Summary
Här beskriver vi starka anjon utbyte högpresterande flytande kromatografi av [3H]-myo-inositol-märkt plantor som är en mycket känslig metod för att upptäcka och kvantifiera inositol polyfosfater i växter.
Abstract
Fosfat estrar av myo-inositol, också benämns inositol fosfater (InsPs), är en klass av cellulära regulatorer spelar viktiga roller i växtfysiologi. På grund av deras negativa laddning, låga överflöd och mottaglighet för hydrolytiska aktiviteter, är detektion och kvantifiering av dessa molekyler utmanande. Detta gäller särskilt starkt fosforylerade former som innehåller "högenergibindningar" diphospho obligationer, även benämns inositol pyrofosfater (PP-InsPs). På grund av dess höga känslighet, är stark anjon utbyte högpresterande vätskekromatografi (SAX-HPLC) av växter märkta med [3H]-myo-inositol är för närvarande den metod för val att analysera dessa molekyler. Genom att använda [3H]-myo-inositol till radiolabel växt plantor, olika InsP arter inklusive flera icke-enantiomeriska isomerer kan upptäckas och diskrimineras med hög känslighet. Här beskrivs uppställningen av ett lämpligt SAX-HPLC-system, liksom det kompletta arbetsflödet från växtodling, radiolabeling och InsP-extraktion till SAX-HPLC-körningen och efterföljande dataanalys. Det protokoll som presenteras här möjliggör diskriminering och kvantifiering av olika InsP-arter, inklusive flera icke-enantiomeriska isomerer och av PP-InsPs, InsP7 och InsP8, och kan lätt anpassas till andra växtarter. Som exempel utförs SAX-HPLC analyser av Arabidopsis thaliana och Lotus japonicus plantor och komplett InsP profiler presenteras och diskuteras. Den metod som beskrivs här utgör ett lovande verktyg för att bättre förstå InsPs biologiska roller i växter.
Introduction
Nästan fyra decennier sedan, inositol fosfater (InsPs) fram som signalering molekyler, efter Ins(1,4,5)P3 (InsP3) identifierades som en andra budbärare som aktiverar receptor-medierad frisättning av Ca2 + i djurceller1,2. Hittills har ingen InsP3-receptor (IP3-R) identifierats i växter, som ifrågasätter en direkt signalering roll för InsP3 i växtceller3. Oavsett, InsP3 fungerar som en föregångare för andra InsPs som deltar i flera växtutvecklingsprocesser, inklusive reglering av specifika signalering vägar3,4,5,6,7,8. Till exempel kan InsP3 ytterligare fosforyleras till InsP6, även känd som "fytinsyra", som representerar en viktig källa till fosfat, myo-inositoloch katjoner, och visades spela nyckelroller i växtförsvar mot patogener, mRNA export och fosfat homeostas5,9,10,11,12.
Inositol pyrofosfater (PP-InsPs) är en klass av InsPs som innehåller minst en högenergi di-fosfosbindning, ursprungligen identifierade i djurceller, amöba och jäst, där de spelar kritiska roller i olika cellulära processer13,14,15. Trots banbrytande arbete på PP-InsPs i växter16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26, de biologiska funktioner och isomer identitet dessa molekyler fortfarande i stort sett gåtfulla. I modellen anläggningen Arabidopsis thaliana, cellulära InsP8 föreslogs att reglera försvar mot insektssmakar och nekrotrofa svampar via sammanträffande-detektion av InsP8 och aktiv jasmonate av ASK1-COI1-JAZ receptor komplexa17. Vidare har roller insP8 och andra PP-InsPs i energi homeostas och näringsämnen avkänning, samt fosfat homeostas föreslagits17,23,24,25,26.
Oavsett vilket biologiskt system som används har en stor metodologisk utmaning vid studier av InsPs varit tillförlitlig detektion och exakt kvantifiering av dessa molekyler. Masspektrometribaserade metoder har använts för att upptäcka InsPs, inklusive PP-InsPs, från cellextrakt. Emellertid, dessa studier misslyckades med att skilja distinkta isomerer26,27. En annan metod för att analysera InsPs sysselsätter pull-down av InsPs från cell lysates med TiO2 pärlor, följt av polyakrylamide gel elektrofores (SIDA) av eluted InsPs. Insp:erna kan sedan färgas av antingen toluidinblått eller DAPI24,28,29. Det är dock än så länge inte möjligt att på ett tillförlitligt sätt upptäcka InsPs lägre än InsP5 från växtextrakt med denna metod. Nyligen publicerades en metod med hjälp av [13C]-myo-inositol för kärnmagnetisk resonans (NMR) analys av InsPs som ett alternativ till stark anjon utbyte högpresterande vätskekromatografi (SAX-HPLC)30. Denna teknik har rapporterats för att uppnå en liknande känslighet jämfört med SAX-HPLC och att tillåta detektion av 5-InsP7, samt diskriminering av olika icke-enantiomeriska InsP5 isomerer från cellextrakt. Genomförandet av den NMR-baserade metoden kräver dock kemiskt syntetiserade och kommersiellt inte tillgängliga [13C]-myo-inositol. Därför är den metod som används i de flesta fall radiolabeling prover med [3H]-myo-inositol, följt av SAX-HPLC31,32,33. Denna teknik är baserad på upptag av radioaktiva myo-inositol i anläggningen och dess omvandling till olika InsPs av den kombinerade aktiviteten av dedikerade cellulära kinaser och fosfataser.
Den [3H]-märkta InsPs är sedan syra-extraherade och fraktionerad med hjälp av SAX-HPLC. På grund av deras negativa laddning interagerar InsPsna starkt med det positivt laddade stationärt arrangerar gradvis av SAX-HPLC kolonnen och kan eluteds med en buffertgradient som innehåller ökande fosfatkoncentrationer för att konkurrera ut InsPs från kolonnen. Elutionstider beror således på laddning och geometri av Den InsP-art som ska avskiljas. I avsaknad av kirala kolumner kan endast icke-enantiomeriska isomerer genom åtskilda av detta protokoll. Men radiolabeled standarder kan användas för att tilldela isomeric karaktär av en specifik InsP topp. Flera insatser i det förflutna av olika laboratorier för att generera märkta och omärkta standarder med (bio)kemiska metoder eller att rena dem från olika celler och organismer har hjälpt tilldela toppar till vissa InsP arter, och även att begränsa den isomeriska identiteten hos enskilda InsP-arter5,7,21,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43. Också, den senaste klarläggandet av enzymatiska vägar som leder till bildandet av PP-InsPs i växter, samt upptäckten av en bakteriell typ III-effektor med en specifik 1-phytase aktivitet, ge information om hur man genererar användbara standarder för dessa analyser10,17,18,22,23.
De resulterande fraktionerna kan mätas i en vätskescintillationsräknare på grund av β-sönderfall av tritium (3H). Med ökande märkningstid nås en isotopic jämvikt, varefter de erhållna InsP-profilerna ska representera InsP-statusen för anläggningen31. Den stora fördelen med detta protokoll i jämförelse med andra tillgängliga tekniker är den höga känslighet som uppnås genom användning av den direkta föregångaren för InsPs och mätning av en radioaktiv signal.
SAX-HPLC av prover som extraherats från [3H]-myo-inositol-märkta växter eller andra organismer används vanligen för detektion och kvantifiering av InsPs som sträcker sig från lägre InsP-arter till PP-InsPs, vilket representerar ett värdefullt verktyg för att bättre förstå Metabolism, funktion och verkningssätt hos InsPs. Hittills är denna metod också det lämpligaste valet för forskare med särskilt intresse för lägre InsP-arter. Medan grunderna i detta förfarande, på vilket det protokoll som beskrivs här bygger på, har tidigare beskrivits7,21,31,34, ett detaljerat protokoll som är anpassat till analysen av växt-härledda InsPs och särskilt av PP-InsPs saknas fortfarande. Tidigare publikationer rapporterade svårigheter att på ett tillförlitligt sätt upptäcka de låga rikliga PP-InsPs, särskilt InsP8, på grund av en eller flera av följande faktorer: relativt låga mängder växtmaterial, [3H]-myo-inositol med låg specifik aktivitet (> 20 Ci/mmol), användning av extraktionsbuffertar som antingen inte är baserade på perklorsyra eller är mindre koncentrerade än 1 M, olika neutraliserande buffertar, samt suboptimala gradienter eller detektion av [3H] med en on-line detektor. I jämförelse med dessa studier, det protokoll som presenteras här är utformad för tillförlitlig upptäckt av PP-InsPs7,21,34.
Här presenterar vi ett detaljerat arbetsflöde, med början från inställningen av utrustningen till växtodling och märkning, InsP extraktion och SAX-HPLC köra själv. Även om metoden var optimerad till modellen anläggningen A. thaliana, det kan enkelt modifieras för att studera andra växtarter, som visas här med den första rapporterade InsP-profilen av modellen baljväxter Lotus japonicus. Även om användningen av en annan växtart kan kräva viss optimering, vi räknar med att de kommer att vara mindre, vilket gör detta protokoll en bra utgångspunkt för ytterligare forskning i anläggningen InsPs. För att underlätta eventuella optimeringar anger vi varje steg inom protokollet där modifieringar är möjliga, samt alla kritiska steg som kan vara utmanande vid upprättande av metoden för första gången. Dessutom rapporterar vi hur data som erhålls med den här metoden kan användas för kvantifiering av specifika Insp: er och hur olika prover kan analyseras och jämföras.
Protocol
1. Att inrätta HPLC-systemet
- Ställ in ett system bestående av två oberoende HPLC-pumpar (binärpump), ett för varje buffert. Båda pumparna behöver styras tillsammans via en dator med respektive programvara eller genom att ha en masterpump. Implementera en kolvstälstvätt för båda pumparna, antingen via gravitationskraft eller genom en tredje lågtryckspump. Utse en pump för buffert A (benämnd pump A) och en för buffert B (benämnd pump B).
OBS: Båda måste kunna generera tryck upp till 60 bar (6 MPa) och flödeshastigheter på minst 0,5 mL/min. - Anslut båda pumparna till en dynamisk mixer.
- Anslut blandaren till en injektionsventil med en provslinga med minst 1 mL-kapacitet.
- Anslut injektionsventilen till kolonnen med en kapillär via motsvarande ändbeslag.
- Anslut kolonnen till fraktionssamlaren genom att använda en kapillär med lämplig längd.
OBS: Denna beskrivning är baserad på vårt HPLC-system (se tabellen över material), som kräver fler manuella steg än nyare och mer sofistikerade system. Vårt system möjliggör enkel åtkomst och modifiering av alla komponenter. Kvartära pumpar (med den binära gradienten som beskrivs här) kan också användas och kommer att leda till elueringsprofiler och övergripande kvalitet på analyserna liknande dem som uppnås med binära pumpar.
2. Beredning av buffertar, kolonn- och HPLC-system
- Förbered buffertarna för extraktion av lösliga InsPs: extraktionsbuffert (1 M HClO4) och neutraliseringsbuffert (1 M K2CO3). Förbered båda buffertarna med ultrarent avjoniserat vatten. De är stabila i rumstemperatur i flera månader. Omedelbart före extraktionen, tillsätt EDTA till båda lösningarna till en slutkoncentration på 3 mM (t.ex., från en filtrerad 250 mM EDTA-stamlösning).
FÖRSIKTIGHET: HClO4 (perklorsyra) är starkt frätande. - Förbered buffertarna för SAX-HPLC-körningen: buffert A (1 mM EDTA) och buffert B (1 mM EDTA, 1,3 M (NH4)2HPO4; pH 3.8 med H3PO4). Förbered båda med hjälp av ultrarent avjoniserat vatten följt av vakuumfiltrering med 0,2 μm porstora membranfilter. Dessa är stabila i rumstemperatur i flera månader.
OBS: EDTA bör ingå i alla buffertar för att förhindra interaktioner av katjoner med InsPs, vilket skulle kunna resultera i förändrad InsP-laddning eller till och med olösliga InsP-saltkomplex. - Programmera toningen enligt följande: 0\u20122 min, 0% buffert B; 2\u20127 min, upp till 10% buffert B; 7\u201268 min, upp till 84% buffert B; 68\u201282 min, upp till 100% buffert B; 82\u2012100 min, 100% buffert B, 100\u2012101 min, ner till 0% buffert B; 101\u2012125 min, 0% buffert B. Den optimala flödeshastigheten för denna lutning är 0,5 mL/min.
- Under körningen, samla fraktioner varje minut, med början från minut 1 till minut 96. De återstående 30 min av gradienten tjäna för att tvätta kolumnen och systemet, och behöver inte samlas för scintillation räkna.
- Ställ om möjligt det maximala nåbara trycket före nödavstängningen av HPLC-pumparna till 80 bar (8 MPa). Detta förhindrar kritiska skador på kolonnens harts.
- När du använder en ny wash SAX HPLC-kolonn tvättar du den noggrant (>50 mL) med filtrerat ultrarent avjoniserat vatten före den första användningen.
OBS: Detta kommer att säkerställa avlägsnande av den inneslutna metanol, vilket förhindrar salt nederbörd i senare steg. Använd om möjligt en separat HPLC-pump. Om detta inte är tillgängligt, se till att HPLC har spolats med vatten innan du tvättar kolonnen. Flödeshastigheten bör inte överstiga 2 mL/min. Efter tvättning är kolonnen klar för analysen och kan, när den hanteras på rätt sätt, användas för 20\u201240 körningar. Därefter kommer resolutionen successivt att minska. Långvarig tvättning med buffert A (>1 h) och utförande av steg 2.6 kan bidra till att öka kolonnens livslängd. Om minskningen av upplösningen kvarstår måste kolumnen bytas ut. Lutningen kan justeras för att öka separationen mellan specifika inositol polyfosfatarter eller för att minska den totala runtime. Att använda olika HPLC-system (med olika tomrumsvolym eller olika volym av kapillärerna) kommer starkt att påverka retentionstiderna. Kolumnändringar har också mindre effekter på kvarhållningstiderna. - Utför en "mock run". I stället för ett extraherat prov injicerar du filtrerat ultrarent avjoniserat vatten i HPLC-systemet och kör standardgradienten. Bråktalen behöver inte samlas in.
OBS: Steg 2.6 är valfritt. Det bör dock utföras om någon av följande situationer gäller: En ny kolumn installeras; HPLC-systemet har använts för en annan metod i förväg; HPLC-systemet har inte använts under längre tid än 3 dagar; Det uppstod ett problem med föregående körning.
3. Växtodling och etikettering med [3H]-myo-inositol
OBS: Följande steg ska utföras med sterila komponenter och under sterila förhållanden, medan du bär handskar för att skydda händerna mot kontamination med radiolabeln. Växtmedier, särskilt när de innehåller sackaros, är benägna att mikrobiell kontaminering.
- Sterilisera A. thaliana frön med 1 mL av 1,2% natriumhypoklorit i 3 min följt av 1 mL av 70% etanol i 3 min. Tillsätt sedan 1 mL 100% etanol, pipettera fröna med etanol på ett cirkulärt filterpapper och låt dem lufttorka under ett laminär-flöde på en ren bänk.
- När du använder L. japonicus frön, placera dem i en mortel och skrubba frön med sandpapper innan sterilisering för att säkerställa en tillräcklig grobarhetsgrad.
- Sug ut Arabidopsis frön i 1–2 rader på kvadratiska Petri-rätter fyllda med solida tillväxtmedier bestående av halvhållfasta Murashige och Skoog (MS) saltlösning, 1% sackaros, 0,7% gellan tuggummi i avjoniserat vatten justerat till pH 5,7 med KOH och låta dem stratifiera i minst 1 dag vid 4 °C i mörker.
- För Lotus frön, så ut dem i 1 rad på kvadrat Petri rätter fyllda med solid tillväxt media bestående av 0,8% bakteriologisk agar i avjoniserat vatten och låta dem stratifiera i minst 3 dagar vid 4 °C i mörker.
- Placera plattorna vertikalt i en tillväxtinkubator eller klimatkammare och låt dem växa under 10–12 dagar under korttidsförhållanden (8 h ljus vid 22 °C, 16 h mörkt vid 20 °C).
- Överför 10–20 plantor i en brunn av en 12-väl tydlig plattbottnad cellkulturplatta fylld med 2 mL halvstyrka MS saltlösning kompletterad med 1% sackaros och justeras till pH 5.7.
- Tillsätt 45 μCi av [3H]-myo-inositol (30–80 Ci/mmol, upplöst i 90% etanol) och blanda genom skonsam virvlande. Täck plattan med motsvarande lock och försegla den med mikroporös kirurgisk tejp (t.ex. mikropore eller leucopore tejp), placera tillbaka den i tillväxtinkubatorn.
VAR FÖRSIKTIG: [3H] är en lågenergibetasändare som kan vara en skadlig strålningsrisk vid inandning, förtäring eller absorberad genom bar hud. Använd alltid handskar vid hantering av radioaktivt material eller utrustning som har direkt eller indirekt kontakt till radioaktivt material. Följ också de lokala reglerna för säker hantering av radiokemikalier (t.ex. bär ytterligare skyddskläder, användning av en dosimeter och undersökningar av ytor för föroreningar på regelbunden basis). - Efter 5 dagars märkning, ta bort plantor från media och tvätta dem kort med avjoniserat vatten. Torka dem med hushållspapper och överför dem till ett 1,5 mL mikrocentrifugrör. Fyll inte röret för mycket, och placera inte mer än 100 mg FW/tub, vilket motsvarar ungefär 10\u201220 17-dagsgamla plantor.
OBS: Ett överskott av växtmaterial kommer att späda syran under extraktionsprocessen och kommer starkt att minska extraktionseffektiviteten.- Snäpp-frysa röret i flytande kväve och förvara det vid -80 °C tills extraktion.
OBS: Proverna kan hållas vid -80 °C i flera veckor utan att göra avkall på provkvaliteten. Tillväxtförhållandena (media, ljus, temperatur, tid) kan modifieras efter behoven hos ett specifikt experiment eller växtarter. Dock bör försiktighet vidtas vid spädning av [3H]-myo-inositol, för att säkerställa kvantifierbara SAX-HPLC körs av god kvalitet. Därför rekommenderas att börja med de [3H]-myo-inositol koncentrationer som anges här och minska det stegvis om så önskas. Under märkningstiden kan växter lämnas till olika behandlingar (t.ex. miljöpåkänningar eller kemiska agenser) för att bedöma hur dessa villkor påverkar globala InsPs. För att nå steady-state-märkning rekommenderar vi att märka växter i minst 5 dagar.
- Snäpp-frysa röret i flytande kväve och förvara det vid -80 °C tills extraktion.
4. Utvinning av lösliga InsPs
OBS: Förvara prover och reagenser på is under hela extraktionsprocessen. Använd alltid handskar och skyddsglasögon på grund av den höga risken för kontakt med radioaktivt material, särskilt vid slipning. Allt som kommer i kontakt med prover betraktas som radioaktivt avfall och ska bortskaffas enligt de lokala reglerna för säker deponering av radioaktivt material.
- Bered de arbetslösningar för extraktions- och neutraliseringsbufferten som i steg 2.1. Varje prov kommer att kräva 600 μL extraktionsbuffert och 400 μL neutraliseringsbuffert. Förvara buffertarna på is.
- Ta proverna från -80 °C frys och förvara dem i flytande kväve tills vidare bearbetning. Slipa proverna med en mikrocentrifugrör mortelstöt tills de börjar tina och tillsätt 500 μL iskall extraktionsbuffert. Fortsätt slipningen tills provet är helt homogeniserat och lösningen har en djup grön färg (om blad finns i provet).
- Centrifugera proverna i 10 min vid 4 °C vid ≥ 18000 x g. Överför supernatanten till ett färskt 1,5 mL-rör. Tänk på att de rör som används för utvinning anses vara fast radioaktivt avfall och måste kasseras i enlighet med detta.
-
Tillsätt försiktigt 300 μL neutraliseringsbuffert till extraktet. Utfällning av proteiner och bubblande kommer att starta omedelbart. Blanda genom att snurra med en pipettspets efter en minut och vänta i några sekunder innan du pipetterar en liten mängd (5 μL) på pH-papper (helst räckvidd på pH 6–9). PH-värdet ska vara mellan pH 7 och 8 i slutändan.
- Tillsätt vid behov små mängder (typiskt 10–20 μL) av antingen neutraliseringsbuffert eller extraktionsbuffert tills önskat pH-värde har uppnåtts. Låt proverna vila på is i minst 1 h med öppet lock.
- Centrifugera proverna i 10 min vid 4 °C vid ≥ 18 000 x g. Överför supernatanten till ett färskt 1,5 mL-rör.
OBS: Proverna kan antingen direkt användas i en SAX-HPLC-körning eller hållas på is (om de används senare samma dag) eller frysas i flytande kväve och förvaras vid -80 °C i 2\u20124 veckor. För att säkerställa en hög reproducerbarhet och jämförbarhet rekommenderas att alltid frysa proverna i flytande kväve i 5 min, även om de kommer att användas direkt efteråt. Längre sikt lagring av extraherade prover vid -80 °C är möjligt så länge prover endast tinas en gång. Om frysta prover används för analysen, se till att inga partiklar är synliga efter upptining. Annars centrifug igen i 10 min vid 4 °C vid ≥ 18 000 x g och överför supernatanten till ett färskt 1,5 mL-rör.
5. Utföra HPLC-körningen
- Utrusta fraktionssamlaren med 96 små scintillationsdrinaler (kapacitet på ~6 mL) och fyll varje injektionsflaska med 2 mL av en lämplig scintillationscocktail (t.ex., Ultima-Flo AP flytande scintillationscocktail) som är kompatibel med buffertar med lågt pH och hög ammoniumfosfatkoncentration (se Tabell över material).
OBS: Antalet injektionsflaska och injektionsflaskans storlek beror på vilken fraktionssamlare och scintillationsräknare som används. Det är viktigt att åtminstone samla de första 90 fraktionerna, om den gradient som beskrivs här används, för att få en fullständig inositol polyfosfatprofil. Se också till att korrekt märka varje injektionsflaska och dess respektive lock, för att förhindra förväxling av fraktioner eller prover. - Starta HPLC-systemet/pumparna och ha det klart att köras. Aktivera kolvtätningstvätten och håll den aktiverad under hela körningen. Fyll på provet genom att manuellt injicera den kompletta supernatanten från steg 4.5 (ca 750 μL) med hjälp av en lämplig spruta (se Tabell över material). Om automatisk injektion är möjlig, överför provet till motsvarande provflaska. Vrid ventilen från "load" till "injicera" läge och starta gradienten och fraktionsuppsamlaren.
OBS: Beroende på vilket HPLC-system som används kan startproceduren skilja sig åt, särskilt när äldre system jämförs (enligt beskrivningen här) med en helt programvarustyrd nyare modell. Det är mycket viktigt att se till att lutningen, provinjektionen och fraktionsuppsamlingen startar samtidigt. - Medan HPLC-körningen pågår, kontrollera trycket regelbundet. Starttrycket ska ligga kring 18–24 bar (1,8–2,4 MPa) och bör långsamt stiga till 50–60 bar (5–6 MPa) när 100 % buffert B har nåtts.
FÖRSIKTIGHET: Minskat tryck kan tyda på en läcka i systemet medan ökat tryck indikerar en blockering. Tryckfluktuationer (≥ 3 bar på några sekunder) kan indikera närvaron av luft i systemet. Tänk på att allt som lämnar kolonnen, samt varje läckage som uppstår vid injektorn eller efteråt är radioaktivt.
OBS: Trycket beror också på HPLC-systemet och kan vara lägre eller högre än vad som anges här. Den kommer långsamt att öka efter cirka 15–20 åk. Detta påverkar dock inte nödvändigtvis kvaliteten på de erhållna körningarna. - Efter körningen, stäng injektionsflaskan tätt och blanda fraktionerna med scintillation cocktail genom kraftig skakning. Fortsätt direkt med mätningen eller håll injektionsflaskan i upprätt läge, helst i mörker.
OBS: Bråk blandade med scintillationscocktail är stabila i veckor och kan mätas senare. Eftersom halveringstiden för tritium är 12,32 år är signalförlusten försumbar. - När körningen av det sista provet för dagen är klar, stoppa båda HPLC pumpar.
- (Tillval) För att öka systemets livslängd, särskilt när det inte används regelbundet, tvätta pump B och kapillärerna genom att placera kapillären från buffert B i en flaska med buffert A och låta pumpen gå i 10–15 min. Innan nästa användning, kom ihåg att byta ut kapillären till buffert B och att koppla loss pump B från blandaren för att spola den med buffert B. När pumpen och kapillärerna fyllts igen med buffert B, återansluts den med blandaren och systemet är klart att använda.
6. Mäta fraktionerna
- Sätt in injektionsflaskan i scintillationsdiskrack och mät varje injektionsflaska i 5 min i en vätskescintillationsräknare.
- Använd helst rack som direkt passar små injektionsflaska och undviker att hänga i injektionsflaskan i större (t.ex. 20 mL) injektionsflaska för att minska räknefel. De programvaruinställningar som används i detta protokoll visas i Kompletterande figur 1.
OBS: Utför regelbundet ett SNC-protokoll (självnormalisering och kalibrering) med unlsläckade [3H]-standarder. Kortare räknetider (1–5 min) är möjliga för att minska väntetiden. Men för att säkerställa en hög räkna reproducerbarhet och noggrannhet, 5 min rekommenderas.
7. Dataanalys
- Exportera mätningarna från scintillationsräknaren som en kalkylbladsfil eller ett kompatibelt/konvertibelt filformat. Utvärdera data med en dator utrustad med Excel eller liknande programvara, och en lämplig analysprogramvara som Origin.
- Förbered ett 2D-linjediagram där de uppmätta antalet per minuter (cpm) plottas mot kvarhållningstiden (se bild 1, bild 2).
- För att jämföra prover med varandra normaliserar du data genom att summera cpm från varje eluterad fraktion från minut 25 till 96 för varje enskilt prov.
OBS: Minut 25 används som cut-off för att utesluta icke-inkorporerade [3H]-myo-inositol, InsP1 och InsP2 från analysen, eftersom de tenderar att fluktuera starkt och kan inte väl separeras (åtminstone med den gradient som föreslås i detta protokoll) och därmed starkt ändra normaliseringsfaktorn på grund av deras höga aktivitet. - Normalisera alla data till provet med den lägsta totala cpm (i fraktioner 25\u201296) genom att dividera den totala cpmen från provet med den lägsta cpmen (i fraktioner 25–96) med de sammanlagda cpm (i fraktioner 25–96) av de andra proverna. Den resulterande faktorn kan sedan användas för att normalisera cpm från varje fraktion genom att multiplicera cpm av varje fraktion med faktorn.
OBS: Till ska summan av cpm-värdena från minut 25 till ände vara lika för alla prover jämfört med varandra. Endast normaliserade körningar ska presenteras i samma graf/figur (när de presenteras som faktiska profiler). Kompletterande figur 2 visar ett exempel på hur dessa beräkningssteg görs (med endast bråk 25–35 av två prover för förenkling). I vissa fall är det dock inte nödvändigt att normalisera data. Till exempel när toppar kvantifieras enligt steg 7.4 och presenteras som procentsatser av totala InsPs (som visas i figur 3D). Som tidigare anges, när man presenterar flera analyser sida vid sida som profiler, eller när den faktiska uppmätta aktiviteten används för slutsatser (t.ex. behandling a) ökar InsP7 med x% jämfört med kontroll, med hänvisning till cpm-värdena i InsP7 av båda proverna och inte till deras procentuella andel av totala InsPs) normalisering behövs. För att analysera effekten av genotyp eller behandlingsskillnader på märkningseffektiviteten är det viktigt att inte normalisera, eftersom detta skulle ogiltigförklara dessa skillnader. Men absolut kvantifiering med denna metod är utmanande eftersom extraktionen effektivitet med detta protokoll kan variabel av olika skäl och ibland även observeras när replika av samma genotyp och behandling analyseras. Tänk på att beroende på HPLC-systemet, kolumn och toning som används för analyserna kan cut-offen behöva ändras. - För att utföra relativa kvantifieringar av vissa inositol polyfosfattoppar och för att därefter skapa stapeldiagram som innehåller data av replikationer för statistiska analyser, fortsätt analysen med en specialiserad programvara som kan beräkna toppområden av kromatogram (t.ex. Se kompletterande figur 3.
OBS: De flesta HPLC-system som är programvarustyrda levereras med en respektive programvara som kan denna uppgift. Toppar bestäms som bråken med cpm-värden ovanför bakgrunden (som varierar i en viss grad mellan körningar) och kvarhållningstider som liknar tidigare publicerade data. Kvarhållandetiden för en specifik topp bestäms i kalkylprogramvara (t.ex. Excel) och används för att tilldela toppar för beräkning av bestämda integraler (t.ex. i Origin). Kompletterande figur 3 illustrerar denna process av toppbestämning, bakgrund subtraktion och integration av toppar.
Representative Results
De resultat som visas här syftar till att illustrera möjliga utfall som erhållits enligt variationer på tekniska och biologiska nivåer. Den första exemplifieras genom analyser med hjälp av nya mot åldrade kolumner (figur 1) och färska kontra lagrade prover (figur 3), och den andra genom att utvärdera utdrag ur två olika växtsystem, A. thaliana (Figur 1, Figur 3) och L. japonicus (Figur 2).
En optimal SAX-HPLC kör avbildas på figur 1A\u2012C, som visar en komplett inositol polyfosfat spektrum som erhållits från A. thaliana extrakt efter scintillation räkna. Observera att toppar är fint separerade och kan tilldelas olika isomerer (eller enantiomer-par) baserat på kromatografiska mobiliteter som beskrivstidigare 5,7.
Figur 2 visar det representativa resultatet av en SAX-HPLC-analys av L. japonicus plantor som odlades och var märkta under samma förhållanden som de Arabidopsis plantor. Medan förmodligen alla InsP arter och toppar som är kända från Arabidopsis kan ses, det finns betydande skillnader när det gäller den relativa (t.ex. nyckeltal mellan isomerer) mängd specifika InsP isomerer, vid jämförelse av profiler av båda arterna. Till exempel visade Lotus extrakt ökade InsP3c, InsP4b, InsP5b och minskade InsP3a, InsP4a, InsP5a och InsP5c jämfört med Arabidopsis som lämnar utrymme för ytterligare undersökningar. Bild 2D illustrerar de olika nyckeltalen mellan InsP-isomerer mellan Arabidopsis och Lotus.
Bild 3 visar två InsP-profiler av ett prov som delades efter extraktionen. Första halvlek analyserades omedelbart och den andra halvan en dag senare, efter förvaring vid -80 °C. Observera att endast mindre skillnader observeras mellan de olika proverna (dvs. svarta och röda linjer på figur 3A\u2012C, och bild 3D). Detta illustrerar att en frys-töcykel inte skadar provet och att själva metoden genererar reproducerbara resultat.
Bild 1: Typisk InsP-profil för en lyckad och av en misslyckad SAX-HPLC-analys som utförs med detta protokoll. (A\u2012C) SAX-HPLC profil av 17-dagsgamla vild-typ (Col-0) Arabidopsis plantor radiolabeled med [3H]-myo-inositol. Global InsP utvinning och SAX-HPLC köras utfördes samma dag. (A) Full spektra; (B, C) Zoom-ins av profilen som visas i A. Alla synliga toppar markeras och tilldelas motsvarande InsP-arter. Baserat på publicerade kromatografiska mobiliteter5,7, representerar InsP4a sannolikt Ins(1,4,5,6)P4 eller Ins(3,4,5,6)P4, InsP5a representerar InsP5 [2-2-2-6 OH], Representerar InsP5b 5 [4-OH] eller dess enantiomeriska form InsP5 [6-OH], och InsP5c representerar InsP5 [1-OH] eller dess enantiomeriska form InsP5 [3-OH]. Den isomeric natures av InsP3a-c, InsP4b, InsP7, och InsP8 är fortfarande okända. Panel (D) visar en SAX-HPLC profil av identiskt odlade växter men med hjälp av en åldrad kolumn (>40 körningar). En tydlig minskning av InsP6 jämfört med andra InsP-arter och frånvaron av PP-InsPs är synlig. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 2: Representativ InsP-profil för L. japonicusväxter. SAX-HPLC profil (A\u2012C) av 17-dagsgamla vild-typ (Gifu) L. japonicus plantor radiolabeled med [3H]-myo-inositol. (A) Full spektra; (B, C) Zoom-ins av profilen som visas i A. Alla synliga toppar markeras och tilldelas motsvarande InsP-arter. Baserat på publicerade kromatografiska mobiliteter5,7, representerar InsP4a sannolikt Ins(1,4,5,6)P4 eller Ins(3,4,5,6)P4, InsP5b sannolikt representerars InsP5 [4-OH] eller dess enantiomeriska form InsP5 [6-OH], och InsP5c sannolikt representerar InsP5 [1-OH] eller dess enantiomeriska form InsP5 [3-OH]. Den isomeric naturer av InsP3a-c, InsP4b, InsP7, och InsP8 är okända. (D) Jämförelse mellan de enskilda InsP-arterna (i % av total aktivitet från eluering 25\u201296) av A. thaliana (uppgifter från figur 1A\u2012C) och L. japonicus (uppgifter från figur 2A–C). Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 3: InsP-profiler av ett delat prov som illustrerar reproducerbarheten hos SAX-HPLC-analyser. (A\u2012C) SAX-HPLC profiler av 17-dagsgamla vild-typ (Col-0) Arabidopsis plantor radiolabeled med [3H]-myo-inositol. Före körningen delades provet och ena halvkörningen omedelbart och den andra hälften en dag senare efter lagring vid -80 °C. (A) Fullspektra; (B, C) Zoom-ins av profilen som visas i A. Alla synliga toppar markeras och tilldelas motsvarande InsP-arter. Baserat på publicerade kromatografiska mobiliteter5,7, Representerar InsP4a sannolikt Ins(1,4,5,6)P4 eller Ins(3,4,5,6)P4, InsP5a represents InsP5 [2-OH], InsP5a represents InsP5 [2-OH], InsP5b representerar InsP5 [4-OH] eller dess enantiomeriska form InsP5 [6-OH], och InsP5c representerar InsP5 [1-OH] eller dess enantiomeriska form InsP5 [3-OH]. Den isomeric natures av InsP3a-c, InsP4b, InsP7, och InsP8 är fortfarande okända. Panel D visar kvantifieringen av InsP6 och PP-InsPs InsP7 och InsP8 av båda körningarna. Värdena representerar beloppet (i %) av respektive InsP-art i förhållande till alla InsP (total aktivitet från eluering 25–96). Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Kompletterande figur 1: Programvaruinställningar för vätskescintillationsräkning med hjälp av en ljusscintillationsräknare. Skärmdumpar som visar programvaruversionen, samt inställningar som används för scintillation räkning av [3H] prover som utförs med detta protokoll avbildas. Vänligen klicka här för att ladda ner denna siffra.
Kompletterande figur 2: Representativt exempel på data normalisering. En skärmbild av ett kalkylblad visar alla steg och formler som används för att normalisera SAX-HPLC körs till varandra. För förenkling visas endast bråk 25–35 av prov. Vänligen klicka här för att ladda ner denna siffra.
Kompletterande figur 3: Peak bestämning, bakgrund subtraktion och integration med hjälp av analys programvara. (A) Data från SAX-HPLC-analys läses in i programvaran (minuter 28–96) och toppanalyserverktyget är valt. (B\u2012E) Baslinjen definieras manuellt genom att poäng mellan enskilda toppar och bakgrunden subtraheras. (F) Toppar bestäms manuellt baserat på utseende och publicerade kromatografisk mobiliteter5,7. (G) Toppintervall definieras manuellt av CPM-värden. (H) Toppar är integrerade och beräknas som % av alla toppar. Vänligen klicka här för att ladda ner denna siffra.
Discussion
Här presenterar vi en mångsidig och känslig metod för att kvantifiera InsPs inklusive PP-InsPs i växtextrakt och ger praktiska tips om hur man får denna metod etablerad. Även om protokollet i allmänhet är robust kan suboptimala körningar och analyser uppstå. I de flesta fall kan dessa körningar identifieras genom en kraftig minskning eller till och med fullständig förlust av starkt fosforylerade InsPs, särskilt PP-InsP-arten InsP7 och InsP8. Möjliga orsaker kan vara mikrobiella föroreningar av växtmaterialet och otillräcklig deaktivering av endogen växt PP-InsP-hydrolaser vid extraktion på grund av otillräcklig slipning och upptining av växtmaterial som inte kommer att vara i omedelbar kontakt med extraktionsbuffert. Ytterligare skäl inkluderar felaktig pH-justering genom otillräcklig eller överskottstillskott av neutraliseringsbuffert, eller helt enkelt otillräckligt provmaterial. Det senare kan göra det svårt att upptäcka PP-InsPs, eftersom de ofta finns i mycket låga mängder i cellerna. Ett överskott av provmaterial eller ineffektiv torkning under steg 3.5 kan orsaka utspädning av perklorsyran, vilket därför också leder till otillräcklig enzymavaktivering och en specifik förlust av InsP6 och PP-InsPs. Mängden växtmaterial, samt radiolabel som används i detta protokoll optimerades baserat på kostnader och prestanda, och är därför nära det lägsta belopp som fortfarande är tillräckligt för att ge optimala resultat. Dessutom kommer kolonnharts gradvis lös sin upplösningskapacitet. Det första tecknet på denna process är (av skäl som inte helt klart för författarna) en specifik förlust av högre fosforylerade InsP arter som PP-InsPs i HPLC spektrumet. Med ytterligare åldrande, kommer inte ens InsP6 lösas ordentligt av kolumnen (Bild 1D). Därför är användningen av en adekvat kolumn, samt noggrann hantering av provet och korrekt underhåll av HPLC-komponenterna avgörande för att säkerställa korrekta resultat.
När man jämför prover och körningar, särskilt när de genereras med olika utrustning (t.ex., HPLC-system och kolumner) eller på olika dagar, är det avgörande att normalisera proverna till varandra (som beskrivs i steg 7.3) och att analysera dem på samma sätt. Endast genom normalisering är det möjligt och exakt att visa flera prover i samma graf (Bild 3). För kvantifiering av enskilda InsP:er i förhållande till totala InsP-skivor, eller till en annan specifik InsP-art, är det inte nödvändigt att normalisera, så länge som endast relativa värden och inte absolutvärden visas. Helst visas både InsP-profilerna och kvantifieringarna. I vissa fall är det dock inte möjligt att på ett tillfredsställande sätt visa två eller flera körningar i samma graf. Olika kvarhållningstider eller olika nivåer av bakgrundsaktivitet kan göra det svårt att jämföra okvantifierade SAX-HPLC-profiler ensam. Detsamma är det sanna när många prover måste jämföras. I sådana fall är en ytterligare utvärdering med hjälp av ytterligare en programvara (t.ex. Origin) för individuell toppkvantifiering nödvändig.
Författarna är medvetna om att det protokoll som beskrivs här kan optimeras och behöver anpassas till varje enskild forskningsfråga. Även om optimeras för Arabidopsis extrakt 7,17 i detta protokoll, denna metod är mångsidig och kan hjälpa till att bestämma InsP profiler av andra växtarter också. Här exemplifierar vi denna möjlighet genom att för första gången presentera en InsP-profil för L. japonicus, som inte krävde några modifieringar av märkningsförhållandena, InsP-utsug eller SAX-HPLC-körning (Figur 2). Noterbart, medan övergripande liknande, skillnader observeras mellan L. japonicus och Arabidopsis InsP profiler. Till exempel i L. japonicus InsP5 [4-OH] eller dess enantiomeriska form InsP5 [6-OH] är rikligare än InsP5 [1-OH] eller dess enantiomeriska form InsP5 [3-OH] i jämförelse med Arabidopsis, där InsP5 [1-OH] eller dess enantiomeriska form InsP5 [3-OH] är den dominerande InsP5 arter. På samma sätt räknar vi med att förändringar i mediesammansättningen, [3H]- myo-inositol-koncentration, växtålder, miljöförhållanden (t.ex. ljus och temperatur), tillsats av kemiska föreningar eller analyser av växt-mikrobiella interaktioner bland andra faktorer, kan behöva testas och anpassas.myo
En viktig nackdel med denna metod som måste beaktas är att märkningen sker i en (steril) flytande kultur, som inte representerar en fysiologisk miljö för de flesta landväxter. Dessutom, på grund av de höga kostnaderna för [³H]-myo-inositol, volymen av märkningslösningen och storleken på odlingskärlet är i allmänhet begränsad, vilket också begränsar storleken på de växter som kan användas. Odling i flytande kultur kan undvikas genom att direkt infiltrera för exempel blad av jord-odlade växter med [³H]-myo-inositol och därefter efter det protokoll som beskrivs här, som tidigarerapporterats 10.
Det finns flera nackdelar med detta protokoll i jämförelse med alternativa metoder, såsom TiO2 pull-down följt av SIDA eller masspektrometri baserade tekniker. På grund av den [3H]-myo-inositol-märkning, kommer endast InsP-arter som direkt härstammar från radiolabeled myo-inositol att upptäckas till. Den metod som beskrivs här är blind för andra Ins isomerer såsom scyllo-inositol och andra isomerer varav några har identifierats i vissa växter44. Vidare kommer myo-InsPs som härrör från andra vägar att uteslutas, inklusive de som syntetiseras av de novo syntes av myo-inositol och myo-inositol-3-fosfat via isomerisering av glukos-6-fosfat, katalyseras av myo-inositol-3-fosfatsyntas (MIPS) proteiner45. Även om [32P] eller [33P]-orto-fosfat kan användas som alternativa etiketter, utgör deras användning en stor nackdel, eftersom varje fosfathaltig molekyl, inklusive de rikliga nukleotider och dess derivat, kommer att märkas. Dessa molekyler kan också extraheras med detta protokoll och binda till SAX kolumnen, vilket kommer att resultera i en hög nivå av bakgrundsaktivitet som kommer att störa identifieringen av enskilda InsP toppar5. Dessutom kan kvantifiering av [32P]- eller [33P] -märkta InsPs och PP-InsPs påverkas starkt av fosfat och pyrofosfat moiety omsättning och kanske inte rapportera en massa avläsning för inositol arter.
Å andra sidan, [3H]-myo-inositol specifikt etiketter myo-inositol-innehållande molekyler. InsPs, inositol-innehållande lipider, såsom fosfositider, och galactinol är i detta fall märkt. Endast InsPs kommer dock att analyseras med detta protokoll, eftersom lipider är olösliga i extraktionsbufferten och galactinol inte binder till SAX-kolumnen.
Hittills är skillnaderna från en anläggning InsP profil som genereras av [3H]-myo-inositol märkning jämfört med en bestäms av TiO2 pulldown / PAGE fortfarande okänd, eftersom sådana jämförelser inte har utförts i växter. En nyligen genomförd studie i djurceller tog upp denna fråga46. I det arbetet identifierades en pool av InsP6 som är osynlig genom [3H]-myo-inositol-märkning, som därigenom direkt bör härledas från glukos-6-fosfat, genom att jämföra SAX-HPLC-profiler med PAGE geler av däggdjurscelllinjer. 24 h av fosfat svält resulterade i en 150% ökning av InsP6 när kvantifiera SIDA geler av InsPs renas med hjälp av TiO2 pulldown. SAX-HPLC-analyser av [3H]-myo-inositol-märkta celler som behandlades identiskt bara visade en ökning med 15% av [3H]-InsP6. Som tidigare nämnts, InsPs lägre än InsP5 är omöjlig att upptäcka med PAGE analys i de flesta fall. Radiolabeling följt av SAX-HPLC verkar vara den metod för val, så länge masspektrometriska protokoll inte är optimerade för att upptäcka denna grupp av mycket negativt laddade molekyler.
En annan kvarvarande utmaning är att skilja enantiomerer i SAX-HPLC-analyser (eller i någon annan metod för InsP-analys)10,17. Denna utmaning kan hanteras genom tillägg av kirala väljare, dvs, enantiopure föreningar som L-arginin amid som interagerar med respektive enantiomeriska molekyler för att bilda diastereomeric komplex som kan separeras10. Vår kännedom om detta tillvägagångssätt har bara genomförts för att diskriminera den enantiomeriska InsP5 isomerer InsP5 [1-OH] och InsP5 [3-OH] av NMR analyser10. Diskriminering av andra enantiomeriska par eller framgångsrik diskriminering av enantiomerer genom kiral SAX-HPLC-analys eller kirala PAGE-baserade metoder har ännu inte rapporterats och bör utvecklas ytterligare. Med tanke på den bevarade syntesen och den bevarade regleringen av PP-InsPs genom fosfor tillgänglighet, föreställer vi oss att särskilt icke-radioaktiva metoder som PAGE eller MS-baserade metoder, tillsammans med näringsanalyser, kommer att hjälpa marken truthing ansträngningar för att kalibrera fjärranalys data som syftar till att diagnostisera näringsbrist i grödor17,18,24,25. Men den metod som presenteras här kan för närvarande fortfarande anses vara guldmyntfoten för InsP analyser och kommer att vara avgörande för att upptäcka nya funktioner av dessa spännande budbärare i växter.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete finansierades av Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Tyska forskningsstiftelsen) inom ramen för Tysklands excellence strategy - EXC-2070 – 390732324 (PhenoRob), forskningsutbildningsgruppen GRK2064 och individuella forskningsanslag SCHA1274/4-1 och SCHA1274/5-1 till G.S.. Vi tackar också Li Schlüter och Brigitte Ueberbach för tekniskt bistånd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Centrifuge | Eppendorf AG | model: 5430 R | |
| Diammonium hydrogen phosphate, ≥97 % | Carl Roth GmbH + Co. KG | 0268.1 | |
| Ethylenediamine tetraacetic acid disodium salt dihydrate, ≥99 %, p.a., ACS | Carl Roth GmbH + Co. KG | 8043.2 | |
| Falcon 12-well clear flat bottom TC-treated multiwell cell culture plate, with lid, individually wrapped, sterile | Corning Inc. | 353043 | |
| Fraction collector | LAMBDA Instruments GmbH | model: OMNICOLL single channel collector | |
| Growth incubator | poly klima GmbH | model: PK 520-LED | |
| HPLC pumps | Kontron Instruments | model: 420 | |
| HPLC syringe for Rheodyne valves, 1 mL | Hamilton Company | 81365 | |
| Injector for HPLC | Supelco | model: Rheodyne 9725 | |
| Inositol, myo-[1,2-3H(N)] | American Radiolabeled Chemicals Inc. | ART 0261 | |
| Liquid nitrogen | University, Chemistry Department | ||
| Liquid scintillation counter | PerkinElmer Inc | model: TRI-CARB 2900TR | |
| Micro pestle | Carl Roth GmbH + Co. KG | CXH7.1 | |
| Mixed cellulose Eester filter, ME range (ME 24), plain, 0.2 µm pore size, 47 mm circle | GE Healthcare Life Sciences | 10401770 | |
| Mixer for HPLC | Kontron Instruments | model: M 800 | |
| Murashige & Skoog medium, salt mixture | Duchefa Biochemie | M0221 | |
| OriginPro software | OriginLab Corp. | ||
| Orthophosphoric acid, ≥85 %, p.a., ISO | Carl Roth GmbH + Co. KG | 6366.1 | |
| Partisphere 5 µm SAX cartridge column, 125 x 4.6 mm | Hichrom Limited | 4621-0505 | |
| Perchloric acid, 70 %, 99.999 % trace metals basis | Sigma-Aldrich | 311421 | |
| Petri dish, square, PS, clear, 120/120/17 mm, sterile | Greiner Bio One International GmbH | 688161 | |
| pH-indicator paper pH 5.5 - 9.0, Neutralit | Merck KGaA | 109564 | |
| Phytagel | Sigma-Aldrich | P8169 | |
| Potassium carbonate | Carl Roth GmbH + Co. KG | P743.2 | |
| Safe-Lock tubes, 1.5 mL | Eppendorf AG | 30120086 | |
| Sample loop for 9725 injectors, volume 2 mL, PEEK | Supelco | 57648 | |
| SNAPTWIST scintillation vial, 6.5 mL | Simport Scientific Inc. | S207-5 | |
| Sterile bench | LaboGene | model: ScanLaf MARS 900 | |
| Sucrose, ≥99,5 %, p.a. | Carl Roth GmbH + Co. KG | 4621.1 | |
| Ultima-Flo AP liquid scintillation cocktail | PerkinElmer Inc | 6013599 | |
| Ultra-pure deionized water | Milli-Q | ||
| Wrenchless WVS End Fitting Kit | Hichrom Limited | 4631-1001 |
References
- Berridge, M. J., Irvine, R. F. Inositol Phosphates and Cell Signaling. Nature. 341 (6239), 197-205 (1989).
- Streb, H., Irvine, R. F., Berridge, M. J., Schulz, I. Release of Ca-2+ from a Nonmitochondrial Intracellular Store in Pancreatic Acinar-Cells by Inositol-1,4,5-Trisphosphate. Nature. 306 (5938), 67-69 (1983).
- Krinke, O., Novotna, Z., Valentova, O., Martinec, J. Inositol trisphosphate receptor in higher plants: is it real. Journal of Experimental Botany. 58 (3), 361-376 (2007).
- Kuo, H. F., et al. Arabidopsis inositol pentakisphosphate 2-kinase, AtIPK1, is required for growth and modulates phosphate homeostasis at the transcriptional level. Plant Journal. 80 (3), 503-515 (2014).
- Kuo, H. F., et al. Arabidopsis inositol phosphate kinases IPK1 and ITPK1 constitute a metabolic pathway in maintaining phosphate homeostasis. Plant Journal. 95 (4), 613-630 (2018).
- Gillaspy, G. E. Lipid-mediated Protein Signaling. Capelluto, D. G. S. , Springer. Netherlands. 141-157 (2013).
- Stevenson-Paulik, J., Bastidas, R. J., Chiou, S. T., Frye, R. A., York, J. D. Generation of phytate-free seeds in Arabidopsis through disruption of inositol polyphosphate kinases. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (35), 12612-12617 (2005).
- Lemtiri-Chlieh, F., MacRobbie, E. A. C., Brearley, C. A. Inositol hexakisphosphate is a physiological signal regulating the K+-inward rectifying conductance in guard cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (15), 8687-8692 (2000).
- Lee, H. S., et al. InsP6-sensitive variants of the Gle1 mRNA export factor rescue growth and fertility defects of the ipk1 low-phytic-acid mutation in Arabidopsis. Plant Cell. 27 (2), 417-431 (2015).
- Blüher, D., et al. A 1-phytase type III effector interferes with plant hormone signaling. Nature Communications. 8, (2017).
- Murphy, A. M., Otto, B., Brearley, C. A., Carr, J. P., Hanke, D. E. A role for inositol hexakisphosphate in the maintenance of basal resistance to plant pathogens. Plant Journal. 56 (4), 638-652 (2008).
- Poon, J. S. Y., Le Fevre, R. E., Carr, J. P., Hanke, D. E., Murphy, A. M. Inositol hexakisphosphate biosynthesis underpins PAMP-triggered immunity to Pseudomonas syringae pv. tomato in Arabidopsis thaliana but is dispensable for establishment of systemic acquired resistance. Molecular Plant Pathology. 21 (3), 376-387 (2020).
- Wild, R., et al. Control of eukaryotic phosphate homeostasis by inositol polyphosphate sensor domains. Science. 352 (6288), 986-990 (2016).
- Shears, S. B. Inositol pyrophosphates: Why so many phosphates. Advances in Biological Regulation. 57, 203-216 (2015).
- Shears, S. B. Intimate connections: Inositol pyrophosphates at the interface of metabolic regulation and cell signaling. Journal of Cellular Physiology. 233 (3), 1897-1912 (2018).
- Desai, M., et al. Two inositol hexakisphosphate kinases drive inositol pyrophosphate synthesis in plants. Plant Journal. 80 (4), 642-653 (2014).
- Laha, D., et al. VIH2 Regulates the Synthesis of Inositol Pyrophosphate InsP8 and Jasmonate-Dependent Defenses in Arabidopsis. Plant Cell. 27 (4), 1082-1097 (2015).
- Laha, D., et al. Arabidopsis ITPK1 and ITPK2 Have an Evolutionarily Conserved Phytic Acid Kinase Activity. Acs Chemical Biology. 14 (10), 2127-2133 (2019).
- Dorsch, J. A., et al. Seed phosphorus and inositol phosphate phenotype of barley low phytic acid genotypes. Phytochemistry. 62 (5), 691-706 (2003).
- Flores, S., Smart, C. C. Abscisic acid-induced changes in inositol metabolism in Spirodela polyrrhiza. Planta. 211 (6), 823-832 (2000).
- Brearley, C. A., Hanke, D. E. Inositol phosphates in barley (Hordeum vulgare L) aleurone tissue are stereochemically similar to the products of breakdown of InsP(6) in vitro by wheat-bran phytase. Biochemical Journal. 318, 279-286 (1996).
- Laha, N. P., et al. ITPK1-Dependent Inositol Polyphosphates Regulate Auxin Responses in Arabidopsis thaliana. bioRxiv. , (2020).
- Laha, D., et al. Inositol Polyphosphate Binding Specificity of the Jasmonate Receptor Complex. Plant Physiology. 171 (4), 2364-2370 (2016).
- Dong, J. S., et al. Inositol Pyrophosphate InsP(8) Acts as an Intracellular Phosphate Signal in Arabidopsis. Molecular Plant. 12 (11), 1463-1473 (2019).
- Zhu, J., et al. Two bifunctional inositol pyrophosphate kinases/phosphatases control plant phosphate homeostasis. Elife. 8, (2019).
- Couso, I., et al. Synergism between Inositol Polyphosphates and TOR Kinase Signaling in Nutrient Sensing, Growth Control, and Lipid Metabolism in Chlamydomonas. Plant Cell. 28 (9), 2026-2042 (2016).
- Ito, M., et al. Hydrophilic interaction liquid chromatography-tandem mass spectrometry for the quantitative analysis of mammalian-derived inositol poly/pyrophosphates. Journal of Chromatography A. 1573, 87-97 (2018).
- Wilson, M. S. C., Saiardi, A. Inositol Phosphates Purification Using Titanium Dioxide Beads. Bio-Protocol. 8 (15), (2018).
- Loss, O., Azevedo, C., Szijgyarto, Z., Bosch, D., Saiardi, A. Preparation of Quality Inositol Pyrophosphates. Jove-Journal of Visualized Experiments. (55), e3027 (2011).
- Harmel, R. K., et al. Harnessing C-13-labeled myo-inositol to interrogate inositol phosphate messengers by NMR Electronic supplementary information (ESI) available. Chemical Science. 10 (20), 5267-5274 (2019).
- Azevedo, C., Saiardi, A. Extraction and analysis of soluble inositol polyphosphates from yeast. Nature Protocols. 1 (5), 2416-2422 (2006).
- Shears, S. B. Inositol Phosphates: Methods and Protocols. Miller, G. J. , Springer US. 1-28 (2020).
- Wilson, M. S. C., Saiardi, A. Importance of Radioactive Labelling to Elucidate Inositol Polyphosphate Signalling. Topics in Current Chemistry. 375 (1), (2017).
- Stevenson-Paulik, J., et al. Inositol phosphate metabolomics: Merging genetic perturbation with modernized radiolabeling methods. Methods. 39 (2), 112-121 (2006).
- Liu, C., Riley, A. M., Yang, X., Shears, S. B., Potter, B. V. L. Synthesis and Biological Activity of d- and l-chiro-Inositol 2,3,4,5-Tetrakisphosphate: Design of a Novel and Potent Inhibitor of Ins(3,4,5,6)P4 1-Kinase/Ins(1,3,4)P3 5/6-Kinase. Journal of Medicinal Chemistry. 44 (18), 2984-2989 (2001).
- Hughes, P. J., Hughes, A. R., Putney, J. W., Shears, S. B. The regulation of the phosphorylation of inositol 1,3,4-trisphosphate in cell-free preparations and its relevance to the formation of inositol 1,3,4,6-tetrakisphosphate in agonist-stimulated rat parotid acinar cells. Journal of Biological Chemistry. 264 (33), 19871-19878 (1989).
- Shears, S. B., Kirk, C. J., Michell, R. H. The pathway of myo-inositol 1,3,4-trisphosphate dephosphorylation in liver. The Biochemical journal. 248 (3), 977-980 (1987).
- Stevenson-Paulik, J., Odom, A. R., York, J. D. Molecular and Biochemical Characterization of Two Plant Inositol Polyphosphate 6-/3-/5-Kinases. Journal of Biological Chemistry. 277 (45), 42711-42718 (2002).
- Stephens, L. R., Hawkins, P. T., Downes, C. P. An analysis of myo-[3H]inositol trisphosphates found in myo-[3H]inositol prelabelled avian erythrocytes. The Biochemical journal. 262 (3), 727-737 (1989).
- Saiardi, A., et al. Mammalian inositol polyphosphate multikinase synthesizes inositol 1,4,5-trisphosphate and an inositol pyrophosphate. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98 (5), 2306 (2001).
- Azevedo, C., Burton, A., Bennett, M., Onnebo, S. M. N., Saiardi, A. Inositol Phosphates and Lipids: Methods and Protocols. Barker, C. J. , Humana Press. 73-85 (2010).
- Saiardi, A., Caffrey, J. J., Snyder, S. H., Shears, S. B. The Inositol Hexakisphosphate Kinase Family: CATALYTIC FLEXIBILITY AND FUNCTION IN YEAST VACUOLE BIOGENESIS. Journal of Biological Chemistry. 275 (32), 24686-24692 (2000).
- Brearley, C. A., Hanke, D. E. Inositol phosphates in the duckweed Spirodela polyrhiza L. Biochemical Journal. 314, 215-225 (1996).
- Pollard, J. K., Steward, F. C., Shantz, E. M. Hexitols in Coconut Milk - Their Role in Nurture of Dividing Cells. Plant Physiology. 36 (4), 492 (1961).
- Donahue, J. L., et al. The Arabidopsis thaliana Myo-inositol 1-phosphate synthase1 gene is required for Myo-inositol synthesis and suppression of cell death. Plant Cell. 22 (3), 888-903 (2010).
- Desfougeres, Y., Wilson, M. S. C., Laha, D., Miller, G. J., Saiardi, A. ITPK1 mediates the lipid-independent synthesis of inositol phosphates controlled by metabolism. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (49), 24551-24561 (2019).
