na Figura 3A\u2012C, e Figura 3D). Isso ilustra que um ciclo de congelamento não prejudica a amostra e que o próprio método gera resultados reprodutíveis.
Figura 1: Perfil típico do InsP de uma análise sax-HPLC mal sucedida realizada com este protocolo. (A\u2012C) Perfil SAX-HPLC de 17 dias de idade wild-type (Col-0) mudas arabidopsis radiolabeled com [3H]-myo-inositol. A extração global do INSP e a execução do SAX-HPLC foram realizadas no mesmo dia. (A) Espectro completo; (B, C) Zoom-ins do perfil mostrado em A. Todos os picos visíveis são destacados e atribuídos às espécies insp correspondentes. Com base nas mobilidades cromatográficas publicadas5,7, InsP4a provavelmente representa Ins(1,4,5,6)P4 ou Ins(3,4,5,6)P4, InsP5a representa InsP5 [2-OH], InsP5b representa InsP5 [4-OH] ou sua forma enantiomerica InsP5 [6-OH], e InsP5c representa InsP5 [1-OH] ou sua forma enantiomerica InsP5 [3-OH]. As naturezas isomeric do InsP3a-c, InsP4b, InsP7e InsP8 ainda são desconhecidas. O painel (D) mostra um perfil SAX-HPLC de plantas cultivadas de forma idêntica, mas usando uma coluna envelhecida (>40 corridas). Uma clara redução do InsP6 em comparação com outras espécies do InsP e a ausência de PP-InsPs é visível. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Perfil representativo do INSP das plantas L. japonicus. Perfil SAX-HPLC (A\u2012C) de 17 dias de idade wild-type (Gifu) L. japonicus mudas radiolabeled com [3H]-myo-inositol. (A) Espectro completo; (B, C) Zoom-ins do perfil mostrado em A. Todos os picos visíveis são destacados e atribuídos às espécies insp correspondentes. Com base nas mobilidades cromatográficas publicadas5,7, InsP4a provavelmente representa Ins(1,4,5,6)P4 ou Ins(3,4,5,6)P4, InsP5b provavelmente representa InsP5 [4-OH] ou sua forma enantiomemérica InsP5 [6-OH], e InsP5c provavelmente representa InsP5 [1-OH] ou sua forma enantiomerica InsP5 [3-OH]. As naturezas isomeric de InsP3a-c, InsP4b, InsP7e InsP8 são desconhecidas. (D) Comparação entre as espécies insp individuais (em % da atividade total da elução 25\u201296) de A. thaliana (dados da Figura 1A\u2012C) e L. japonicus (dados da Figura 2A-C). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Perfis insp de uma amostra dividida ilustrando a reprodutibilidade das análises SAX-HPLC. (A\u2012C) Perfis SAX-HPLC de 17 dias de idade wild-type (Col-0) mudas arabidopsis radiolabeled com [3H]-myo-inositol. Antes da execução, a amostra foi dividida e metade executada imediatamente e a outra metade um dia depois após o armazenamento a -80 °C.(A) Espectro completo; (B, C) Zoom-ins do perfil mostrado em A. Todos os picos visíveis são destacados e atribuídos às espécies insp correspondentes. Com base nas mobilidades cromatográficas publicadas5,7, InsP4a provavelmente representa Ins(1,4,5,6)P4 ou Ins(3,4,5,6)P4, InsP5a representa InsP5 [2-OH], InsP5a representa InsP5 [2-OH], InsP5b representa InsP5 [4-OH] ou sua forma enantiomerica InsP5 [6-OH], e InsP5c representa InsP5 [1-OH] ou sua forma enantiomerica InsP5 [3-OH]. As naturezas isomeric do InsP3a-c, InsP4b, InsP7e InsP8 ainda são desconhecidas. O painel D mostra a quantificação do InsP6 e do INSS7 e do InsP8 de ambas as corridas. Os valores representam a quantidade (em %) das respectivas espécies insP relativas a todas as InsP (atividade total da elução 25-96). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura suplementar 1: Configurações de software para contagem de cintilação líquida usando um contador de cintilação leve. Capturas de tela que mostram a versão do software, bem como configurações usadas para a contagem de cintilação de [3H] amostras realizadas com este protocolo são retratadas. Clique aqui para baixar este número.
Figura Suplementar 2: Exemplo representativo da normalização dos dados. Uma captura de tela de uma planilha mostra todas as etapas e fórmulas usadas para normalizar as corridas do SAX-HPLC entre si. Para simplificação, apenas frações 25-35 de amostras são mostradas. Clique aqui para baixar este número.
Figura suplementar 3: Determinação de pico, subtração de fundo e integração usando software de análise. (A) Os dados da análise SAX-HPLC são carregados no software (minutos 28-96) e a ferramenta de analisador de pico é selecionada. (B\u2012E) A linha de base é definida manualmente por pontos de definição entre picos individuais e o fundo é subtraído. (F) Os picos são determinados manualmente com base na aparência e mobilidades cromatográficas publicadas5,,7. (G) As faixas de pico são definidas manualmente pelos valores do CPM. (H) Os picos são integrados e calculados como % de todos os picos. Clique aqui para baixar este número.
Discussion
Aqui apresentamos um método versátil e sensível para quantificar o InsPs, incluindo PP-InsPs em extratos vegetais e fornecer dicas práticas sobre como estabelecer esse método. Embora o protocolo seja geralmente robusto, corridas e análises subótimas podem ocorrer. Na maioria dos casos, essas corridas podem ser identificadas por uma forte redução ou até mesmo perda completa de InsPs altamente fosforiladas, especialmente as espécies PP-InsP InsP7 e InsP8. As possíveis razões podem ser contaminações microbianas do material vegetal e desativação insuficiente das hidrolases pp-insp da planta endógena durante a extração devido à moagem e degelo insuficientes de material vegetal que não estará em contato imediato com o tampão de extração. Outras razões incluem ajuste de pH impreciso por adição insuficiente ou excessiva de tampão de neutralização, ou simplesmente material amostral insuficiente. Este último pode dificultar a detecção de PP-InsPs, uma vez que muitas vezes estão presentes em quantidades muito baixas nas células. Um excesso de material amostral ou secagem ineficiente durante a etapa 3.5 pode causar diluição do ácido polemóico, levando também à desativação insuficiente da enzima e a uma perda específica de InsP6 e PP-InsPs. A quantidade de material vegetal, bem como o rótulo de rádio utilizado neste protocolo foram otimizados com base em custos e desempenho, e, portanto, é próximo do menor valor que ainda é suficiente para fornecer resultados ótimos. Além disso, a resina da coluna perderá gradualmente sua capacidade de resolução. O primeiro sinal desse processo é (por razões não totalmente claras para os autores) uma perda específica de espécies insp mais fosforiladas como as PP-InsPs no espectro HPLC. Com mais envelhecimento, mesmo o InsP6 não será resolvido adequadamente pela coluna(Figura 1D). Portanto, o uso de uma coluna adequada, bem como o manuseio meticuloso da amostra e a manutenção adequada dos componentes HPLC é crucial para garantir resultados precisos.
Ao comparar amostras e corridas, especialmente quando geradas com diferentes equipamentos (por exemplo, sistemas e colunas HPLC) ou em dias diferentes, é crucial normalizar as amostras umas às outras (conforme descrito na etapa 7.3) e analisá-las da mesma forma. Somente através da normalização é possível e preciso mostrar múltiplas amostras no mesmo gráfico(Figura 3). Para quantificação de InsPs individuais relativos ao InsPs total, ou a outra espécie específica do InsP, não é necessário normalizar, desde que apenas valores relativos e não valores absolutos sejam mostrados. Idealmente, tanto os perfis insP quanto as quantificações são mostrados. No entanto, em alguns casos não é possível mostrar adequadamente duas ou mais corridas no mesmo gráfico. Diferentes tempos de retenção ou diferentes níveis de atividade de fundo podem dificultar a comparação apenas de perfis SAX-HPLC não quantificados. O mesmo é o verdadeiro quando muitas amostras precisam ser comparadas. Nesses casos, é necessária uma nova avaliação usando um software adicional (por exemplo, Origin) para quantificação de pico individual.
Os autores estão cientes de que o protocolo aqui descrito pode ser otimizado e precisa ser adaptado a cada questão de pesquisa individual. Apesar de ser otimizado para extratos arabidopsis 7,17 neste protocolo, este método é versátil e pode ajudar a determinar perfis insP de outras espécies vegetais também. Aqui exemplificamos essa possibilidade apresentando pela primeira vez um perfil insP para L. japonicus, que não exigiu modificações das condições de rotulagem, extração insP ou execução SAX-HPLC(Figura 2). Notavelmente, embora globalmente semelhantes, diferenças são observadas entre os perfis L. japonicus e Arabidopsis InsP. Por exemplo, em L. japonicus InsP5 [4-OH] ou sua forma esantiomerica InsP5 [6-OH] são mais abundantes do que InsP5 [1-OH] ou sua forma estérica InsP5 [3-OH] em comparação com arabidopsis, onde InsP5 [1-OH] ou sua forma enantiomerica InsP5 [3-OH] são as espécies insp5 dominantes. Da mesma forma, prevemos que alterações na composição da mídia, [3H]- concentraçãode mio-inositol, idade vegetal, condições ambientais (por exemplo, luz e temperatura), adição de compostos químicos ou análises de interações vegetais-microbianas, entre outros fatores, podem precisar ser testadas e adaptadas.
Uma desvantagem importante desse método que precisa ser considerado é que a rotulagem é feita em uma cultura líquida (estéril), que não representa um ambiente fisiológico para a maioria das plantas terrestres. Além disso, devido aos altos custos demyo[³H]- myo-inositol, o volume da solução de rotulagem e o tamanho do vaso cultural é geralmente limitado, o que também restringe o tamanho das plantas que podem ser utilizadas. O cultivo na cultura líquida pode ser evitado infiltrando-se diretamente, pormyoexemplo, folhas de plantas cultivadas no solo com [³H]- myo-inositol e, posteriormente, seguindo o protocolo aqui descrito, como relatado anteriormente10.
Existem várias desvantagens deste protocolo em comparação com métodos alternativos, como tiO2 pull-down seguido por técnicas baseadas em PAGE ou espectrometria de massa. Devido à rotulagemdemyo-inositol, apenas as espécies insP que se originam diretamente do myo-inositolradiolabeled serão detectadas no final.myo O método descrito aqui é cego para outros isômeros ins, como scyllo-inositol e outros isômeros alguns dos quais foram identificados em certas plantas44. Além disso, serão excluídos myo-InsPs derivados de outras vias, incluindo aquelas sintetizadas por de novo síntese de mio-inositol e mio-inositol-3-fosfato via isomerização de glicose-6-fosfato, catalisada por proteínas mio-inositol-3-fosfato (MIPS)45. myo Embora [32P] ou [33P]-ortopedia-fosfato possa ser usado como rótulos alternativos, seu uso representa uma grande desvantagem, uma vez que cada molécula contendo fosfato, incluindo os nucleotídeos abundantes e seus derivados, será rotulada. Essas moléculas também podem ser extraídas com este protocolo e se ligam à coluna SAX, o que resultará em um alto nível de atividade de fundo que interferirá na identificação dos picos insp individuais5. Além disso, a quantificação de [32P]- ou [33P] rotulado InsPs e PP-InsPs pode ser fortemente influenciada por fosfato e pifosfato moiety turnover e pode não relatar uma leitura em massa para espécies inositol.
Por outro lado, [3H]-myo-inositol especificamente rotula moléculas contendo mio-inositol. InsPs, lipídios contendo inositol, como fosforinositídeos, e galactinol são, neste caso, rotulados. No entanto, apenas os InsPs serão analisados com este protocolo, uma vez que os lipídios são insolúveis no tampão de extração e o galactinol não se liga à coluna SAX.
Até agora, as diferenças em relação ao perfil insp da planta gerada pela rotulagem inositoldemyo-inositol em comparação com uma determinada por TiO2 pulldown/PAGE permanecem desconhecidas, uma vez que tais comparações não foram realizadas em plantas.myo Um estudo recente em células animais abordou essa questão46. Nesse trabalho, foi identificada uma piscina de InsP6 invisível por [3H]- rotulagem myo-inositol, que deve ser diretamente derivada da glicose-6-fosfato, comparando-se perfis sax-HPLC com géis PAGE de linhas celulares de mamíferos.myo 24 h de fome de fosfato resultou em um aumento de 150% do InsP6 ao quantificar géis PAGE de InsPs purificados usando a retirada de TiO2. As análises sax-HPLC de [3H]-myo-inositol-labels cells que foram tratadas de forma idêntica apenas mostraram um aumento de 15% de [3H]-InsP6. Como mencionado anteriormente, os InsPs inferiores ao InsP5 são indetectáveis com a análise page na maioria dos casos. O radiolabeling seguido pelo SAX-HPLC parece ser o método de escolha, desde que os protocolos espectrométricos de massa não sejam otimizados para detectar esse grupo de moléculas altamente carregadas negativamente.
Outro desafio restante é distinguir os enantiomers nas análises sax-HPLC (ou em qualquer outro método de análise do INSS)10,17. Este desafio pode ser enfrentado pela adição de seletores quiral, ou seja, compostos de enantiopure como L-arginina amide que interagem com as respectivas moléculas egnâneas para formar complexos diastereomericos que podem ser separados10. Pelo que sabemos, essa abordagem só foi implementada para discriminar os isômeros InsP5 e InsP5 [1-OH] e InsP5 [3-OH] pelas análises NMR10. A discriminação de outros pares eantiomericos ou a discriminação bem-sucedida de enantiomers por análise quiral sax-HPLC ou métodos baseados em PAGE quiral ainda não foram relatados e devem ser desenvolvidos. Considerando a síntese conservada e a regulação conservada das PP-InsPs pela disponibilidade de fósforo, imaginamos que especialmente métodos não radioativos, como métodos baseados em PAGE ou MS, juntamente com análises de nutrientes, ajudarão os esforços de veracidade do solo para calibrar dados de sensoriamento remoto projetados para diagnosticar deficiências de nutrientes nas culturas17,,18,,24,,25. No entanto, o método aqui apresentado ainda pode ser considerado o padrão-ouro para análises do INSS e será fundamental para descobrir novas funções desses mensageiros intrigantes nas plantas.
Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pela Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, German Research Foundation) sob a Estratégia de Excelência da Alemanha - EXC-2070 - 390732324 (PhenoRob), o Grupo de Treinamento de Pesquisa GRK2064 e bolsas de pesquisa individuais SCHA1274/4-1 e SCHA1274/5-1 para a G.S.. Agradecemos também li Schlüter e Brigitte Ueberbach por assistência técnica.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Centrifuge | Eppendorf AG | model: 5430 R | |
| Diammonium hydrogen phosphate, ≥97 % | Carl Roth GmbH + Co. KG | 0268.1 | |
| Ethylenediamine tetraacetic acid disodium salt dihydrate, ≥99 %, p.a., ACS | Carl Roth GmbH + Co. KG | 8043.2 | |
| Falcon 12-well clear flat bottom TC-treated multiwell cell culture plate, with lid, individually wrapped, sterile | Corning Inc. | 353043 | |
| Fraction collector | LAMBDA Instruments GmbH | model: OMNICOLL single channel collector | |
| Growth incubator | poly klima GmbH | model: PK 520-LED | |
| HPLC pumps | Kontron Instruments | model: 420 | |
| HPLC syringe for Rheodyne valves, 1 mL | Hamilton Company | 81365 | |
| Injector for HPLC | Supelco | model: Rheodyne 9725 | |
| Inositol, myo-[1,2-3H(N)] | American Radiolabeled Chemicals Inc. | ART 0261 | |
| Liquid nitrogen | University, Chemistry Department | ||
| Liquid scintillation counter | PerkinElmer Inc | model: TRI-CARB 2900TR | |
| Micro pestle | Carl Roth GmbH + Co. KG | CXH7.1 | |
| Mixed cellulose Eester filter, ME range (ME 24), plain, 0.2 µm pore size, 47 mm circle | GE Healthcare Life Sciences | 10401770 | |
| Mixer for HPLC | Kontron Instruments | model: M 800 | |
| Murashige & Skoog medium, salt mixture | Duchefa Biochemie | M0221 | |
| OriginPro software | OriginLab Corp. | ||
| Orthophosphoric acid, ≥85 %, p.a., ISO | Carl Roth GmbH + Co. KG | 6366.1 | |
| Partisphere 5 µm SAX cartridge column, 125 x 4.6 mm | Hichrom Limited | 4621-0505 | |
| Perchloric acid, 70 %, 99.999 % trace metals basis | Sigma-Aldrich | 311421 | |
| Petri dish, square, PS, clear, 120/120/17 mm, sterile | Greiner Bio One International GmbH | 688161 | |
| pH-indicator paper pH 5.5 - 9.0, Neutralit | Merck KGaA | 109564 | |
| Phytagel | Sigma-Aldrich | P8169 | |
| Potassium carbonate | Carl Roth GmbH + Co. KG | P743.2 | |
| Safe-Lock tubes, 1.5 mL | Eppendorf AG | 30120086 | |
| Sample loop for 9725 injectors, volume 2 mL, PEEK | Supelco | 57648 | |
| SNAPTWIST scintillation vial, 6.5 mL | Simport Scientific Inc. | S207-5 | |
| Sterile bench | LaboGene | model: ScanLaf MARS 900 | |
| Sucrose, ≥99,5 %, p.a. | Carl Roth GmbH + Co. KG | 4621.1 | |
| Ultima-Flo AP liquid scintillation cocktail | PerkinElmer Inc | 6013599 | |
| Ultra-pure deionized water | Milli-Q | ||
| Wrenchless WVS End Fitting Kit | Hichrom Limited | 4631-1001 |
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