Summary
Этот протокол описывает применение одномекулярной флуоресценции на месте гибридизации (smFISH) для измерения кинетики in vivo синтеза и деградации мРНК.
Abstract
Одномекулярная флуоресценция на месте гибридизации (smFISH) позволяет подсчитать абсолютное количество мРНК в отдельных клетках. Здесь мы описываем применение smFISH для измерения темпов транскрипции и деградации мРНК в кишечной палочке. Поскольку smFISH основан на фиксированных клетках, мы выполняем smFISH в нескольких точках времени во время эксперимента, т.е. когда клетки претерпевают синхронизированные изменения после индукции или подавления экспрессии генов. В каждой точке времени субрегионы мРНК спектрально отличаются от удлинением транскрипции зонда и преждевременным прекращением. Результат этого протокола также позволяет анализировать внутриклеточную локализацию мРНК и неоднородность в числах копирования мРНК среди клеток. Используя этот протокол, многие образцы (50 евро) могут быть обработаны в течение 8 ч, как и количество времени, необходимое для нескольких образцов. Мы обсуждаем, как применить этот протокол для изучения транскрипции и деградации кинетики различных мРНК в бактериальных клетках.
Introduction
Поток генетической информации из ДНК в мРНК и белок является одним из самых фундаментальных клеточных процессов, регуляции которого важны для клеточнойпригодности 1. Количество мРНК в клетке определяется двумя динамическими процессами, транскрипцией и деградацией мРНК. Однако, как транскрипция и деградация мРНК регулируются во времени и пространстве одной клетки остается не полностью понятым, в основном из-за нехватки экспериментальных методов количественного измерения их кинетики in vivo.
Методы, основанные на общей мРНК, извлеченные из популяции клеток, таких как Северная помарка, RT-PCR, секвенирование РНК и микроармей экспрессии генов, могут измерять относительную разницу в уровнях мРНК и широко использовались для анализаскорости удлинивания транскрипции 2,,3,,4,,5 или скоростидеградации мРНК 6,,7. Тем не менее, они не обеспечивают абсолютное количество мРНК на ячейку, и, следовательно, они не подходят для зондирования скорости инициациитранскрипции 8. Кроме того, поскольку мРНК извлекаются из популяции клеток, пространственное распределение мРНК в пределах одной клетки и изменчивость числа копий мРНК среди клеток не могут быть измерены.
Секвенирование РНК нового поколения на отдельных клетках (scRNAseq) может количественно определить количество мРНК на клетку в геномной шкале9. Тем не менее, по-прежнему трудно использовать этот метод для измерения транскрипции кинетики, из-за проблем с подготовкой образца и высокой стоимости. В частности, применение scRNAseq к бактериям было технически затруднено из-за низкого изобилиямРНК 10,,11.
Одномекулярная флуоресценция на месте гибридизации (smFISH) основана на гибридизации флуоресцентно помеченных однострухихзондов,последовательности которых дополняют целевуюмРНК интереса 12,13. Концепция гибридизации конкретных последовательностей аналогична концепции, используемой в Северной помарке или РТ-ПЦР, но гибридизация происходит на месте в пределах фиксированных ячеек, чтобы сохранить местную локализацию мРНК. Сигнал одной мРНК усиливается с помощью многих зондов, 20 нуклеотидов (nt) в длину, гибридизируясь с различными частямимРНК (рисунок 1A)13. В этом "плитка" зонд подход, количество зондов, необходимых для обнаружения одной мРНК устанавливает более низкий предел по длине мРНК, которые могут быть проверены. Кроме того, мРНК интерес может быть транскрипционно сливается с некодирующих массив тандем Лак оператора последовательностей, таким образом, что несколько копий флуоресцентно помечены лако зонд гибридизироваться на однумРНК ( Рисунок 1B)14.
smFISH был использован для количественной оценки количества мРНК на клетку в стабильном состоянии (т.е. при синтезе и распаде находятся в балансе) и для анализа среднего и изменчивости мРНК средибактериальных клеток 15,,16,17. В последнее время smFISH был применен для количественной оценки мРНК номера в неустойком состоянии, сразу после индукции или подавления экспрессии генов в кишечнойпалочке 18,19,20. Временные изменения в абсолютных числах копий мРНК затем использовались для расчета скорости инициации транскрипции, удлинения и прекращения, а также скорости деградации мРНК. Для этого приложения обычные процедуры smFISH могут быть громоздкими, поскольку существует множество образцов, каждый из которых представляет одну точку времени, которые должны пройти через несколько шагов буферного обмена (т.е. центрифугации и стирки). Здесь мы описываем протокол smFISH, в котором шаги обработки образца резко упрощаются, прилипая к поверхности крышки и аспирируя жидкости с вакуумной системойфильтрации 14,19. В качестве примера можно привести экспрессию лака в кишечной палочке,демонстрируется полный рабочий процесс (рисунок 2),включаяанализ изображений (рисунок 3),что дает виво кинетику транскрипции (начало, удлинение и прекращение) и деградацию мРНК, изменчивость клеток к клетке в выражении мРНК и локализацию мРНК. Мы ожидаем, что протокол широко применим к зондированию кинетики vivo и локализации других мРНК у различных видов бактерий.
Protocol
1. Подготовка зондов SMFISH
ПРИМЕЧАНИЕ: Для обозначения зондов smFISH с помощью одного флюорофора следуйте стандартному протоколу маркировки олигонуклеотидов нуклеиновой кислоты на основе химии эстерГСЗ 21.
- Дизайн зондов smFISH. Решите, следует ли использовать "плитки" зондов или "array" зондов (Рисунок 1) для гена интереса. Смотрите раздел Обсуждение о том, как принять решение.
- Для "плитки" зондов(рисунок 1A), используйте онлайн-инструмент дизайнера зонда (например, см. Таблицу материалов).
- Для "array" зонды (Рисунок 1B), выполнить BLAST последовательности поиска, чтобы убедиться, что зонд последовательность не дополняет любые другие последовательности мРНК.
- Для изучения транскрипции лака мРНК и кинетики деградации используйте два набора из 24 зондов, каждый из которых охватывает первую и последнюю 1 кб областей лака (3072 б.п.)19.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эти наборы зондов, hereinafter, называют "5" мРНК зонд "и" 3' mRNA зонд ", соответственно. Последовательности этих зондов перечислены в таблице материалов.
- Закажите последовательности зондов в качестве олигонуклеотидов ДНК с аминокислотным связующим C6 в конце 5' Растворите отдельные зонды в воде до 1 мМ.
- Объедините равноумолярное количество зондов для наборов "5' mRNA probe" и "3' mRNA probe". Например, для 5'mRNA зонда, установленного для лака,объединить 20 йл каждого зонда (всего 24 вида зондов в наборе).
- Выполните этанолосадков 22 из комбинированных зондов для удаления любых загрязнений первичных и вторичных аминов (таких как Трис, глицин, и аммония соли), которые могут препятствовать спряжения реакции. В конце концов, растворить гранулы ДНК в 100 йл воды (уступая 4,5 мм ДНК в наборе зонда).
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг рекомендуется, даже если зонды прошли стандартную очистку десата производителем. Стандартная очистка на основе фильтра может работать вместо и в дополнение к осадкам этанола. - Выберите два спектрально различных фторфоров с монофункциональной NHS ester moiety, таким образом, что 5' и 3' mRNA наборы зонда могут быть помечены по-разному. Например, подготовить Cy5 NHS эстер для 5' mRNA зондов и Cy3B NHS эстер для 3' mRNA зондов. Растворите каждый тип фторфоров в ангидроусе DMSO до финальных 20 мг/мл (25 мМ).
- Приготовьте бикарбонат натрия 0,1 М (рН 8,5) прямо перед каждой реакцией маркировки. Воздействие воздуха в течение длительного времени снизит его рН и снизит эффективность маркировки.
- Для реакции спряжения объедините следующее: 15 МКЛ фторфорного запаса Cy5 (от шага 1.5), 4 МКЛ 5' мРНК-зонда (от шага 1.4), 75 МЛ бикарбоната натрия (от шага 1.6) и 7 мл воды. Оберните трубку алюминиевой фольгой и встряхните при комнатной температуре на 3-6 ч.
ПРИМЕЧАНИЕ: Более длинная инкубация не обязательно приводит к повышению эффективности маркировки. Кроме того, реакция может быть увеличена или уменьшена, если концентрации компонентов поддерживаются. - Повторите вышеуказанный шаг для набора зонда 3' mRNA и соответствующего флюорофора (т.е. Cy3B NHS-ester).
- Выполните этанолаосадков 22 для удаления оон-реагировали молекулы красителя. Растворите гранулы в 50 мкл буфера TE (10mM Tris-HCl pH 8.0 с 1mM EDTA).
- Оцените концентрацию ДНК и флюорофора с помощью спектрометра УФ-Вис.
- Измерьте абсорбанс на 260 nm и 559 nm (Cy3B) или 649 nm (Cy5). Если выборка слишком сконцентрирована, чтобы дать точное измерение, разбавьте 1 МКЛ образца до 10 МКЛ.
- Преобразование абсорбации в концентрацию:
ε ДНК 0,2МКМ -1 (для 20-нт одной нити ДНК), εCy5 и 0,25МКМ -1, и εCy3B и 0,13МКМ -1 DNA
ПРИМЕЧАНИЕ: «ДНК» – это концентрация всего зонда в растворе. Концентрация отдельных зондов примерно в 24 раз ниже. Концентрация общих зондов будет использоваться в качестве "концентрации зонда" с этой точки. Если соотношение между «ДНК» и «красителем» составляет 1, следующий шаг HPLCможет быть пропущен 23, и образец должен быть разбавлен до окончательных 4-5 МКМ в буфере TE.
- (Рекомендуемый) Очистите помеченные зонды от неокрашенных зондов и свободных красителей с помощью HPLC.
ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя этот дополнительный шаг очистки приведет к потере образца, это выгодно для приложений вниз по течению. Удаление неокрашенных зондов ДНК увеличит сигнал флуоресценции от целей мРНК и удаление неотредактированных красителей уменьшит фоновую флуоресценцию.- Подготовка HPLC со стандартной аналитической колонкой C18, трехэтиламмонийным ацетатом 0,1 М (TEAA) в качестве буфера А и ацетонитрилом в качестве буфера B.
- Добавьте 1 M TEAA в образец (из шага 1.9), чтобы сделать 0.1 M TEAA.
- Установите градиентную программу следующим образом: 0-5 мин с 0% B, 5-35 мин с 0-30% линейным градиентом B, 35-37 мин с 30-100% линейным градиентом В и 37-40 мин с 0% B. Держите скорость потока на уровне 0,1 мл/мин и записывая хроматограммы на 260 и 649 нм (для образцов с маркировкой Cy5) или на 260 и 559 нм (для образцов с маркировкой Cy3B).
- Соберите элайтный образец, когда абсорбанс увеличивается как в ДНК, так и в флюорофорных каналах.
- Сосредоточьте элалированный образец с помощью вакуумного концентратора и повторно приостановите гранулы в буфере TE 50-100.
- Проверьте концентрацию ДНК и флюорофора с помощью спектрометра UV-Vis (см. шаг 1.10). Разбавить, при необходимости, чтобы сделать окончательную концентрацию вокруг 4-5 МКМ. Храните зонды при -20 градусов по Цельсию
2. Подготовка решений
- Подготовь большой объем воды и буферов, обработанных DEPC(таблица 1). Эти решения могут длиться более года при комнатной температуре.
- Подготовка 4x фиксации раствора и мытья раствора(таблица 1).
- Подготовье решения для предварительной гибридизации и решения для гибридизации зонда(таблица 1). Подготовьте решение для гибридизации зонда во время инкубации в шаге 5.1 или шаге 6.1, а затем держите раствор в столешнице 37 градусов по Цельсию в течение 20-40 минут с крышкой, чтобы свести к минимуму воздействие света.
ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрации формамида, SSC и зонда были оптимизированы для наборов зонда лака, чтобы свести к минимуму фоновую флуоресценцию при максимизации реального сигнала. Подробнее о том, как изменить эти концентрации для различных приложений, можно найти в разделе Обсуждение.
3. Подготовка обложек и стеклянных горок
- Чистые крышки и стеклянные горки.
- Поместите отдельные крышки и слайды в банку Coplin с помощью типсов. Убедитесь, что крышки и слайды разделены и не касаются друг друга.
- Заполните банку 100% этанолом и закройте крышку. Поместите банку в водяную ванну ультразвуковой очиститель и sonicate в течение 15-20 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для соникателя водяной ванны рекомендуется отключить функцию нагревателя. - Вылейте этанол и промыть ультрачистой водой 3-4x. Используйте воду, вытекающей непосредственно из машины очистки воды.
- Вылейте воду из банки и заполните ее 70% этанола. Закройте крышку и выполните sonication в течение 15-20 минут и мыть с ультрачистой водой.
- Заполните банку ультрачистой водой и sonicate в течение 15-20 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Coverslips и стеклянные горки можно хранить на ночь в банке Coplin заполнены ультрачистой водой. - Возьмите слайд или крышку из банки Coplin с помощью чистых типсов и высушить его с помощью N2 газа. Повторите это для остальных слайдов и coverslips.
- Поместите высушенные слайды в чистую коробку для хранения до использования в шаге 7.5. Поместите высушенные крышки в пустой 1000-L пипетка кончик коробки, которая будет служить в качестве "камеры" в оставшейся процедуре.
- Используя гидрофобный маркер, нарисуйте круги на обложках после круглых отверстий в трубоуглой коробке. Эти круги (диаметром 0,5 см) будут служить «колодцами». Подождите, по крайней мере 5-10 мин для маркера, чтобы быть полностью высушены.
ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда держите крышку кончика коробки закрытой. - Нанесите на каждую колодец падение на 20 л на 0,1% поли-L-лизина. Инкубировать в течение 10-50 мин при комнатной температуре.
ПРИМЕЧАНИЕ: Отрегулируйте этот объем в зависимости от размера хорошо. Убедитесь, что раствор полностью охватывает площадь колодец. Для более длительной инкубации, будьте осторожны, чтобы избежать испарения. - После инкубации аспират поли-L-лизин, не касаясь поверхности, как это будет соскребать поли-L-лизин. Затем нанесите каплю (20 л) воды DEPC на поли-L-лизин обработанные скважины. Закройте крышку "камеры", чтобы предотвратить испарение до шага 5.1.
4. Эксперимент по времени и фиксация образца
- Выращиваем клетки кишечной палочки в жидкой культуре 20 мл в колбе 250 мл. Держите колбу в шейкере для водяной ванны (30 градусов по Цельсию) и продолжайте трястись. Остановите шейкер только при взятых образцах.
ПРИМЕЧАНИЕ: Результаты, представленные в этой работе, получены из клеток MG1655, выращенных в минимальной среде M9, дополненной 0,2% глицеролом, 0,1% казамино-кислот и 1 мг/лтиаминак экспоненциальной фазе роста (OD 600-0,2). - Добавьте 250 МКЛ 4x фиксируя раствора в пустой трубке 1,5 мл. Повторите и подготовить несколько трубок, столько, сколько времени точек, которые должны быть приняты. Этикетка труб с номерами тока времени и держать их при комнатной температуре.
- Возьмите 750 МКЛ клеточной культуры (OD600и 0,2) перед началом эксперимента по тайм-курсу. Добавьте культуру в трубку, помеченную как "ноль времени" (от шага 4.2). Переверните трубку осторожно, чтобы смешать клетки с фиксировавым раствором.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не pipette вверх и вниз, чтобы смешивать, вихрь, или "быть грубым" на клетках. Этот образец представляет подавленное состояние и будет использоваться в качестве контроля для расчета интенсивности флуоресценции одной мРНК (см. шаг 9.4). - Добавьте 0,02-1 мМ изопропил β-D-1-тиогалактопиранозид (IPTG) в жидкую культуру, чтобы вызвать выражение лака. Запустите таймер в этой точке (т 0 мин) и образец с определенным интервалом времени (например, каждые 1 мин) с тех пор. Для выборки повторите шаг 4.3.
- Добавьте 5 мМ ортонитрофейнл-β-D-фукопиранозид (ONPF) или 500мМ глюкозы 24 в определенное время во время эксперимента на время курса (например, при t 1,5 мин) для подавления экспрессии лака. После повторного подавления продолжайте пробыь культуры (Шаг 4.3) для отслеживания деградации мРНК.
ПРИМЕЧАНИЕ: Репрессии также могут быть сделаны с 400 мкг / мл рифампицин, ингибитор инициации транскрипции25. - Для фиксации инкубировать трубки, содержащие пробы клеток при комнатной температуре в течение 15 минут, а затем инкубации во льду в течение 30 мин.
- Чтобы удалить фиксаторы, центрифуга труб при температуре 4500 х г в течение 4 мин при комнатной температуре. Удалите супернатант с пипеткой.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не забудьте выбросить формальдегид в отдельном контейнере отходов в соответствии с протоколом безопасности. - Добавьте 1 мл DEPC-PBS и повторно приостановит ячейки. Повторите центрифугации и повторной подвески 2 раза больше раз.
ПРИМЕЧАНИЕ: Фиксированные клетки хрупкие и нуждаются в щадящей обработке. Тщательно повторно приостановить гранулы и избежать пузырьков. - После заключительного шага мытья, повторно приостановить ячейки в 30 йл DEPC-PBS.
5. Пермеабилизация клеточных мембран
- Применять каждый образец точки времени к различным скважинам на крышке (30 мкл на скважину). Подождите 10-30 минут при комнатной температуре, чтобы клетки прилипли к поверхности. Избегайте слияния жидких капель между скважинами.
- Чтобы смыть несвехие клетки, аспирировать жидкость и применить 20 йл DEPC PBS к каждой хорошо. Аспират DEPC PBS в течение нескольких минут.
- Permeabilize клеточных мембран, применяя 15 йл 70% этанола для каждой хорошо в течение 4 мин. Аспирировать этанол после 4 мин, и убедитесь, что скважины полностью сухой.
ПРИМЕЧАНИЕ: Очень важно ограничить обработку этанола в течение 4 минут. Более длительное лечение приведет к чрезмерной проницаемой. - Нанесите 30 йл раствора для мытья на каждую колодец.
6. Гибридизация зонда
- Аспирировать раствор для мытья из каждого хорошо. Нанесите на каждую колодец 30 МКЛ предмиоциплиберного решения. Инкубировать камеру в духовке 37 градусов по Цельсию в течение 30 минут.
ПРИМЕЧАНИЕ: Добавить 50 мл воды в нижней части камеры, чтобы обеспечить влажность. - Аспирировать предмиоциализации решение из каждой хорошо. Примените к каждой из колодец 30 мкл решения для гибридизации зонда. Накройте камеру алюминиевой фольгой и инкубировать в духовке 37 градусов по Цельсию в течение 2 ч.
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что решение для гибридизации зонда находится в столешнице 37 градусов по Цельсию перед этим шагом. Избегайте слияния жидкостей между скважинами. При необходимости нанесите меньший объем раствора на каждую колодец.
7. Пост-гибридизация стирки и подготовки к визуализации
- Используя многоканальный пипетку, нанесите 30 йл раствора для мытья для каждого хорошо все сразу. Аспирировать и повторять 3-5x раз стирки. Инкубировать камеру в духовке 37 градусов по Цельсию в течение 15-30 мин.
- Повторите шаг 7.1 еще два раза.
- Вымойте каждый колодец с DEPC-PBS 5x раз. Следуйте методу, используемому в шаге 7.1, но пропустите процесс инкубации.
- Аспирировать жидкость из крышки. Примените 4 МКЛ DEPC-PBS к каждой колодец.
- Используя типсы, поднимите и переверните крышку и аккуратно поместите ее на стеклянную горку (от шага 3.2). Избегайте пузырей.
- Печать края крышки с силиконовой зубной резинки.
- Подождите, пока резинка затвердеют. Здесь можно сделать паузу и хранить слайд на ночь при 4 градусах Цельсия.
ПРИМЕЧАНИЕ: Другие протоколы smFISH предлагают добавить кислорода очистки реагентов (например, глюкозы оксидазы / каталазы) или с помощью коммерческих анти-увяданиемонтажа среды 14,26 для увеличения фотосыбомости фторфоров.
8. Изображение
- Чтобы найти область, интересную, используйте живой режим фазовой контрастной визуализации. Измените поле зрения в хорошо, маневрируя этап джойстик. Выберите область, где плотность клеток является оптимальной (т.е. Есть много клеток, которые в основном разделены). Отрегулируйте z-фокус таким образом, чтобы фазово-контрастные изображения клеток были в фокусе.
- Сделай снимки в порядке экспозиции Cy5 (4-s), Cy3 (2-s экспозиции) и фазового контраста (0,2-s экспозиции).
ПРИМЕЧАНИЕ: Молекулы красителя Cy3B изображены в канале Cy3, а изображения называются изображениями Cy3. - Повторите Шаги 8.1-8.2, чтобы получить изображения 10 различных областей в пределах хорошо.
- Перемести цель в другую колодец и повторите шаги 8.1-8.3.
- Экспортные изображения в качестве файлов TIFF.
- (По желанию) Изображение разноцветных бусин adsorbed на поверхности обложки в Cy5 и Cy3 каналов для определения пространственного сдвига между Cy5 и Cy3 каналов для целей регистрации изображений.
- Нанесите 10 мкл разноцветных флуоресцентных бусин (диаметр 0,2 мкм) на чистую поверхность крышки и подождите 10-30 мин. После мытья с 50 фунтов стерлингов PBS, применить 5 йл PBS и бутерброд крышки со стеклянной горкой. Печать и крепление на микроскопе.
- Изображение бисера в обоих cy5 и Cy3 каналов.
9. Анализ изображений
ПРИМЕЧАНИЕ: Код Matlab, используемый на этом этапе, доступен на следующем веб-сайте GitHub: https://github.com/sjkimlab/Code_Publication/tree/master/JoVE_2020. Папка GitHub содержит все необходимое для анализа изображений, включая значения параметров сегментации ячеев и идентификации тосов. Процедура на этом этапе далее объясняется в главном скрипте, называемом "FISHworkflow.m".
- Откройте инструмент сегментации ячеей, такой как microbeTracker27 или Oufti28,и загрузите контрастные изображения фазы нагрузки. Выберите "Независимые кадры" и нажмите кнопку под названием "Все кадры", чтобы начать процесс сегментации, из которого идентифицируются ячейки и вычисляютсяих контуры (рисунок 3B,C).
ПРИМЕЧАНИЕ: Подробные протоколы использования этих программных пакетов доступны в Интернете (например, oufti.org). - Загрузите изображения флуоресценции Cy5 в функции spotFinder microbeTracker или Oufti и нажмите кнопку«Беги»,чтобы начать идентификацию и количественную оценку пятна на основе 2D гауссийскойпримерки (рисунок 3B,C). Повторите этот шаг для cy3 флуоресценции изображения для анализа пятен в канале Cy3. Этот шаг создает список пятен в каждой ячейке, включая их интенсивности и координаты.
- (По желанию) Отфильтруйте тусклые пятна (ложные срабатывания) с помощью порога, как это объясняется в файле FISHworkflow.m.
ПРИМЕЧАНИЕ: Изучите флуоресцентные пятна в отрицательном контроле (например, MG1655 илак)и определите порог для фильтрации ложных срабатываний. - Чтобы получить спотовую интенсивность одной мРНК, используйте список точечных интенсивностей, измеренных в нулевое время (до добавления IPTG), и подготовьте распределение интенсивности пятна с моделью гауссийской смеси с двумя компонентами смеси. Возьмите пиковое положение первой гауссийской популяции (черная линия на рисунке 3D,E,E) как спотовая интенсивность одной мРНК. Выполните это для Cy5 пятна и Cy3 пятна отдельно, чтобы получить интенсивность пятна одного 5' и 3' лака мРНК.
ПРИМЕЧАНИЕ: Повторите это в каждом эксперименте по времени, потому что интенсивность пятна одной мРНК может незначительно различаться в различных экспериментах. - Разделите интенсивность флуоресценции пятна с интенсивностью одной мРНК (от шага 9.4) для получения количества мРНК в пределах пятна. Сумма нормализованной интенсивности пятна внутри ячейки для расчета общего количества мРНК в ячейке(рисунок 3F). Выполните эти расчеты для 5' и 3' мРНК отдельно.
- Рассчитайте и смоируйте средние числа мРНК на ячейку в каждой точке времени (например, рисунок 4B),и проанализируйте кинетику виво транскрипции и деградации мРНК от временного изменения средних уровнеймРНК (рисунок 4B).
- Чтобы получить скорость удлинение транскрипции, выполните наименее квадратную установку линии к первоначальному подъему сигналов 5' и 3' mRNA и определите перехваты базальных уровней(рисунок 4B). Разница между этими перехватами указывает на среднее время, в течение времени для РНКП, чтобы путешествовать из 5' зонд области в 3' зонд области. Разделите расстояние между двумя наборами зондов (2 кб) с этим временем, чтобы получить среднюю скорость удлинение транскрипции.
- Для получения скорости деградации мРНК, подходят экспоненциальные функции распада, y q A'exp (-t/) к окончательной области распада 5' и 3' мРНК сигналов (например, рисунок 4B). Подходящим параметром является средний срок службы мРНК.
- (По желанию) Проанализируйте вариацию экспрессии генов от клетки к клетке (например, реакцию уровня клетки на индукцию, показанную на рисунке 4C),на основе распределения чисел мРНК в каждой клетке (рассчитанной в шаге 9.5).
- (По желанию) Используя информацию о месте расположения вдоль основных и незначительных осей ячейки (получено из шага 9.2), проанализируйте локализацию мРНК(рисунок 4D,E).
- (По желанию) Анализируйте ко-локализацию 5' и 3' mRNAs(рисунок 5) путем сравнения локализации пятен, обнаруженных в каналах Cy5 и Cy3.
- Загрузите изображения разноцветных бусин (Шаг 8.6) в функции spotFinderF в microbeTracker и получите координаты бисерных центроидов в каналах Cy5 и Cy3. Используйте список координат центроидов для расчета матрицы преобразования аффина, которая сообщает, как каналы Cy5 и Cy3 сдвигаются и вращаются по отношению другк другу 29.
- Примените матрицу преобразования аффина к изображениям Cy5 и Cy3 FISH для преобразования изображений Cy3 в координаты Cy5. Классифициву, если пятно локализовано в другом месте в другом канале. Например, пятно в канале Cy5 считается совместно локализованным с другим местом в канале Cy3, если расстояние между их центроидами составляет менее 150 нм(рисунок 5).
- Проанализируйте, сколько пятен Cy5 классифицируются как «совместно локализованные» с пятнами Cy3 в каждой точке времени. Также проанализируйте интенсивность ко локализованных пятен(рисунок 5).
Representative Results
На рисунке 3 показаны репрезентативные изображения из этого протокола smFISH. Полное поле зрения (86,7 мкм х 66,0 мкм с помощью нашей микроскопии установки подробно описаны в таблице материалов) показывает, 500 E. палочки клетки разбросаны по всему полю (Рисунок 3A). Если плотность клеток намного выше, чем показано на этом изображении, автоматическая сегментация клеток становится трудной, поскольку алгоритмы сегментации не надежно идентифицируют отдельные клетки, когда клетки касаются друг друга. Для достижения оптимальной плотности клеток в поле зрения необходимо отрегулировать концентрацию клеток и инкубационое время, используемое для присоединения поверхности (шаг 5.1).
Морфология клеток в фазовых контрастных изображениях должна оставаться сопоставимой с изображениями живых клеток для целейсегментации (рисунок 3A-C). Если клетки чрезмерно проницаемы, морфология клеток изменяется (например, «призраки»; Дополнительная цифра 1). В этом случае можно сократить продолжительность 70% лечения этанолом в шаге 5.3.
До индукции средний уровень экспрессии лака составил 0,03 мРНК на ячейку, в соответствии спредыдущими отчетами 15,30. Кроме того, распределение интенсивности пятна лака мРНК до индукции не очень хорошо вписывались в нормальное распределение или распределение Пуассона из-за наличия пятен с высокой интенсивности(рисунок 3D,E). Это говорит о том, что большинство пятен, обнаруженных в подавленном состоянии, представляют собой единую лаковую мРНК, но небольшая популяция пятен содержит более одной лак-мРНК. Чтобы изолировать популяцию с помощью одного лака мРНК, мы использовали модель гауссийской смеси с двумя компонентами смеси (insets на рисунке 3D,E). Затем среднее число первых гауссийских было принято в качестве среднего интенсивности одного пятна мРНК (например, пик черной кривой на рисунке 3D)и использовалось для преобразования интенсивности пятна в количество мРНК для любых пятен, обнаруженных в эксперименте по времени. Для расчета общего количества мРНК внутри ячейки в каждой ячейке были суммированы нормализованные интенсивности пятна(рисунок 3F)19.
Когда уровень экспрессии лака мРНК низок, в клетке пространственно разделены пятна, ограниченные дифракцией, с ограниченной дифракцией. Таким образом, изображения этих пятен могут быть проанализированы 2D Gaussian установки для их интенсивности и локализации.
Когда уровень выражения высок, так что пятна перекрываются друг с другом внутри ячейки, 2D гауссийская фитинг не делает надежной количественной оценки. В этом случае уровень мРНК должен быть рассчитан путем деления общего фонового сигнала флуоресценции внутри ячейки со всей интенсивностью одноймРНК 19.
Когда экспрессия лака индуцируется, сигнал 5' лака мРНК увеличивается сначала, а 3' лака мРНК увеличивается позже(рисунок 4B). Если выражение лака подавлено, сигналы лака 5' и 3' лака уменьшаются с некоторой задержкой между ними(рисунок 4B). Чтобы получить скорость удлинение транскрипции, рост 5' и 3' сигналы сначала подходят с линиями(рисунок 4B), и разница в x-перехватов принимаются как время для РНКП, чтобы путешествовать расстояние между двумя регионами зонда (2,000 nt). Скорость удлинение транскрипции может быть измерена из каждого эксперимента тайм-курса и стандартные отклонения могут быть рассчитаны из экспериментальных дубликатов. Средняя скорость удлинения транскрипции составила 15-30 nt/s в наших экспериментальных условиях19.
Кроме того, скорость деградации мРНК (обратная часть среднего срока службы мРНК) была получена путем установки области распада с экспоненциальной функцией(рисунок 4B). Наши данные о времени содержат деградацию мРНК во время и послетранскрипции 31. Мы вписываемся в точки времени после того, как 3' мРНК начала распадаться (t'gt; 6 мин) для зондирования деградации выпущенных мРНК. Мы получили 90 с, как средняя продолжительность жизни либо 5' или 3' лак мРНК 19.
Скорость инициации транскрипции может быть рассчитана со склона 5' увеличение сигнала после индукции(рисунок 4B, синий), или от среднего числа мРНК в стабильном состоянии (который является скорость инициации делится на скорость деградации). Кроме того, вероятность преждевременного прекращения транскрипции может быть оценена либо путем соотношения между уклоном 3' увеличение сигнала против 5' увеличение сигнала32 или между устойчивым состоянием уровней 3' и 5' mRNAрегионов 19.
Поскольку smFISH является одноклеточной техникой, мы можем анализировать изменчивость от клетки к клетке в транскрипции. Например, можно проанализировать процент клеток, выражаюющих лак мРНК после добавления IPTG(рисунок 4C). Можно также решить, изменяется ли локализация мРНК после индукции. Мы заметили, что 5' и 3' лака мРНК пятна двигаться немного наружу, вдали от центра клетки (Рисунок 4D,E), в соответствии с предыдущимдокладом 33.
Наконец, анализ совместной локализации между 5' и 3' мРНК пятна могут быть информативными(рисунок 5A). Например, в репрессированном состоянии (ноль времени) около 25% пятен мРНК 5 локализованы с 3' мРНК месте. При т 1 мин, так как многие генные локусы имеют синтез 5' мРНК, но еще не 3' синтез мРНК, большинство из 5' мРНК пятна сами по себе без 3' мРНК-сигнала (т.е. низкая вероятность совместной локализации). Однако, когда появляется 3' мРНК (т.е. т 2 мин), вероятность совместной локализации возрастает (фиолетовая стрелка на рисунке 5A,B). Этот момент времени, когда ко-локализация становится частым, зависит от скорости удлинения транскрипции. 2-D плотность участка 5' и 3' лака мРНК номера в каждом месте совместной локализации обнаружены в это время точка может быть использована для вывода плотности РНКП на ген лака (Рисунок 5C). Как сообщалосьранее 19, 5' мРНК номера в этом участке показывают, что большинство лака локусы имеют менее 10 РНКП на ДНК, когда выражение лака индуцируется 1 мММ IPTG. Кроме того, 3' mRNA номера в этом участке связано с кластеризациейРНКП 34. Тот факт, что число 3' мРНК близко к одному, означает, что примерно один РНКП входит в область зонда 3. Это говорит о том, что РНКП на гене лака пространственно разделены, вместо формирования кластера (или «конвоя»).
Рисунок 1: Дизайн зондов smFISH для мРНК интереса. (A)Метод плитки. Последовательности коротких олигонуклеотидов ДНК (20 б.п. в длину) выбираются таким образом, чтобы они могли покрывать мРНК интереса. Олигонуклеотидные зонды помечены молекулой флуоресцентного красителя. (B)Метод массива. Некодирующий массив тандемных последовательностей (например,"lacO array") транскрипционно сливается с мРНК, представляющим интерес. Флуоресцентно помеченный зонд, дополняющий повторяющийся блок (например, зонд lacO длиной 17 б.п.) используется для усиления сигнала мРНК. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Схема экспериментальной процедуры smFISH и продолжительность каждого шага. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: анализ изображений smFISH. (A-C) smFISH микроскопии изображение 5' лака мРНК (красный) и 3' лак мРНК (зеленый) в диком типе кишечной палочки (MG1655), выращенных в M9 минимальной среде дополняется 0,2% глицерол, 0,1% казамино кислот и 1 мг/л тиамина при 30 градусах Цельсия(А)Репрезентативное изображение образца из т 3 мин после индукции с 0,05 мМ IPTG при т 0 мин и репрессии с глюкозой 500 мМ при т 1,5 мин. Фазовая контрастность и два флуоресценции изображения Cy5 (для 5' лака мРНК, красный) и Cy3 (для 3' лака мРНК, зеленый) были наложены с псевдо-окраски. На снимке показано целое поле 86,7 мкм х 66,0 мкм. Шкала бар, 5 мкм. (B)Увеличить в версии небольшой области (желтый ящик) в (A). Контуры клеток показаны белым цветом, а пятна флуоресценции, идентифицированные на основе анализа изображений, показаны красными точками. Шкала бар, 1 мкм. (C)Обнаружение контуров клеток и флуоресцентных пятен при высоком состоянии экспрессии (t 4 мин после индукции с 1 мМ IPTG). Шкала бар, 1 мкм. (D-E) Распределения интенсивности пятна 5' и 3' mRNA измерены перед добавлением IPTG (репрессированное состояние). Гистограммы показаны с двумя гауссийские функции (черный и серый), средние значения которых из модели гауссийской смеси. Вставка показывает квантово-количественный участок случайных чисел, генерируемых из гауссийских моделей смеси и экспериментально измеренных интенсивности пятна мРНК (n No 1040 для 5' мРНК и 680 для 3' mRNA). (F)Информация, полученная для отдельной ячейки, указанной в панели (B). Для данной ячейки (i) пятна были определены в каналах Cy5 и Cy3, а их интенсивность (I) и координация вдоль короткой и длинной оси ячейки(d, l)были количественно определены из 2D гауссийской установки. После нормализации спотовые интенсивности были суммированы, чтобы дать общее количество 5' или 3' mRNAs в этой ячейке. Кроме того, ко-локализация между пятнами из разных каналов может быть проанализирована, как в примере, показанный на рисунке 5. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Анализ кинетики in vivo транскрипции и деградации мРНК. (A)Схематические и репрезентативные изображения двухцветных экспериментов smFISH, измеряя изменения уровней лака мРНК с течением времени. Красные и зеленые пунктирные линии указывают Cy5 или Cy3B помечены олигонуклеотидные зонды, которые гибридизируются с 1-кб длиной 5' и 3' мРНК регионов лака мРНК в кишечнойпалочке , соответственно. Также показаны наложения двух флуоресцентных изображений с фазово-контрастным изображением в указанных точках времени после индукции с 0,2 мММ IPTG при т 0 мин. Транскрипция была подавлена с глюкозой 500 мМ при т 1,5 мин. Шкала бар, 1 мкм. Цифра была изменена с Ким идр. (B) 5' и 3' lacZ лака мРНК номера на ячейку с течением времени, во время эксперимента, описанного в панели (A). Бары ошибок являются загрузочные SEMs. По крайней мере 1200 клеток были проанализированы за точку времени. Первоначальный подъем сигналов 5' и 3' mRNA был пригонка с линией (голубой). Разница в x-перехватах составила 1,93 мин., что дало среднюю скорость удлинения транскрипции 17,3 nt/s. Окончательный распад сигналов 5' и 3' mRNA был вписаен в экспоненциальную функцию распада (серый). Параметры пригонки указывают на то, что средняя продолжительность жизни мРНК составляет 1,52 мин для 5' мРНК и 1,66 мин для 3' mRNA. (C)Процент клеток с одним или более пятнами лака мРНК во время эксперимента, описанного в (A). Бары ошибок являются загрузочные SEMs. (D)Локализация пятна вдоль короткой оси ячейки. Можно количественно близости пятна к мембране, разделив расположение вдоль короткой оси (d) с половиной ширины ячейки (w). (E) Изменение локализации 5' и 3' лака мРНК пятна вдоль короткой оси клеток во время эксперимента, описанного в (A). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5: Анализ совместной локализации пятен 5' и 3' мРНК. (A)Схема, показывающая ожидаемую ко-локализацию между 5' и 3' мРНК пятна после индукции. При изготовлении 3' мРНК возрастает вероятность того, что пятно мРНК будет локализовано на 3' мРНК (фиолетовая стрелка). (B)Вероятность совместной локализации после индукции с 1 мММ IPTG. Фиолетовая стрелка указывает точку времени, когда вероятность совместной локализации сначала становится частой в соответствии со схемой в панели (A). (C) Количество 5' и 3' лака mRNAs в месте совместной локализации обнаружено на t 2 мин после индукции с 1 mM IPTG (всего 841 пятна). Серые точки представляют собой отдельные ко-локализованные пятна, в то время как красные точки представляют среднее значение связанных данных. Бары ошибок SEM. Оттенок серого указывает на плотность точек в данной области графика. Пунктирная линия указывает на наклон 1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 6: Оптимизация состояния гибридизации зонда. Были использованы два вида образцов: клетки MG1655, выращенные, как описано на рисунке 3, и остаются неинфицированными (синими) или обработанными 0,5 мМ IPTG в течение 20 мин (красный). Решение для гибридизации зондов было сделано с различными концентрациями зондов (всего 72 спряченных Cy5 зондов плитки всей области лака) и формамида. Концентрации формамида также корректировались в предмиоциализации раствора и раствора для мытья, соответственно. "Нет зонда" (серая линия) указывает на уровень флуоресценции клеток с поддержкой IPTG, обработанных без зондов во время шага гибридизации. Средняя интенсивность флуоресценции, нормализованная по площади клеток (АС), была рассчитана из 300-800 клеток. Бары ошибок являются загрузочные SEMs. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Дополнительная цифра 1: Искаженные морфологии клеток из-за чрезмерной проницаемой. Наложение фазового контраста (серая шкала), 5' лака мРНК (Cy5, красный) и 3' лака мРНК (Cy3, зеленый) изображения клеток MG1655 через 5 минут после индукции с 1 мМ МФТГ. (A)Пример, показывающий смесь нормальных клеток и чрезмерно проницаемых клеток, не имеющих нормальной морфологии (показан с розовыми стрелками). (B)Пример, показывающий "призрачные" клетки, слипшиеся вместе. Масштабная планка 1 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
| DEPC Вода | ||||
| Добавьте 0,1% DEPC в ультрачистую воду и инкубировать бутылку (покрытую) в духовке 37 градусов на ночь и автоклав на следующий день. | ||||
| ДЕПК PBS (10X) | ||||
| Смешайте следующее: | ||||
| 80 г | NaCl (финал 1.37 M) | |||
| 2 г | KCl (окончательный 27 мМ) | |||
| 14,2 г | Na2HPO4 (окончательный 100 мМ) | |||
| 2,7 г | KH2PO4 (окончательный 20 мМ) | |||
| Ультрачистая вода до 1L | ||||
| Фильтр (0,22 мкм) в стеклянную бутылку. | ||||
| Добавьте 0,1% DEPC и следуйте инструкциям для воды DEPC. | ||||
| Чтобы сделать 1X раствор, разбавить 10 раз водой DEPC. | ||||
| 1M DEPC фосфатный буфер натрия, рН 7,4 | ||||
| Смешайте следующее: | ||||
| 115 г | Na2HPO4 | |||
| 22,8 г | 2PO4 | |||
| Ультрачистая вода до 1 л | ||||
| Фильтр (0,22 мкм) в стеклянную бутылку. | ||||
| Добавьте 0,1% DEPC и следуйте инструкциям для воды DEPC. | ||||
| Решение для фиксации 4X (16% формальдегида) | ||||
| 5 мл | 20% формальдегид | |||
| 500 мкл | Вода DEPC | |||
| 750 МКЛ | 1M DEPC фосфатный буфер натрия, рН 7,4 | |||
| Хранить при 4 градусах Цельсия до 2-4 недель. | ||||
| ВНИМАНИЕ: Формальдегид токсичен. Носите перчатки и использовать дым капот при принятии этого решения. | ||||
| Решение для мытья посуды | ||||
| Смешайте следующее: | ||||
| 10 мл | Формамид (окончательный 25%) | |||
| 4 мл | 20X SSC (окончательный 2X) | |||
| Заполните воду DEPC до 40 мл | ||||
| Фильтр (0,22 мкм) и хранить при 4 кк | ||||
| ВНИМАНИЕ: Формамид токсичен. Носите перчатки и использовать дым капот при принятии этого решения. | ||||
| Решение для предварительной гибридизации | ||||
| 200 мкл | Формамид (окончательный 20%) | |||
| 100 мкл | 20X SSC (окончательный 2X) | |||
| 10 йл | 100X VRC (окончательный 1X) | |||
| 25 мкл | 4% (w/v) BSA (окончательный 0.1%) | |||
| 685 йл | Вода DEPC | |||
| ПРИМЕЧАНИЕ: Вихрь VRC акции, прежде чем принимать 10 йл из. | ||||
| ВНИМАНИЕ: Формамид токсичен и известен тератоген. Носите перчатки и обрабатывать его под капотом дыма. | ||||
| Решение для гибридизации зондов | ||||
| 200 мкл | Формамид (окончательный 20%) | |||
| 100 мкл | 20X SSC (окончательный 2X) | |||
| 10 йл | 100X VRC (окончательный 1X) | |||
| 25 мкл | 4% (w/v) BSA (окончательный 0.1%) | |||
| 10 йл | 40 мг/мл кишечной палочки тРНК (окончательный 0,4 мг/мл) | |||
| 200 мкл | 50% декстран сульфат (окончательный 10%) | |||
| x хЛ | 5' мРНК-зонд (от шага 1.12) до финальных 4 нм. | |||
| у йл | 3' мРНК-зонд набор (от шага 1.12) до окончательного 4 нм. | |||
| - | DEPC воды, чтобы сделать общий объем 1 мл | |||
| ПРИМЕЧАНИЕ: Добавить декстран сульфат последним. Потому что это очень вязкий, вырезать конец кончика пипетки, прежде чем принимать 200 йл из 50% запасов. После добавления декстрана сульфата, пипетка вверх и вниз, чтобы гомогенизировать раствор. | ||||
Таблица 1: Рецепты используемых решений.
Discussion
Здесь мы представили протокол smFISH для измерения кинетики мРНК в кишечной палочке. В ранее опубликованных протоколах smFISH длябактерий 23, клетки хранились в трубках до самого конца протокола, то есть до тех пор, пока они не будут готовы к визуализации. Хотя он имеет много преимуществ, таких как минимальная неспецифическая привязка флуоресцентныхзондов на поверхности крышки 23, трудно следовать этим протоколам, когда Есть много образцов из эксперимента тайм-курса. Во-первых, необходимо отведать и даже собрать достаточно большой объем клеток (1 мл) до фиксации. Во-вторых, образцы клеток необходимо центрифугировать несколько раз для обмена растворами и мытья после шага гибридизации. В нашем протоколе небольшой объем (lt;1 mL) культуры непосредственно смешивается с фиксироваваемым раствором в трубке объемом 1,5 мл, помогая быстро «заморозить» состояние клетки в момент отбора проб. Кроме того, клетки остаются прикрепленными к поверхности на протяжении всей процедуры, и различные решения могут быть быстро обменяются, аспирируя жидкости с вакуумной системой фильтрации и применяя раствор капли сразу с многоканальной пипеткой. Эта разница делает наш протокол очень выгодным, когда большое количество образцов необходимо обрабатывать сразу. Используя наш протокол, 12-48 образцов могут быть обработаны одновременно, и вся процедура FISH может быть завершена в течение 8 часов, примерно аналогичное количество времени, необходимое для нескольких образцов(рисунок 2). Несмотря на то, что в качестве примера мы использовали экспрессию лака в кишечной палочке, протокол широко применим к различным генам и бактериальным видам с соображениями, обсуждаемыми ниже.
Для различных генов, первое, что нужно рассмотреть это smFISH зондов. Можно разработать олигонуклеотидные зонды, которые плитки мРНК интереса (Рисунок 1A)13. В этом "плитка" зонд подход, каждый зонд является 20 базы длиной и помечены флюорофор на 5' или 3' терминуса. Эта стратегия удобна тем, что генетические манипуляции не нужны. Кроме того, тандемное повторение последовательности 20 bp, чужое геномной последовательности (например, массив последовательности лако в Caulobacter crescentus14), может быть вставлено в непереведенную область гена, представляющий интерес, и один зонд, дополняющий повторную единицу, используется для обозначения мРНК («array» подход; Рисунок 1B). В обоих случаях множественные флюорофоры украшают мРНК, давая усиленный сигнал флуоресценции, который можно легко отличить от одного зонда, не особенно связанного внутри клетки.
Выбирать ли подходы «плитка» или «array» зависит от отрицательного контроля, образца, в котором проверяется неспецифическая привязка зондов, поскольку в ней отсутствует целевая мРНК. Для плиточныезонды ( Рисунок 1A), мутант штамм без гена интереса или состояние, при котором ген не транскрибируется (например, репрессии лака) может служить отрицательным контролем для тестирования неспецифической привязки зондов. Для массива на основе smFISH (Рисунок 1B), дикий тип штамма не хватает массива может служить в качестве отрицательного контроля, поскольку он не содержит связывающих сайтов для зондов.
Оптимальные условия гибридизации могут зависеть от последовательности зонда и даже выбора красителей флюорофора. Мы оптимизировали условие гибридизации для наборов зондов лака, сохраняя температуру гибридизации на уровне 37 градусов по Цельсию и тестируя различные концентрации наборов зондов и формамида в растворе гибридизации. Более высокие концентрации формамида, как правило, снижают как неспецифические, так и специфическиесвязывающие 26,,35. Мы рекомендуем систематически менять гибридизацию и условия ее стирки, сохраняя при этом время гибридизации и температуру на прежнем уровне. По мере того как условие становится более строгим, как неспецифическое, так и специфическое связывающее снижение(рисунок 6). Важно найти точку, когда неспецифическая привязка начинает бить ниже приемлемого порога без дальнейшего ущерба для конкретной привязки. Например, мы использовали уровень сигнала, полученный без каких-либо зондов ("без зондов") в качестве порога(рисунок 6).
Двухцветный метод smFISH, маркующий две отдельные области мРНК, ограничивается длинными генами. Для измерения скорости удлинения транскрипции мы воспользовались тем фактом, что лакс длинный (3075 б.п.) и его выражение может быть вызвано IPTG. Когда ген короткий, трудно спроектировать два набора плиточные зонды (около 5' и 3' концов) и решить задержку времени между появлениями 5' против 3' mRNA регионов. В этом случае можно рассчитывать зарождающиеся мРНК в стабильном состоянии с помощью smFISH и анализировать их распределение с помощью аналитической модели, которая имеет скорость удлинение транскрипции в качествеподходящего параметра 20. Кроме того, когда ген, представляющий интерес, не является неодохвимым, можно лечить клетки с рифампицином в нулевое время и измерять временное изменение в 5' и 3' мРНК субрегионные. Задержка от уменьшения сигнала 5' mRNA до сигнала 3' mRNA может быть использована для расчета скорости удлинение транскрипции, как это было сделаноранее 31.
Наконец, протокол smFISH является универсальным и может сочетаться с другими схемами маркировки. Ранее локус ДНК визуализировали вместе с мРНК путем объединения мРНК ФИШ либо с ДНК FISH14, либо с флуоресцентной системой репортера-оператора20. Белковые продукты можно визуализировать, выполняя иммунофлуоресценцию вместе с мРНКFISH 14,,36. Кроме того, его можно комбинировать с трехмерноймикроскопией супер-разрешения 37 для визуализации мРНК во всехтрех измерениях 38,,39.
Disclosures
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.
Acknowledgments
Этот протокол был разработан С.К. во время ее постдокторских исследований в лаборатории доктора Кристин Джейкобс-Вагнер в Медицинском институте Говарда Хьюза и Институте микробных наук при йельском университете. Мы благодарим доктора Джейкобс-Вагнер и ее сотрудников лаборатории за различные вклады в разработку метода и Лору Тройер за критическое прочтение рукописи. С.К. признает поддержку программы ученых Сирла; К.В. признает поддержку Джеймса Стипендиата Preble Research Award от Университета Иллинойса.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacterial strain | |||
| Escherichia coli MG1655 | |||
| Chemicals, peptides, and others | |||
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 34851 | UPLC buffer B |
| Ammonium chloride | Fisher Chemical | A661-500 | To make M9 medium |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | B2518 | Probe hybridization |
| Calcium chloride | Acros Organics | 349610250 | To make M9 medium |
| Casamino acid | BD Difco | 223050 | To make M9 medium |
| Cy3B NHS ester | GE Healthcare Life Sciences | PA63101 | Fluorophore for FISH probes |
| Cy5 NHS ester | GE Healthcare Life Sciences | PA15101 | Fluorophore for FISH probes |
| DEPC | Sigma-Aldrich | D5758 | |
| Dextran sulfate | Millipore | S4030 | Probe hybridization |
| Dextrose | Fisher Chemical | D16 | To repress the expression of lacZ |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | To dissolve fluorophores |
| E. coli tRNA | Sigma-Aldrich | R1753 | Probe hybridization |
| Ethanol | Decon Laboratories | 2701 | Used in DNA purification, lysis, and cleaning coverslips |
| FISH probes | Biosearch Technologies | Sequences are published in ref#16 | |
| Formaldehyde | Ladd Research Industries | 20295 | Fixation |
| Formamide | American Bio | AB00600 | Probe hybridization, pre-hybridization, and wash |
| Glycerol | Americanbio | AB00751-01000 | To make M9 medium |
| Isopropylthio-β-galactoside (IPTG) | Invitrogen | 15529019 | lacZ induction |
| Magnesium sulfate | Fisher Chemical | M65-500 | To make M9 medium |
| 2-Nitrophenyl β-D-fucopyranoside (ONPF) | Santa Cruz Biotechnology | sc-216258 | lacZ repression |
| Picodent twinsil 22 | Picodent | 1300 1000 | Sealant |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P8920 | To treat the coverslip surface |
| Potassium chloride | Fisher BioReagents | BP366-500 | To make PBS |
| Potassium phosphate monobasic | Fisher BioReagents | BP362-500 | To make PBS and M9 medium |
| Rifampicin | Sigma-Aldrich | R3501 | To stop transcription initiation |
| Saline-sodium citrate buffer (SSC) | Invitrogen | AM9763 | Probe hybridization, pre-hybridization, and wash |
| sodium bicarbonate | Fisher BioReagents | BP328-500 | Fluorophore-probe conjugation |
| Sodium chloride | Fisher BioReagents | BP358-1 | For DNA purification, PBS and M9 medium |
| Sodium phosphate dibasic | Fisher BioReagents | BP332-500 | To make PBS and M9 medium |
| Sodium phosphate monobasic | Fisher BioReagents | BP329-500 | To make a sodium phosphate buffer |
| Super PAP Pen | Invitrogen | 8899 | Hydrophobic marker for coverslips |
| TetraSpek microspheres | Invitrogen | T7280 | Controls for multi-channel registration |
| Thiamine | Sigma-Aldrich | T1270 | To make M9 medium |
| Triethylammonium acetate | Sigma-Aldrich | 90358 | UPLC buffer A |
| Vanadyl ribonucleoside complex (VRC) | Sigma-Aldrich | 94742 | Probe hybridization and pre-hybridization |
| Equipment | |||
| C18 column | Waters | Acquity BEH C18 column | |
| Countertop centrifuge | Eppendorf | 5425 | |
| Countertop incubator | Eppendorf | Thermomixer F1.5 | |
| Incubator (Oven) | Thermo Scientific | 51030514 | Gravity convection |
| Water purification system | Millipore | Milli-Q Reference | |
| Nanodrop | Thermo Scientific | 2000C | |
| Nitrogen gas | Building | For blow-drying coverslips and glass slides | |
| UPLC | Waters | Acquity UPLC system | |
| Vacuum and aspirator | Building | Aspirator is made of a filtration flask with a side arm. | |
| Vacuum concentrator | Labconco | 7810010 | Centrivap; to dry samples collected from UPLC. |
| Vortexer | Scientific Industries | Genie-2 SI-0236 | |
| Water bath shaker | New Brunswick | Innova 3100 | Critical for time-course experiments |
| Water bath sonicator | VWR | 97043-960 | To clean coverslips and glass slides |
| Tools | |||
| 1.5-mL tubes | Eppendorf | 22431021 | DNA lobind tubes |
| 1000-uL pipette tip box | Denville Scientific | P1126 | An empty box after using all the tips |
| Coplin jar | SPI | 01240-AB | To clean coverslips and glass slides |
| Coverslip | Fisher Scientific | 22-050-230 | 24x60 No1 |
| Filtered pipette tips | Denville Scientific | P1121,P1122,P1126 | SHARP® Precision Barrier Tips |
| Forceps | SPI | K35a | To handle clean coverslips and glass slides |
| Glass slide | Fisher Scientific | 12-544-1 | |
| Gloves | Microflex | MK-296-M | |
| Multichannel pipetter | Eppendorf | 2231300045 | To use in the washing step (#7) |
| Pipette | Gilson | P1000, P200, P20 | |
| Reagent reservoir | MTC Bio | P8025-1S | To use in the washing step (#7) |
| Syringe filter (0.22 um) | Millipore | SLGS033SS | |
| Timer | VWR | 62344-641 | |
| Software and algorithms | |||
| MATLAB | Mathworks | R2013 and up | https://www.mathworks.com |
| MicrobeTracker or Oufti | https://www.github.com/JacobsWagnerLab/MicrobeTracker | ||
| https://oufti.org/ | |||
| Stellaris Probe Designer | Biosearch Technologies | https://www.biosearchtech.com/support/tools/design-software/stellaris-probe-designer | |
| Microscope | |||
| CCD camera | Hamamatsu Photonics | Orca-II-ER | |
| Cy3 filter set | Chroma | 49004 | |
| Cy5 filter set | Chroma | 49006 | |
| Epi-fluorescence microscope | Nikon | Eclipse Ti | For phase-contrast and epi fluorescence |
| Fluorescence excitation source | Lumencor | SOLA-E | |
| Nikon Elements software | Nikon | software that controls the microscope setup | |
| Phase-contrast 100x objective | Nikon | Plan Apochromat (NA 1.45) | |
| Probe sequence | |||
| DNA oligos with C6 amino modification at the 5' end | Biosearch Technologies Inc | ||
| lacZ1 | GTGAATCCGTAATCATGGTC | 5' mRNA | |
| lacZ2 | TCACGACGTTGTAAAACGAC | 5' mRNA | |
| lacZ3 | ATTAAGTTGGGTAACGCCAG | 5' mRNA | |
| lacZ4 | TATTACGCCAGCTGGCGAAA | 5' mRNA | |
| lacZ5 | ATTCAGGCTGCGCAACTGTT | 5' mRNA | |
| lacZ6 | AAACCAGGCAAAGCGCCATT | 5' mRNA | |
| lacZ7 | AGTATCGGCCTCAGGAAGAT | 5' mRNA | |
| lacZ8 | AACCGTGCATCTGCCAGTTT | 5' mRNA | |
| lacZ9 | TAGGTCACGTTGGTGTAGAT | 5' mRNA | |
| lacZ10 | AATGTGAGCGAGTAACAACC | 5' mRNA | |
| lacZ11 | GTAGCCAGCTTTCATCAACA | 5' mRNA | |
| lacZ12 | AATAATTCGCGTCTGGCCTT | 5' mRNA | |
| lacZ13 | AGATGAAACGCCGAGTTAAC | 5' mRNA | |
| lacZ14 | AATTCAGACGGCAAACGACT | 5' mRNA | |
| lacZ15 | TTTCTCCGGCGCGTAAAAAT | 5' mRNA | |
| lacZ16 | ATCTTCCAGATAACTGCCGT | 5' mRNA | |
| lacZ17 | AACGAGACGTCACGGAAAAT | 5' mRNA | |
| lacZ18 | GCTGATTTGTGTAGTCGGTT | 5' mRNA | |
| lacZ19 | TTAAAGCGAGTGGCAACATG | 5' mRNA | |
| lacZ20 | AACTGTTACCCGTAGGTAGT | 5' mRNA | |
| lacZ21 | ATAATTTCACCGCCGAAAGG | 5' mRNA | |
| lacZ22 | TTTCGACGTTCAGACGTAGT | 5' mRNA | |
| lacZ23 | ATAGAGATTCGGGATTTCGG | 5' mRNA | |
| lacZ24 | TTCTGCTTCAATCAGCGTGC | 5' mRNA | |
| lacZ25 | ACCATTTTCAATCCGCACCT | ||
| lacZ26 | TTAACGCCTCGAATCAGCAA | ||
| lacZ27 | ATGCAGAGGATGATGCTCGT | ||
| lacZ28 | TCTGCTCATCCATGACCTGA | ||
| lacZ29 | TTCATCAGCAGGATATCCTG | ||
| lacZ30 | CACGGCGTTAAAGTTGTTCT | ||
| lacZ31 | TGGTTCGGATAATGCGAACA | ||
| lacZ32 | TTCATCCACCACATACAGGC | ||
| lacZ33 | TGCCGTGGGTTTCAATATTG | ||
| lacZ34 | ATCGGTCAGACGATTCATTG | ||
| lacZ35 | TGATCACACTCGGGTGATTA | ||
| lacZ36 | ATACAGCGCGTCGTGATTAG | ||
| lacZ37 | GATCGACAGATTTGATCCAG | ||
| lacZ38 | AAATAATATCGGTGGCCGTG | ||
| lacZ39 | TTTGATGGACCATTTCGGCA | ||
| lacZ40 | TATTCGCAAAGGATCAGCGG | ||
| lacZ41 | AAGACTGTTACCCATCGCGT | ||
| lacZ42 | TGCCAGTATTTAGCGAAACC | ||
| lacZ43 | AAACGGGGATACTGACGAAA | ||
| lacZ44 | TAATCAGCGACTGATCCACC | ||
| lacZ45 | GGGTTGCCGTTTTCATCATA | ||
| lacZ46 | TCGGCGTATCGCCAAAATCA | ||
| lacZ47 | TTCATACAGAACTGGCGATC | ||
| lacZ48 | TGGTGTTTTGCTTCCGTCAG | ||
| lacZ49 | ACGGAACTGGAAAAACTGCT | 3' mRNA | |
| lacZ50 | TATTCGCTGGTCACTTCGAT | 3' mRNA | |
| lacZ51 | GTTATCGCTATGACGGAACA | 3' mRNA | |
| lacZ52 | TTTACCTTGTGGAGCGACAT | 3' mRNA | |
| lacZ53 | GTTCAGGCAGTTCAATCAAC | 3' mRNA | |
| lacZ54 | TTGCACTACGCGTACTGTGA | 3' mRNA | |
| lacZ55 | AGCGTCACACTGAGGTTTTC | 3' mRNA | |
| lacZ56 | ATTTCGCTGGTGGTCAGATG | 3' mRNA | |
| lacZ57 | ACCCAGCTCGATGCAAAAAT | 3' mRNA | |
| lacZ58 | CGGTTAAATTGCCAACGCTT | 3' mRNA | |
| lacZ59 | CTGTGAAAGAAAGCCTGACT | 3' mRNA | |
| lacZ60 | GGCGTCAGCAGTTGTTTTTT | 3' mRNA | |
| lacZ61 | TACGCCAATGTCGTTATCCA | 3' mRNA | |
| lacZ62 | TAAGGTTTTCCCCTGATGCT | 3' mRNA | |
| lacZ63 | ATCAATCCGGTAGGTTTTCC | 3' mRNA | |
| lacZ64 | GTAATCGCCATTTGACCACT | 3' mRNA | |
| lacZ65 | AGTTTTCTTGCGGCCCTAAT | 3' mRNA | |
| lacZ66 | ATGTCTGACAATGGCAGATC | 3' mRNA | |
| lacZ67 | ATAATTCAATTCGCGCGTCC | 3' mRNA | |
| lacZ68 | TGATGTTGAACTGGAAGTCG | 3' mRNA | |
| lacZ69 | TCAGTTGCTGTTGACTGTAG | 3' mRNA | |
| lacZ70 | ATTCAGCCATGTGCCTTCTT | 3' mRNA | |
| lacZ71 | AATCCCCATATGGAAACCGT | 3' mRNA | |
| lacZ72 | AGACCAACTGGTAATGGTAG | 3' mRNA | |
References
- Bervoets, I., Charlier, D. Diversity, versatility and complexity of bacterial gene regulation mechanisms: opportunities and drawbacks for applications in synthetic biology. FEMS Microbiology Reviews. 43 (3), 304-339 (2019).
- Epshtein, V., Nudler, E. Cooperation between RNA polymerase molecules in transcription elongation. Science. 300 (5620), 801-805 (2003).
- Vogel, U., Jensen, K. F. The RNA chain elongation rate in Escherichia coli depends on the growth rate. Journal of Bacteriology. 176 (10), 2807-2813 (1994).
- Tennyson, C. N., Klamut, H. J., Worton, R. G. The human dystrophin gene requires 16 hours to be transcribed and is cotranscriptionally spliced. Nature Genetics. 9, 184 (1995).
- Singh, J., Padgett, R. A. Rates of in situ transcription and splicing in large human genes. Nature Structural & Molecular Biology. 16, 1128 (2009).
- Selinger, D. W., Saxena, R. M., Cheung, K. J., Church, G. M., Rosenow, C. Global RNA Half-Life Analysis in Escherichia coli Reveals Positional Patterns of Transcript Degradation. Genome Research. 13 (2), 216-223 (2003).
- Bernstein, J. A., Khodursky, A. B., Lin, P. -H., Lin-Chao, S., Cohen, S. N. Global analysis of mRNA decay and abundance in Escherichia coli at single-gene resolution using two-color fluorescent DNA microarrays. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (15), 9697-9702 (2002).
- Pérez-Ortín, J. E., Medina, D. A., Chávez, S., Moreno, J. What do you mean by transcription rate. BioEssays. 35 (12), 1056-1062 (2013).
- Tang, F., et al. mRNA-Seq whole-transcriptome analysis of a single cell. Nature Methods. 6 (5), 377-382 (2009).
- Kuchina, A., et al. Microbial single-cell RNA sequencing by split-pool barcoding. BioRxiv. , 869248 (2019).
- Blattman, S. B., Jiang, W., Oikonomou, P., Tavazoie, S. Prokaryotic single-cell RNA sequencing by in situ combinatorial indexing. Nature Microbiology. , (2020).
- Femino, A., Fay, F., Fogarty, K., Singer, R. Visualization of single RNA transcripts in situ. Science. 280 (5363), 585-590 (1998).
- Raj, A., vanden Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nature Methods. 5 (10), 877-879 (2008).
- Montero Llopis, P., et al. Spatial organization of the flow of genetic information in bacteria. Nature. 466 (7302), 77-81 (2010).
- So, L. -h, et al. General properties of transcriptional time series in Escherichia coli. Nature Genetics. 43 (6), 554-560 (2011).
- Taniguchi, Y., et al. Quantifying E. coli proteome and transcriptome with single-molecule sensitivity in single cells. Science. 329 (5991), 533-538 (2010).
- Jones, D. L., Brewster, R. C., Phillips, R. Promoter architecture dictates cell-to-cell variability in gene expression. Science. 346 (6216), 1533-1536 (2014).
- Iyer, S., Park, B. R., Kim, M. Absolute quantitative measurement of transcriptional kinetic parameters in vivo. Nucleic Acids Research. 44 (18), 142 (2016).
- Kim, S., Beltran, B., Irnov, I., Jacobs-Wagner, C. Long-Distance Cooperative and Antagonistic RNA Polymerase Dynamics via DNA Supercoiling. Cell. 179 (1), 106-119 (2019).
- Wang, M., Zhang, J., Xu, H., Golding, I. Measuring transcription at a single gene copy reveals hidden drivers of bacterial individuality. Nature Microbiology. 4 (12), 2118-2127 (2019).
- Joo, C., Ha, T. Labeling DNA (or RNA) for single-molecule FRET. 2012 (9), Cold Spring Harbor. 1005-1008 (2012).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Standard Ethanol Precipitation of DNA in Microcentrifuge Tubes. 2006 (1), Cold Spring Harbor Protocols. 4456 (2006).
- Skinner, S. O., Sepúlveda, L. A., Xu, H., Golding, I. Measuring mRNA copy number in individual Escherichia coli cells using single-molecule fluorescent in situ hybridization. Nature Protocols. 8 (6), 1100-1113 (2013).
- Adesnik, M., Levinthal, C. The synthesis and degradation of lactose operon messenger RNA in E. coli. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 35, 451-459 (1970).
- Campbell, E. A., et al. Structural mechanism for rifampicin inhibition of bacterial RNA polymerase. Cell. 104 (6), 901-912 (2001).
- Raj, A., Tyagi, S. Methods in Enzymology. Walter, N. G. 472, Academic Press. 365-386 (2010).
- Sliusarenko, O., Heinritz, J., Emonet, T., Jacobs-Wagner, C. High-throughput, subpixel precision analysis of bacterial morphogenesis and intracellular spatio-temporal dynamics. Molecular Microbiology. 80 (3), 612-627 (2011).
- Paintdakhi, A., et al. Oufti: an integrated software package for high-accuracy, high-throughput quantitative microscopy analysis. Molecular Microbiology. 99 (4), 767-777 (2016).
- Moffitt, J. R., Zhuang, X. Methods in Enzymology. Filonov, G. S., Jaffrey, S. R. 572, Academic Press. 1-49 (2016).
- Yu, J., Xiao, J., Ren, X., Lao, K., Xie, X. S. Probing gene expression in live cells, one protein molecule at a time. Science. 311 (5767), 1600-1603 (2006).
- Chen, H., Shiroguchi, K., Ge, H., Xie, X. S. Genome-wide study of mRNA degradation and transcript elongation in Escherichia coli. Molecular Systems Biology. 11 (1), 781 (2015).
- Vogel, U., Sørensen, M., Pedersen, S., Jensen, K. F., Kilstrup, M. Decreasing transcription elongation rate in Escherichia Coli exposed to amino acid starvation. Molecular Microbiology. 6 (15), 2191-2200 (1992).
- Yang, S., et al. Transcription and translation contribute to gene locus relocation to the nucleoid periphery in E. coli. Nature Communications. 10 (1), 5131 (2019).
- Zenklusen, D., Larson, D. R., Singer, R. H. Single-RNA counting reveals alternative modes of gene expression in yeast. Nature Structural & Molecular Biology. 15 (12), 1263-1271 (2008).
- Fontenete, S., Guimarães, N., Wengel, J., Azevedo, N. F. Prediction of melting temperatures in fluorescence in situ hybridization (FISH) procedures using thermodynamic models. Critical Reviews in Biotechnology. 36 (3), 566-577 (2016).
- Sepúlveda, L. A., Xu, H., Zhang, J., Wang, M., Golding, I. Measurement of gene regulation in individual cells reveals rapid switching between promoter states. Science. 351 (6278), 1218-1222 (2016).
- Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. Three-Dimensional Super-Resolution Imaging by Stochastic Optical Reconstruction Microscopy. Science. 319 (5864), 810-813 (2008).
- Moffitt, J. R., Pandey, S., Boettiger, A. N., Wang, S., Zhuang, X. Spatial organization shapes the turnover of a bacterial transcriptome. eLife. 5, 13065 (2016).
- Fei, J., et al. Determination of in vivo target search kinetics of regulatory noncoding RNA. Science. 347 (6228), 1371-1374 (2015).
