Denne protokol beskriver en anvendelse af enkelt-molekyle fluorescens in situ hybridisering (smFISH) til at måle in vivo kinetik af mRNA syntese og nedbrydning.
Single-molekyle fluorescens in situ hybridisering (smFISH) giver mulighed for at tælle det absolutte antal mRNA’er i de enkelte celler. Her beskriver vi en anvendelse af smFISH til at måle satserne for transskription og mRNA nedbrydning i Escherichia coli. Da smFISH er baseret på faste celler, udfører vi smFISH på flere tidspunkter i løbet af et tidsforløbseksperiment, dvs. På hvert tidspunkt skelnes subregioner af et mRNA spectrally til sondetransskriptionsforseelse og for tidlig afslutning. Resultatet af denne protokol giver også mulighed for at analysere intracellulær lokalisering af mRNAs og heterogenitet i mRNA-kopinumre blandt celler. Ved hjælp af denne protokol mange prøver (~ 50) kan behandles inden for 8 timer, ligesom den tid, der er nødvendig for blot et par prøver. Vi diskuterer, hvordan man anvender denne protokol til at studere transskription og nedbrydning kinetik af forskellige mRNAs i bakterieceller.
Strømmen af genetiske oplysninger fra DNA til mRNA og protein er en af de mest grundlæggende cellulære processer, hvis regulering er vigtig for cellulære fitness1. Antallet af mRNA’er i en celle bestemmes af to dynamiske processer, transskription og mRNA-nedbrydning. Men hvordan transskription og mRNA nedbrydning er reguleret i tid og rum af en enkelt celle forbliver ikke helt forstået, hovedsagelig på grund af manglen på eksperimentelle metoder til kvantitativt at måle deres kinetik in vivo.
Metoder baseret på total mRNA’er, der er udvundet fra en population af celler, såsom Northern blot, RT-PCR, RNA-sekvensering og genekspressionsmikroarrays, kan måle den relative forskel i mRNA-niveauer og er blevet anvendt i vid udstrækning til at analysere transskriptionshastigheden2,,3,,4,,5 eller hastigheden af mRNA-nedbrydning6,7. Men de giver ikke det absolutte antal mRNAs per celle, og dermed, de er ikke egnet til sondering af hastigheden af transskriptionindledning 8. Også, fordi mRNA’er er udvundet fra en population af celler, kan den rumlige fordeling af mRNA’er inden for en enkelt celle og variabiliteten af mRNA-kopinumre blandt cellerne ikke måles.
Næste generations RNA-sekvensering på individuelle celler (scRNAseq) kan kvantificere antallet af mRNA’er pr. celle i en genomisk skala9. Det er dog stadig vanskeligt at bruge denne teknik til at måle transskription kinetik, på grund af udfordringer med prøve forberedelse og høje omkostninger. Især har anvendelsen af scRNAseq på bakterier været teknisk vanskelig på grund af lav mRNA overflod10,11.
Enkeltmolekyle fluorescens in situ hybridisering (smFISH) er baseret på hybridisering af fluorescerende-mærkede enkeltstrengede sonder, hvis sekvenser supplerer målet mRNA af interesse12,13. Begrebet sekvens-specifik hybridisering svarer til den, der anvendes i Northern blot eller RT-PCR, men hybridisering sker in situ inden for faste celler, for at bevare den oprindelige lokalisering af mRNA’er. Signalet fra en enkelt mRNA forstærkes ved hjælp af mange sonder, ~ 20 nukleotider (nt) i længden, hybridisering til forskellige dele af et mRNA (Figur 1A)13. I denne “flisebelægning” sonde tilgang, antallet af sonder er nødvendige for at opdage en enkelt mRNA sætter en lavere grænse for længden af mRNA, der kan analyseres. Alternativt kan mRNA af interesse transskriptionelt smeltet til en ikke-kodning vifte af tandem Lac operatør sekvenser, således at flere kopier af en fluorescerende mærket lacO sonde hybridisere til en enkelt mRNA (Figur 1B)14.
smFISH er blevet brugt til at kvantificere antallet af mRNAs pr. celle i stabil tilstand (dvs. når syntese og henfald er i balance) og til at analysere middelværdi og variabilitet af mRNAs blandt bakterieceller15,16,17. For nylig er smFISH blevet anvendt til at kvantificere mRNA-numre i ikke-stabil tilstand, lige efter induktion eller undertrykkelse af genekspression i E. coli18,19,20. De tidsmæssige ændringer i de absolutte mRNA-kopinumre blev derefter brugt til at beregne hastigheden af transskriptionsiniering, forlængelse og afslutning samt hastigheden af mRNA-nedbrydning. Til denne ansøgning kan konventionelle smFISH-procedurer være besværlige, fordi der er mange prøver, der hver repræsenterer et tidspunkt, der skal gennemgå flere bufferudvekslingstrin (dvs. centrifugering og vask). Her beskriver vi en smFISH-protokol, hvor prøvehåndteringstrinnene forenkles dramatisk ved at få cellerne til at holde sig til overfladen af en dækslæd og ved at aspirere væsker med et vakuumfiltreringssystem14,19. Ved hjælp lacZ af lacZ-ekspressionen i E. coli som eksempel demonstreres den fulde arbejdsgang (Figur 2), herunder billedanalyse (Figur 3), der giver in vivo kinetik af transskription (indledning, forlængelse og afslutning) og mRNA-nedbrydning, celle-til-celle-variabilitet i mRNA-ekspression og mRNA-lokalisering. Vi forventer, at protokollen er bredt anvendelig til sonde in vivo kinetik og lokalisering af andre mRNAs i forskellige bakteriearter.
Her præsenterede vi en smFISH protokol til måling af mRNA kinetik i E. coli. I de tidligere offentliggjorte smFISH protokoller for bakterier23, celler blev holdt i rørene indtil slutningen af protokollen, det vil sige indtil de er klar til billeddannelse. Selv om det har mange fordele, såsom minimal uspecifikke binding af fluorescerende sonder på coverslip overflade23,er det vanskeligt at følge disse protokoller, når der er mange prøver fra en tid-kursus eksperiment. For det første skal der udtages prøver af en forholdsvis stor mængde celler (>1 ml) og endda høstes før fiksering. For det andet skal celleprøverne centrifugeres flere gange for at udveksle opløsninger og vaske efter hybridiseringstrinnet. I vores protokol blandes en lille mængde (<1 ml) af kultur direkte med en fastgørelsesløsning i et 1,5 ml rør, hvilket hjælper med hurtigt at "fryse" celletilstanden på prøvetagningstidspunktet. Cellerne forbliver også fastgjort til overfladen under hele proceduren, og forskellige løsninger kan hurtigt udskiftes ved at indsugning af væsker med et vakuumfiltreringssystem og anvende opløsningsfald på én gang med en multikanalpipette. Denne forskel gør vores protokol meget fordelagtig, når et stort antal prøver skal behandles på én gang. Ved hjælp af vores protokol, 12-48 prøver kan håndteres samtidigt, og hele FISH procedure kan afsluttes inden for ~ 8 timer, omkring en lignende mængde tid, der er nødvendig for et par prøver (Figur 2). Selv om vi brugte udtrykket lacZ i E. coli som et eksempel, protokollen er bredt anvendelig på forskellige gener og bakteriearter med overvejelser diskuteret nedenfor.
For forskellige gener, den første ting at overveje, er smFISH sonder. Man kan designe oligonucleotid sonder, flise mRNA af interesse (Figur 1A)13. I denne “flisebelægning” sonde tilgang, hver sonde er ~ 20 base lang og mærket med en fluorophore på 5 ‘eller 3’ terminus. Denne strategi er praktisk, da ingen genetisk manipulation er nødvendig. Alternativt kan en tandem gentagelse af ~ 20 bp sekvens, fremmed for den genomiske sekvens (f.eks en vifte af lacO sekvens i Caulobacter crescentus14), indsættes i den uoversatte region af et gen af interesse og en enkelt sonde supplerer den gentagne enhed bruges til at mærke mRNA (“array” tilgang; Figur 1B). I begge tilfælde dekorerer flere fluorophores et mRNA, hvilket giver forstærket fluorescenssignal, der let kan skelnes fra en enkelt sonde, der er uspecifikke bundet inde i en celle.
Om der skal vælges “fliselægning” eller “array”-tilgange, afhænger af den negative kontrol, en prøve, hvor uspecifikke bindinger af sonder testes, fordi den mangler målet mRNA. For flisebelægningssonder (figur 1A) kan en mutant stamme uden genet af interesse eller en tilstand, hvor genet ikke transskriberes (f.eks. undertrykkelse af lacZ) tjene som en negativ kontrol til test af uspecifik binding af sonder. For array-baserede smFISH(Figur 1B), en wild-type stamme mangler array kan tjene som en negativ kontrol, fordi det ikke indeholder bindende steder for sonder.
Optimale hybridiseringsforhold kan afhænge af sondesekvenserne og endda valget af fluorophorefarvestoffer. Vi optimerede hybridiseringsbetingelsen for lacZ-sondesæt ved at holde hybridiseringstemperaturen på 37 °C og teste forskellige koncentrationer af sondesæt og formamid i hybridiseringsløsningen. Højere koncentrationer af formamid har tendens til at reducere både uspecifikke og specifikkebindinger 26,35. Vi anbefaler systematisk at ændre hybridiseringen og dens vaskeforhold, samtidig med at hybridiseringstid og temperatur bevares på samme måde. Efterhånden som betingelsen bliver strengere, falder både det uspecifikke og det specifikke bindende fald (figur 6). Det er vigtigt at finde et punkt, hvor den uspecifikke binding begynder at ramme under en acceptabel tærskel uden yderligere at gå på kompromis med den specifikke binding. For eksempel brugte vi det signalniveau, der blev opnået uden sonder (“ingen sonder”) som en tærskel (figur 6).
Den tofarvede smFISH-metode, der mærker to separate regioner i et mRNA, er begrænset til lange gener. For at måle transskriptionshastigheden, benyttede vi os af det faktum, at lacZ er lang (3075 bp) og dens udtryk kan induceres af IPTG. Når et gen er kort, er det vanskeligt at designe to fliselæggende sondesæt (nær 5′ og 3′ ender) og løse tidsforsinkelsen mellem optrædener af 5′ vs. 3′ mRNA-områder. I dette tilfælde kan man tælle spirende mRNAs på steady state ved smFISH og analysere deres fordeling med en analytisk model, der har hastigheden af transskription forlængelse som en passende parameter20. Når et af interesse genet ikke er inducerende, kan man også behandle celler med rifampicin ved tid nul og måle den tidsmæssige ændring i 5′ og 3′ mRNA-underområder. Forsinkelsen fra faldet på 5′ mRNA-signal til 3′ mRNA-signalet kan derefter bruges til at beregne transskriptionshastigheden som tidligere31.
Endelig er smFISH-protokollen alsidig og kan kombineres med andre mærkningsordninger. Tidligere blev DNA locus visualiseret sammen med mRNA’er ved at kombinere mRNA FISH med enten DNA FISH14 eller fluorescerende reporter-operatør system20. Proteinprodukter kan visualiseres ved at udføre immunfluorescens sammen med mRNA FISH14,36. Det kan også kombineres med tre-dimensionelle super-opløsning mikroskopi37 til at visualisere mRNA’er i alle tredimensioner 38,39.
The authors have nothing to disclose.
Denne protokol blev udviklet af S.K. under hendes postdoc forskning i Dr. Christine Jacobs-Wagners laboratorium på Howard Hughes Medical Institute og Microbial Sciences Institute på Yale University. Vi takker Dr. Jacobs-Wagner og hendes lab medlemmer for forskellige input i løbet af metoden udvikling og Laura Troyer for kritisk læsning af manuskriptet. S.K. anerkender støtte fra Searle Scholars-programmet; K.V. anerkender støtte fra James Scholar Preble Research Award fra University of Illinois.
Bacterial strain | |||
Escherichia coli MG1655 | |||
Chemicals, peptides, and others | |||
Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 34851 | UPLC buffer B |
Ammonium chloride | Fisher Chemical | A661-500 | To make M9 medium |
Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | B2518 | Probe hybridization |
Calcium chloride | Acros Organics | 349610250 | To make M9 medium |
Casamino acid | BD Difco | 223050 | To make M9 medium |
Cy3B NHS ester | GE Healthcare Life Sciences | PA63101 | Fluorophore for FISH probes |
Cy5 NHS ester | GE Healthcare Life Sciences | PA15101 | Fluorophore for FISH probes |
DEPC | Sigma-Aldrich | D5758 | |
Dextran sulfate | Millipore | S4030 | Probe hybridization |
Dextrose | Fisher Chemical | D16 | To repress the expression of lacZ |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | To dissolve fluorophores |
E. coli tRNA | Sigma-Aldrich | R1753 | Probe hybridization |
Ethanol | Decon Laboratories | 2701 | Used in DNA purification, lysis, and cleaning coverslips |
FISH probes | Biosearch Technologies | Sequences are published in ref#16 | |
Formaldehyde | Ladd Research Industries | 20295 | Fixation |
Formamide | American Bio | AB00600 | Probe hybridization, pre-hybridization, and wash |
Glycerol | Americanbio | AB00751-01000 | To make M9 medium |
Isopropylthio-β-galactoside (IPTG) | Invitrogen | 15529019 | lacZ induction |
Magnesium sulfate | Fisher Chemical | M65-500 | To make M9 medium |
2-Nitrophenyl β-D-fucopyranoside (ONPF) | Santa Cruz Biotechnology | sc-216258 | lacZ repression |
Picodent twinsil 22 | Picodent | 1300 1000 | Sealant |
Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P8920 | To treat the coverslip surface |
Potassium chloride | Fisher BioReagents | BP366-500 | To make PBS |
Potassium phosphate monobasic | Fisher BioReagents | BP362-500 | To make PBS and M9 medium |
Rifampicin | Sigma-Aldrich | R3501 | To stop transcription initiation |
Saline-sodium citrate buffer (SSC) | Invitrogen | AM9763 | Probe hybridization, pre-hybridization, and wash |
sodium bicarbonate | Fisher BioReagents | BP328-500 | Fluorophore-probe conjugation |
Sodium chloride | Fisher BioReagents | BP358-1 | For DNA purification, PBS and M9 medium |
Sodium phosphate dibasic | Fisher BioReagents | BP332-500 | To make PBS and M9 medium |
Sodium phosphate monobasic | Fisher BioReagents | BP329-500 | To make a sodium phosphate buffer |
Super PAP Pen | Invitrogen | 8899 | Hydrophobic marker for coverslips |
TetraSpek microspheres | Invitrogen | T7280 | Controls for multi-channel registration |
Thiamine | Sigma-Aldrich | T1270 | To make M9 medium |
Triethylammonium acetate | Sigma-Aldrich | 90358 | UPLC buffer A |
Vanadyl ribonucleoside complex (VRC) | Sigma-Aldrich | 94742 | Probe hybridization and pre-hybridization |
Equipment | |||
C18 column | Waters | Acquity BEH C18 column | |
Countertop centrifuge | Eppendorf | 5425 | |
Countertop incubator | Eppendorf | Thermomixer F1.5 | |
Incubator (Oven) | Thermo Scientific | 51030514 | Gravity convection |
Water purification system | Millipore | Milli-Q Reference | |
Nanodrop | Thermo Scientific | 2000C | |
Nitrogen gas | Building | For blow-drying coverslips and glass slides | |
UPLC | Waters | Acquity UPLC system | |
Vacuum and aspirator | Building | Aspirator is made of a filtration flask with a side arm. | |
Vacuum concentrator | Labconco | 7810010 | Centrivap; to dry samples collected from UPLC. |
Vortexer | Scientific Industries | Genie-2 SI-0236 | |
Water bath shaker | New Brunswick | Innova 3100 | Critical for time-course experiments |
Water bath sonicator | VWR | 97043-960 | To clean coverslips and glass slides |
Tools | |||
1.5-mL tubes | Eppendorf | 22431021 | DNA lobind tubes |
1000-uL pipette tip box | Denville Scientific | P1126 | An empty box after using all the tips |
Coplin jar | SPI | 01240-AB | To clean coverslips and glass slides |
Coverslip | Fisher Scientific | 22-050-230 | 24×60 No1 |
Filtered pipette tips | Denville Scientific | P1121,P1122,P1126 | SHARP® Precision Barrier Tips |
Forceps | SPI | K35a | To handle clean coverslips and glass slides |
Glass slide | Fisher Scientific | 12-544-1 | |
Gloves | Microflex | MK-296-M | |
Multichannel pipetter | Eppendorf | 2231300045 | To use in the washing step (#7) |
Pipette | Gilson | P1000, P200, P20 | |
Reagent reservoir | MTC Bio | P8025-1S | To use in the washing step (#7) |
Syringe filter (0.22 um) | Millipore | SLGS033SS | |
Timer | VWR | 62344-641 | |
Software and algorithms | |||
MATLAB | Mathworks | R2013 and up | https://www.mathworks.com |
MicrobeTracker or Oufti | https://www.github.com/JacobsWagnerLab/MicrobeTracker | ||
https://oufti.org/ | |||
Stellaris Probe Designer | Biosearch Technologies | https://www.biosearchtech.com/support/tools/design-software/stellaris-probe-designer | |
Microscope | |||
CCD camera | Hamamatsu Photonics | Orca-II-ER | |
Cy3 filter set | Chroma | 49004 | |
Cy5 filter set | Chroma | 49006 | |
Epi-fluorescence microscope | Nikon | Eclipse Ti | For phase-contrast and epi fluorescence |
Fluorescence excitation source | Lumencor | SOLA-E | |
Nikon Elements software | Nikon | software that controls the microscope setup | |
Phase-contrast 100x objective | Nikon | Plan Apochromat (NA 1.45) | |
Probe sequence | |||
DNA oligos with C6 amino modification at the 5' end | Biosearch Technologies Inc | ||
lacZ1 | GTGAATCCGTAATCATGGTC | 5' mRNA | |
lacZ2 | TCACGACGTTGTAAAACGAC | 5' mRNA | |
lacZ3 | ATTAAGTTGGGTAACGCCAG | 5' mRNA | |
lacZ4 | TATTACGCCAGCTGGCGAAA | 5' mRNA | |
lacZ5 | ATTCAGGCTGCGCAACTGTT | 5' mRNA | |
lacZ6 | AAACCAGGCAAAGCGCCATT | 5' mRNA | |
lacZ7 | AGTATCGGCCTCAGGAAGAT | 5' mRNA | |
lacZ8 | AACCGTGCATCTGCCAGTTT | 5' mRNA | |
lacZ9 | TAGGTCACGTTGGTGTAGAT | 5' mRNA | |
lacZ10 | AATGTGAGCGAGTAACAACC | 5' mRNA | |
lacZ11 | GTAGCCAGCTTTCATCAACA | 5' mRNA | |
lacZ12 | AATAATTCGCGTCTGGCCTT | 5' mRNA | |
lacZ13 | AGATGAAACGCCGAGTTAAC | 5' mRNA | |
lacZ14 | AATTCAGACGGCAAACGACT | 5' mRNA | |
lacZ15 | TTTCTCCGGCGCGTAAAAAT | 5' mRNA | |
lacZ16 | ATCTTCCAGATAACTGCCGT | 5' mRNA | |
lacZ17 | AACGAGACGTCACGGAAAAT | 5' mRNA | |
lacZ18 | GCTGATTTGTGTAGTCGGTT | 5' mRNA | |
lacZ19 | TTAAAGCGAGTGGCAACATG | 5' mRNA | |
lacZ20 | AACTGTTACCCGTAGGTAGT | 5' mRNA | |
lacZ21 | ATAATTTCACCGCCGAAAGG | 5' mRNA | |
lacZ22 | TTTCGACGTTCAGACGTAGT | 5' mRNA | |
lacZ23 | ATAGAGATTCGGGATTTCGG | 5' mRNA | |
lacZ24 | TTCTGCTTCAATCAGCGTGC | 5' mRNA | |
lacZ25 | ACCATTTTCAATCCGCACCT | ||
lacZ26 | TTAACGCCTCGAATCAGCAA | ||
lacZ27 | ATGCAGAGGATGATGCTCGT | ||
lacZ28 | TCTGCTCATCCATGACCTGA | ||
lacZ29 | TTCATCAGCAGGATATCCTG | ||
lacZ30 | CACGGCGTTAAAGTTGTTCT | ||
lacZ31 | TGGTTCGGATAATGCGAACA | ||
lacZ32 | TTCATCCACCACATACAGGC | ||
lacZ33 | TGCCGTGGGTTTCAATATTG | ||
lacZ34 | ATCGGTCAGACGATTCATTG | ||
lacZ35 | TGATCACACTCGGGTGATTA | ||
lacZ36 | ATACAGCGCGTCGTGATTAG | ||
lacZ37 | GATCGACAGATTTGATCCAG | ||
lacZ38 | AAATAATATCGGTGGCCGTG | ||
lacZ39 | TTTGATGGACCATTTCGGCA | ||
lacZ40 | TATTCGCAAAGGATCAGCGG | ||
lacZ41 | AAGACTGTTACCCATCGCGT | ||
lacZ42 | TGCCAGTATTTAGCGAAACC | ||
lacZ43 | AAACGGGGATACTGACGAAA | ||
lacZ44 | TAATCAGCGACTGATCCACC | ||
lacZ45 | GGGTTGCCGTTTTCATCATA | ||
lacZ46 | TCGGCGTATCGCCAAAATCA | ||
lacZ47 | TTCATACAGAACTGGCGATC | ||
lacZ48 | TGGTGTTTTGCTTCCGTCAG | ||
lacZ49 | ACGGAACTGGAAAAACTGCT | 3' mRNA | |
lacZ50 | TATTCGCTGGTCACTTCGAT | 3' mRNA | |
lacZ51 | GTTATCGCTATGACGGAACA | 3' mRNA | |
lacZ52 | TTTACCTTGTGGAGCGACAT | 3' mRNA | |
lacZ53 | GTTCAGGCAGTTCAATCAAC | 3' mRNA | |
lacZ54 | TTGCACTACGCGTACTGTGA | 3' mRNA | |
lacZ55 | AGCGTCACACTGAGGTTTTC | 3' mRNA | |
lacZ56 | ATTTCGCTGGTGGTCAGATG | 3' mRNA | |
lacZ57 | ACCCAGCTCGATGCAAAAAT | 3' mRNA | |
lacZ58 | CGGTTAAATTGCCAACGCTT | 3' mRNA | |
lacZ59 | CTGTGAAAGAAAGCCTGACT | 3' mRNA | |
lacZ60 | GGCGTCAGCAGTTGTTTTTT | 3' mRNA | |
lacZ61 | TACGCCAATGTCGTTATCCA | 3' mRNA | |
lacZ62 | TAAGGTTTTCCCCTGATGCT | 3' mRNA | |
lacZ63 | ATCAATCCGGTAGGTTTTCC | 3' mRNA | |
lacZ64 | GTAATCGCCATTTGACCACT | 3' mRNA | |
lacZ65 | AGTTTTCTTGCGGCCCTAAT | 3' mRNA | |
lacZ66 | ATGTCTGACAATGGCAGATC | 3' mRNA | |
lacZ67 | ATAATTCAATTCGCGCGTCC | 3' mRNA | |
lacZ68 | TGATGTTGAACTGGAAGTCG | 3' mRNA | |
lacZ69 | TCAGTTGCTGTTGACTGTAG | 3' mRNA | |
lacZ70 | ATTCAGCCATGTGCCTTCTT | 3' mRNA | |
lacZ71 | AATCCCCATATGGAAACCGT | 3' mRNA | |
lacZ72 | AGACCAACTGGTAATGGTAG | 3' mRNA |