Detta protokoll beskriver en tillämpning av enmolekylfluorescens in situ-hybridisering (smFISH) för att mäta in vivo-kinetiken av mRNA-syntes och nedbrytning.
Enmolekylfluorescens in situ-hybridisering (smFISH) möjliggör räkning av absoluta antalet mRNAs i enskilda celler. Här beskriver vi en tillämpning av smFISH att mäta andelen transkription och mRNA nedbrytning i Escherichia coli. Som smFISH bygger på fasta celler, utför vi smFISH vid flera tidpunkter under en time-course experiment, dvs, när celler genomgår synkroniserade förändringar vid induktion eller förtryck av genuttryck. Vid varje tidpunkt är delregioner i ett mRNA spektralt urskiljda till sond transkription töjning och förtida uppsägning. Resultatet av detta protokoll möjliggör också för analys av intracellulära lokalisering av mRNAs och heterogenitet i mRNA kopia nummer bland celler. Med hjälp av detta protokoll många prover (~ 50) kan bearbetas inom 8 h, som den tid som behövs för bara några få prover. Vi diskuterar hur man tillämpar detta protokoll för att studera transkription och nedbrytning kinetik av olika mRNAs i bakterieceller.
Flödet av genetisk information från DNA till mRNA och protein är en av de mest grundläggande cellulära processer, vars reglering är viktigt för cellulär kondition1. Antalet mRNAs i en cell bestäms av två dynamiska processer, transkription och mRNA nedbrytning. Hur transkription och mRNA nedbrytning regleras i tid och rum av en enda cell förblir dock inte helt förstått, till stor del på grund av bristen på experimentella metoder för att kvantitativt mäta deras kinetik in vivo.
Metoder baserade på totalt mRNAs extraherade från en population av celler, såsom Northern blot, RT-PCR, RNA sekvensering, och genuttryck mikroarrayer, kan mäta den relativa skillnaden i mRNA nivåer och har använts i stor utsträckning för att analysera graden av transkription töjning2,3,4,5 ellergraden av mRNA nedbrytning6,7. De ger dock inte det absoluta antalet mRNAs per cell, och därmed, de är inte lämpliga för sondering graden av transkription inledande8. Också, eftersom mRNAs extraheras från en population av celler, kan den rumsliga fördelningen av mRNAs inom en enda cell och variabiliteten av mRNA kopia nummer bland celler inte mätas.
Nästa generations RNA-sekvensering på enskilda celler (scRNAseq) kan kvantifiera antalet mRNAs per cell i en genomisk skala9. Det är dock fortfarande svårt att använda denna teknik för att mäta transkription kinetik, på grund av utmaningar med provberedning och höga kostnader. I synnerhet har tillämpningen av scRNAseq på bakterier varit tekniskt svårt på grund av låg mRNA överflöd10,11.
Single-molecule fluorescens in situ hybridization (smFISH) baseras på hybridiseringen av fluorescently-märkt singel-stranded sonder vars ordnar är kompletterande till uppsätta som mål mRNA avintresserar 12,13. Begreppet sekvensspecifik hybridisering liknar den som används i Northern blot eller RT-PCR, men hybridiseringen sker in situ inom fasta celler, för att bevara den infödda lokaliseringen av mRNAs. Signalen av en enda mRNA förstärks med hjälp av många sonder, ~ 20 nukleotider (nt) i längd, hybridisering till olika delar av en mRNA (Figur 1A)13. I denna “plattsättning” sond tillvägagångssätt, antalet sonder som behövs för att upptäcka en enda mRNA sätter en lägre gräns på längden av mRNA som kan analyseras. Alternativt kan mRNA av intresse vara transkriptionellt smält till en icke-kodande array av tandem Lac operatörssekvenser, så att flera kopior av en fluorescently märkt LacO sond hybridisera till en enda mRNA (Figur 1B)14.
smFISH har använts för att kvantifiera antalet mRNAs per cell vid steady state (dvs. när syntes och förfall är i balans) och för att analysera medelvärdet och variabiliteten av mRNAs bland bakterieceller15,16,17. Nyligen har smFISH tillämpats för att kvantifiera mRNA-tal vid icke-steady state, direkt efter induktion eller förtryck av genuttryck i E. coli18,19,20. De tidsmässiga förändringarna i de absoluta mRNA-kopieringsnumren användes sedan för att beräkna graden av transkriptionsinitiering, töjning och uppsägning, samt graden av mRNA-nedbrytning. För denna ansökan kan konventionella smFISH förfaranden vara besvärligt eftersom det finns många prover, var och en representerar en tidpunkt, som behöver gå igenom flera steg buffertutbyte (dvs centrifugeringen och tvätt). Här beskriver vi ett smFISH-protokoll, där provhanteringsstegen förenklas dramatiskt genom att celler följs till ytan på ett täckskydd och genom att aspirera vätskor med ett vakuumfiltreringssystem14,19. Med hjälp av uttrycket av lacZ i E. coli som exempel, är det fullständiga arbetsflödet ( Figur2) påvisas, inklusive bildanalys (Figur 3) ger in vivo kinetik av transkription (initiering, töjning och uppsägning) och mRNA nedbrytning, cell-till-cell variabilitet i mRNA uttryck, och mRNAIZATION. Vi räknar med att protokollet är allmänt tillämpligt på sond in vivo-kinetik och lokalisering av andra mRNAs hos olika bakteriearter.
Här presenterade vi ett smFISH-protokoll för mätning av mRNA-kinetik i E. coli. I de tidigare publicerade smFISH protokollen för bakterier23, celler hölls i rören tills själva slutet av protokollet, det vill säga tills de är redo för avbildning. Även om det har många fördelar, såsom minimal ospecifik bindning av fluorescerande sonder på täckunderlagetyta 23, är det svårt att följa dessa protokoll när det finns många prover från en tid-kurs experiment. Först behöver en relativt stor volym celler (>1 mL) provsmakas och till och med skördas före fixering. För det andra måste cellproverna centrifugeras flera gånger för att utbyta lösningar och tvätta efter hybridiseringssteget. I vårt protokoll, en liten volym (< 1 mL) av kultur är direkt blandat med en fixlösning i en 1,5-mL rör, hjälper till att snabbt "frysa" celltillståndet vid provtagningsögonblicket. Också, celler stanna fäst vid ytan under hela förfarandet, och olika lösningar kan utbytas snabbt genom att aspirera vätskor med ett vakuum filtreringssystem och tillämpa lösning droppar på en gång med en flerkanalspipett. Denna skillnad gör vårt protokoll mycket fördelaktigt när ett stort antal prover måste bearbetas på en gång. Med hjälp av vårt protokoll kan 12-48 prover hanteras samtidigt och hela FISH-proceduren kan slutföras inom ~8 timmar, ungefär en liknande tid som behövs för några få prover (Bild 2). Även om vi använde uttrycket av lacZ i E. coli som exempel, är protokollet allmänt tillämpliga på olika gener och bakteriearter med överväganden som diskuteras nedan.
För olika gener, det första att tänka på är smFISH sonder. Man får utforma oligonukleotid sonder som kakel mRNA av intresse (Figur 1A)13. I denna “plattsättning” sond tillvägagångssätt, är varje sond ~ 20 bas lång och märkt med en fluorophore vid 5 ‘eller 3’-ändstationen. Denna strategi är bekväm eftersom ingen genetisk manipulation behövs. Alternativt kan en tandemrest på ~20 bp-sekvens, främmande till den genomiska sekvensen (t.ex. en array av lacO-sekvens i Caulobacter crescentus14), införas i den oöversatta regionen av en gen av intresse och en enda sond som kompletterar upprepningsenheten används för att märka mRNA (“array”-metoden; Bild 1B). I båda fallen dekorerar flera fluoroforer ett mRNA, vilket ger förstärkt fluorescenssignal som lätt kan skiljas från en enda sond ospecifikt bunden inuti en cell.
Om du ska välja “plattsättning” eller “array” tillvägagångssätt beror på den negativa kontrollen, ett prov där ospecifik bindning av sonder testas eftersom den saknar målet mRNA. För plattsättningssonder (Figur 1A), kan en mutant stam utan genen av intresse eller ett tillstånd, där genen inte transkriberas (t.ex. förtrycket av lacZ) fungera som en negativ kontroll för att testa ospecifik bindning av sonder. För den matrisbaserade smFISH (Bild 1B) kan en vildtypsstam som saknar matrisen fungera som en negativ kontroll eftersom den inte innehåller bindningsplatser för sonderna.
Optimala hybridiseringsförhållanden kan bero på sondsekvenserna och till och med valet av fluorofafärgämnen. Vi optimerade hybridiseringsvillkoret för lacZ-probeuppsättningar genom att hålla hybridiseringstemperaturen vid 37 °C och testa olika koncentrationer av probuppsättningar och formamid i hybridiseringslösningen. Högre koncentrationer av formamid tenderar att minska både ospecifik och specifik bindning26,35. Vi rekommenderar att man systematiskt ändrar hybridiseringen och dess tvättförhållanden samtidigt som hybridiseringstiden och temperaturen håller samma. I och med att villkoret blir strängare minskar både ospecifik och specifik bindning (figur 6). Det är viktigt att hitta en punkt där den icke-specifika bindningen börjar träffa under ett godtagbart tröskelvärde utan att ytterligare äventyra specifik bindning. Vi använde till exempel den signalnivå som erhållits utan några sonder (“inga sonder”) som ett tröskelvärde (Bild 6).
Den tvåfärgade smFISH-metoden som märker två separata regioner i ett mRNA är begränsat till långa gener. För att mäta graden av transkription töjning, tog vi fördel av det faktum att lacZ är lång (3075 bp) och dess uttryck kan induceras av IPTG. När en gen är kort, är det svårt att utforma två plattsättning sond uppsättningar (nära 5′ och 3′ slutar) och lösa tidsfördröjningen mellan framträdanden av 5 ‘ vs. 3 ‘ mRNA regioner. I detta fall kan man räkna begynnande mRNAs på steady state by smFISH och analysera deras distribution med en analytisk modell som har graden av transkription töjning som en passande parameter20. Också, när en gen av intresse inte är inducible, kan man behandla celler med rifampicin vid tid noll och mäta den tidsmässiga förändringen i 5′ och 3′ mRNA sub-regioner. Fördröjningen från minskningen av 5′ mRNA signal till den av 3′ mRNA signal kan sedan användas för att beräkna graden av transkription töjning som gjorttidigare 31.
Slutligen är smFISH-protokollet mångsidigt och kan kombineras med andra märkningsscheman. Tidigare visualiserades DNA-locus tillsammans med mRNAs genom att kombinera mRNA FISH med antingen DNA FISH14 eller fluorescerande reporter-operator system20. Proteinprodukter kan visualiseras genom att man utför immunofluorescens tillsammans med mRNA FISH14,36. Också, det kan kombineras med tredimensionella super-upplösning mikroskopi37 att visualisera mRNAs i alla tredimensionerna 38,39.
The authors have nothing to disclose.
Detta protokoll har utvecklats av S.K. under hennes postdoktorala forskning i Dr. Christine Jacobs-Wagners laboratorium vid Howard Hughes Medical Institute och Microbial Sciences Institute vid Yale University. Vi tackar Dr Jacobs-Wagner och hennes labbmedlemmar för olika ingångar under metodutvecklingen och Laura Troyer för kritisk läsning av manuskriptet. S.K. erkänner stöd från Searle Scholars Program; K.V. erkänner stöd av James Scholar Preble Research Award från University of Illinois.
Bacterial strain | |||
Escherichia coli MG1655 | |||
Chemicals, peptides, and others | |||
Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 34851 | UPLC buffer B |
Ammonium chloride | Fisher Chemical | A661-500 | To make M9 medium |
Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | B2518 | Probe hybridization |
Calcium chloride | Acros Organics | 349610250 | To make M9 medium |
Casamino acid | BD Difco | 223050 | To make M9 medium |
Cy3B NHS ester | GE Healthcare Life Sciences | PA63101 | Fluorophore for FISH probes |
Cy5 NHS ester | GE Healthcare Life Sciences | PA15101 | Fluorophore for FISH probes |
DEPC | Sigma-Aldrich | D5758 | |
Dextran sulfate | Millipore | S4030 | Probe hybridization |
Dextrose | Fisher Chemical | D16 | To repress the expression of lacZ |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | To dissolve fluorophores |
E. coli tRNA | Sigma-Aldrich | R1753 | Probe hybridization |
Ethanol | Decon Laboratories | 2701 | Used in DNA purification, lysis, and cleaning coverslips |
FISH probes | Biosearch Technologies | Sequences are published in ref#16 | |
Formaldehyde | Ladd Research Industries | 20295 | Fixation |
Formamide | American Bio | AB00600 | Probe hybridization, pre-hybridization, and wash |
Glycerol | Americanbio | AB00751-01000 | To make M9 medium |
Isopropylthio-β-galactoside (IPTG) | Invitrogen | 15529019 | lacZ induction |
Magnesium sulfate | Fisher Chemical | M65-500 | To make M9 medium |
2-Nitrophenyl β-D-fucopyranoside (ONPF) | Santa Cruz Biotechnology | sc-216258 | lacZ repression |
Picodent twinsil 22 | Picodent | 1300 1000 | Sealant |
Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P8920 | To treat the coverslip surface |
Potassium chloride | Fisher BioReagents | BP366-500 | To make PBS |
Potassium phosphate monobasic | Fisher BioReagents | BP362-500 | To make PBS and M9 medium |
Rifampicin | Sigma-Aldrich | R3501 | To stop transcription initiation |
Saline-sodium citrate buffer (SSC) | Invitrogen | AM9763 | Probe hybridization, pre-hybridization, and wash |
sodium bicarbonate | Fisher BioReagents | BP328-500 | Fluorophore-probe conjugation |
Sodium chloride | Fisher BioReagents | BP358-1 | For DNA purification, PBS and M9 medium |
Sodium phosphate dibasic | Fisher BioReagents | BP332-500 | To make PBS and M9 medium |
Sodium phosphate monobasic | Fisher BioReagents | BP329-500 | To make a sodium phosphate buffer |
Super PAP Pen | Invitrogen | 8899 | Hydrophobic marker for coverslips |
TetraSpek microspheres | Invitrogen | T7280 | Controls for multi-channel registration |
Thiamine | Sigma-Aldrich | T1270 | To make M9 medium |
Triethylammonium acetate | Sigma-Aldrich | 90358 | UPLC buffer A |
Vanadyl ribonucleoside complex (VRC) | Sigma-Aldrich | 94742 | Probe hybridization and pre-hybridization |
Equipment | |||
C18 column | Waters | Acquity BEH C18 column | |
Countertop centrifuge | Eppendorf | 5425 | |
Countertop incubator | Eppendorf | Thermomixer F1.5 | |
Incubator (Oven) | Thermo Scientific | 51030514 | Gravity convection |
Water purification system | Millipore | Milli-Q Reference | |
Nanodrop | Thermo Scientific | 2000C | |
Nitrogen gas | Building | For blow-drying coverslips and glass slides | |
UPLC | Waters | Acquity UPLC system | |
Vacuum and aspirator | Building | Aspirator is made of a filtration flask with a side arm. | |
Vacuum concentrator | Labconco | 7810010 | Centrivap; to dry samples collected from UPLC. |
Vortexer | Scientific Industries | Genie-2 SI-0236 | |
Water bath shaker | New Brunswick | Innova 3100 | Critical for time-course experiments |
Water bath sonicator | VWR | 97043-960 | To clean coverslips and glass slides |
Tools | |||
1.5-mL tubes | Eppendorf | 22431021 | DNA lobind tubes |
1000-uL pipette tip box | Denville Scientific | P1126 | An empty box after using all the tips |
Coplin jar | SPI | 01240-AB | To clean coverslips and glass slides |
Coverslip | Fisher Scientific | 22-050-230 | 24×60 No1 |
Filtered pipette tips | Denville Scientific | P1121,P1122,P1126 | SHARP® Precision Barrier Tips |
Forceps | SPI | K35a | To handle clean coverslips and glass slides |
Glass slide | Fisher Scientific | 12-544-1 | |
Gloves | Microflex | MK-296-M | |
Multichannel pipetter | Eppendorf | 2231300045 | To use in the washing step (#7) |
Pipette | Gilson | P1000, P200, P20 | |
Reagent reservoir | MTC Bio | P8025-1S | To use in the washing step (#7) |
Syringe filter (0.22 um) | Millipore | SLGS033SS | |
Timer | VWR | 62344-641 | |
Software and algorithms | |||
MATLAB | Mathworks | R2013 and up | https://www.mathworks.com |
MicrobeTracker or Oufti | https://www.github.com/JacobsWagnerLab/MicrobeTracker | ||
https://oufti.org/ | |||
Stellaris Probe Designer | Biosearch Technologies | https://www.biosearchtech.com/support/tools/design-software/stellaris-probe-designer | |
Microscope | |||
CCD camera | Hamamatsu Photonics | Orca-II-ER | |
Cy3 filter set | Chroma | 49004 | |
Cy5 filter set | Chroma | 49006 | |
Epi-fluorescence microscope | Nikon | Eclipse Ti | For phase-contrast and epi fluorescence |
Fluorescence excitation source | Lumencor | SOLA-E | |
Nikon Elements software | Nikon | software that controls the microscope setup | |
Phase-contrast 100x objective | Nikon | Plan Apochromat (NA 1.45) | |
Probe sequence | |||
DNA oligos with C6 amino modification at the 5' end | Biosearch Technologies Inc | ||
lacZ1 | GTGAATCCGTAATCATGGTC | 5' mRNA | |
lacZ2 | TCACGACGTTGTAAAACGAC | 5' mRNA | |
lacZ3 | ATTAAGTTGGGTAACGCCAG | 5' mRNA | |
lacZ4 | TATTACGCCAGCTGGCGAAA | 5' mRNA | |
lacZ5 | ATTCAGGCTGCGCAACTGTT | 5' mRNA | |
lacZ6 | AAACCAGGCAAAGCGCCATT | 5' mRNA | |
lacZ7 | AGTATCGGCCTCAGGAAGAT | 5' mRNA | |
lacZ8 | AACCGTGCATCTGCCAGTTT | 5' mRNA | |
lacZ9 | TAGGTCACGTTGGTGTAGAT | 5' mRNA | |
lacZ10 | AATGTGAGCGAGTAACAACC | 5' mRNA | |
lacZ11 | GTAGCCAGCTTTCATCAACA | 5' mRNA | |
lacZ12 | AATAATTCGCGTCTGGCCTT | 5' mRNA | |
lacZ13 | AGATGAAACGCCGAGTTAAC | 5' mRNA | |
lacZ14 | AATTCAGACGGCAAACGACT | 5' mRNA | |
lacZ15 | TTTCTCCGGCGCGTAAAAAT | 5' mRNA | |
lacZ16 | ATCTTCCAGATAACTGCCGT | 5' mRNA | |
lacZ17 | AACGAGACGTCACGGAAAAT | 5' mRNA | |
lacZ18 | GCTGATTTGTGTAGTCGGTT | 5' mRNA | |
lacZ19 | TTAAAGCGAGTGGCAACATG | 5' mRNA | |
lacZ20 | AACTGTTACCCGTAGGTAGT | 5' mRNA | |
lacZ21 | ATAATTTCACCGCCGAAAGG | 5' mRNA | |
lacZ22 | TTTCGACGTTCAGACGTAGT | 5' mRNA | |
lacZ23 | ATAGAGATTCGGGATTTCGG | 5' mRNA | |
lacZ24 | TTCTGCTTCAATCAGCGTGC | 5' mRNA | |
lacZ25 | ACCATTTTCAATCCGCACCT | ||
lacZ26 | TTAACGCCTCGAATCAGCAA | ||
lacZ27 | ATGCAGAGGATGATGCTCGT | ||
lacZ28 | TCTGCTCATCCATGACCTGA | ||
lacZ29 | TTCATCAGCAGGATATCCTG | ||
lacZ30 | CACGGCGTTAAAGTTGTTCT | ||
lacZ31 | TGGTTCGGATAATGCGAACA | ||
lacZ32 | TTCATCCACCACATACAGGC | ||
lacZ33 | TGCCGTGGGTTTCAATATTG | ||
lacZ34 | ATCGGTCAGACGATTCATTG | ||
lacZ35 | TGATCACACTCGGGTGATTA | ||
lacZ36 | ATACAGCGCGTCGTGATTAG | ||
lacZ37 | GATCGACAGATTTGATCCAG | ||
lacZ38 | AAATAATATCGGTGGCCGTG | ||
lacZ39 | TTTGATGGACCATTTCGGCA | ||
lacZ40 | TATTCGCAAAGGATCAGCGG | ||
lacZ41 | AAGACTGTTACCCATCGCGT | ||
lacZ42 | TGCCAGTATTTAGCGAAACC | ||
lacZ43 | AAACGGGGATACTGACGAAA | ||
lacZ44 | TAATCAGCGACTGATCCACC | ||
lacZ45 | GGGTTGCCGTTTTCATCATA | ||
lacZ46 | TCGGCGTATCGCCAAAATCA | ||
lacZ47 | TTCATACAGAACTGGCGATC | ||
lacZ48 | TGGTGTTTTGCTTCCGTCAG | ||
lacZ49 | ACGGAACTGGAAAAACTGCT | 3' mRNA | |
lacZ50 | TATTCGCTGGTCACTTCGAT | 3' mRNA | |
lacZ51 | GTTATCGCTATGACGGAACA | 3' mRNA | |
lacZ52 | TTTACCTTGTGGAGCGACAT | 3' mRNA | |
lacZ53 | GTTCAGGCAGTTCAATCAAC | 3' mRNA | |
lacZ54 | TTGCACTACGCGTACTGTGA | 3' mRNA | |
lacZ55 | AGCGTCACACTGAGGTTTTC | 3' mRNA | |
lacZ56 | ATTTCGCTGGTGGTCAGATG | 3' mRNA | |
lacZ57 | ACCCAGCTCGATGCAAAAAT | 3' mRNA | |
lacZ58 | CGGTTAAATTGCCAACGCTT | 3' mRNA | |
lacZ59 | CTGTGAAAGAAAGCCTGACT | 3' mRNA | |
lacZ60 | GGCGTCAGCAGTTGTTTTTT | 3' mRNA | |
lacZ61 | TACGCCAATGTCGTTATCCA | 3' mRNA | |
lacZ62 | TAAGGTTTTCCCCTGATGCT | 3' mRNA | |
lacZ63 | ATCAATCCGGTAGGTTTTCC | 3' mRNA | |
lacZ64 | GTAATCGCCATTTGACCACT | 3' mRNA | |
lacZ65 | AGTTTTCTTGCGGCCCTAAT | 3' mRNA | |
lacZ66 | ATGTCTGACAATGGCAGATC | 3' mRNA | |
lacZ67 | ATAATTCAATTCGCGCGTCC | 3' mRNA | |
lacZ68 | TGATGTTGAACTGGAAGTCG | 3' mRNA | |
lacZ69 | TCAGTTGCTGTTGACTGTAG | 3' mRNA | |
lacZ70 | ATTCAGCCATGTGCCTTCTT | 3' mRNA | |
lacZ71 | AATCCCCATATGGAAACCGT | 3' mRNA | |
lacZ72 | AGACCAACTGGTAATGGTAG | 3' mRNA |