Denne protokollen beskriver en anvendelse av enkeltmolekylfluorescens in situ hybridisering (smFISH) for å måle in vivo kinetikk av mRNA syntese og nedbrytning.
Enkeltmolekylfluorescens i situ hybridisering (smFISH) gjør det mulig å telle det absolutte antallet mRNAs i individuelle celler. Her beskriver vi en anvendelse av smFISH for å måle frekvensen av transkripsjon og mRNA nedbrytning i Escherichia coli. Siden smFISH er basert på faste celler, utfører vi smFISH på flere tidspunkter i løpet av et tidsforløpet, det vil vil vil at når celler gjennomgår synkroniserte endringer ved induksjon eller undertrykkelse av genuttrykk. På hvert tidspunkt utmerker underregioner av en mRNA seg ut til sondetranskripsjonsutnavming og for tidlig avslutning. Resultatet av denne protokollen gjør det også mulig å analysere intracellulær lokalisering av mRNAs og heterogenitet i mRNA-kopinumre blant celler. Ved hjelp av denne protokollen kan mange eksempler (~ 50) behandles innen 8 timer, som hvor mye tid som trengs for bare noen få eksempler. Vi diskuterer hvordan du bruker denne protokollen til å studere transkripsjon og nedbrytning kinetikk av ulike mRNAs i bakterielle celler.
Flyten av genetisk informasjon fra DNA til mRNA og protein er en av de mest grunnleggende cellulære prosessene, hvis regulering er viktig for cellulær kondisjon1. Antall mRNAer i en celle bestemmes av to dynamiske prosesser, transkripsjon og mRNA-nedbrytning. Men hvordan transkripsjon og mRNA nedbrytning reguleres i tid og rom for en enkelt celle forblir ikke helt forstått, hovedsakelig på grunn av mangel på eksperimentelle metoder for å kvantitativt måle deres kinetikk in vivo.
Metoder basert på totale mRNAs hentet fra en populasjon av celler, for eksempel Northern blot, RT-PCR, RNA sekvensering og genuttrykk microarrays, kan måle den relative forskjellen i mRNA nivåer og har blitt mye brukt til å analysere frekvensen av transkripsjon forlengelse2,3,4,5 eller frekvensen av mRNA nedbrytning6,7. De gir imidlertid ikke det absolutte antallet mRNAer per celle, og dermed er de ikke egnet for å sonderere frekvensen av transkripsjonsinitiering8. Også fordi mRNAs er hentet fra en populasjon av celler, kan den romlige fordelingen av mRNAer i en enkelt celle og variabiliteten av mRNA-kopinumre mellom celler ikke måles.
Neste generasjons RNA-sekvensering på individuelle celler (scRNAseq) kan kvantifisere antall mRNAer per celle i genomisk skala9. Det er imidlertid fortsatt vanskelig å bruke denne teknikken til å måle transkripsjonskinetikk, på grunn av utfordringer med prøveforberedelse og høye kostnader. Spesielt har anvendelsen av scRNAseq til bakterier vært teknisk vanskelig på grunn av lav mRNA overflod10,11.
Enkeltmolekylfluorescens i situ hybridisering (smFISH) er basert på hybridisering av fluorescerende merkede enkelttrådet sonder hvis sekvenser er komplementære til målet mRNA av interesse12,13. Konseptet sekvensspesifikk hybridisering ligner på det som brukes i Nordlig blot eller RT-PCR, men hybridiseringen gjøres in situ i faste celler, for å bevare den opprinnelige lokaliseringen av mRNAs. Signalet til en enkelt mRNA forsterkes ved hjelp av mange prober, ~ 20 nukleotider (nt) i lengde, hybridiserer til forskjellige deler av en mRNA (figur 1A)13. I denne “flislegging” sonde tilnærming, antall sonder som trengs for å oppdage en enkelt mRNA setter en lavere grense på lengden på mRNA som kan analyseres. Alternativt kan mRNA av interesse være transkripsjonelt smeltet til en ikke-koding rekke tandem Lac operatør sekvenser, slik at flere kopier av en fluorescerende merket lacO sonde hybridisere til en enkelt mRNA (Figur 1B)14.
smFISH har blitt brukt til å kvantifisere antall mRNAer per celle ved steady state (det vil si når syntese og forfall er i balanse) og for å analysere gjennomsnittet og variasjonen til mRNAer blant bakterielleceller 15,,16,,17. Nylig har smFISH blitt brukt til å kvantifisere mRNA-tall ved ikke-steady state, rett etter induksjon eller undertrykkelse av genuttrykk i E. coli18,19,20. De timelige endringene i de absolutte mRNA-kopinumrene ble deretter brukt til å beregne frekvensen av transkripsjonsinitiering, forlengelse og oppsigelse, samt frekvensen av mRNA-nedbrytning. For dette programmet kan konvensjonelle smFISH-prosedyrer være tungvinte fordi det er mange prøver, som hver representerer ett tidspunkt, som må gå gjennom flere bufferutvekslingstrinn (det vil si sentrifugering og vasking). Her beskriver vi en smFISH-protokoll, der prøvehåndteringstrinnene forenkles dramatisk ved å få celler festet til overflaten av en dekkslipp og ved å aspirere væsker med et vakuumfiltreringssystem14,,19. Ved hjelp av uttrykket av lacZ i E. coli som eksempel, demonstreres hele arbeidsflyten ( figur2) inkludert bildeanalyse (figur 3) som gir in vivo kinetikk av transkripsjon (initiering, forlengelse og oppsigelse) og mRNA-nedbrytning, celle-til-celle-variabilitet i mRNA-uttrykk og mRNA-lokalisering. Vi forventer at protokollen er allment aktuelt for sonde in vivo kinetikk og lokalisering av andre mRNAs i ulike bakteriearter.
Her presenterte vi en smFISH-protokoll for måling av mRNA-kinetikk i E. coli. I de tidligere publiserte smFISH-protokollene for bakterier23ble celler holdt i rørene helt til slutten av protokollen, det vil si til de er klare for bildebehandling. Selv om det har mange fordeler, for eksempel minimal uspesifikk binding av fluorescerende sonder på dekkglassoverflaten23,er det vanskelig å følge disse protokollene når det er mange prøver fra et tidsforløpets eksperiment. Først må et relativt stort volum av celler (> 1 ml) prøves og til og med høstes før fiksering. For det andre må celleprøvene sentrifugeres flere ganger for å utveksle løsninger og å vaske etter hybridiseringstrinnet. I vår protokoll blandes et lite volum (<1 ml) av kultur direkte med en festeløsning i et 1,5 ml rør, noe som bidrar til å raskt "fryse" celletilstanden i øyeblikket for prøvetaking. Cellene forblir også festet til overflaten gjennom hele prosedyren, og ulike løsninger kan byttes raskt ved å aspirere væsker med et vakuumfiltreringssystem og bruke løsningsdråper samtidig med en flerkanals pipette. Denne forskjellen gjør vår protokoll svært fordelaktig når et stort antall prøver må behandles samtidig. Ved hjelp av vår protokoll kan 12-48 prøver håndteres samtidig, og hele FISH-prosedyren kan fullføres innen ~ 8 timer, omtrent en lignende mengde tid som trengs for noen få prøver (figur 2). Selv om vi brukte uttrykket av lacZ i E. coli som et eksempel, er protokollen allment anvendelig for ulike gener og bakterielle arter med hensyn som diskuteres nedenfor.
For forskjellige gener er det første du må vurdere smFISH-sonder. Man kan designe oligonukleotid sonder som fliser mRNA av interesse (Figur 1A)13. I denne “flislegging” sonde tilnærming, hver sonde er ~ 20 base lang og merket med en fluorofor på 5 ‘eller 3’ terminus. Denne strategien er praktisk som ingen genetisk manipulasjon er nødvendig. Alternativt kan en tandemg repeat av ~ 20 bp sekvens, fremmed for den genomiske sekvensen (f.eks. en rekke lacO-sekvens i Caulobacter crescentus14),settes inn i det uoversette området av et gen av interesse, og en enkelt sonde komplementær til gjentakelsesenheten brukes til å merke mRNA (“array” tilnærming; Figur 1B). I begge tilfeller dekorerer flere fluoroforer en mRNA, noe som gir forsterket fluorescenssignal som lett kan differensieres fra en enkelt sonde som ikke er spesifikt bundet inne i en celle.
Om du vil velge “flislegging” eller “array” tilnærminger avhenger av den negative kontrollen, et utvalg der uspesifikk binding av sonder er testet fordi den mangler målet mRNA. For flislegging sonder (Figur 1A), en mutant belastning uten genet av interesse eller en tilstand, der genet ikke er transkribert (f.eks undertrykkelse av lacZ) kan tjene som en negativ kontroll for testing av uspesifikk binding av sonder. For den matrisebaserte smFISH (figur 1B)kan en villtypebelastning som mangler matrisen, fungere som en negativ kontroll fordi den ikke inneholder bindingssteder for sondene.
Optimale hybridiseringsforhold kan avhenge av sondesekvensene og til og med valget av fluoroforfargestoffer. Vi optimaliserte hybridiseringstilstanden for lacZ-sondesett ved å holde hybridiseringstemperaturen ved 37 °C og teste ulike konsentrasjoner av sondesett og formamid i hybridiseringsløsningen. Høyere konsentrasjoner av formamid har en tendens til å redusere både uspesifikk og spesifikkbinding 26,,35. Vi anbefaler systematisk å endre hybridiseringen og vaskeforholdene samtidig som hybridiseringstid og temperatur er like. Etter hvert som tilstanden blir strengere, reduseres både uspesifikt og spesifikk binding (figur 6). Det er viktig å finne et punkt der den uspesifikke bindingen begynner å treffe under en akseptabel terskel uten ytterligere å gå på akkord med spesifikk binding. Vi brukte for eksempel signalnivået som ble oppnådd uten sonder (“ingen prober”) som en terskel (figur 6).
Den tofargede smFISH-metoden som merker to separate regioner i en mRNA er begrenset til lange gener. For å måle frekvensen av transkripsjon forlengelse, vi tok nytte av det faktum at lacZ er lang (3075 bp) og uttrykket kan induseres av IPTG. Når et gen er kort, er det vanskelig å designe to fliser sonde sett (nær 5 ‘og 3 ‘ ender) og løse tidsforsinkelsen mellom opptredener av 5 ‘vs. 3’ mRNA regioner. I dette tilfellet kan man telle gryende mRNAs på jevn tilstand ved smFISH og analysere fordelingen med en analytisk modell som har frekvensen av transkripsjon forlengelse som en passende parameter20. Også når et gen av interesse ikke er induserbart, kan man behandle celler med rifampicin på tid null og måle den timelige endringen i 5′ og 3′ mRNA-underregioner. Forsinkelsen fra reduksjonen av 5′ mRNA-signal til 3′ mRNA-signal kan deretter brukes til å beregne frekvensen av transkripsjonsutrevaluering som gjort tidligere31.
Til slutt er smFISH-protokollen allsidig og kan kombineres med andre merkingsordninger. Tidligere ble DNA-locus visualisert sammen med mRNAs ved å kombinere mRNA FISH med enten DNA FISH14 eller fluorescerende reporter-operatørsystem20. Proteinprodukter kan visualiseres ved å utføre immunofluorescence sammen med mRNA FISH14,36. Det kan også kombineres med tredimensjonal superoppløsning mikroskopi37 for å visualisere mRNAs i alle tre dimensjoner38,39.
The authors have nothing to disclose.
Denne protokollen ble utviklet av S.K. under hennes postdoktorforskning i Dr. Christine Jacobs-Wagners laboratorium ved Howard Hughes Medical Institute og Microbial Sciences Institute ved Yale University. Vi takker Dr. Jacobs-Wagner og hennes laboratoriemedlemmer for ulike innspill under metodeutviklingen og Laura Troyer for kritisk lesing av manuskriptet. S.K. anerkjenner støtte fra Searle Scholars Program; K.V. anerkjenner støtte fra James Scholar Preble Research Award fra University of Illinois.
Bacterial strain | |||
Escherichia coli MG1655 | |||
Chemicals, peptides, and others | |||
Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 34851 | UPLC buffer B |
Ammonium chloride | Fisher Chemical | A661-500 | To make M9 medium |
Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | B2518 | Probe hybridization |
Calcium chloride | Acros Organics | 349610250 | To make M9 medium |
Casamino acid | BD Difco | 223050 | To make M9 medium |
Cy3B NHS ester | GE Healthcare Life Sciences | PA63101 | Fluorophore for FISH probes |
Cy5 NHS ester | GE Healthcare Life Sciences | PA15101 | Fluorophore for FISH probes |
DEPC | Sigma-Aldrich | D5758 | |
Dextran sulfate | Millipore | S4030 | Probe hybridization |
Dextrose | Fisher Chemical | D16 | To repress the expression of lacZ |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | To dissolve fluorophores |
E. coli tRNA | Sigma-Aldrich | R1753 | Probe hybridization |
Ethanol | Decon Laboratories | 2701 | Used in DNA purification, lysis, and cleaning coverslips |
FISH probes | Biosearch Technologies | Sequences are published in ref#16 | |
Formaldehyde | Ladd Research Industries | 20295 | Fixation |
Formamide | American Bio | AB00600 | Probe hybridization, pre-hybridization, and wash |
Glycerol | Americanbio | AB00751-01000 | To make M9 medium |
Isopropylthio-β-galactoside (IPTG) | Invitrogen | 15529019 | lacZ induction |
Magnesium sulfate | Fisher Chemical | M65-500 | To make M9 medium |
2-Nitrophenyl β-D-fucopyranoside (ONPF) | Santa Cruz Biotechnology | sc-216258 | lacZ repression |
Picodent twinsil 22 | Picodent | 1300 1000 | Sealant |
Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P8920 | To treat the coverslip surface |
Potassium chloride | Fisher BioReagents | BP366-500 | To make PBS |
Potassium phosphate monobasic | Fisher BioReagents | BP362-500 | To make PBS and M9 medium |
Rifampicin | Sigma-Aldrich | R3501 | To stop transcription initiation |
Saline-sodium citrate buffer (SSC) | Invitrogen | AM9763 | Probe hybridization, pre-hybridization, and wash |
sodium bicarbonate | Fisher BioReagents | BP328-500 | Fluorophore-probe conjugation |
Sodium chloride | Fisher BioReagents | BP358-1 | For DNA purification, PBS and M9 medium |
Sodium phosphate dibasic | Fisher BioReagents | BP332-500 | To make PBS and M9 medium |
Sodium phosphate monobasic | Fisher BioReagents | BP329-500 | To make a sodium phosphate buffer |
Super PAP Pen | Invitrogen | 8899 | Hydrophobic marker for coverslips |
TetraSpek microspheres | Invitrogen | T7280 | Controls for multi-channel registration |
Thiamine | Sigma-Aldrich | T1270 | To make M9 medium |
Triethylammonium acetate | Sigma-Aldrich | 90358 | UPLC buffer A |
Vanadyl ribonucleoside complex (VRC) | Sigma-Aldrich | 94742 | Probe hybridization and pre-hybridization |
Equipment | |||
C18 column | Waters | Acquity BEH C18 column | |
Countertop centrifuge | Eppendorf | 5425 | |
Countertop incubator | Eppendorf | Thermomixer F1.5 | |
Incubator (Oven) | Thermo Scientific | 51030514 | Gravity convection |
Water purification system | Millipore | Milli-Q Reference | |
Nanodrop | Thermo Scientific | 2000C | |
Nitrogen gas | Building | For blow-drying coverslips and glass slides | |
UPLC | Waters | Acquity UPLC system | |
Vacuum and aspirator | Building | Aspirator is made of a filtration flask with a side arm. | |
Vacuum concentrator | Labconco | 7810010 | Centrivap; to dry samples collected from UPLC. |
Vortexer | Scientific Industries | Genie-2 SI-0236 | |
Water bath shaker | New Brunswick | Innova 3100 | Critical for time-course experiments |
Water bath sonicator | VWR | 97043-960 | To clean coverslips and glass slides |
Tools | |||
1.5-mL tubes | Eppendorf | 22431021 | DNA lobind tubes |
1000-uL pipette tip box | Denville Scientific | P1126 | An empty box after using all the tips |
Coplin jar | SPI | 01240-AB | To clean coverslips and glass slides |
Coverslip | Fisher Scientific | 22-050-230 | 24×60 No1 |
Filtered pipette tips | Denville Scientific | P1121,P1122,P1126 | SHARP® Precision Barrier Tips |
Forceps | SPI | K35a | To handle clean coverslips and glass slides |
Glass slide | Fisher Scientific | 12-544-1 | |
Gloves | Microflex | MK-296-M | |
Multichannel pipetter | Eppendorf | 2231300045 | To use in the washing step (#7) |
Pipette | Gilson | P1000, P200, P20 | |
Reagent reservoir | MTC Bio | P8025-1S | To use in the washing step (#7) |
Syringe filter (0.22 um) | Millipore | SLGS033SS | |
Timer | VWR | 62344-641 | |
Software and algorithms | |||
MATLAB | Mathworks | R2013 and up | https://www.mathworks.com |
MicrobeTracker or Oufti | https://www.github.com/JacobsWagnerLab/MicrobeTracker | ||
https://oufti.org/ | |||
Stellaris Probe Designer | Biosearch Technologies | https://www.biosearchtech.com/support/tools/design-software/stellaris-probe-designer | |
Microscope | |||
CCD camera | Hamamatsu Photonics | Orca-II-ER | |
Cy3 filter set | Chroma | 49004 | |
Cy5 filter set | Chroma | 49006 | |
Epi-fluorescence microscope | Nikon | Eclipse Ti | For phase-contrast and epi fluorescence |
Fluorescence excitation source | Lumencor | SOLA-E | |
Nikon Elements software | Nikon | software that controls the microscope setup | |
Phase-contrast 100x objective | Nikon | Plan Apochromat (NA 1.45) | |
Probe sequence | |||
DNA oligos with C6 amino modification at the 5' end | Biosearch Technologies Inc | ||
lacZ1 | GTGAATCCGTAATCATGGTC | 5' mRNA | |
lacZ2 | TCACGACGTTGTAAAACGAC | 5' mRNA | |
lacZ3 | ATTAAGTTGGGTAACGCCAG | 5' mRNA | |
lacZ4 | TATTACGCCAGCTGGCGAAA | 5' mRNA | |
lacZ5 | ATTCAGGCTGCGCAACTGTT | 5' mRNA | |
lacZ6 | AAACCAGGCAAAGCGCCATT | 5' mRNA | |
lacZ7 | AGTATCGGCCTCAGGAAGAT | 5' mRNA | |
lacZ8 | AACCGTGCATCTGCCAGTTT | 5' mRNA | |
lacZ9 | TAGGTCACGTTGGTGTAGAT | 5' mRNA | |
lacZ10 | AATGTGAGCGAGTAACAACC | 5' mRNA | |
lacZ11 | GTAGCCAGCTTTCATCAACA | 5' mRNA | |
lacZ12 | AATAATTCGCGTCTGGCCTT | 5' mRNA | |
lacZ13 | AGATGAAACGCCGAGTTAAC | 5' mRNA | |
lacZ14 | AATTCAGACGGCAAACGACT | 5' mRNA | |
lacZ15 | TTTCTCCGGCGCGTAAAAAT | 5' mRNA | |
lacZ16 | ATCTTCCAGATAACTGCCGT | 5' mRNA | |
lacZ17 | AACGAGACGTCACGGAAAAT | 5' mRNA | |
lacZ18 | GCTGATTTGTGTAGTCGGTT | 5' mRNA | |
lacZ19 | TTAAAGCGAGTGGCAACATG | 5' mRNA | |
lacZ20 | AACTGTTACCCGTAGGTAGT | 5' mRNA | |
lacZ21 | ATAATTTCACCGCCGAAAGG | 5' mRNA | |
lacZ22 | TTTCGACGTTCAGACGTAGT | 5' mRNA | |
lacZ23 | ATAGAGATTCGGGATTTCGG | 5' mRNA | |
lacZ24 | TTCTGCTTCAATCAGCGTGC | 5' mRNA | |
lacZ25 | ACCATTTTCAATCCGCACCT | ||
lacZ26 | TTAACGCCTCGAATCAGCAA | ||
lacZ27 | ATGCAGAGGATGATGCTCGT | ||
lacZ28 | TCTGCTCATCCATGACCTGA | ||
lacZ29 | TTCATCAGCAGGATATCCTG | ||
lacZ30 | CACGGCGTTAAAGTTGTTCT | ||
lacZ31 | TGGTTCGGATAATGCGAACA | ||
lacZ32 | TTCATCCACCACATACAGGC | ||
lacZ33 | TGCCGTGGGTTTCAATATTG | ||
lacZ34 | ATCGGTCAGACGATTCATTG | ||
lacZ35 | TGATCACACTCGGGTGATTA | ||
lacZ36 | ATACAGCGCGTCGTGATTAG | ||
lacZ37 | GATCGACAGATTTGATCCAG | ||
lacZ38 | AAATAATATCGGTGGCCGTG | ||
lacZ39 | TTTGATGGACCATTTCGGCA | ||
lacZ40 | TATTCGCAAAGGATCAGCGG | ||
lacZ41 | AAGACTGTTACCCATCGCGT | ||
lacZ42 | TGCCAGTATTTAGCGAAACC | ||
lacZ43 | AAACGGGGATACTGACGAAA | ||
lacZ44 | TAATCAGCGACTGATCCACC | ||
lacZ45 | GGGTTGCCGTTTTCATCATA | ||
lacZ46 | TCGGCGTATCGCCAAAATCA | ||
lacZ47 | TTCATACAGAACTGGCGATC | ||
lacZ48 | TGGTGTTTTGCTTCCGTCAG | ||
lacZ49 | ACGGAACTGGAAAAACTGCT | 3' mRNA | |
lacZ50 | TATTCGCTGGTCACTTCGAT | 3' mRNA | |
lacZ51 | GTTATCGCTATGACGGAACA | 3' mRNA | |
lacZ52 | TTTACCTTGTGGAGCGACAT | 3' mRNA | |
lacZ53 | GTTCAGGCAGTTCAATCAAC | 3' mRNA | |
lacZ54 | TTGCACTACGCGTACTGTGA | 3' mRNA | |
lacZ55 | AGCGTCACACTGAGGTTTTC | 3' mRNA | |
lacZ56 | ATTTCGCTGGTGGTCAGATG | 3' mRNA | |
lacZ57 | ACCCAGCTCGATGCAAAAAT | 3' mRNA | |
lacZ58 | CGGTTAAATTGCCAACGCTT | 3' mRNA | |
lacZ59 | CTGTGAAAGAAAGCCTGACT | 3' mRNA | |
lacZ60 | GGCGTCAGCAGTTGTTTTTT | 3' mRNA | |
lacZ61 | TACGCCAATGTCGTTATCCA | 3' mRNA | |
lacZ62 | TAAGGTTTTCCCCTGATGCT | 3' mRNA | |
lacZ63 | ATCAATCCGGTAGGTTTTCC | 3' mRNA | |
lacZ64 | GTAATCGCCATTTGACCACT | 3' mRNA | |
lacZ65 | AGTTTTCTTGCGGCCCTAAT | 3' mRNA | |
lacZ66 | ATGTCTGACAATGGCAGATC | 3' mRNA | |
lacZ67 | ATAATTCAATTCGCGCGTCC | 3' mRNA | |
lacZ68 | TGATGTTGAACTGGAAGTCG | 3' mRNA | |
lacZ69 | TCAGTTGCTGTTGACTGTAG | 3' mRNA | |
lacZ70 | ATTCAGCCATGTGCCTTCTT | 3' mRNA | |
lacZ71 | AATCCCCATATGGAAACCGT | 3' mRNA | |
lacZ72 | AGACCAACTGGTAATGGTAG | 3' mRNA |