Summary
이 프로토콜은 mRNA 합성 및 분해의 생체 내 운동학을 측정하기 위해 시상 혼성화(smFISH)에서 단일 분자 형광의 적용을 설명합니다.
Abstract
시상 혼성화(smFISH)에서 단일 분자 형광은 개별 세포에서 절대 수의 mRNA수를 계산할 수 있게 한다. 여기서, 우리는 대장균에서 전사 및 mRNA 분해의 비율을 측정하기 위해 smFISH의 응용 프로그램을 설명합니다. smFISH는 고정 된 세포를 기반으로하므로, 우리는 시간 과정 실험 중 여러 시간 지점에서 smFISH를 수행, 즉, 세포가 유전자 발현의 유도 또는 억압에 따라 동기화 된 변화를 겪고있을 때. 매 시점에서, mRNA의 하위 영역은 전사 연신 및 조기 종료를 탐사하는 것으로 관측적으로 구별된다. 이 프로토콜의 결과는 또한 세포 중 mRNA 복사 번호에 있는 mRNA 및 이질성의 세포내 국소화를 분석하는 것을 허용합니다. 이 프로토콜을 사용하면 몇 가지 샘플에 필요한 시간과 같이 많은 샘플(~50)을 8시간 이내에 처리할 수 있습니다. 우리는 세균성 세포에 있는 다른 mRNAs의 전사 그리고 저하 운동학을 공부하기 위하여 이 프로토콜을 적용하는 방법을 토론합니다.
Introduction
DNA에서 mRNA 및 단백질에 유전 정보의 흐름은 세포 적합성1에대한 규제가 중요한 가장 기본적인 세포 과정 중 하나입니다. 세포내의 mRNA 수는 두 가지 동적 프로세스, 전사 및 mRNA 저하에 의해 결정됩니다. 그러나, 전사와 mRNA 분해가 단일 세포의 시간과 공간에서 규제되는 방식은 완전히 이해되지 않고 있으며, 이는 주로 생체 내에서 자신의 운동학을 정량적으로 측정하는 실험 적 방법의 부족으로 인해 완전히 이해되지 않습니다.
노던 블롯, RT-PCR, RNA 시퀀싱 및 유전자 발현 마이크로어레이와 같은 세포의 집단으로부터 추출된 총 mRNA에 기초한 방법은 mRNA 수준에서 상대적 차이를 측정할 수 있으며 전사 연신율2,,3,,4,45 또는 mRNA 분해6,,7의비율을 분석하는 데 널리 사용되어 왔다. 그러나, 그들은 세포 당 mRNA의 절대 수를 제공하지 않으며, 따라서, 그들은 전사 개시8의비율을 탐구하기에 적합하지 않습니다. 또한, mRNA는 세포의 집단으로부터 추출되기 때문에, 단일 세포 내의 mRNA의 공간 분포 및 세포 중 mRNA 카피 수의 가변성을 측정할 수 없다.
개별 세포(scRNAseq)에 대한 차세대 RNA 염기서열분석은 게놈 척도9에서세포당 mRNA수를 정량화할 수 있다. 그러나 샘플 준비 및 높은 비용으로 인해 전사 운동학을 측정하기 위해이 기술을 사용하기는 여전히 어렵습니다. 특히, 세균에 대한 scRNAseq의 적용은 낮은 mRNA 풍부10,,11로인해 기술적으로 어려웠다.
시상 혼성화(smFISH)에서의 단일 분자 형광은 형광 표지된 단일 가닥 프로브의 혼성화를 기반으로 하며, 그 서열은 관심있는 12,,13의표적 mRNA에 상보적이다. 서열 특이적 혼성화의 개념은 노던 블롯 또는 RT-PCR에서 사용되는 것과 유사하지만, 하이브리드화는 mRNA의 기본 국산화를 보존하기 위해 고정 된 세포 내의 장소에서 수행됩니다. 단일 mRNA의 신호는 많은 프로브를 사용하여 증폭되고, ~20 뉴클레오티드(nt)의 길이, mRNA의 상이한 부분으로 혼성화(도1A)13. 이 "타일링" 프로브 접근법에서 단일 mRNA를 감지하는 데 필요한 프로브 의 수는 분석할 수 있는 mRNA 의 길이에 대해 하한을 설정합니다. 대안적으로, 관심있는 mRNA는 동덤 락 연산자 서열의 비코딩 어레이에 전사적으로 융합될 수 있고, 이러한 형광라벨lacO 프로브의 다중 사본이 단일 mRNA(도1B)14에혼성화될 수 있다.
smFISH는 세포당 mRNAs수를 정상 상태로 정량화하고(즉, 합성 및 붕괴가 균형을 맞출 때) 세균세포15,,16,,17사이에서 mRNA의 평균 및 가변성을 분석하는 데 사용되어 왔다. 최근에는 대장균18,,19,20에서유전자 발현의 유도 또는 억압 직후, 비정상 상태에서 mRNA 수를 정량화하기 위해 smFISH가 적용되고있다. 절대 mRNA 카피 번호의 일시적인 변화는 전사 개시, 신장 및 종료의 속도뿐만 아니라 mRNA 분해 속도를 계산하는 데 사용되었습니다. 이 응용 프로그램의 경우, 종래의 smFISH 절차는 각각 한 번지점을 나타내는 많은 샘플이 있기 때문에 번거로울 수 있으며, 여러 버퍼 교환 단계 (즉, 원심 분리 및 세척)를 거쳐야합니다. 여기서, 우리는 견본 처리 단계가 극적으로 단순화되는 smFISH 프로토콜을 기술합니다, 이는 세포가 커버슬립의 표면에 부착하고 진공 여과시스템(14,,19)으로액체를 심음함으로써 극적으로 단순화된다. 대장균에서 락즈의 발현을 예로 들며, 전체 워크플로우(도2)는전사의 생체 역학(개시, 신장 및 종단)과 mRNA 분해, mRNA 발현 및 mRNA 국소화의 생체 내 운동학을 산출하는 영상분석(도 3)을포함하는 것으로 입증된다. 우리는 프로토콜이 다양한 박테리아 종에서 다른 mRNA의 생체 역학 및 국소화에서 프로브에 널리 적용 될 것으로 예상.
Protocol
1. smFISH 프로브 준비
참고: 단일 플루오로포어로 smFISH 프로브를 라벨을 부착하려면 NHS 에스테르화학(21)에기초한 핵산 올리고뉴클레오티드라벨링표준 프로토콜을 따르십시오.
- smFISH 프로브를 디자인합니다. 관심 유전자에 대해 "타일링" 프로브 또는 "배열"프로브(도 1)를사용할지 여부를 결정합니다. 결정을 내리는 방법에 대한 토론 섹션을 참조하십시오.
- "타일링"프로브(그림 1A)의경우 온라인 프로브 디자이너 도구(예: 재료 표 참조)를 사용합니다. Table of Materials
- "배열"프로브(도 1B)의경우, 블라스트 서열 검색을 수행하여 프로브 서열이 다른 mRNA 서열에 상보적이지 않도록 합니다.
- lacZ mRNA 전사 및 분해 운동학을 연구하려면, 24개의 프로브 2세트를 사용하며, 각 세트는 lacZ(3,072bp)19의첫 번째 및 마지막 1kb 영역을 덮는다. lacZ
참고: 이러한 프로브 세트는, 본래, 각각 "5' mRNA 프로브" 및 "3' mRNA 프로브"로 지칭된다. 이러한 프로브의 시퀀스는 재료 표에나열됩니다.
- 5'끝에 C6 아미노 링커가 있는 DNA 올리고뉴클레오티드로 프로브 서열을 주문합니다. 개별 프로브를 물에 1m로 용해합니다.
- "5' mRNA 프로브"와 "3' mRNA 프로브" 세트에 대 한 프로브의 equimolar 금액을 결합. 예를 들어, lacZ에대해 설정된 5' mRNA 프로브의 경우 각 프로브의 20 μL(세트내 총 24종의 프로브)을 결합합니다.
- 결합된 프로브의 에탄올침전(22)을 수행하여 균주 반응을 억제할 수 있는 1차 및 이차 아민(예: Tris, 글리신 및 암모늄 염)의 오염을 제거합니다. 결국, DNA 펠릿을 100μL의 물(프로브 세트에서 ~4.5mMM의 DNA 산출)에 용해한다.
참고: 이 단계는 프로브가 제조업체에 의해 표준 염무제 정제를 받은 경우에도 권장됩니다. 표준 필터 기반 정화는 에탄올 강수량 대신 및 그 외에 작동할 수 있다. - 5'와 3'mRNA 프로브 세트를 차별화하여 표시할 수 있도록 단기능 NHS 에스테르 모이티를 가진 두 개의 스펙트럼 뚜렷한 형광을 선택하십시오. 예를 들어, 3'mRNA 프로브에 대 한 5' mRNA 프로브및 Cy3B NHS 에스테르에 대 한 Cy5 NHS 에스테르를 준비. 최종 20 mg / mL (~25 mMM)에 무수 DMSO에 형광의 각 유형을 용해.
- 각 라벨링 반응 직전에 0.1M 중탄산나트륨(pH 8.5)을 준비한다. 장시간 공기에 노출되면 pH가 낮아지고 라벨링 효율이 줄어듭니다.
- 균주 반응의 경우, 다음을 결합: 15 μL 의 Cy5 불소소 재주 (1.5 단계에서), 5 mRNA 프로브 세트의 4 μL (단계 1.4에서), 중탄산 나트륨의 75 μL (1.6 단계에서), 물 7 μL. 튜브를 알루미늄 호일로 감싸고 실온에서 3-6시간 동안 흔들어 줍니다.
참고: 인큐베이션이 길어질수록 라벨링 효율이 높아지는 것은 아닙니다. 또한, 성분의 농도가 유지되면 반응이 위또는 아래로 확장될 수 있다. - 3'mRNA 프로브 세트 및 해당 형광소(즉, Cy3B NHS-ester)에 대한 위의 단계를 반복한다.
- 에탄올침전(22)을 수행하여 반응하지 않은 염료 분자를 제거합니다. 펠릿을 TE 버퍼의 ~50 μL에서 녹입니다(1mM EDTA로 10m Ts-HCl pH 8.0).
- UV-Vis 분광기를 사용하여 DNA와 형광의 농도를 추정합니다.
- 흡광도는 260nm 및 559 nm(Cy3B) 또는 649nm(Cy5)에서 측정합니다. 시료가 너무 집중되어 정확한 측정을 산출하면 시료의 1 μL을 10 μL로 희석합니다.
- 흡광도를 농도로 변환합니다.
εDNA = 0.2 μM-1 (20nt 단일 가닥 DNA용), εCy5 = 0.25 μM-1,및 εCy3B = 0.13 μM-1
참고: [DNA]는 용액 내의 총 프로브의 농도입니다. 개별 프로브의 농도는 약 24배 낮습니다. 총 프로브의 농도는 이 시점부터 "프로브 농도"로 사용됩니다. [DNA] 및 [염료] 사이의 비율이 1인 경우, 다음 HPLC 단계는23을건너뛸 수 있으며, 샘플은 TE 버퍼에서 최종 4-5 μM으로 희석되어야 한다.
- (추천) 레이블이 지정되지 않은 프로브에서 표지된 프로브를 정화하고 HPLC를 사용하여 무료 염료를 제거합니다.
참고: 이 추가 정화 단계는 시료 손실로 이어질 수 있지만 다운스트림 응용 프로그램에 유용합니다. 표지가 없는 DNA 프로브를 제거하면 mRNA 표적으로부터형광 신호를 증가시키고 반응하지 않은 염료를 제거하면 배경 형광이 감소합니다.- 표준 분석 C18 컬럼, 0.1 M 트리에틸라모늄 아세테이트(TEAA) 완충A, 완충B로 아세토나이트로 HPLC를 준비한다.
- 샘플에 1M TEAA를 추가하여(1.9단계에서) 0.1M TEAA를 만듭니다.
- 0-5분 B, B의 0-30% 선형 그라데이션으로 5-35분, 그라데이션 프로그램을 다음과 같이 설정합니다. 35-37 분 B의 30-100 % 선형 그라데이션, 37-40 분 0 % B. 0.1 mL /min에서 유량을 유지하고 260 및 649 nm (Cy5 라벨 샘플의 경우) 또는 260 및 559 nm (Cy3B-샘플 라벨)에서 크로마토그램을 기록하십시오.
- DNA와 불소채널 모두에서 흡수성이 증가할 때 용출된 샘플을 수집합니다.
- 진공 농축기를 사용하여 용출된 시료를 농축하고 50-100 μL TE 버퍼로 펠릿을 다시 중단한다.
- UV-Vis 분광기를 사용하여 DNA와 형광의 농도를 확인하십시오(1.10단계 참조). 희석, 필요한 경우, 4-5 μM 주위에 최종 농도를 만들기 위해. -20 °C에서 프로브를 저장
2. 솔루션 준비
- 많은 양의 DEPC 처리 된 물과 버퍼(표 1)를준비합니다. 이러한 솔루션은 실온에서 1년 이상 지속될 수 있습니다.
- 4 배 고정 용액을 준비하고 세척 용액(표 1)을준비합니다.
- 사전 혼성화 솔루션 및 프로브 하이브리드화솔루션(표 1)을준비합니다. 5.1 단계 또는 6.1 단계에서 인큐베이션 중에 프로브 혼성화 용액을 준비한 다음 37°C 싱크탑 셰이커에 용액을 20-40분 동안 유지하여 빛에 대한 노출을 최소화합니다.
참고: 포르마미드, SSC 및 프로브의 농도는 실제 신호를 최대화하면서 배경 형광을 최소화하기 위해 lacZ 프로브 세트에 최적화되었습니다. 다른 응용 프로그램에 대한 이러한 농도를 수정하는 방법에 대한 자세한 내용은 토론 섹션을 참조하십시오.
3. 커버립 및 유리 슬라이드 준비
- 커버립과 유리 슬라이드를 청소합니다.
- 개별 커버립과 슬라이드를 집게를 사용하여 코플린 항아리에 놓습니다. 커버립과 슬라이드가 서로 닿지 않고 분리되어 있는지 확인합니다.
- 항아리를 100% 에탄올로 채우고 뚜껑을 닫습니다. 항아리를 수조 초음파 청소기에 놓고 15-20 분 동안 초음파 처리하십시오.
참고: 수조 초음파 처리기의 경우 히터 기능을 끄는 것이 좋습니다. - 에탄올을 붓고 초순수로 3-4배 씻어내라. 정수기에서 직접 흐르는 물을 사용하십시오.
- 항아리에서 물을 붓고 70 % 에탄올로 채웁니다. 뚜껑을 닫고 15-20 분 동안 초음파 처리를 수행하고 초순수물로 씻어 내보시다.
- 항아리를 초순수물로 채우고 15-20분 동안 초음파 처리합니다.
참고: 커버립과 유리 슬라이드는 초순수물로 채워진 코플린 항아리에 밤새 보관할 수 있습니다. - 깨끗한 집게를 사용하여 코플린 항아리에서 슬라이드 나 커버 슬립을 가져 와서 N2 가스를 사용하여 블로우 드라이하십시오. 나머지 슬라이드 및 커버립에 대해 이 작업을 반복합니다.
- 말린 슬라이드를 7.5 단계에서 사용할 때까지 깨끗한 보관 상자에 놓습니다. 말린 커버립을 빈 1,000μL 파이펫 팁 박스에 놓아 나머지 절차에서 "챔버"로 사용됩니다.
- 소수성 마커를 사용하여 파이펫 팁 박스의 원형 구멍에 따라 커버립에 원을 그립니다. 이 원(직경 0.5cm)은 "우물"로 작용합니다. 마커가 완전히 건조될 때까지 최소 5-10분 이상 기다립니다.
참고: 팁 박스 뚜껑을 닫는 다. - 각 웰에 0.1%의 폴리 L-리신을 20μL 드롭으로 적용합니다. 실온에서 10-50분 동안 배양하십시오.
참고: 이 볼륨을 양크기에 따라 조정합니다. 솔루션이 우물 영역을 완전히 커버하도록 합니다. 더 긴 잠복식을 위해 증발을 피하십시오. - 잠복 후 폴리 L-리신이 표면을 만지지 않고 흡인후 폴리 L-리신을 긁어 냅니다. 그런 다음 DEPC 물의 방울(~20 μL)을 폴리 L-리신 처리 된 우물에 적용합니다. "챔버"의 뚜껑을 닫아 5.1 단계까지 증발을 방지하십시오.
4. 타임코스 실험 및 샘플 고정
- 250mL 플라스크에서 ~20mL 액체 배양에서 대장균 세포를 성장시다. 플라스크를 수조 셰이커(30°C)에 보관하고 계속 흔들어 줍니다. 샘플을 채취하는 경우에만 셰이커를 중지합니다.
참고: 본 논문에 제시된 결과는 M9 최소 배지에서 재배된 MG1655 세포로부터 0.2% 글리세롤, 0.1% 카산산, 1 mg/L 티아민에서 기하급수적 성장 단계(OD600~0.2)에서 얻어진다. - 빈 1.5mL 튜브에 4x 고정 용액의 250 μL을 추가합니다. 여러 튜브를 반복하고 준비할 수 있습니다. 시간 포인트 번호로 튜브에 라벨을 지정하고 실온에서 보관하십시오.
- 시간 과정 실험을 시작하기 전에 세포 배양 (OD600~0.2)의 750 μL을 가져 가라. "시간 제로"로 표시된 튜브에 문화를 추가합니다(4.2단계에서). 튜브를 부드럽게 반전하여 셀을 고정 용액과 혼합합니다.
참고: 세포에 혼합, 소용돌이 또는 "거칠게" 위아래로 피펫하지 마십시오. 이 샘플은 억압된 상태를 나타내며 단일 mRNA의 형광 강도를 계산하는 대조군으로 사용될 것이다(단계 9.4 참조). - 0.02-1 mM의 이소프로필 β-D-1-티오갈라크토피라노사이드(IPTG)를 액체 배양에 첨가하여 lacZ 발현을 유도한다. 이 시점에서 타이머를 시작하고(t = 0분) 다음부터 특정 시간 간격(예: 1분마다)으로 샘플을 채올 경우 샘플링합니다. 샘플링을 위해 4.3 단계를 반복합니다.
- 5 mM orthonitropheynl-β-D-fucopyranoside (ONPF) 또는 500 mM 포도당24 시간 동안 특정 시간에 추가 (예를 들어 t = 1.5 분) lacZ 발현을 억압. 억압 후, mRNA 분해를 추적하기 위해 배양(Step 4.3)을 계속 샘플링한다.
참고: 억압은 ~400 μg/mL 리팜피신, 전사 개시억제제(25)로도수행할 수 있다. - 고정을 위해, 15 분 동안 실온에서 샘플링 된 세포를 포함하는 튜브를 인큐베이션한 다음 30 분 동안 얼음속의 배양을합니다.
- 고정제를 제거하려면 실온에서 4 분 동안 4,500 x g의 튜브원심분리하십시오. 파이펫으로 상체를 제거합니다.
참고: 안전 프로토콜에 따라 별도의 폐기물 용기에 포름알데히드를 폐기해야 합니다. - 1mL DEPC-PBS를 추가하고 셀을 다시 일시 중단합니다. 원심분리 및 재서스펜션을 2배 더 반복합니다.
참고: 고정 된 세포는 깨지기 쉽고 부드러운 치료가 필요합니다. 조심스럽게 펠릿을 다시 중단하고 거품을 피하십시오. - 최종 세척 단계 후 ~ 30 μL DEPC-PBS에서 세포를 다시 중단합니다.
5. 세포막의 투과성
- 각 시간 점 샘플을 커버슬립의 다른 우물에 적용합니다(웰당 ~30 μL). 셀이 표면에 부착될 때까지 실온에서 10-30분 기다립니다. 우물 사이에 액체 방울의 병합을 피하십시오.
- 언바운드 셀을 헹구려면 액체를 흡인하고 각각 의 양에 ~20 μL DEPC PBS를 적용합니다. 몇 분 이내에 DEPC PBS를 흡인.
- 세포막을 4분 동안 각 웰에 70%의 70%의 15μL을 적용하여 세포막을 충자화한다. 4 분 후에 에탄올을 흡입하고 우물이 완전히 건조했는지 확인하십시오.
참고: 에탄올 치료를 4분 동안 제한하는 것이 중요합니다. 더 긴 치료는 과다 투과화귀귀착됩니다. - 각 웰에 워시 용액의 30 μL을 적용합니다.
6. 프로브 혼성화
- 각 우물에서 세척 용액을 흡인. 각 웰에 사전 혼성화 솔루션의 30 μL을 적용합니다. 37°C 오븐에서 챔버를 30분 동안 배양합니다.
참고: 습도를 제공하기 위해 챔버 바닥에 ~50mL의 물을 추가합니다. - 각 웰에서 사전 혼성화 솔루션을 흡인합니다. 프로브 혼성화 용액의 ~30 μL을 각 웰에 적용합니다. 알루미늄 호일로 챔버를 덮고 37°C 오븐에서 2시간 동안 배양합니다.
참고: 프로브 혼성화 용액이 이 단계 전에 37°C 싱크탑 셰이커에 있는지 확인합니다. 우물 사이에 액체가 병합되는 것을 피하십시오. 필요한 경우 각 웰에 더 적은 양의 솔루션을 적용합니다.
7. 혼성화 후 세척 및 이미징 준비
- 멀티채널 파이펫을 사용하여 세척 용액의 ~30 μL을 한 번에 각각 양호하게 적용합니다. 흡입하고 세척의 3-5 배 시간을 반복합니다. 챔버를 37°C 오븐에서 15-30분 동안 배양합니다.
- 7.1 단계를 두 번 더 반복합니다.
- DEPC-PBS로 각각 5배 나 씻어내라. 7.1 단계에서 사용되는 방법을 따르지만 인큐베이션 프로세스를 건너뜁니다.
- 커버슬립에서 액체를 흡인합니다. 각 우물에 DEPC-PBS의 4 μL을 적용합니다.
- 집게를 사용하여 커버슬립을 들어 올리고 뒤집고 유리 슬라이드 위에 부드럽게 놓습니다(3.2 단계에서). 거품을 피하십시오.
- 실리콘 치과 검으로 커버 슬립의 가장자리를 밀봉합니다.
- 잇몸이 굳어지를 때까지 기다립니다. 여기서 일시 중지하고 슬라이드를 4°C에서 하룻밤 동안 저장할 수 있습니다.
참고: 다른 smFISH 프로토콜은 산소 청소 시약(예를 들어, 포도당 산화/카탈라제)을 추가하거나 상업용 안티페이드 장착매체(14,,26)를 사용하여 형광류의 광안정성을 높이는 것을 제안한다.
8. 이미징
- 관심 영역을 찾으려면 위상 대비 이미징의 라이브 모드를 사용합니다. 무대 조이스틱을 조작하여 우물 내에서 시야를 변경합니다. 세포 밀도가 최적 영역을 선택하십시오(즉, 대부분 분리된 세포가 많이 있습니다). 위상 대비 셀 이미지가 초점을 맞출 수 있도록 z 초점을 조정합니다.
- Cy5(4-s 노출), Cy3(2-s 노출), 위상 대비(0.2-s 노출) 순으로 스냅샷을 찍습니다.
참고: Cy3B 염료 분자는 Cy3 채널에서 이미지되고 이미지는 Cy3 이미지라고 합니다. - 8.1-8.2 단계를 반복하여 우물 내에서 ~10개의 다른 영역의 이미지를 수집합니다.
- 목표를 다른 우물로 이동하고 8.1-8.3 단계를 반복합니다.
- 이미지를 TIFF 파일로 내보냅니다.
- (선택 사항) 이미지 다색 구슬은 이미지 등록을 위해 Cy5와 Cy3 채널 사이의 공간 변화를 결정하기 위해 Cy5 및 Cy3 채널의 커버슬립 표면에 흡착되어 있습니다.
- 깨끗한 커버슬립 표면에 다색 형광구비드(직경 0.2μm)를 바르고 10-30분 정도 기다립니다. PBS의 ~50 μL로 세척한 후 PBS의 ~5 μL을 바르고 커버슬립을 유리 슬라이드로 샌드위치로 처리합니다. 현미경에 밀봉하고 장착하십시오.
- Cy5 및 Cy3 채널 모두에서 이미지 구슬.
9. 이미지 분석
참고: 이 단계에서 사용되는 Matlab 코드는 다음 GitHub 웹 사이트인 https://github.com/sjkimlab/Code_Publication/tree/master/JoVE_2020 사용할 수 있습니다. GitHub 폴더에는 셀 세분화 및 스팟 식별을 위한 매개 변수 값을 포함하여 이미지 분석에 필요한 모든 것이 포함되어 있습니다. 이 단계의 절차는 마스터 스크립트에서 "FISHworkflow.m"이라고 더 설명됩니다.
- 미생물추적기(27) 또는 우프티(28)와28같은 세포 세분화 도구를 열고 위상 대비 이미지를 로드합니다. "독립 프레임"을 선택하고 "모든 프레임"이라는 버튼을 눌러 셀이 식별되고 윤곽선이 계산되는 세분화 프로세스를시작합니다(그림 3B,C).
참고: 이러한 소프트웨어 패키지를 사용하기 위한 자세한 프로토콜은 온라인에서 사용할 수 있습니다(예: oufti.org). - 미생물추적기 또는 우프티의 스팟파인더 기능에 Cy5 형광 이미지를 로드하고,"실행"버튼을 눌러 2D 가우시안피팅(그림 3B,C)에따라 스팟 식별 및 정량화를 시작합니다. Cy3 형광 이미지에 대해 이 단계를 반복하여 Cy3 채널의 반점을 분석합니다. 이 단계는 각 셀의 강도 및 좌표를 포함하여 반점 목록을 생성합니다.
- (선택 사항) FISHworkflow.m 파일에 설명된 대로 임계값을 사용하여 희미한 반점(거짓 긍정)을 필터링합니다.
참고: 음수 제어(예: MG1655 ΔlacZ)에서형광 반점을 검사하고 거짓 긍정을 필터링하는 임계값을 결정합니다. - 단일 mRNA의 현물 강도를 얻으려면, (IPTG를 추가하기 전에) 시간 제로에서 측정된 현물 강도 목록을 사용하고, 두 개의 혼합물 성분과 가우시안 혼합물 모델과 스팟 강도의 분포를 맞춥니다. 단일 mRNA의 반점 강도로서 첫 번째 가우시안 인구(도 3D,E의검은 선)의 피크 위치를 차지하십시오. Cy5 스팟 및 Cy3 스팟에 대해 별도로 수행하여 단일 5' 및 3'lacZ mRNA의 반점 강도를 얻습니다.
참고: 단일 mRNA의 반점 강도가 다른 실험에서 약간 다를 수 있기 때문에 모든 시간 과정 실험에서 이를 반복합니다. - 한 지점의 형광 강도를 단일 mRNA의 강도(9.4단계로부터)로 나누어 한 지점 내의 mRNA 수를 얻습니다. 셀 내의 합 정규화 된 스팟 강도는 셀에서 mRNA의 총 수를 계산한다(도3F). 5' 및 3'mRNA에 대해 이러한 계산을 별도로 수행합니다.
- 각 시점에서 세포당 평균 mRNA 숫자를 계산 및 플롯(예를 들어, 도 4B),평균 mRNA 수준(도4B)의시간적 변화로부터 전사 및 mRNA 분해의 생체 내 운동학을 분석한다.
- 전사 신장속도를 얻으려면, 5' 및 3'mRNA 신호에서 초기 상승에 대한 라인의 최소 제곱 피팅을 수행하고 기저수준(도 4B)에대한 요격을 식별한다. 이러한 요격의 차이는 RNAP가 5' 프로브 영역에서 3'프로브 영역으로 이동하는 평균 시간을 나타냅니다. 이 때 두 프로브 세트(2kb)와 거리를 나누어 전사 신장의 평균 속도를 얻습니다.
- mRNA 분해 속도를 얻으려면 지수 부패 함수, y =A·ep(-t/θ)를 5' 및 3' mRNA 신호(예를 들어, 도 4B)의최종 부패 부위에 맞춥니다. 피팅 매개 변수, θ는 평균 mRNA 수명입니다.
- (선택 사항) 각 세포에서 mRNA 숫자의 분포를 기반으로 유전자 발현(예를 들어, 도 4C에표시된 유도에 대한 세포 수준 반응)의 세포 간 변이를 분석합니다(9.5단계에서 계산됨).
- (선택 사항) 셀의 주요 축 및 작은 축을 따라 스팟 위치에 대한 정보를 사용하여(9.2단계에서 얻은) mRNA(도4D,E)의국소화를 분석한다.
- (선택 사항) Cy5 및 Cy3 채널에서 검출된 반점의 국소화를 비교하여 5' 및 3mRNA(그림5)의공동 국소화를 분석합니다.
- 마이크로베트래커에서 스팟파인더F 기능에 다색 구슬(8.6단계)의 이미지를 로드하고 Cy5 및 Cy3 채널에서 비드 센트로이드 좌표를 얻습니다. 중심 좌표 목록을 사용하여 Affine 변환 행렬을 계산하여 Cy5 및 Cy3 채널이 서로 에 대해 어떻게 이동하고 회전하는지알려줍니다.29.
- Cy5 및 Cy3 FISH 이미지에 affine 변환 매트릭스를 적용하여 Cy5 좌표에서 Cy3 이미지를 변환합니다. 스팟이 다른 채널의 다른 스팟과 공동 지역화된 경우 분류합니다. 예를 들어, Cy5 채널의 스팟은 중심가 사이의 거리가 150nm 미만인 경우 Cy3 채널의 다른 지점과 공동 국한되는 것으로간주됩니다(그림 5).
- 각 시점에서 Cy3 스팟과 "공동 지역화"로 분류되는 Cy5 스팟 수를 분석합니다. 또한, 공동 국화 된 반점의 강도를 분석(도 5).
Representative Results
그림 3은 이 smFISH 프로토콜의 대표적인 이미지를 보여줍니다. 전체 시야(86.7 μm x 66.0 μm)는 재료표에상세하여 현미경 설정을 사용하여 ) ~ 500 E. 대장균 세포가 필드 전체에 분산되어 있다(도3A)를나타낸다. 세포의 밀도가 이 이미지에 표시된 것보다 훨씬 높으면, 분할 알고리즘이 세포가 서로 접촉할 때 개별 세포를 안정적으로 식별하지 못하기 때문에 자동 세포 세분화가 어려워집니다. 하나는 시야에서 세포의 최적의 밀도를 달성하기 위해 표면 준수 (단계 5.1)에 사용되는 세포 및 배양 시간의 농도를 조정해야합니다.
상 대비 이미지에서 세포의 형태는 세분화 목적을 위해 살아있는 세포의 형태와 비교되어야한다(그림 3A-C). 세포가 과다 투과화되면 세포 형태가 변경됩니다(예: "유령"; 보충 도 1). 이 경우, 단계 5.3에서 70% 에탄올 치료의 지속 시간을 줄일 수 있다.
유도 전에 평균 lacZ 발현 수준은 셀당 ~0.03 mRNAs였으며, 이전보고서(15,,30)와일치한다. 또한, 유도 전에 lacZ mRNA 스팟 강도의 분포는 높은강도(도 3D,E)를가진 반점의 존재로 인해 정상적인 분포 또는 푸아송 분포와 잘 맞지 않았다. 이것은 억압된 상태에서 검출된 반점의 대부분이 단일 lacZ mRNA를 나타낸다는 것을 건의합니다, 그러나 반점의 작은 인구는 하나 이상의 lacZ mRNA를 포함합니다. 단일 lacZ mRNA로 인구를 격리하기 위해, 우리는 두 개의 혼합물 성분 (도 3D,E의인셋)과 가우시안 혼합물 모델을 사용했다. 이어서, 제1 가우시안의 평균 강도는 단일 mRNA 스팟(예를 들어, 도 3D에서검은 곡선의 피크)의 평균 강도로 촬영되었고, 타임코스 실험에서 검출된 임의의 반점에 대해, mRNA의 수로 반점 강도를 변환하는 데 사용되었다. 셀 내의 총 mRNA 수를 계산하기 위해, 정규화된 스팟 강도는 각셀(그림 3F)19에서합산되었다.
lacZ mRNA의 발현 수준이 낮을 때, 세포 내에서 공간적으로 분리된 하나 또는 두 개의 회절 제한 lacZ mRNA 반점이 있다. 따라서 이러한 반점의 이미지는 강도와 현지화를 위해 2D 가우시안 피팅으로 분석할 수 있습니다.
발현 수준이 높을 때, 그 반점이 셀 내에서 서로 겹치는 것과 같은, 2D 가우시안 피팅은 신뢰할 수 있는 정량화를 하지 않습니다. 이 경우, mRNA 수준은 단일 mRNA19의평균 강도를 가진 세포 내의 총, 배경 감도형 형광 신호를 분할하여 계산되어야 한다.
lacZ의 발현이 유도되면, 5' lacZ mRNA의 신호가 먼저 증가하고 3'lacZ mRNA의 신호가 나중에 증가한다(도4B). lacZ lacZ의 발현이 억압되면, 5'와 3'lacZ mRNA 신호가 모두 감소하여 그 사이에 약간의지연(도 4B)이지연된다. 전사 연신율을 얻기 위해 5' 및 3'신호의 상승은선(도 4B)에먼저 맞으며, X 차단의 차이는 RNAP가 두 프로브 영역(2,000nt)사이의 거리를 이동하는 시간으로 취합니다. 전사 연분의 속도는 각 시간 과정 실험에서 측정될 수 있으며 표준 편차는 실험 복제본으로부터 계산될 수 있다. 전사 신장의 평균 속도는 우리의 실험 조건19에서15-30 nt /s이었다.
또한, mRNA 분해속도(평균 mRNA 수명의 역)는 지수기능(도 4B)을가진 부패 부위를 피팅함으로써 얻어졌다. 우리의 시간 과정 데이터는 전사31동안 및 후 mRNA 저하를 포함합니다. 우리는 3'mRNA가 붕괴하기 시작한 후 시간 점에 맞게 (t > 6 분) 방출 된 mRNA의 저하를 조사합니다. 우리는 5' 또는 3' lacZ mRNA19의평균 수명으로 ~90s를 얻었다.
전사 개시속도는 유도 후 5' 신호증가(도 4B,파란색) 또는 정상 상태에서 평균 mRNA 수로부터 계산될 수 있다(이는 열화율로 나눈 개시속도). 더욱이, 조기 전사 종료 확률은 3' 신호 증가대 5신호 증가 사이의 비율을 취하거나3'과 5mRNA영역(19)의정상 상태 수준 사이에서 추정될 수 있다.
smFISH는 단세포 기술이기 때문에 전사에서 세포 대 세포 가변성을 분석할 수 있습니다. 예를 들어, IPTG가 첨가된 후 lacZ mRNA를 발현하는 세포의 백분율을 분석할 수있다(도 4C). 또한 유도 후 mRNA 현지화가 변경되는지 여부를 해결할 수 있습니다. 우리는 5' 및 3'lacZ mRNA 반점이 이전보고서(33)와일치하는 세포의 중심(도4D,E)에서약간 바깥쪽으로 이동하는 것을 관찰했다.
마지막으로, 5'와 3' mRNA 반점 사이의 공동 국소화 분석은 유익할 수있다(도 5A). 예를 들어, 억압된 상태(시간 제로)에서 5' mRNA 반점의 약 25%가 3'mRNA 반점과 공동 국한된다. t = 1 분에서, 많은 유전자 loci가 5'mRNA 합성을 가지고 있지만, 아직 3' mRNA 합성, 5'mRNA 반점의 대부분은 3'mRNA 신호없이 스스로 (즉, 공동 국소화의 낮은 확률). 그러나, 3'mRNA가 나타나면(즉, t = 2분), 공동 국소화 확률이 증가한다(도 5A,B의보라색 화살표). 이 시점은 공동 국소화가 빈번해지면 전사 신장 속도에 따라 달라집니다. 이 시점에서 검출된 각 공동 국소화 스팟 내에서 5' 및 3'lacZ mRNA 수의 2-D 밀도 플롯은 lacZ 유전자(도 5C)에대한 RNAPs의 밀도를 추론하는 데 사용될 수 있다. 앞서 보고된 바와 같이19,이 플롯에서 5' mRNA 숫자는 lacZ 발현이 1mM IPTG에 의해 유도될 때 대부분의 lacZ 로시가 DNA에 10 RNAPs 미만을 가지고 있음을 나타낸다. 추가적으로, 이 플롯의 3' mRNA 숫자는RNAPs(34)의군집과 관련이 있다. 3' mRNA의 수가 하나에 가깝다는 사실은 대략 하나의 RNAP가 3'프로브 영역으로 들어가는 것을 의미합니다. 이것은 lacZ 유전자에 있는 RNAP가 클러스터 (또는 "호송")를 형성하는 대신 공간적으로 분리된다는 것을 건의합니다.
그림 1: mRNA에 대한 smFISH 프로브의 설계. (A)타일링 방법. 짧은 DNA 올리고뉴클레오티드(길이~20bp)의 서열이 선택되어 관심 있는 mRNA를 커버할 수 있습니다. 올리고뉴클레오티드 프로브는 형광염 분자로 표지됩니다. (B)배열 방법. 탠덤 서열의 비코딩 어레이(예를 들어,"lacO 어레이")는 관심 있는 mRNA에 전사적으로 융합된다. 경전 유닛(예를 들어, 길이 17bp의 lacO 프로브)을 보완하는 형광 라벨 프로브가 mRNA의 신호를 증폭시키는 데 사용된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 각 단계의 smFISH 실험 절차 및 시간 시간의 회로도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: smFISH 이미지 분석. (A-C)smFISH 현미경 이미지는 5' lacZ mRNA (빨간색) 및 3' lacZ mRNA (녹색) 야생 형 E. 대장균(MG1655)은 M9 최소 배지에서 재배하여 0.2% 글리세롤, 0.1% 카산산, 30°C에서 1 mg/L 티아민1mg/L 티아민(A) 0.05mM IPTG를 입력한 후 0.05m IPTG를 50m= 50m=50m에서 0.05m.A Cy5(5'lacZ mRNA, 빨간색용) 및 lacZ Cy3(3'lacZ mRNA, 녹색)의 위상 대비 및 2개의 형광 이미지는 의사 색소로 오버레이되었다. lacZ 이미지는 86.7 μm x 66.0 μm의 전체 필드를 보여줍니다. 스케일 바, 5 μm. (B)작은 영역(노란색 상자)의 확대 버전(A). 세포 윤곽선은 흰색으로 표시되고, 화상 분석에서 확인된 형광 반점은 빨간 점으로 표시됩니다. 스케일 바, 1 μm. (C)높은 발현 조건 하에서 세포 윤곽선 및 형광 반점의 검출(t = 1 mM IPTG로 유도 후 4분). 스케일 바, 1 μm. (D-E) IPTG(억압된 상태)를 추가하기 전에 측정된 5' 및 3' mRNA 현악 강도의 분포. 히스토그램은 가우시안 혼합물 모델의 평균 값이 두 개의 가우시안 함수(검은색과 회색)로 표시됩니다. Inset은 가우시안 혼합물 모델및 실험적으로 측정된 mRNA 현물 강도(n = 1040 for 5' mRNA및 3mRNA에 대한 680)에서 생성된 난수의 정량적 플롯을 나타낸다. (F)패널(B)을 가리키는 개별 셀에 대해 얻은 정보. 주어진 셀(i)의 경우, 반점은 Cy5 및 Cy3 채널에서 확인되었고, 그 강도(I)와 세포의 짧고 긴 축을 따라좌표(d, l)는2D 가우시안 피팅으로부터 정량화되었다. 정규화 스팟 강도가 합산된 후 이 셀에서 총 5' 또는 3mRNA를 산출합니다. 또한, 서로 다른 채널의 반점 간의 공동 지역화는 도 5에도시된 예와 같이 분석될 수 있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 전사 및 mRNA 분해의 생체 내 운동학의 분석. (A)시간이 지남에 따라 lacZ mRNA 수준의 변화를 측정하는 2색 smFISH 실험의 회로도 및 대표적인 이미지. 빨간색과 녹색 점선은 대장균의 lacZ mRNA의 1kb-long 5' 및 3mRNA 부위에 혼성화되는 Cy5 또는 Cy3B 표지 올리고뉴클레오티드 프로브를 각각 나타낸다. 또한 t = 0 분에서 0.2 mM IPTG를 유도 한 후 표시된 시간 지점에서 위상 대비 이미지를 가진 두 개의 형광 이미지의 오버레이가 도시되어 있습니다. 전사는 t = 1.5 분에서 500 mM 포도당으로 억압되었다. 스케일 바, 1 μm. 이 수치는 김 외19에서수정되었습니다. (B)5' 및 3' lacZ mRNA 는 시간이 지남에 따라 세포당, 패널(A)에 기재된 실험 중에. 오류 막대는 부트 스트랩 SEM입니다. 시간당 적어도 1,200개의 세포가 분석되었다. 5' 및 3' mRNA 신호의 초기 상승은 선(파란색)에 맞습니다. x-가로채기의 차이는 1.93분으로, 17.3nt/s의 전사 연신율을 산출했습니다. 5' 및 3' mRNA 신호의 최종 붕괴는 지수 부패 기능(회색)에 적합하였다. 적합 매개 변수는 평균 mRNA 수명이 5' mRNA에 대해 1.52 분, 3'mRNA의 경우 1.66 분임을 나타냅니다. (C)(A)에 기재된 실험 중에 하나 이상의 lacZ mRNA 반점을 가진 세포의 백분율. 오류 막대는 부트 스트랩 SEM입니다. (D)셀의 짧은 축을 따라 반점의 국소화. 짧은축(d)을따라 위치를셀(w)의절반 폭으로 나누어 멤브레인에 대한 스팟의 근접성을 정량화할 수 있다. (E)(A)에 기재된 실험 중 세포의 짧은 축을 따라 5' 및 3'lacZ mRNA 반점의 국소화 변화. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 5' 및 3' mRNA 반점의 공동 국소화 분석. (A)유도 후 5'와 3' mRNA 반점 사이의 예상 공동 국소화를 나타내는 회로도. 3' mRNA가 만들어지면, 3'mRNA 반점이 3'mRNA 반점증가(보라색 화살표)와 공동 국화되는 5' mRNA 반점의 확률이 증가합니다. (B)1mM IPTG를 유도한 후 공동국화의 확률. 보라색 화살표는 패널(A)의 회로도에 따라 공동 지역화 확률이 먼저 빈번해지는 시점을 나타냅니다. (C)1mM IPTG(총 841점)를 유도한 후 t= 2분 에서 검출된 공동 국소화 스팟 내에서 5' 및 3'lacZ mRNAs의 개수. 회색 점은 개별 공동 지역화 된 반점을 나타내는 반면 빨간색 점은 비닝 데이터의 평균을 나타냅니다. 오류 막대는 SEM입니다. 회색 음영은 그래프의 지정된 영역에서 점의 밀도를 나타냅니다. 점선은 1의 경사를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 6: 프로브 혼성화 조건의 최적화. 샘플의 두 가지 종류가 사용되었다: MG1655 세포는 도 3에 설명된 바와 같이 성장하고 유도되지 않은 유지 (파란색) 또는 20 분 (빨간색)에 대한 0.5 mM IPTG로 처리. 프로브 혼성화 용액은 다양한 농도의 프로브(전체 lacZ 영역을 타일링하는 총 72개의 Cy5-컨쥬게이트 프로브)와 formamide로 만들어졌습니다. 포름아미드 농도는 또한 미리 혼성화 용액 및 세척 용액에서 조정되었다, 그에 따라. "프로브 없음"(회색 선)은 혼성화 단계 동안 프로브없이 처리된 IPTG 첨가 세포의 형광 수준을 나타낸다. 세포 영역(AU)에 의해 정규화된 평균 형광 강도는 300-800 세포로부터 계산되었다. 오류 막대는 부트 스트랩 SEM입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 도1: 과잉 투과로 인한 왜곡된 세포 형태. 위상 대비(회색 스케일), 5' lacZ mRNA(Cy5, red), 및 3' lacZ mRNA(Cy3, green) 이미지의 MG1655 세포는 1mM IPTG로 유도 후 5분 후에. (A)정상 세포와 정상 형태가 부족한 지나치게 투과된 세포의 혼합물을 보여주는 예(분홍색 화살표로 표시). (B)"유령"세포가 함께 뭉쳐 있는 것을 보여주는 예. 스케일 바 = 1 μm. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
| DEPC 물 | ||||
| 초순수물에 0.1% DEPC를 추가하고 병(덮여)을 하룻밤 사이에 37°C 오븐에 배양하고 다음날 오토클레이브를 배양합니다. | ||||
| DEPC PBS (10X) | ||||
| 다음을 혼합합니다. | ||||
| 80 g | 나Cl (최종 1.37 M) | |||
| 2 g | KCl (최종 27m) | |||
| 14.2 g | 나2HPO4 (최종 100mM) | |||
| 2.7 g | KH2PO4 (최종 20mM) | |||
| 초순수- 1L | ||||
| 유리 병에 필터 (0.22 μm). | ||||
| 0.1% DEPC를 추가하고 DEPC 물에 대한 지침을 따릅니다. | ||||
| 1X 용액을 만들려면 DEPC 물로 10회 희석하십시오. | ||||
| 1M DEPC 인산염 나트륨 완충제, pH 7.4 | ||||
| 다음을 혼합합니다. | ||||
| 115 g | 나2HPO4 | |||
| 22.8 g | NaH2PO4 | |||
| 초순수 - 1L | ||||
| 유리 병에 필터 (0.22 μm). | ||||
| 0.1% DEPC를 추가하고 DEPC 물에 대한 지침을 따릅니다. | ||||
| 4X 고정 솔루션(16% 포름알데히드) | ||||
| 5 mL | 20% 포름알데히드 | |||
| 500 μL | DEPC 물 | |||
| 750 μL | 1M DEPC 인산염 나트륨 완충제, pH 7.4 | |||
| 최대 2-4주 동안 4°C에 보관하십시오. | ||||
| 주의: 포름알데히드는 독성이 있습니다. 장갑을 착용하고이 솔루션을 만들 때 연기 후드를 사용합니다. | ||||
| 워시 솔루션 | ||||
| 다음을 혼합합니다. | ||||
| 10mL | 포르마미드 (최종 25%) | |||
| 4 mL | 20X SSC (최종 2X) | |||
| DEPC 물을 40mL로 채우기 | ||||
| 필터(0.22 μm) 및 4°C에 보관 | ||||
| 주의: 포르마미드는 독성이 있습니다. 장갑을 착용하고이 솔루션을 만들 때 연기 후드를 사용합니다. | ||||
| 사전 하이브리드화 솔루션 | ||||
| 200 μL | 포르마미드 (최종 20%) | |||
| 100 μL | 20X SSC (최종 2X) | |||
| 10 μL | 100X VRC (최종 1X) | |||
| 25 μL | 4% (w/v) BSA (최종 0.1%) | |||
| 685 μL | DEPC 물 | |||
| 참고: 10 μL을 복용하기 전에 VRC 스톡을 소용돌이시다. | ||||
| 주의: 포르마미드는 독성이 있고 알려진 테라토겐입니다. 장갑을 착용하고 연기 후드 아래에 처리합니다. | ||||
| 프로브 하이브리드화 솔루션 | ||||
| 200 μL | 포르마미드 (최종 20%) | |||
| 100 μL | 20X SSC (최종 2X) | |||
| 10 μL | 100X VRC (최종 1X) | |||
| 25 μL | 4% (w/v) BSA (최종 0.1%) | |||
| 10 μL | 40 mg/mL E. 대장균 tRNA (최종 0.4 mg/mL) | |||
| 200 μL | 50% 황산염 (최종 10%) | |||
| x μL | 5' mRNA 프로브 세트 (단계 1.12에서) 최종 4 nM. | |||
| y μL | 3' mRNA 프로브 세트 (단계 1.12에서) 최종 4 nM. | |||
| - | 총 부피 1mL을 만드는 DEPC 물 | |||
| 참고 : 마지막 dextran 황산염을 추가합니다. 매우 점성이 있기 때문에 파이펫 팁의 끝을 잘라낸 후 50 % 스톡에서 200 μL을 꺼냅니다. dextran 황산염을 추가 한 후, 파이펫위아래로 위아래로 사용하여 용액을 균질화합니다. | ||||
표 1: 사용되는 솔루션의 조리법.
Discussion
여기서, 대장균에서mRNA 운동학을 측정하기 위한 smFISH 프로토콜을 제시했다. 박테리아(23)를위한 이전에 발표된 smFISH 프로토콜에서, 세포는 프로토콜의 끝까지 튜브에 보관되었다, 즉, 그들은 이미징을 위한 준비가 될 때까지. 커버슬립표면(23)에형광 프로브의 최소 비특이적 결합과 같은 많은 이점이 있지만, 타임코스 실험에서 많은 샘플이 있을 때 이러한 프로토콜을 따르기가 어렵다. 첫째, 상대적으로 많은 양의 셀(>1 mL)을 샘플링하고 심지어 고정하기 전에 수확해야 합니다. 둘째, 세포 샘플은 솔루션을 교환하고 혼성화 단계 후에 세척하기 위해 여러 번 원심분리되어야 합니다. 우리의 프로토콜에서, 문화의 작은 볼륨 (&1 mL)은 샘플링 순간에 셀 상태를 신속하게 "동결"하는 데 도움이, 1.5 mL 튜브의 고정 솔루션과 직접 혼합된다. 또한, 세포는 절차 전반에 걸쳐 표면에 부착된 상태를 유지하고, 진공 여과 시스템으로 액체를 흡입하고 다중 채널 파이펫으로 한 번에 용액 방울을 적용하여 다른 솔루션을 신속하게 교환할 수 있습니다. 이러한 차이로 인해 많은 수의 샘플을 한 번에 처리해야 할 때 프로토콜이 매우 유리합니다. 우리의 프로토콜을 사용하여, 12-48 견본은 동시에 취급될 수 있고 전체 FISH 절차는 몇 가지 견본에 필요한 대략 유사한 시간의 대략 8 시간 안에 완료될 수 있습니다(그림 2). 우리는 예를 들면 대장균에 있는 lacZ의 발현을 예로 사용하더라도, 프로토콜은 아래에 설명된 고려사항과 다른 유전자 및 세균성 종에 넓게 적용됩니다.
다른 유전자에 대 한, 고려해 야 할 첫 번째 것은 smFISH 프로브. 하나는 관심있는 mRNA타일 올리고뉴클레오티드 프로브를 설계할 수 있습니다(도 1A)13. 이 "타일링" 프로브 접근법에서 각 프로브는 ~20베이스 길이이며 5' 또는 3' 종단에 불소로 표시됩니다. 이 전략은 유전 적 조작이 필요하지 하기 때문에 편리합니다. 대안적으로, ~20bp 서열의 탠덤 반복, 게놈 서열에 이소(예를 들어, Caulobacter crescentus14에서 lacO 서열의 배열), 관심 유전자의 번역되지 않은 영역에 삽입될 수 있고 단일 프로브는 mRNA("배열" 접근법)에 라벨을 붙이는 데 사용된다. 그림 1B). 두 경우 모두, 다중 형광은 mRNA를 장식하여 세포 내부에 특이적으로 결합된 단일 프로브로부터 쉽게 분화될 수 있는 증폭형 형광 신호를 제공합니다.
"타일링" 또는 "배열" 접근법을 선택할지 여부는 대상 mRNA가 부족하기 때문에 프로브의 비특이적 결합이 테스트되는 샘플인 음수 제어에 따라 달라집니다. 타일링프로브(도 1A)의경우, 유전자가 전사되지 않은 유전자 또는 조건의 유전자가 없는 돌연변이 균주(예를 들어, lacZ의억압)는 프로브의 비특이적 결합을 테스트하기 위한 부정적인 대조군역할을 할 수 있다. 어레이 기반 smFISH(도1B)의경우 배열이 부족한 야생형 스트레인은 프로브에 대한 바인딩 부위를 포함하지 않기 때문에 음의 제어 역할을 할 수 있다.
최적의 혼성화 조건은 프로브 서열 및 플루오로포레 염료의 선택에 따라 달라질 수 있습니다. 혼성화 온도를 37°C로 유지하고 혼성화 용액에서 다양한 프로브 세트 및 포르마이미드 농도를 테스트하여 lacZ 프로브 세트의 혼성화 조건을 최적화했습니다. 포르마이드의 높은 농도는 비특이적 및 특이적결합(26,,35)을모두 감소시키는 경향이 있다. 하이브리드화 시간과 온도를 동일하게 유지하면서 하이브리드화와 세척 조건을 체계적으로 변경하는 것이 좋습니다. 조건이 더욱 엄격해짐에 따라, 비특이적 및 특정 결합감소(도 6). 특정 바인딩을 추가로 손상시키지 않으면서 비특이적 바인딩이 허용 가능한 임계값 이하로 떨어지기 시작하는 지점을 찾는 것이 중요합니다. 예를 들어, 프로브 없이 얻은 신호 레벨을임계값(도 6)으로사용하였다.
mRNA의 두 개의 별도 영역을 표지하는 2색 smFISH 방법은 긴 유전자로 제한됩니다. 전사 신장속도를 측정하기 위해 lacZ가 길고(3075bp)이고 그 발현이 IPTG에 의해 유도될 수 있다는 사실을 이용했습니다. 유전자가 짧을 때, 2개의 타일링 프로브 세트(5'와 3'끝 근처)를 설계하고 5'대 3'mRNA 부위의 출현 사이의 시간 지연을 해결하는 것은 어렵습니다. 이 경우, 초기 mRNAs를 smFISH에 의해 안정된 상태로 계산하고 피팅매개변수(20)로서전사 신장속도를 가진 분석 모델로 분포를 분석할 수 있다. 또한, 관심 유전자가 유도할 수 없는 경우, 하나는 시간 제로에서 리팜피신으로 세포를 치료하고 5' 및 3'mRNA 하위 영역에서 측두적인 변화를 측정할 수 있다. 5' mRNA 신호의 감소로부터 3' mRNA 신호의 감소로부터의 지연은 이전에31과같이 전사 신장속도를 계산하는 데 사용될 수 있다.
마지막으로 smFISH 프로토콜은 다양하며 다른 라벨링 구성표와 결합할 수 있습니다. 이전에는 mRNA FISH와 DNA FISH14 또는 형광 리포터-연산시스템(20)을 결합하여20DNA 궤적과 함께 DNA 궤적을 시각화했다. 단백질 제품은 mRNA FISH14,,36과함께 면역 형광을 수행함으로써 시각화될 수 있다. 또한 3차원 초해상도 현미경검사법(37)과 결합하여,38,39의모든 3차원에서 mRNA를 시각화할 수 있다.
Disclosures
저자는 경쟁적인 재정적 이익이 없다고 선언합니다.
Acknowledgments
이 프로토콜은 하워드 휴즈 의학 연구소와 예일 대학의 미생물 과학 연구소에서 크리스틴 제이콥스-바그너 박사의 실험실에서 박사 후 연구 중 S.K.에 의해 개발되었다. 우리는 제이콥스 바그너 박사와 그녀의 실험실 구성원에게 방법 개발 중에 다양한 입력을 하고 원고를 비판적으로 읽어 준 로라 트로이어에게 감사드립니다. S.K.는 Searle 학자 프로그램의 지원을 인정합니다. K.V.는 일리노이 대학교에서 제임스 학자 프리블 연구 상을 수상했다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacterial strain | |||
| Escherichia coli MG1655 | |||
| Chemicals, peptides, and others | |||
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 34851 | UPLC buffer B |
| Ammonium chloride | Fisher Chemical | A661-500 | To make M9 medium |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | B2518 | Probe hybridization |
| Calcium chloride | Acros Organics | 349610250 | To make M9 medium |
| Casamino acid | BD Difco | 223050 | To make M9 medium |
| Cy3B NHS ester | GE Healthcare Life Sciences | PA63101 | Fluorophore for FISH probes |
| Cy5 NHS ester | GE Healthcare Life Sciences | PA15101 | Fluorophore for FISH probes |
| DEPC | Sigma-Aldrich | D5758 | |
| Dextran sulfate | Millipore | S4030 | Probe hybridization |
| Dextrose | Fisher Chemical | D16 | To repress the expression of lacZ |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | To dissolve fluorophores |
| E. coli tRNA | Sigma-Aldrich | R1753 | Probe hybridization |
| Ethanol | Decon Laboratories | 2701 | Used in DNA purification, lysis, and cleaning coverslips |
| FISH probes | Biosearch Technologies | Sequences are published in ref#16 | |
| Formaldehyde | Ladd Research Industries | 20295 | Fixation |
| Formamide | American Bio | AB00600 | Probe hybridization, pre-hybridization, and wash |
| Glycerol | Americanbio | AB00751-01000 | To make M9 medium |
| Isopropylthio-β-galactoside (IPTG) | Invitrogen | 15529019 | lacZ induction |
| Magnesium sulfate | Fisher Chemical | M65-500 | To make M9 medium |
| 2-Nitrophenyl β-D-fucopyranoside (ONPF) | Santa Cruz Biotechnology | sc-216258 | lacZ repression |
| Picodent twinsil 22 | Picodent | 1300 1000 | Sealant |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P8920 | To treat the coverslip surface |
| Potassium chloride | Fisher BioReagents | BP366-500 | To make PBS |
| Potassium phosphate monobasic | Fisher BioReagents | BP362-500 | To make PBS and M9 medium |
| Rifampicin | Sigma-Aldrich | R3501 | To stop transcription initiation |
| Saline-sodium citrate buffer (SSC) | Invitrogen | AM9763 | Probe hybridization, pre-hybridization, and wash |
| sodium bicarbonate | Fisher BioReagents | BP328-500 | Fluorophore-probe conjugation |
| Sodium chloride | Fisher BioReagents | BP358-1 | For DNA purification, PBS and M9 medium |
| Sodium phosphate dibasic | Fisher BioReagents | BP332-500 | To make PBS and M9 medium |
| Sodium phosphate monobasic | Fisher BioReagents | BP329-500 | To make a sodium phosphate buffer |
| Super PAP Pen | Invitrogen | 8899 | Hydrophobic marker for coverslips |
| TetraSpek microspheres | Invitrogen | T7280 | Controls for multi-channel registration |
| Thiamine | Sigma-Aldrich | T1270 | To make M9 medium |
| Triethylammonium acetate | Sigma-Aldrich | 90358 | UPLC buffer A |
| Vanadyl ribonucleoside complex (VRC) | Sigma-Aldrich | 94742 | Probe hybridization and pre-hybridization |
| Equipment | |||
| C18 column | Waters | Acquity BEH C18 column | |
| Countertop centrifuge | Eppendorf | 5425 | |
| Countertop incubator | Eppendorf | Thermomixer F1.5 | |
| Incubator (Oven) | Thermo Scientific | 51030514 | Gravity convection |
| Water purification system | Millipore | Milli-Q Reference | |
| Nanodrop | Thermo Scientific | 2000C | |
| Nitrogen gas | Building | For blow-drying coverslips and glass slides | |
| UPLC | Waters | Acquity UPLC system | |
| Vacuum and aspirator | Building | Aspirator is made of a filtration flask with a side arm. | |
| Vacuum concentrator | Labconco | 7810010 | Centrivap; to dry samples collected from UPLC. |
| Vortexer | Scientific Industries | Genie-2 SI-0236 | |
| Water bath shaker | New Brunswick | Innova 3100 | Critical for time-course experiments |
| Water bath sonicator | VWR | 97043-960 | To clean coverslips and glass slides |
| Tools | |||
| 1.5-mL tubes | Eppendorf | 22431021 | DNA lobind tubes |
| 1000-uL pipette tip box | Denville Scientific | P1126 | An empty box after using all the tips |
| Coplin jar | SPI | 01240-AB | To clean coverslips and glass slides |
| Coverslip | Fisher Scientific | 22-050-230 | 24x60 No1 |
| Filtered pipette tips | Denville Scientific | P1121,P1122,P1126 | SHARP® Precision Barrier Tips |
| Forceps | SPI | K35a | To handle clean coverslips and glass slides |
| Glass slide | Fisher Scientific | 12-544-1 | |
| Gloves | Microflex | MK-296-M | |
| Multichannel pipetter | Eppendorf | 2231300045 | To use in the washing step (#7) |
| Pipette | Gilson | P1000, P200, P20 | |
| Reagent reservoir | MTC Bio | P8025-1S | To use in the washing step (#7) |
| Syringe filter (0.22 um) | Millipore | SLGS033SS | |
| Timer | VWR | 62344-641 | |
| Software and algorithms | |||
| MATLAB | Mathworks | R2013 and up | https://www.mathworks.com |
| MicrobeTracker or Oufti | https://www.github.com/JacobsWagnerLab/MicrobeTracker | ||
| https://oufti.org/ | |||
| Stellaris Probe Designer | Biosearch Technologies | https://www.biosearchtech.com/support/tools/design-software/stellaris-probe-designer | |
| Microscope | |||
| CCD camera | Hamamatsu Photonics | Orca-II-ER | |
| Cy3 filter set | Chroma | 49004 | |
| Cy5 filter set | Chroma | 49006 | |
| Epi-fluorescence microscope | Nikon | Eclipse Ti | For phase-contrast and epi fluorescence |
| Fluorescence excitation source | Lumencor | SOLA-E | |
| Nikon Elements software | Nikon | software that controls the microscope setup | |
| Phase-contrast 100x objective | Nikon | Plan Apochromat (NA 1.45) | |
| Probe sequence | |||
| DNA oligos with C6 amino modification at the 5' end | Biosearch Technologies Inc | ||
| lacZ1 | GTGAATCCGTAATCATGGTC | 5' mRNA | |
| lacZ2 | TCACGACGTTGTAAAACGAC | 5' mRNA | |
| lacZ3 | ATTAAGTTGGGTAACGCCAG | 5' mRNA | |
| lacZ4 | TATTACGCCAGCTGGCGAAA | 5' mRNA | |
| lacZ5 | ATTCAGGCTGCGCAACTGTT | 5' mRNA | |
| lacZ6 | AAACCAGGCAAAGCGCCATT | 5' mRNA | |
| lacZ7 | AGTATCGGCCTCAGGAAGAT | 5' mRNA | |
| lacZ8 | AACCGTGCATCTGCCAGTTT | 5' mRNA | |
| lacZ9 | TAGGTCACGTTGGTGTAGAT | 5' mRNA | |
| lacZ10 | AATGTGAGCGAGTAACAACC | 5' mRNA | |
| lacZ11 | GTAGCCAGCTTTCATCAACA | 5' mRNA | |
| lacZ12 | AATAATTCGCGTCTGGCCTT | 5' mRNA | |
| lacZ13 | AGATGAAACGCCGAGTTAAC | 5' mRNA | |
| lacZ14 | AATTCAGACGGCAAACGACT | 5' mRNA | |
| lacZ15 | TTTCTCCGGCGCGTAAAAAT | 5' mRNA | |
| lacZ16 | ATCTTCCAGATAACTGCCGT | 5' mRNA | |
| lacZ17 | AACGAGACGTCACGGAAAAT | 5' mRNA | |
| lacZ18 | GCTGATTTGTGTAGTCGGTT | 5' mRNA | |
| lacZ19 | TTAAAGCGAGTGGCAACATG | 5' mRNA | |
| lacZ20 | AACTGTTACCCGTAGGTAGT | 5' mRNA | |
| lacZ21 | ATAATTTCACCGCCGAAAGG | 5' mRNA | |
| lacZ22 | TTTCGACGTTCAGACGTAGT | 5' mRNA | |
| lacZ23 | ATAGAGATTCGGGATTTCGG | 5' mRNA | |
| lacZ24 | TTCTGCTTCAATCAGCGTGC | 5' mRNA | |
| lacZ25 | ACCATTTTCAATCCGCACCT | ||
| lacZ26 | TTAACGCCTCGAATCAGCAA | ||
| lacZ27 | ATGCAGAGGATGATGCTCGT | ||
| lacZ28 | TCTGCTCATCCATGACCTGA | ||
| lacZ29 | TTCATCAGCAGGATATCCTG | ||
| lacZ30 | CACGGCGTTAAAGTTGTTCT | ||
| lacZ31 | TGGTTCGGATAATGCGAACA | ||
| lacZ32 | TTCATCCACCACATACAGGC | ||
| lacZ33 | TGCCGTGGGTTTCAATATTG | ||
| lacZ34 | ATCGGTCAGACGATTCATTG | ||
| lacZ35 | TGATCACACTCGGGTGATTA | ||
| lacZ36 | ATACAGCGCGTCGTGATTAG | ||
| lacZ37 | GATCGACAGATTTGATCCAG | ||
| lacZ38 | AAATAATATCGGTGGCCGTG | ||
| lacZ39 | TTTGATGGACCATTTCGGCA | ||
| lacZ40 | TATTCGCAAAGGATCAGCGG | ||
| lacZ41 | AAGACTGTTACCCATCGCGT | ||
| lacZ42 | TGCCAGTATTTAGCGAAACC | ||
| lacZ43 | AAACGGGGATACTGACGAAA | ||
| lacZ44 | TAATCAGCGACTGATCCACC | ||
| lacZ45 | GGGTTGCCGTTTTCATCATA | ||
| lacZ46 | TCGGCGTATCGCCAAAATCA | ||
| lacZ47 | TTCATACAGAACTGGCGATC | ||
| lacZ48 | TGGTGTTTTGCTTCCGTCAG | ||
| lacZ49 | ACGGAACTGGAAAAACTGCT | 3' mRNA | |
| lacZ50 | TATTCGCTGGTCACTTCGAT | 3' mRNA | |
| lacZ51 | GTTATCGCTATGACGGAACA | 3' mRNA | |
| lacZ52 | TTTACCTTGTGGAGCGACAT | 3' mRNA | |
| lacZ53 | GTTCAGGCAGTTCAATCAAC | 3' mRNA | |
| lacZ54 | TTGCACTACGCGTACTGTGA | 3' mRNA | |
| lacZ55 | AGCGTCACACTGAGGTTTTC | 3' mRNA | |
| lacZ56 | ATTTCGCTGGTGGTCAGATG | 3' mRNA | |
| lacZ57 | ACCCAGCTCGATGCAAAAAT | 3' mRNA | |
| lacZ58 | CGGTTAAATTGCCAACGCTT | 3' mRNA | |
| lacZ59 | CTGTGAAAGAAAGCCTGACT | 3' mRNA | |
| lacZ60 | GGCGTCAGCAGTTGTTTTTT | 3' mRNA | |
| lacZ61 | TACGCCAATGTCGTTATCCA | 3' mRNA | |
| lacZ62 | TAAGGTTTTCCCCTGATGCT | 3' mRNA | |
| lacZ63 | ATCAATCCGGTAGGTTTTCC | 3' mRNA | |
| lacZ64 | GTAATCGCCATTTGACCACT | 3' mRNA | |
| lacZ65 | AGTTTTCTTGCGGCCCTAAT | 3' mRNA | |
| lacZ66 | ATGTCTGACAATGGCAGATC | 3' mRNA | |
| lacZ67 | ATAATTCAATTCGCGCGTCC | 3' mRNA | |
| lacZ68 | TGATGTTGAACTGGAAGTCG | 3' mRNA | |
| lacZ69 | TCAGTTGCTGTTGACTGTAG | 3' mRNA | |
| lacZ70 | ATTCAGCCATGTGCCTTCTT | 3' mRNA | |
| lacZ71 | AATCCCCATATGGAAACCGT | 3' mRNA | |
| lacZ72 | AGACCAACTGGTAATGGTAG | 3' mRNA | |
References
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