Summary
В этой статье представлен метод, который сочетает в себе соблюдение всего костного мозга и цитометрии потока сортировки для изоляции, культивирования, сортировки и выявления мезенхимальных стволовых клеток костного мозга из крысиных челюстей.
Abstract
Здесь мы представляем эффективный метод изоляции и культивирования мезенхимальных стволовых клеток костного мозга (mBMSCs) в пробирке для быстрого получения многочисленных высококачественных клеток для экспериментальных требований. mBMSCs может быть широко использован в терапевтическом применении в качестве тканевых инженерных клеток в случае черепно-мозговых заболеваний и черепно-челюстно-лицевой регенерации в будущем из-за отличной способности к самообувечиваем и потенциалу дифференциации нескольких линий. Поэтому важно получать mBMSCs в больших количествах.
В этом исследовании костный мозг был смыт из челюсти и первичных mBMSCs были изолированы через весь костный мозг приверженец культивирования. Кроме того, CD29иCD90иCD45и mBMSCs были очищены с помощью флуоресцентной сортировки клеток. Второе поколение очищенных MBMSCs были использованы для дальнейшего изучения и отображается потенциал в дифференциации на остеобласты, адипоциты и хондроциты. Используя эту модель in vitro, можно получить большое количество пролиферативных mBMSCs, которые могут облегчить изучение биологических характеристик, последующую реакцию на микроокнивиронику и другие применения mBMSCs.
Introduction
Мезенхимальные стволовые клетки костного мозга (BMSCs) являются негематопоэтическими стволовыми клетками, полученными из костного мозга, которые проявляют сильную способность к пролиферациии потенциал многослойной дифференциации 1,2,3,4. Действительно, BMSCs были рассмотрены в качестве идеального кандидата для костной ткани инженерии и регенерации с тех пор они были обнаружены. В течение многих лет, подвиховый гребень или длинные кости, такие как голени и бедренной кости были наиболее распространенным источником BMSCs для черепно-мозговой регенерации. Однако орафасовые БМС, такие как мандибулярные БМС (МБМКС), демонстрируют некоторые отличия от длинных костных БМСК, такие как различное эмбриональное происхождение и структура развития. Челюсти возникают из нервных клеток гребня нейроэктодермного зародышевого слоя и проходят внутримембранное окостенение, в то время как осевые и аппендикулярные скелеты из мезодерма и проходят эндохонделальное окостенение. Кроме того, клинические наблюдения и экспериментальные исследования на животных постоянно указывают на то, что существуют функциональные различия между орафациальной и подвиховной гребень BMSCs5,6,7,8. Отчеты показали, что BMSCs производные от черепно-мозговой кости, такие как челюсти, челюстной кости и альвеолярной кости выставлены превосходное пролиферации, продолжительность жизни, и дифференциации возможности, чем у из осяных и аппендикулярныхкостей 9. mBMSCs, таким образом, считаются предпочтительными ресурсами для будущего терапевтического применения черепно-мозговых заболеваний, таких как херувим, опухоль челюсти, остеопороз челюстной кости, и дефектпародонтальной ткани 10,11,12. Чтобы понять потенциал лечения в доклинических экспериментах, необходимо установить метод быстрой изоляции и культивирования mBMSCs in vitro.
В этом исследовании, цель состояла в том, чтобы получить очищенные mBMSCs путем присоединения всего костного мозга и потока цитометрии сортировки. Анатомическая морфология крысиной челюсти, четко наблюдаемая с помощью микрокомитной томографии (Micro-CT) и гистологических секций, показала, что трабекулярная кость челюсти была между резцаторным медуллярным пространством и альвеолярной костью. Костный мозг из трабекулярной кости был промыт для получения клеток мсудистого мозга, но клетки, культурные таким образом, не были чистыми mBMSCs и,вероятно,состоят из нескольких типов клеток с неопределенными потенциями и различных линий, таких как клетки из костей, жира иэндотелиальных клеток 13,14. Следующим шагом очистки клеток было особенно важно. Поток цитометрии фильтрует клетки, распознавая сочетание белков клеточной поверхности и был широко принят в обогащении мезенхимальных стволовых клеток. Однородность клеток является основным преимуществом цитометрии потока, но процесс не определяет жизнеспособность клеток и может привести к ограниченной урожайности клеток. В этом исследовании P0 mBMSCs, полученные из всего костного мозга присоединения были отсортированы по цитометрии потока для получения mBMSCs с высокой чистотой и сильной пролиферативной способности.
Это исследование вводит воспроизводимый и надежный протокол для изоляции, культуры и дифференциации крысы мибибулярных BMSCs с использованием сочетания всего костного мозга присоединения и потока цитометрии сортировки. Это надежный и удобный метод для исследователей в смежных областях для использования.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все экспериментальные процедуры для животных в этой статье были одобрены Комитетом по уходу за животными Шанхайской девятой народной больницы, Медицинской школой Шанхайского университета Цзяо Тонг.
1. Подготовка
- Используйте двух 5-недельных самцов крыс Спрага Доули для эксперимента.
- Стерилизовать все инструменты, в том числе держатели игл, пинцет и ножницы при высокой температуре или погрузить в 75% этанола в течение 10 минут.
ПРИМЕЧАНИЕ: Погружение этанола не должно быть слишком долго, чтобы избежать повреждения клеток. - Подготовь культурные СМИ заранее, состав которых представлен в таблице 1. Дополнить каждую среду, как описано ниже.
- Подготовка среды α-MEM (с 10% FBS): Дополнение минимальной необходимой средней альфа (α-MEM) с 10% сыворотки крупного рогатого скота плода и 1% пенициллина и стрептомицина.
- Подготовка остеогенной дифференциации среды: Дополнение остеогенной дифференциации базальной среды с 10% фетальной сыворотки крупного рогатого скота, 1% глутамина, 1% пенициллин-стрептомицин, 0,20% аскорбиновой кислоты, 1% β-глицерофосфат и 0,01% дексаметазон.
- Подготовка остеогенной индукционной среды: Смешайте 70% α-MEM культуры среды (с 10% FBS) и 30% остеогенной дифференциации среды.
- Подготовка адипогенной дифференциации среды A: Дополнение адипогенной дифференциации базальной среды с 10% сыворотки крупного рогатого скота плода, 1% глутамина, 1% пенициллин-стрептомицин, 0,20% инсулина, 0,10% IBMX, 0,10% Росиглитазон и 0,01% дексаметазон.
- Подготовка адипогенической дифференциации среды В: дополнение адипогенной дифференциации базальной среды с 10% сыворотки крупного рогатого скота плода, 1% глутамина, 1% пенициллина-стрептомицина и 0,20% инсулина.
- Подготовка хондрогенной дифференциации среды: Дополнение хондрогенной дифференциации базальной среды с 0,01% дексаметазон, 0,30% аскорбиновой кислоты, 1% ITS, 0,10% пирувата натрия, 0,10% Пролина и 1% TGF-No3.
ПРИМЕЧАНИЕ: Остеогенная дифференциация среды должны быть использованы в течение месяца после конфигурации. Эффективный период настроенной хондрогенной дифференциации среды составляет 12 ч.
2. Изоляция и культивирование крыс mBMSCs
ПРИМЕЧАНИЕ: Все экспериментальные операции должны выполняться на льду как можно больше для поддержания жизнеспособности клеток.
- Сбор крыс челюсти
- Euthanize два 5-недельный мужчина Sprague Доули крыс CO2 удушья. Убедитесь, что дыхание животного остановлено, прежде чем приступить к эксперименту.
- Промыть этих крыс в стакан, содержащий 75% этанола в течение 3 мин.
- Поместите крысу в чистый капот дыма, чтобы собрать челюсти.
ПРИМЕЧАНИЕ: Стерилизовать дым капот ультрафиолетовым излучением света в течение 30 минут перед использованием. - Поместите крысу в положение лежа. Инсизовать шкуры и мышцы буцинатора от двустороннего ангуля ориса до задней области нижней челюсти, которая является единственной подвижной костью с нижним резецом.
ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется сделать 2 см разрез с каждой стороны ингула oris, чтобы получить четкое поле операции. - Откройте рот крысы, нажав челюстно-челюстные и мюндибулярные резцы в противоположном направлении с обоими пальцами, чтобы разоблачить мидибулярные зубы, которые прикреплены к челюстно-микрой.
- Полностью отключите бускальные мышцы и сухожилия, прикрепленные к коракоиды и нижней границе нижней челюсти.
ПРИМЕЧАНИЕ: Повышенная подвижность челюсти наблюдается во время этого шага из-за отсутствия мышечного напряжения. - Нажмите на мандибулярные задние зубы и поверните назад и вниз, пока кондилы с обеих сторон четко подвергаются.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг выполняется, чтобы искусственно открыть рот крысы в максимально возможной степени, чтобы вывихнуть condyle. Мандибл соединен с черепом через двусторонние кондилы, поэтому воздействие кондилей приводит к разрыву между черепом и челюсти. - Отдели тело челюсти от черепа.
- Очистите адепт мягких тканей на поверхности кости с помощью мокрой марли.
- Поместите кость в 10-сантиметровую стерильную стеклянную тарелку, наполненную предварительно заколонной минимальной необходимой средней α (α-MEM) или фосфатным буферным солевым раствором (PBS) на льду, чтобы сохранить жизнеспособность.
- Изоляция и культивирование mBMSCs
- Отрежьте переднюю кость вдоль мезиального края первого молара от мюндибулярного тела. Удалите мюндибулярный рамус, включая коракоид и кондилу вдоль дистального края третьего моляра, чтобы разоблачить полость костного мозга.
- Заполните 10 см стерильной стеклянной тарелкой с 10 мл α-MEM (с 10% FBS).
- Используйте шприц 1 мл, чтобы α культуру МЕМ. С помощью шприца иглы вставляется в полость костного мозга, неоднократно промыть костный мозг в блюдо. Промыть костную полость по крайней мере 3 раза как с мезиальной, так и с дистальной сторон кости, соответственно, пока кость не побелеет.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это самый важный шаг, так как полость костного мозга крысиной челюсти не так очевидна, как в длинной кости и правильной точке вставить иглу должна быть определена эмпирически. Все экспериментальные образцы, о них выше, должны храниться на льду для поддержания жизнеспособности клеток, поэтому время работы должно быть не более 2 ч. - Перенесите средства, содержащие промытые клетки, в центрифугу 15 мл и центрифугу при 800 х г при 4 градусах Цельсия в течение 5 минут. Отбросьте супернатант.
- Повторное увеличение ячеек с 3 мл α-MEM (с 10% FBS). Плита клеток в новом 10 см культуры блюдо и инкубировать при 37 градусов по Цельсию в 5% CO2 инкубатора.
- Проверьте морфологические изменения и рост этих клеток на 3-й день культуры. Удалите культурную среду с неадхерентными клетками и фрагментами тканей. Аккуратно добавьте 10 мл свежих α-MEM (с 10% FBS).
- После 7 дней культуры, P0 mBMSCs достигли 70% до 80% слияния.
- Сортировка ячеев потока
ПРИМЕЧАНИЕ: P0 mBMSCs были фенотипически идентифицированы и в первую очередь очищены путем сортировки клеток потока.- Аспирировать и отказаться от культуры среды, а затем мыть блюдо с PBS. Отбросьте PBS.
- Добавьте 1 мл 0,25% трипсина с 0,02% ЭДТА в блюде. Переиг дайджест клеток при 37 градусов по Цельсию в течение 5 минут, а затем добавить 2 мл α-MEM (с 10% FBS), чтобы остановить реакцию.
- Перенесите подвеску клеток в центрифугу 15 мл и центрифугу при 800 х г в течение 5 минут.
- Повторное распределение клеток в 120 МКЛ PBS (с 10% FBS) после центрифугации.
- Блокируйте эти клеточные суспензии с 1 МЛ антитела против CD16/CD32 при 4 градусах Цельсия в течение 15 мин.
- Передача 100 МКЛ клеточной подвески в новую трубку микроцентрифуга, пятно клеток с фикоэритроном (PE)-конъюгированных антител против CD45, фторскин-изотиоцианат (FITC)-конъюгированных антител против CD90 и Allophycocyanin (APC)-антитела против CD29 при 4 кк для 1 ч втемноте 13,15. Концентрация антител, используемых в этом эксперименте, показана в таблице 2. Используйте другие 20 МКЛ клеточной подвески в качестве необлитого отрицательного контроля.
- Затем центрифуга труб на 800 х г в течение 5 мин, отбросить подвеску, и повторного перерасхода клеток в 0,5 мл PBS (с 10% FBS).
- Добавьте 10 л 0,01 мг/мл DAPI за 10 минут до анализа.
- Используйте 40 нм фильтры, размещенные на центрифуге труб для фильтрации клеток.
- Проанализируйте клетки на флуоресценции активированных клеток Сортер. Установите панели следующим образом. Во-первых, удалите мертвые клетки из общего числа ячеек путем заготовки DAPI- ячеек, затем ворот CD29иCD90и CD45 -в выбранных ячейках в качестве целевых mBMSCs.
- Соберите отсортированныйCD29 и CD90и CD45 -клетки в 15 мл центрифуги трубки с 3 мл α-MEM (с 10% FBS) предварительно подготовлены.
- Центрифуга труб при 800 х г в течение 5 мин. Удалите буфер сбора и добавьте 1 мл свежего α-MEM (с 10% FBS) для повторного перерасхода ячеек. Затем тарелка их в 6 см культуры блюдо.
3. Способность к образованию колоний
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг был выполнен, чтобы проверить способность деления mBMSCs. 15 Лет
- Для этого эксперимента выберите второй проход mBMSCs (P2). Когда слияние клеток достигло 80% до 90%, повторное процедить клетки в серийный градиент в 6 хорошо пластины для оценки их способности клонального распространения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется установить градиент от 1 х 102 до 1 х 103 клеток на колодец, но окончательные разбавления различных клеточных линий человеческого или животного происхождения были эмпирически определены. - Культура клеток в α-MEM (с 10% FBS) в течение примерно двух недель, пока большое количество колонии формирования единиц можно было увидеть под световым микроскопом. Освежите культурную среду каждые 3 дня.
- Аспирировать и отказаться от культуры среды, мыть колодцы с PBS дважды в течение 5 минут за один раз. Далее добавьте 4% параформальдегид раствор для каждой хорошо и исправить, по крайней мере 10 мин.
- Удалите параформальдегид и промыть скважины дважды с PBS.
- Окрашивайте клетки раствором кристально фиолетового окрашивания и инкубировать их в 37 градусов по Цельсию в течение примерно 10 минут.
ПРИМЕЧАНИЕ: Время окрашивания соответствующим образом регулируется до тех пор, пока не будет достигнут желаемый оттенок. - Удалите окрашивающий раствор и промыть образцы дистиллированной водой, чтобы остановить реакцию.
- Изображение под стереомикроскопом и количество разбросанных клеточных колоний, которые состояли по крайней мере из 50 клеток.
4. Многолинейная дифференциация MBMSCs
ПРИМЕЧАНИЕ: P2 mBMSCs были использованы для последующих экспериментов, если не описано иное.
- Остеогенная индукция mBMSCs
- Дайджест mBMSCs, как описано выше. Семенные клетки при плотности 2,5 х 105/см 2 в 12 хорошо пластины дополнены 1 мл α-MEM (с 10% FBS).
- Когда слияние клеток достигло 60-70%, измените среду на 30% остеогенных индукционных носителей. Культура клеток с α-MEM (с 10% FBS) в качестве отрицательного контроля и изменения среды каждые 2 дня.
ПРИМЕЧАНИЕ: После того, как большое количество узелков кальция появляются во время остеогенеза, рекомендуется менять средний обмен шаблон на половину объема среднего обмена каждые 2 дня, чтобы предотвратить остеобласты от плавающей. - После культивирования в течение семи дней, оценить кальцификации этих клеток щелочной фосфатазыокрашивания 16,17.
- Удалите культурную среду и зафиксировать клетки с 4% параформальдегид в течение 10 мин. Промыть клетки с помощью 1 мл PBS на колодец в течение 3 минут в два раза.
- Затем окрашивают клетки щелочным раствором окрашивания фосфатазы и инкубируют при 37 градусов по Цельсию в течение 10-30 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Инкубация может быть выполнена на ночь при комнатной температуре, чтобы получить необходимый цвет. - Вымойте колодцы дистиллированной водой, чтобы остановить реакцию. Фотографи под световым микроскопом. Красные пигментированные гранулы представляют собой щелочную фосфатазу (ALP).
- После культивирования оставшихся клеток в течение еще 7 дней, выполнить ализарин красное окрашивание для оценки минерализации потенциала клеток.
- Пятно клеток с 0,5% ализарин красный раствор окрашивания после фиксации клеток в течение 10мин 16,18. Остановите хромогенную реакцию дистиллированной водой через 3-5 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Время реакции может быть продлено в зависимости от цвета разработан. - Наконец, поместите культурную пластину под световой микроскоп для наблюдения за эффектом остеогенного окрашивания; красные узелки указывают на отложения кальция этих клеток.
- Адипогенная индукция mBMSCs
- Семя P2 mBMSCs в 12 хорошо пластины, как описано выше.
- После того, как хорошо стало 90% слияние, культура клеток с адипогенной дифференциации среды А. Использование клеток, культурных в α-MEM культуры среды (с 10% FBS) в качестве отрицательного контроля.
- После 2 дней индукции, аспирировать средний из хорошо и добавить 1 мл адипогенной дифференциации средней B в каждой хорошо.
- После одного дня, удалить средний B и начать цикл снова со средним добавил обратно в колодец. Культура клеток поочередно с использованием средних А и В.
- Применить дифференциации среды А и В поочередно в течение трех циклов и обнаружить адипогенез этих клеток с помощью масла красного Oокрашивания 16,18.
ПРИМЕЧАНИЕ: Много круглых и больших липидных капель можно наблюдать путем культивирования этих клеток с дифференциацией среды B в течение дополнительных 2 до 3 дней. - Удалите среду и исправить клетки с 4% параформальдегид в течение 10 минут. Вымойте клетки с помощью PBS.
- Пятно клетки с маслом красного O окрашивания раствора и инкубировать при 37 градусов по Цельсию в течение примерно 3 мин.
- Удалить окрашивание раствор и мыть колодцы с дистиллированной водой.
- Наблюдайте за адипогенезом под световым микроскопом.
- Индукция хондрогенеза mBMSCs
- Семена P2 mBMSCs в 15 мл центрифуги трубки при плотности 5 х 105/см2.
- Центрифуга труб при 300 х г в течение 5 мин. Отбросьте супернатант.
- Повторное течение клеток с 0,5 мл хондрогенной дифференциации среды. Центрифуга клетки на 300 х г в течение 5 мин.
- Расслабьте крышку центрифуги трубки и инкубировать его при 37 градусов по Цельсию в 5% CO2 инкубатора. Возобновление среды каждые 2 дня.
ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки начинают гранулирование после 24 ч. Рекомендуется не перемещать центрифугу трубки на 48 ч. Будьте осторожны, чтобы не аспирировать гранулы клетки при изменении среды. - После 21 дней индукции, исправить ячейки гранулы с 4% параформальдегида, а затем обезвоживание, парафин встраивания и секционирования.
- После депарафинизации и увлажнения, пятно слайдов в Alcian синий раствор, по крайней мере 15мин 18,19,20,21, затем мыть дистиллированной водой, чтобы остановить реакцию. Захват фотографий под световым микроскопом.
- Для иммунофлуоресцентного окрашивания коллагена II типа выполните следующие шаги.
- Инкубировать слайды с 5 мкг / мл протеиназы K в течение 15 мин при 37 градусов по Цельсию после депарафинизации и гидратации шаг.
- Инкубировать слайды в блокирующий буфер в течение 1 ч при 37 градусов по Цельсию.
- Нанесите 1 МКЛ антитела коллагена II типа в 200 мкл блокирующего буфера на слайды и инкубировать на ночь при 4 градусах Цельсия.
- На следующий день, мыть слайды с PBS в два раза и инкубировать со вторичными антителами при 37 градусов по Цельсию в течение 1 ч.
- Инкубировать ломтики с 40,6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI) в течение 10 мин.
- Сфот фотографируете каждый слайд под микроскопией флуоресценции.
5. ПЦР в режиме реального времени
- Извлекайте общую РНК из mBMSCs с помощью изотиоцианата гуанидия на основе коммерчески доступного реагента.
- Выполните обратную транскрипцию РНК в комплементарной ДНК с помощью коммерчески доступного комплекта. Условия реакции обратной транскрипции были следующими: 65 градусов по Цельсию в течение 5 минут, 37 градусов по Цельсию в течение 15 минут, 85 градусов по Цельсию для 15 с.
- Выполните ПЦР в режиме реального времени для обнаружения остеогенеза и адипогенза конкретных генов с помощью грунтовок, перечисленных в таблице 3. Процедура усиления ПЦР была следующей: 95 градусов по Цельсию в течение 5 мин. 95 градусов по Цельсию для 5 с, 60 градусов по Цельсию для 30 с для 40 циклов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Используя этот протокол, большая часть клеток прилипла к пластине на третий день после первоначальной культуры. Как правило, после дополнительных 3-4 дней культуры, слияние клеток достигло 70 до 80%(рисунок 1B). При сортировке флуоресцентныхклеток,DAPI - CD29- CD90иCD45- mBMSCs былиочищены 18,22, что составило около 81,1% в клетках P0 (Рисунок 1C).
После посева P2 mBMSCs на 100 клеток в каждой колодец 6 пластины в течение недели, значительное количество колоний формирования единиц были соблюдены, что свидетельствует о значительной способности колонии формирования mBMSCs(рисунок 1D).
Для оценки способности к дифференциации нескольких линий, mBMSCs были вызваны в остео-, хондро- и адипо-линий, соответственно, в 12 пластин хорошо. MBMSCs отображается сильная остеогенная способность дифференциации. Повышенная активность ALP, красные узелки, распределяемые спорадически под ализарином красного окрашивания, и повышенная экспрессия остеогенных специфических генов Runx2, Alp, Bsp и Ocn (Рисунок 2) указали на эстрогенную индукцию. Для адипогенеза, выявленного окрашивания маслом красного O, многочисленные богатые липидами вакуолы были очевидны после 9 дней индукции. Аналогичным образом, экспрессия адипогенных специфических генов Ppar-1 и Cebpa показала значительное увеличение(рисунок 3). Для микроскопического наблюдения хондрогенной дифференциации слайдов, образцы показали положительное окрашивание для алцианского синего. Кроме того, иммуностиметь анти-типом II коллагеновых антител показал повышенное накопление матрицы хряща(рисунок 4).
| Культура Средний | компонент | Окончательная концентрация |
| 1.α-MEM среды культуры (с 10%FBS) | α-минимальная необходимая среда | |
| Фетальная сыворотка крупного рогатого скота | 10% | |
| Пенициллин и стрептомицин | 1% | |
| 2.Остеогенная индукционная среда | α-MEM среды (с 10%FBS) | 70% |
| Остеогенная дифференциация дифференциации среды | 30% | |
| 3.Остеогенная дифференциация среды | Остеогенная дифференциация базальной среды | |
| Фетальная сыворотка крупного рогатого скота | 10% | |
| глутамин | 1% | |
| Пенициллин-Стрептомицин | 1% | |
| аскорбиновая кислота | 0.20% | |
| β-глицерофосфат | 1% | |
| Дексаметазон | 0.01% | |
| 4.Адипогенная дифференциация среды А | Адипогенная дифференциация базальной среды | |
| Фетальная сыворотка крупного рогатого скота | 10% | |
| глутамин | 1% | |
| Пенициллин-Стрептомицин | 1% | |
| инсулин | 0.20% | |
| IBMX | 0.10% | |
| Розиглитазон | 0.10% | |
| Дексаметазон | 0.01% | |
| 5.Адипогенная дифференциация среды B: | Адипогенная дифференциация базальной среды | |
| Фетальная сыворотка крупного рогатого скота | 10% | |
| глутамин | 1% | |
| Пенициллин-Стрептомицин | 1% | |
| инсулин | 0.20% | |
| 6.Хондрогенная дифференциация среды: | Хондрогенез дифференциации базиальной среды | |
| Дексаметазон | 0.01% | |
| аскорбиновая кислота | 0.30% | |
| свой | 1% | |
| Пируват натрия | 0.10% | |
| Пролин | 0.10% | |
| TGF-No3 | 1% |
Таблица 1: Компоненты среды культуры и среды дифференциации.
| антитело | концентрация |
| CD90.1 (Thy-1.1) Моноклональные антитела | 0,5 мг/мл |
| CD45 Моноклональные антитела | 0,2 мг/мл |
| CD29 Антитела | 0,2 мг/мл |
| КоллагенII кролик поликлональные антитела | 5 мг/мл |
| Коза Анти-Rabbit IgG ХЛ (Алекса Флюор® 488) | 1 мг/мл |
Таблица 2: Концентрация антител, используемая в данном исследовании.
| букварь | Последовательность (от 5' до 3') | |
| ГАДДХ | Фоварда: CGGCAAGTTCAACGGCAGTCAAGG | |
| Обратный: ACGACATACTCAGCAGCATCACC | ||
| Runx2 | Foward: GCCTTCAAGGTTGTAGCCCT | |
| Обратное: TGAACCTGGCCACTTGGTTTTT | ||
| горная вершина | Foward: AAACTCGCTTATGGTCCG | |
| Обратный: TGGGTTTGAATTCCTGCGGGGT | ||
| BPS | Фовард: GCACGGTTGAGTATGGGGAA | |
| Обратный: ATCCTGACCCTCGTAGCCTT | ||
| Окн | Нападающий:CAACCCCAATTGTGACGAGC | |
| Обратный:GGCAACACATGCCCTAAACG | ||
| Себба | Foward: AGTCGGTGGATAACAGCAACG | |
| Обратный: CGGTCATTGTCACTGGTCAACTCC | ||
| Ппар No1 | Foward: CCATCGAGGACATCCAAGACAACC | |
| Обратный: GTGCTCTGTGAATCTGCCTGAG | ||
Таблица 3: Праймеры, используемые в ПЦР в режиме реального времени.
Рисунок 1: Изоляция и культура mBMSCs. (A)Схематическая диаграмма протокола. mBMSCs были изолированы и помойки на день 0 и инкубировали α-MEM среды культуры. На 7-й день P0 mBMSCs были очищены через сортировку цитометрии потока и отсортированные клетки были покроено на новом блюде культуры. На 14-й день были собраны P1 mBMSCs и покрытие на пластине 12-колодец. На 15-й день P2 mBMSCs были индуцированы в остеобласты, адипогенные клетки и хондробласты под соответствующей индукционной средой. (B)Схематическая модель крысиного мюндибулярного костного мозга и микроскопическое наблюдение P0 mBMSCs. (C)Цитометрия потока сортировки крыс mBMSCs. Анализ цитометрии потока показывает, что эти клетки были положительными для CD29 и CD90, но отрицательными для CD45, что совпадает с характеристиками BMSC. Из них было отсортировано 1,4х 10 6 ячеек, что составило соответственно 80% от общего количества клеток. (D)Представительное изображение кристально фиолетовых окрашенных клонов P2 mBMSC. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Остеогенный потенциал дифференциации mBMSCs. (A)После 7 дней остеогенной индукции, изменение активности ALP было визуализированы. Большое количество минерализованных узелков были окрашены под ализарин красного окрашивания в 14 дней после индукции остеогенной дифференциации. (B,C) Положительная область ALP и ализарин красного окрашивания были оценены с помощью программного обеспечения Image J. (C-G) Экспрессия мРНК остеобластов-специфических маркеров Runx2, Alp, Bsp и Ocn значительно возросла после 7 дней остеогенеза. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Адипогенный потенциал дифференциации MBMSCs после девяти дней индукции. (A)Большое количество липидных капель формы и адипоцитов были окрашены маслом-красным-O. (B,C) Выражение мРНК адипогенных маркеров Cebpa и Ppar-1 заметно увеличилось после 9 дней адипогенеза. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Стереоскоп зрения хондрогенного эффекта дифференциации. (A) mBMSCs после 21 дней хондрогенной индукции показал положительный для alcian синего окрашивания. (B)Иммунофлуоресценция изображения хондрогенного агрегата, окрашенного коллагеном анти-типа II. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот протокол описывает метод изоляции BMSCs от крыс челюсти in vitro путем совмещать все присоединение костного мозга и флуоресцентную сортировку клетки, которая просто и надежный путь получить пролиферативные mBMSCs с сильной способностью дифференциации. Этот метод может предварительно очистить MBMSCs путем сортировки клеток потока, но если Есть более высокие требования к однородности клеток, более точные методы очистки могут потребоваться.
В настоящее время существует четыре основных метода, используемых для изоляции mBMSCs, в том числе соблюдение всего костного мозга, градиентной центрифугации плотности, флуоресцентной сортировки клеток и магнитной активированнойсортировки клеток 22. Приверженность и плотность градиентной центрифугации всего костного мозга являются наиболее распространенными и простыми методами, используемыми для получения МБМГС за короткое время, однако их главным недостатком является низкая чистота собранных МБМГС. Последние два метода могут изолировать высокоочищенные mBMSCs с помощью иммунологических методов, но имеют недостатки быть дорогим, занимает много времени и нарушения жизнеспособности клеток. В этом исследовании преимущества соблюдения всего костного мозга и метод сортировки флуоресцентных клеток были объединены, чтобы получить достаточное количество пролиферативных mBMSCs в течение короткого времени.
Несомненно, одним из наиболее важных шагов в этом протоколе является вскрытие крысиной челюсти, которая сильно отличается от костей ося и аппендикулярных костей. Важно понять анатомию крысиной челюсти, чтобы получить нетронутый образец. Как и человек, крысиная нижняя челюсть сидит под челюсти, держит нижние зубы на месте и соединена с черепом двусторонними кондилами. Так как челюсти является единственной костью, которая может двигаться в черепе, Есть много мышц, прикрепленных к челюсти, которые контролируют его движение. Только путем удаления этих мягких тканей полностью и поворота рот открытым максимально может кондилы, соединяющиеся с черепом подвергаются. Стоит также отметить, что кондилярная шея является физической слабостью в челюсти и легко сломать. Если при повороте челюсти вниз обнаружено чрезмерное сопротивление, это означает, что мускулы не могут быть полностью удалены. Когда это наблюдается, не вращать его ограниченно, в противном случае легко сломать кондиларную шею тем самым приводит к загрязнению клеток. Другие трудности в разделении и культуре mBMSCs включают низкое содержание в костном мозге, деликатная активность клеток, низкая чистота, низкая частота клеток и загрязнениегематопоэтических клеток 18,23. Для получения МБМКС с хорошим ростом и относительно высоким потенциалом дифференциации крайне важно обеспечить деятельность МБМГ. Есть несколько ключевых шагов, в том числе использование четырехнедельных старых крыс для этого и последующих экспериментов, так как молодые крысы предпочитают поддерживать хорошую жизнеспособность. Многие исследования подтвердили, что активность MBMSCs связана с возрастом экспериментальных животных. Эти MBMSCs от старых доноров может привести к снижению активности распространения, дифференциации потенциал и продолжительностьжизни 2. Все операции во время сбора клеток должны быть завершены на льду и время работы должно быть как можно короче, предпочтительно в течение 2 часов. Кроме того, держать время пищеварения трипсина не более 3 минут. Наконец, еще одной проблемой в этом протоколе является процесс сбора МБМХ. Это может быть хлопотно, чтобы избавиться mBMSCs из костной полости, потому что полость крысы челюсти очень мала, поэтому очень важно быть знакомым с анатомической структурой. Micro-CT изображения могут быть большим подводка для этого. Кроме того, стоит отметить, что, поскольку ювенильный кости стройные и хрупкие, поломка может привести к загрязнению.
Ссылаясь на иммунофенотипические характеристики, БМСЦ выражают несколько фенотипов, но ни один из которых не специфичен для них24. Общепризнано, что БМСК не выражают CD11b, CD14, CD34 или CD45, но они имеют высокое выражение Sca-1, CD29, CD90 и CD105. Это исследование выбрало широко принятые маркеры CD29, CD90 и CD45 для сортировкифлуоресцентных клеток 13,14,25. Было установлено,что на cd29 и CD90иCD45- ячейки приходится соответственно 80% от общего количества клеток, что было достаточно для последующей клеточной культуры и исследований.
На протяжении десятилетий терапия стволовыми клетками широко используется в лечении различных заболеваний, таких как заболевания иммунной системы, гематологические системные заболевания, рак или травмы. Несомненно, MBMSCs, как замена BMSCs, можно использовать как более безопасный и более мощный инструмент в терапии стволовой клетки из-за их превосходных характеристик. Таким образом, культура клеток и расширение МБМКС становятся особенно важными для получения достаточного количества клеток для лечения.
Таким образом, это исследование продемонстрировало многообещающий и надежный протокол сбора обильных mBMSCs с высокой однородностью и многодиа дифференциации возможностей в течение короткого периода времени.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Все авторы заговорят, что у них нет конфликта интересов.
Acknowledgments
Благодарим за помощь Лабораторию оцифровке стоматологии и научно-исследовательский центр краниофациальных аномалий Шанхайской девятой народной больницы. Работа этой рукописи поддерживается грантами Национального фонда естественных наук Китая (NSFC) (81570950,81870740,81800949), Шанхайский саммит - Плато Дисциплины, фонд SHIPM-mu от Шанхайского института точной медицины, Шанхайская девятая населения больница, Шанхайская школа медицины Университета Цзяо Тонга (JC201809), проект стимулирования высокоуровневой инновационной команды для Медицинской школы Шанхайского университета Цзяо Тонга. И Л.Д. является ученым выдающихся молодых медицинских талантов, Шанхай "Восходящие звезды медицинского таланта" Программа развития молодежи и "Чэнь Син" проекта из Шанхайского университета Цзяотун.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin-EDTA(1X) | Gibco | 25200072 | |
| 10cm culture dish | Corning | ||
| acutenaculum | |||
| Adipogenic differentiation medium | Cyagen biosciences inc. | MUBMX-90031 | |
| Alcian Blue | Beyotime Biotechnology | ||
| Alizarin red | Sigma-Aldrich | A5533 | |
| Alkaline Phosphatase Color Development Kit | Beyotime Biotechnology | C3206 | |
| alpha-Minimum essential medium | GE Healthcare HyClone Cell Culture | SH30265.01B | |
| Anti -CollagenII Rabbit pAb | Abcam | ab34712 | |
| Antibodies against CD16/CD32 | |||
| Antifade Mounting Medium with DAPI | Beyotime Biotechnology | P0131 | |
| APC anti-mouse/rat CD29 Antibody | biolegend inc | 102215 | |
| Biosafety cabinet | Esco | AC2-4S8-CN | |
| CD45 Monoclonal Antibody (OX1), PE, eBioscience | Invitrogen | 12-0461-82 | |
| CD90.1 (Thy-1.1) Monoclonal Antibody (HIS51), FITC, eBioscience | Invitrogen | 11-0900-85 | |
| Centrifuge | cence | L500 | |
| Chondrogenesis differentiation medium | cyagen biosciences inc. | ||
| Confocal laser scanning microscope | Zeiss | LSM880 | |
| Countess II FL Automated Cell Counter | Invitrogen | AMQAF1000 | |
| Crystal Violet Staining Solution | Beyotime Biotechnology | C0121 | |
| Fetal Bovine Serum | GE Healthcare HyClone Cell Culture | SH30084.03 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488) | abcam | ab150077 | |
| Incubator | Esco | CCL-170B-8 | |
| Inverted microscope | olympus | CKX53 | |
| Magzol reagent(Trizol reagent) | Magen | ||
| micropipettor | Eppendorf | ||
| Oil Red O | |||
| Osteogenic differentiation medium | cyagen biosciences inc. | MUBMX-90021 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15070063 | |
| Phosphate-buffered saline(1X) | Gibco | 20012027 | |
| PrimeScript RT Master Kit | TakaRa Bio Inc | RR036A | |
| Proteinase K | Sigma-Aldrich | P6556 | |
| QuickBlock Blocking Buffer | Beyotime Biotechnology | P0260 | |
| scissor | |||
| SYBR1 Premix | TakaRa Bio Inc | ||
| Toluidine Blue | Beyotime Biotechnology | ||
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250061 |
References
- Jin, C., et al. Stem cell education for medical students at Tongji University: Primary cell culture and directional differentiation of rat bone marrow mesenchymal stem cells. Biochemistry and Molecular Biology Education. 46 (2), 151-154 (2018).
- Chu, D. T., et al. An Update on the Progress of Isolation, Culture, Storage, and Clinical Application of Human Bone Marrow Mesenchymal Stem/Stromal Cells. International Journal of Molecular Sciences. 21 (3), 708 (2020).
- Jin, Z., Chen, J., Shu, B., Xiao, Y., Tang, D. Bone mesenchymal stem cell therapy for ovariectomized osteoporotic rats: a systematic review and meta-analysis. BMC Musculoskeleton Disorder. 20 (1), 556 (2019).
- Jiang, Y., et al. Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow. Nature. 418 (6893), 41-49 (2002).
- Musina, R. A., Bekchanova, E. S., Belyavskii, A. V., Sukhikh, G. T. Differentiation potential of mesenchymal stem cells of different origin. Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 141 (1), 147-151 (2006).
- Lloyd, B., et al. Similarities and differences between porcine mandibular and limb bone marrow mesenchymal stem cells. Archives in Oral Biology. 77, 1-11 (2017).
- Zhang, W., et al. Comparison of the use of adipose tissue-derived and bone marrow-derived stem cells for rapid bone regeneration. Journal of Dental Research. 92 (12), 1136-1141 (2013).
- Stefanik, D., et al. Disparate osteogenic response of mandible and iliac crest bone marrow stromal cells to pamidronate. Oral Disorders. 14 (5), 465-471 (2008).
- Aghaloo, T. L., et al. Osteogenic potential of mandibular vs. long-bone marrow stromal cells. Journal of Dental Research. 89 (11), 1293-1298 (2010).
- Kaigler, D., et al. Stem cell therapy for craniofacial bone regeneration: a randomized, controlled feasibility trial. Cell Transplantation. 22 (5), 767-777 (2013).
- Li, C., Wang, F., Zhang, R., Qiao, P., Liu, H. Comparison of proliferation and osteogenic differentiation potential of rat mandibular and femoral bone marrow mesenchymal stem cells in vitro. Stem Cells Development. 2020, 1941629 (2020).
- Matsubara, T., et al. Alveolar bone marrow as a cell source for regenerative medicine: differences between alveolar and iliac bone marrow stromal cells. Journal of Bone and Mineral Research. 20 (3), 399-409 (2005).
- Chan, C. K. F., et al. Identification of the Human Skeletal Stem Cell. Cell. 175 (1), 43-56 (2018).
- Bianco, P., Riminucci, M., Gronthos, S., Robey, P. G. Bone marrow stromal stem cells: nature, biology, and potential applications. Stem Cells. 19 (3), 180-192 (2001).
- Franken, N. A., Rodermond, H. M., Stap, J., Haveman, J., van Bree, C. Clonogenic assay of cells in vitro. Nature Protocol. 1 (5), 2315-2319 (2006).
- Xu, H., et al. Icariin prevents oestrogen deficiency-induced alveolar bone loss through promoting osteogenesis via STAT3. Cell Proliferation. 53 (2), 12743 (2020).
- Zhang, P., Wu, Y., Jiang, Z., Jiang, L., Fang, B. Osteogenic response of mesenchymal stem cells to continuous mechanical strain is dependent on ERK1/2-Runx2 signaling. Internation Journal of Molecular Medicine. 29 (6), 1083-1089 (2012).
- Zhu, H., et al. A protocol for isolation and culture of mesenchymal stem cells from mouse compact bone. Nature Protocol. 5 (3), 550-560 (2010).
- Lach, M. S., et al. Chondrogenic Differentiation of Pluripotent Stem Cells under Controllable Serum-Free Conditions. International Journal of Molecular Sciences. 20 (11), 2711 (2019).
- Huang, X., Zhong, L., Hendriks, J., Post, J. N., Karperien, M. The Effects of the WNT-Signaling Modulators BIO and PKF118-310 on the Chondrogenic Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells. International Journal of Molecular Sciences. 19 (2), 561 (2018).
- Gale, A. L., Linardi, R. L., McClung, G., Mammone, R. M., Ortved, K. F. Comparison of the Chondrogenic Differentiation Potential of Equine Synovial Membrane-Derived and Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells. Frontiers in Veterinary Sciences. 6, 178 (2019).
- Li, X., Zhang, Y., Qi, G. Evaluation of isolation methods and culture conditions for rat bone marrow mesenchymal stem cells. Cytotechnology. 65 (3), 323-334 (2013).
- Kagami, H., Agata, H., Tojo, A. Bone marrow stromal cells (bone marrow-derived multipotent mesenchymal stromal cells) for bone tissue engineering: basic science to clinical translation. International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 43 (3), 286-289 (2011).
- Chamberlain, G., Fox, J., Ashton, B., Middleton, J. Concise review: mesenchymal stem cells: their phenotype, differentiation capacity, immunological features, and potential for homing. Stem Cells. 25 (11), 2739-2749 (2007).
- Abdallah, B. M., Alzahrani, A. M., Abdel-Moneim, A. M., Ditzel, N., Kassem, M. A simple and reliable protocol for long-term culture of murine bone marrow stromal(mesenchymal) stem cells that retained their in vitro and in vivo stemness in long-term culture. Biology Proceedings Online. 21, 3 (2019).
