यह प्रोटोकॉल एमआरएनए संश्लेषण और क्षरण के वीवो काइनेटिक्स को मापने के लिए सीटू संकरण (एसएमफिश) में एकल-अणु फ्लोरेसेंस के अनुप्रयोग का वर्णन करता है।
सीटू संकरण (एसएमफिश) में एकल-अणु फ्लोरेसेंस व्यक्तिगत कोशिकाओं में एमआरएएनए की पूर्ण संख्या की गणना करने की अनुमति देता है। यहां, हम एस्चेरिचिया कोलाईमें प्रतिलेखन और एमआरएनए क्षरण की दरों को मापने के लिए smfish के एक आवेदन का वर्णन करते हैं। चूंकि स्मफिश निश्चित कोशिकाओं पर आधारित है, इसलिए हम एक समय-पाठ्यक्रम प्रयोग के दौरान कई समय बिंदुओं पर smfish प्रदर्शन करते हैं, यानी, जब कोशिकाएं जीन अभिव्यक्ति के प्रेरण या दमन पर सिंक्रोनाइज्ड परिवर्तनों से गुजर रही होती हैं। हर समय बिंदु पर, एक एमआरएनए के उप-क्षेत्रों को प्रतिलेखन विस्तार और समय से पहले समाप्ति की जांच करने के लिए स्पेक्ट्रैल रूप से प्रतिष्ठित किया जाता है। इस प्रोटोकॉल का परिणाम कोशिकाओं के बीच एमआरएएनए कॉपी नंबरों में mRNAs और विषमता के इंट्रासेलुलर स्थानीयकरण का विश्लेषण करने की भी अनुमति देता है। इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके कई नमूनों (~ 50) को 8 घंटे के भीतर संसाधित किया जा सकता है, जैसे कि कुछ नमूनों के लिए आवश्यक समय की मात्रा। हम चर्चा करते हैं कि बैक्टीरियल कोशिकाओं में विभिन्न mRNAs के प्रतिलेखन और क्षरण गतिज का अध्ययन करने के लिए इस प्रोटोकॉल को कैसे लागू किया जाए।
डीएनए से एमआरएनए और प्रोटीन तक आनुवंशिक जानकारी का प्रवाह सबसे मौलिक सेलुलर प्रक्रियाओं में से एक है, जिसका विनियमन सेलुलर फिटनेस1के लिए महत्वपूर्ण है। एक कोशिका में mRNAs की संख्या दो गतिशील प्रक्रियाओं, प्रतिलेखन, और mRNA गिरावट द्वारा निर्धारित किया जाता है। हालांकि, कैसे प्रतिलेखन और mRNA गिरावट समय में विनियमित कर रहे है और एक ही कोशिका के स्थान पूरी तरह से समझ में नहीं आता है, मोटे तौर पर प्रयोगात्मक तरीकों की कमी के कारण मात्रात्मक रूप से वीवो में अपने काइनेटिक्स को मापने के लिए ।
कोशिकाओं की आबादी से निकाले गए कुल mRNAs के आधार पर विधियां, जैसे उत्तरी दाग, आरटी-पीसीआर, आरएनए अनुक्रमण, और जीन अभिव्यक्ति microarrays, एमआरएनए के स्तर में सापेक्ष अंतर को माप सकते हैं और व्यापक,रूप से ट्रांसक्रिप्शन विस्तार2,3,4,5 या एमआरएनए,क्षरण6, 7,7की दर की दर का विश्लेषण करने के लिए उपयोग किया गया है।, हालांकि, वे प्रति सेल एमआरएन की पूर्ण संख्या प्रदान नहीं करते हैं, और इसलिए, वे ट्रांसक्रिप्शन दीक्षा8की दर की जांच करने के लिए उपयुक्त नहीं हैं। इसके अलावा, क्योंकि mRNAs कोशिकाओं की आबादी से निकाले जाते हैं, एक ही कोशिका के भीतर mRNAs के स्थानिक वितरण और कोशिकाओं के बीच mRNA कॉपी संख्या की परिवर्तनशीलता मापा नहीं जा सकता है ।
व्यक्तिगत कोशिकाओं (scRNAseq) पर अगली पीढ़ी के आरएनए अनुक्रमण जीनोमिक स्केल9में प्रति सेल mRNAs की संख्या निर्धारित कर सकते हैं । हालांकि, नमूना तैयारी और उच्च लागत के साथ चुनौतियों के कारण ट्रांसक्रिप्शन काइनेटिक्स को मापने के लिए इस तकनीक का उपयोग करना मुश्किल बना हुआ है। विशेष रूप से, कम एमआरएनए बहुतायत10, 11,11के कारण बैक्टीरिया के लिए scRNAseq का आवेदन तकनीकी रूप से मुश्किल हो गया है।
सीटू संकरण (एसएमफिश) में एकल-अणु फ्लोरेसेंस फ्लोरोसेंटली-लेबल एकल-फंसे जांच के संकरण पर आधारित है जिनके दृश्य ब्याज12, 13,13के लक्ष्य एमआरएनए के पूरक हैं। अनुक्रम-विशिष्ट संकरण की अवधारणा उत्तरी दाग या आरटी-पीसीआर में उपयोग की जाने वाली है, लेकिन संकरण निश्चित कोशिकाओं के भीतर सीटू में किया जाता है, ताकि RNAs के मूल स्थानीयकरण को संरक्षित किया जा सके। एक एमआरएनए का संकेत कई जांचों का उपयोग करके परिलक्षित होता है, ~ 20 न्यूक्लियोटाइड (एनटी) लंबाई में, एक एमआरएनए(चित्रा 1A)13के विभिन्न हिस्सों में संकरण। इस “टाइलिंग” जांच दृष्टिकोण में, एक ही mRNA का पता लगाने के लिए आवश्यक जांच की संख्या mRNA की लंबाई है कि assayed जा सकता है पर एक कम सीमा सेट । वैकल्पिक रूप से, ब्याज की एमआरएनए को ट्रांसक्रिप्शनली रूप से टैंडेम लाख ऑपरेटर दृश्यों की एक गैर-कोडिंग सरणी में जोड़ा जा सकता है, जैसे कि फ्लोरोसेंटली लेबल वाली लैको प्रोब की कई प्रतियां एक एमआरएनए(चित्रा 1 बी)14के लिए संकरित होती हैं।
smfish स्थिर राज्य में प्रति सेल mRNAs की संख्या की मात्रा निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया गया है (यानी, जब संश्लेषण और क्षय संतुलन में हैं) और जीवाणु कोशिकाओं के बीच mRNAs के मतलब और परिवर्तनशीलता का विश्लेषण करने के लिए15,16,,17।, हाल ही में, ई. कोलाई,18, 19,19,20में जीन अभिव्यक्ति के प्रेरण या दमन के ठीक बाद, गैर-स्थिर स्थिति में एमआरएनए संख्याओं की मात्रा निर्धारित करने के लिए smfish लागू किया गया है । पूर्ण एमआरएनए कॉपी नंबरों में अस्थायी परिवर्तन तब ट्रांसक्रिप्शन दीक्षा, विस्तार और समाप्ति की दर की गणना करने के साथ-साथ एमआरएनए क्षरण की दर का उपयोग किया जाता था। इस आवेदन के लिए, पारंपरिक smfish प्रक्रियाओं बोझिल हो सकता है क्योंकि वहां कई नमूने हैं, प्रत्येक एक समय बिंदु का प्रतिनिधित्व करते हैं, कि कई बफर विनिमय कदम (यानी, अपकेंद्रित्र और धोने) के माध्यम से जाने की जरूरत है । यहां, हम एक स्मफिश प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं, जिसमें सेल को कवर्लिप की सतह का पालन करके और वैक्यूम निस्पंदन प्रणाली14, 19,के साथ तरल पदार्थ को प्राप्त करके नमूना हैंडलिंग चरणों को नाटकीय रूप से सरल बनायाजाताहै। एक उदाहरण के रूप में ई. कोलाई में लैक्ज़ की अभिव्यक्ति का उपयोग करते हुए, पूर्ण कार्यप्रवाह(चित्रा 2)का प्रदर्शन किया जाता है, जिसमें छवि विश्लेषण(चित्र 3)ट्रांसक्रिप्शन (दीक्षा, विस्तार, और समाप्ति) के वीवो काइनेटिक्स में उपज और एमआरएनए क्षरण, एमआरएनए अभिव्यक्ति में सेल-टू-सेल परिवर्तनशीलता, और एमआरएनए स्थानीयकरण शामिल है। हम आशा करते हैं कि प्रोटोकॉल विभिन्न बैक्टीरिया प्रजातियों में वीवो काइनेटिक्स और अन्य mRNAs के स्थानीयकरण में जांच के लिए व्यापक रूप से लागू होता है।
यहां, हम ई. कोलाईमें mRNA काइनेटिक्स को मापने के लिए एक smfish प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया । बैक्टीरिया23के लिए पहले प्रकाशित smfish प्रोटोकॉल में, कोशिकाओं को प्रोटोकॉल के अंत तक ट्यूबों में रखा गया था, कि जब तक वे इमेजिंग के लिए तैयार हैं । हालांकि इसके कई लाभ हैं, जैसे कि कवरस्लिप सतह23पर फ्लोरोसेंट जांच के न्यूनतम गैर-विशिष्ट बाध्यकारी, जब एक समय-पाठ्यक्रम प्रयोग से कई नमूने होते हैं तो इन प्रोटोकॉल का पालन करना मुश्किल होता है। सबसे पहले, कोशिकाओं की एक अपेक्षाकृत बड़ी मात्रा (>1 mL) के लिए नमूना और यहां तक कि निर्धारण से पहले काटा जाना चाहिए । दूसरा, सेल नमूनों को समाधान का आदान-प्रदान करने और संकरण कदम के बाद धोने के लिए कई बार अपकेंद्री करने की आवश्यकता है । हमारे प्रोटोकॉल में, संस्कृति की एक छोटी मात्रा (<1 एमएल) सीधे एक १.५-एमएल ट्यूब में एक फिक्सिंग समाधान के साथ मिलाया जाता है, जो नमूने के समय सेल राज्य को जल्दी से "फ्रीज" करने में मदद करता है। इसके अलावा, कोशिकाएं पूरी प्रक्रिया में सतह से जुड़ी रहती हैं, और वैक्यूम फिल्ट्रेशन सिस्टम के साथ तरल पदार्थों को एस्पिरेशन करके और मल्टी-चैनल पिपेट के साथ एक बार में समाधान बूंदों को लागू करके विभिन्न समाधानों का आदान-प्रदान किया जा सकता है। यह अंतर हमारे प्रोटोकॉल को अत्यधिक लाभप्रद बनाता है जब बड़ी संख्या में नमूनों को एक बार में संसाधित करने की आवश्यकता होती है। हमारे प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, 12-48 नमूनों को एक साथ संभाला जा सकता है और पूरी मछली प्रक्रिया ~ 8 घंटे के भीतर पूरी की जा सकती है, कुछ नमूनों(चित्रा 2)के लिए आवश्यक समय की एक समान राशि के बारे में। यद्यपि हमने एक उदाहरण के रूप में ई. कोलाई में लैक्ज़ की अभिव्यक्ति का उपयोग किया, प्रोटोकॉल नीचे चर्चा किए गए विचारों के साथ विभिन्न जीन और जीवाणु प्रजातियों पर व्यापक रूप से लागू होता है।
विभिन्न जीन के लिए, पहली बात पर विचार करने के लिए smfish जांच है । कोई भी ओलिगोन्यूक्लियोटाइड जांच कर सकता है जो ब्याज के एमआरएनए(चित्र 1ए)13को टाइल करता है । इस “टाइलिंग” जांच दृष्टिकोण में, प्रत्येक जांच ~ 20 आधार लंबी है और 5 ‘ या 3 ‘ टर्मिनस पर एक फ्लोरोफोर के साथ लेबल । यह रणनीति सुविधाजनक है क्योंकि कोई आनुवंशिक हेरफेर की जरूरत नहीं है । वैकल्पिक रूप से, ~ 20 बीपी अनुक्रम का एक मिलकर दोहराने, जीनोमिक अनुक्रम के लिए विदेशी (उदाहरण के लिए, Caulobacter वर्धमान14में लाको अनुक्रम की एक सरणी), ब्याज की एक जीन के अअनुवादित क्षेत्र में डाला जा सकता है और दोहराने इकाई के लिए एक एकल जांच पूरक mRNA लेबल (“सरणी” दृष्टिकोण; चित्रा 1B)। दोनों ही मामलों में, कई फ्लोरोफोरस एक एमआरएनए को सजाते हैं, जो परिलक्षित फ्लोरेसेंस संकेत देते हैं जिसे आसानी से एक कोशिका के अंदर गैर-विशिष्ट रूप से बंधे एक जांच से अलग किया जा सकता है।
“टाइलिंग” या “सरणी” दृष्टिकोण चुनना है या नहीं, यह नकारात्मक नियंत्रण पर निर्भर करता है, एक नमूना जहां जांच के गैर-विशिष्ट बाध्यकारी का परीक्षण किया जाता है क्योंकि इसमें लक्ष्य एमआरएनए का अभाव है। टाइलिंग जांच(चित्रा 1A),ब्याज या एक शर्त के जीन के बिना एक उत्परिवर्ती तनाव के लिए, जिसमें जीन लिखित नहीं है (जैसे, lacZके दमन) जांच के गैर विशिष्ट बाध्यकारी परीक्षण के लिए एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में काम कर सकते हैं । सरणी-आधारित smfish(चित्रा 1B)के लिए, सरणी की कमी वाला एक जंगली प्रकार का तनाव नकारात्मक नियंत्रण के रूप में काम कर सकता है क्योंकि इसमें जांच के लिए बाध्यकारी साइटें शामिल नहीं हैं।
इष्टतम संकरण की स्थिति जांच दृश्यों और यहां तक कि फ्लोरोफोर रंगों की पसंद पर निर्भर हो सकती है। हमने संकरण तापमान को 37 डिग्री सेल्सियस पर रखकर और संकरण समाधान में जांच सेट और फॉर्ममाइड की विभिन्न सांद्रता का परीक्षण करके लैक्ज़ जांच सेटों के लिए संकरण स्थिति को अनुकूलित किया। फॉर्मामाइड की अधिक सांद्रता गैर – विशिष्ट और विशिष्ट बाध्यकारी दोनों26,35को कम करती है । हम संकरण समय और तापमान को समान रखते हुए व्यवस्थित रूप से संकरण और इसकी धोने की स्थिति को बदलने की सलाह देते हैं। के रूप में हालत और अधिक कठोर हो जाता है, दोनों गैर विशिष्ट और विशिष्ट बाध्यकारी कमी(चित्रा 6)। यह एक बिंदु है जहां गैर विशिष्ट बाध्यकारी आगे विशिष्ट बाध्यकारी समझौता किए बिना एक स्वीकार्य दहलीज से नीचे हिट करने के लिए शुरू होता है खोजने के लिए महत्वपूर्ण है । उदाहरण के लिए, हमने बिना किसी जांच (“कोई जांच नहीं”) के बिना प्राप्त सिग्नल स्तर का उपयोग एक सीमा(चित्र 6) केरूप में किया।
एक एमआरएनए के दो अलग-अलग क्षेत्रों को लेबल करने वाली दो रंग की स्मफिश विधि लंबे जीन तक सीमित है। प्रतिलेखन विस्तार की दर को मापने के लिए, हमने इस तथ्य का लाभ उठाया कि लैक्ज़ लंबा (3075 बीपी) है और इसकी अभिव्यक्ति आईपीटीजी द्वारा प्रेरित की जा सकती है। जब एक जीन कम होता है, तो दो टाइलिंग प्रोब सेट (5′ और 3 ‘ सिरों के पास) डिजाइन करना मुश्किल होता है और 5 ‘ बनाम 3 ‘ एमआरएनए क्षेत्रों के दिखावे के बीच समय की देरी को हल करना मुश्किल होता है । इस मामले में, कोई भी एसएमफिश द्वारा स्थिर स्थिति में नवजात mRNAs की गणना कर सकता है और एक विश्लेषणात्मक मॉडल के साथ उनके वितरण का विश्लेषण कर सकता है जिसमें एक फिटिंग पैरामीटर20के रूप में ट्रांसक्रिप्शन विस्तार की दर है। इसके अलावा, जब ब्याज का जीन अक्षुण्ण नहीं होता है, तो कोई भी समय शून्य पर रिफाम्पिकिन के साथ कोशिकाओं का इलाज कर सकता है और 5 ‘ और 3 ‘ mRNA उप-क्षेत्रों में लौकिक परिवर्तन को माप सकता है । 5 एमआरएनए सिग्नल की कमी से 3 ‘ एमआरएनए सिग्नल की कमी से देरी का उपयोग पहले31के अनुसार प्रतिलेखन विस्तार की दर की गणना करने के लिए किया जा सकता है।
अंत में, smfish प्रोटोकॉल बहुमुखी है और अन्य लेबलिंग योजनाओं के साथ जोड़ा जा सकता है। इससे पहले, डीएनए लोकस को या तो डीएनए फिश14 या फ्लोरोसेंट रिपोर्टर-ऑपरेटर सिस्टम20के साथ एमआरएनए फिश के संयोजन से mRNAs के साथ एक साथ कल्पना की गई थी । एमआरएनए फिश14,36के साथ मिलकर इम्यूनोफ्लोरेसेंस करके प्रोटीन उत्पादों की कल्पना की जा सकती है । इसके अलावा, इसे तीन आयामी सुपर-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी37 के साथ जोड़ा जा सकता है ताकि तीनों आयामों38,,39में आरएएनए की कल्पना की जा सके।
The authors have nothing to disclose.
यह प्रोटोकॉल एस. के. द्वारा हावर्ड ह्यूजेस मेडिकल इंस्टीट्यूट और येल विश्वविद्यालय में माइक्रोबियल साइंसेज इंस्टीट्यूट में डॉ क्रिस्टीन जैकब्स-वैगनर की प्रयोगशाला में अपने पोस्टडॉक्टोरल शोध के दौरान विकसित किया गया था । हम पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पठन के लिए विधि विकास और लौरा ट्रॉयर के दौरान विभिन्न आदानों के लिए डॉ जैकब्स-वैगनर और उनके लैब सदस्यों को धन्यवाद देते हैं । एस. के. Searle विद्वानों कार्यक्रम से समर्थन स्वीकार करते हैं; केवी इलिनोइस विश्वविद्यालय से जेम्स स्कॉलर प्रीबल रिसर्च अवार्ड के समर्थन को स्वीकार करते हैं ।
Bacterial strain | |||
Escherichia coli MG1655 | |||
Chemicals, peptides, and others | |||
Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 34851 | UPLC buffer B |
Ammonium chloride | Fisher Chemical | A661-500 | To make M9 medium |
Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | B2518 | Probe hybridization |
Calcium chloride | Acros Organics | 349610250 | To make M9 medium |
Casamino acid | BD Difco | 223050 | To make M9 medium |
Cy3B NHS ester | GE Healthcare Life Sciences | PA63101 | Fluorophore for FISH probes |
Cy5 NHS ester | GE Healthcare Life Sciences | PA15101 | Fluorophore for FISH probes |
DEPC | Sigma-Aldrich | D5758 | |
Dextran sulfate | Millipore | S4030 | Probe hybridization |
Dextrose | Fisher Chemical | D16 | To repress the expression of lacZ |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | To dissolve fluorophores |
E. coli tRNA | Sigma-Aldrich | R1753 | Probe hybridization |
Ethanol | Decon Laboratories | 2701 | Used in DNA purification, lysis, and cleaning coverslips |
FISH probes | Biosearch Technologies | Sequences are published in ref#16 | |
Formaldehyde | Ladd Research Industries | 20295 | Fixation |
Formamide | American Bio | AB00600 | Probe hybridization, pre-hybridization, and wash |
Glycerol | Americanbio | AB00751-01000 | To make M9 medium |
Isopropylthio-β-galactoside (IPTG) | Invitrogen | 15529019 | lacZ induction |
Magnesium sulfate | Fisher Chemical | M65-500 | To make M9 medium |
2-Nitrophenyl β-D-fucopyranoside (ONPF) | Santa Cruz Biotechnology | sc-216258 | lacZ repression |
Picodent twinsil 22 | Picodent | 1300 1000 | Sealant |
Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P8920 | To treat the coverslip surface |
Potassium chloride | Fisher BioReagents | BP366-500 | To make PBS |
Potassium phosphate monobasic | Fisher BioReagents | BP362-500 | To make PBS and M9 medium |
Rifampicin | Sigma-Aldrich | R3501 | To stop transcription initiation |
Saline-sodium citrate buffer (SSC) | Invitrogen | AM9763 | Probe hybridization, pre-hybridization, and wash |
sodium bicarbonate | Fisher BioReagents | BP328-500 | Fluorophore-probe conjugation |
Sodium chloride | Fisher BioReagents | BP358-1 | For DNA purification, PBS and M9 medium |
Sodium phosphate dibasic | Fisher BioReagents | BP332-500 | To make PBS and M9 medium |
Sodium phosphate monobasic | Fisher BioReagents | BP329-500 | To make a sodium phosphate buffer |
Super PAP Pen | Invitrogen | 8899 | Hydrophobic marker for coverslips |
TetraSpek microspheres | Invitrogen | T7280 | Controls for multi-channel registration |
Thiamine | Sigma-Aldrich | T1270 | To make M9 medium |
Triethylammonium acetate | Sigma-Aldrich | 90358 | UPLC buffer A |
Vanadyl ribonucleoside complex (VRC) | Sigma-Aldrich | 94742 | Probe hybridization and pre-hybridization |
Equipment | |||
C18 column | Waters | Acquity BEH C18 column | |
Countertop centrifuge | Eppendorf | 5425 | |
Countertop incubator | Eppendorf | Thermomixer F1.5 | |
Incubator (Oven) | Thermo Scientific | 51030514 | Gravity convection |
Water purification system | Millipore | Milli-Q Reference | |
Nanodrop | Thermo Scientific | 2000C | |
Nitrogen gas | Building | For blow-drying coverslips and glass slides | |
UPLC | Waters | Acquity UPLC system | |
Vacuum and aspirator | Building | Aspirator is made of a filtration flask with a side arm. | |
Vacuum concentrator | Labconco | 7810010 | Centrivap; to dry samples collected from UPLC. |
Vortexer | Scientific Industries | Genie-2 SI-0236 | |
Water bath shaker | New Brunswick | Innova 3100 | Critical for time-course experiments |
Water bath sonicator | VWR | 97043-960 | To clean coverslips and glass slides |
Tools | |||
1.5-mL tubes | Eppendorf | 22431021 | DNA lobind tubes |
1000-uL pipette tip box | Denville Scientific | P1126 | An empty box after using all the tips |
Coplin jar | SPI | 01240-AB | To clean coverslips and glass slides |
Coverslip | Fisher Scientific | 22-050-230 | 24×60 No1 |
Filtered pipette tips | Denville Scientific | P1121,P1122,P1126 | SHARP® Precision Barrier Tips |
Forceps | SPI | K35a | To handle clean coverslips and glass slides |
Glass slide | Fisher Scientific | 12-544-1 | |
Gloves | Microflex | MK-296-M | |
Multichannel pipetter | Eppendorf | 2231300045 | To use in the washing step (#7) |
Pipette | Gilson | P1000, P200, P20 | |
Reagent reservoir | MTC Bio | P8025-1S | To use in the washing step (#7) |
Syringe filter (0.22 um) | Millipore | SLGS033SS | |
Timer | VWR | 62344-641 | |
Software and algorithms | |||
MATLAB | Mathworks | R2013 and up | https://www.mathworks.com |
MicrobeTracker or Oufti | https://www.github.com/JacobsWagnerLab/MicrobeTracker | ||
https://oufti.org/ | |||
Stellaris Probe Designer | Biosearch Technologies | https://www.biosearchtech.com/support/tools/design-software/stellaris-probe-designer | |
Microscope | |||
CCD camera | Hamamatsu Photonics | Orca-II-ER | |
Cy3 filter set | Chroma | 49004 | |
Cy5 filter set | Chroma | 49006 | |
Epi-fluorescence microscope | Nikon | Eclipse Ti | For phase-contrast and epi fluorescence |
Fluorescence excitation source | Lumencor | SOLA-E | |
Nikon Elements software | Nikon | software that controls the microscope setup | |
Phase-contrast 100x objective | Nikon | Plan Apochromat (NA 1.45) | |
Probe sequence | |||
DNA oligos with C6 amino modification at the 5' end | Biosearch Technologies Inc | ||
lacZ1 | GTGAATCCGTAATCATGGTC | 5' mRNA | |
lacZ2 | TCACGACGTTGTAAAACGAC | 5' mRNA | |
lacZ3 | ATTAAGTTGGGTAACGCCAG | 5' mRNA | |
lacZ4 | TATTACGCCAGCTGGCGAAA | 5' mRNA | |
lacZ5 | ATTCAGGCTGCGCAACTGTT | 5' mRNA | |
lacZ6 | AAACCAGGCAAAGCGCCATT | 5' mRNA | |
lacZ7 | AGTATCGGCCTCAGGAAGAT | 5' mRNA | |
lacZ8 | AACCGTGCATCTGCCAGTTT | 5' mRNA | |
lacZ9 | TAGGTCACGTTGGTGTAGAT | 5' mRNA | |
lacZ10 | AATGTGAGCGAGTAACAACC | 5' mRNA | |
lacZ11 | GTAGCCAGCTTTCATCAACA | 5' mRNA | |
lacZ12 | AATAATTCGCGTCTGGCCTT | 5' mRNA | |
lacZ13 | AGATGAAACGCCGAGTTAAC | 5' mRNA | |
lacZ14 | AATTCAGACGGCAAACGACT | 5' mRNA | |
lacZ15 | TTTCTCCGGCGCGTAAAAAT | 5' mRNA | |
lacZ16 | ATCTTCCAGATAACTGCCGT | 5' mRNA | |
lacZ17 | AACGAGACGTCACGGAAAAT | 5' mRNA | |
lacZ18 | GCTGATTTGTGTAGTCGGTT | 5' mRNA | |
lacZ19 | TTAAAGCGAGTGGCAACATG | 5' mRNA | |
lacZ20 | AACTGTTACCCGTAGGTAGT | 5' mRNA | |
lacZ21 | ATAATTTCACCGCCGAAAGG | 5' mRNA | |
lacZ22 | TTTCGACGTTCAGACGTAGT | 5' mRNA | |
lacZ23 | ATAGAGATTCGGGATTTCGG | 5' mRNA | |
lacZ24 | TTCTGCTTCAATCAGCGTGC | 5' mRNA | |
lacZ25 | ACCATTTTCAATCCGCACCT | ||
lacZ26 | TTAACGCCTCGAATCAGCAA | ||
lacZ27 | ATGCAGAGGATGATGCTCGT | ||
lacZ28 | TCTGCTCATCCATGACCTGA | ||
lacZ29 | TTCATCAGCAGGATATCCTG | ||
lacZ30 | CACGGCGTTAAAGTTGTTCT | ||
lacZ31 | TGGTTCGGATAATGCGAACA | ||
lacZ32 | TTCATCCACCACATACAGGC | ||
lacZ33 | TGCCGTGGGTTTCAATATTG | ||
lacZ34 | ATCGGTCAGACGATTCATTG | ||
lacZ35 | TGATCACACTCGGGTGATTA | ||
lacZ36 | ATACAGCGCGTCGTGATTAG | ||
lacZ37 | GATCGACAGATTTGATCCAG | ||
lacZ38 | AAATAATATCGGTGGCCGTG | ||
lacZ39 | TTTGATGGACCATTTCGGCA | ||
lacZ40 | TATTCGCAAAGGATCAGCGG | ||
lacZ41 | AAGACTGTTACCCATCGCGT | ||
lacZ42 | TGCCAGTATTTAGCGAAACC | ||
lacZ43 | AAACGGGGATACTGACGAAA | ||
lacZ44 | TAATCAGCGACTGATCCACC | ||
lacZ45 | GGGTTGCCGTTTTCATCATA | ||
lacZ46 | TCGGCGTATCGCCAAAATCA | ||
lacZ47 | TTCATACAGAACTGGCGATC | ||
lacZ48 | TGGTGTTTTGCTTCCGTCAG | ||
lacZ49 | ACGGAACTGGAAAAACTGCT | 3' mRNA | |
lacZ50 | TATTCGCTGGTCACTTCGAT | 3' mRNA | |
lacZ51 | GTTATCGCTATGACGGAACA | 3' mRNA | |
lacZ52 | TTTACCTTGTGGAGCGACAT | 3' mRNA | |
lacZ53 | GTTCAGGCAGTTCAATCAAC | 3' mRNA | |
lacZ54 | TTGCACTACGCGTACTGTGA | 3' mRNA | |
lacZ55 | AGCGTCACACTGAGGTTTTC | 3' mRNA | |
lacZ56 | ATTTCGCTGGTGGTCAGATG | 3' mRNA | |
lacZ57 | ACCCAGCTCGATGCAAAAAT | 3' mRNA | |
lacZ58 | CGGTTAAATTGCCAACGCTT | 3' mRNA | |
lacZ59 | CTGTGAAAGAAAGCCTGACT | 3' mRNA | |
lacZ60 | GGCGTCAGCAGTTGTTTTTT | 3' mRNA | |
lacZ61 | TACGCCAATGTCGTTATCCA | 3' mRNA | |
lacZ62 | TAAGGTTTTCCCCTGATGCT | 3' mRNA | |
lacZ63 | ATCAATCCGGTAGGTTTTCC | 3' mRNA | |
lacZ64 | GTAATCGCCATTTGACCACT | 3' mRNA | |
lacZ65 | AGTTTTCTTGCGGCCCTAAT | 3' mRNA | |
lacZ66 | ATGTCTGACAATGGCAGATC | 3' mRNA | |
lacZ67 | ATAATTCAATTCGCGCGTCC | 3' mRNA | |
lacZ68 | TGATGTTGAACTGGAAGTCG | 3' mRNA | |
lacZ69 | TCAGTTGCTGTTGACTGTAG | 3' mRNA | |
lacZ70 | ATTCAGCCATGTGCCTTCTT | 3' mRNA | |
lacZ71 | AATCCCCATATGGAAACCGT | 3' mRNA | |
lacZ72 | AGACCAACTGGTAATGGTAG | 3' mRNA |