Summary
Questo articolo fornisce una metodologia dettagliata per la dissociazione dei tessuti e gli approcci di frazionamento cellulare che consentono l'arricchimento di cellule epiteliali vitali dalle regioni prossimali e distali del polmone umano. Qui questi approcci sono applicati per l'analisi funzionale di cellule progenitrici epiteliali polmonari attraverso l'uso di modelli di coltura di organoidi 3D.
Abstract
I modelli organoidi epiteliali servono come strumenti preziosi per studiare la biologia di base di un sistema di organi e per la modellazione delle malattie. Se coltivate come organoidi, le cellule progenitrici epiteliali possono auto-rinnovarsi e generare progenie differenziante che mostra funzioni cellulari simili a quelle delle loro controparti in vivo . Qui descriviamo un protocollo passo-passo per isolare i progenitori specifici della regione dal polmone umano e generare colture organoidi 3D come strumento sperimentale e di convalida. Definiamo le regioni prossimali e distali del polmone con l'obiettivo di isolare le cellule progenitrici specifiche della regione. Abbiamo utilizzato una combinazione di dissociazione enzimatica e meccanica per isolare le cellule totali dal polmone e dalla trachea. Specifiche cellule progenitrici sono state quindi frazionate dalle cellule di origine prossimale o distale utilizzando lo smistamento cellulare associato alla fluorescenza (FACS) basato su marcatori di superficie specifici del tipo cellulare, come NGFR per lo smistamento delle cellule basali e HTII-280 per lo smistamento delle cellule alveolari di tipo II. I progenitori basali o alveolari isolati di tipo II sono stati utilizzati per generare colture organoidi 3D. Sia i progenitori distali che quelli prossimali formavano organoidi con un'efficienza di formazione della colonia del 9-13% nella regione distale e del 7-10% nella regione prossimale quando placcati 5000 cellule / pozzetto il giorno 30. Gli organoidi distali hanno mantenuto le cellule alveolari di tipo II HTII-280+ in coltura, mentre gli organoidi prossimali si sono differenziati in cellule ciliate e secretorie entro il giorno 30. Queste colture organoidiche 3D possono essere utilizzate come strumento sperimentale per lo studio della biologia cellulare dell'epitelio polmonare e delle interazioni mesenchimali epiteliali, nonché per lo sviluppo e la convalida di strategie terapeutiche mirate alla disfunzione epiteliale in una malattia.
Introduction
Gli spazi aerei del sistema respiratorio umano possono essere ampiamente suddivisi in zone conduttrici e respiratorie che mediano rispettivamente il trasporto di gas e il loro successivo scambio attraverso la barriera epiteliale-microvascolare. Le vie aeree conduttrici comprendono trachea, bronchi, bronchioli e bronchioli terminali, mentre gli spazi dell'aria respiratoria comprendono bronchioli respiratori, dotti alveolari e alveoli. Il rivestimento epiteliale di questi spazi aerei cambia nella composizione lungo l'asse prossima-distale per soddisfare i requisiti unici di ogni zona funzionalmente distinta. L'epitelio pseudostratificato delle vie aeree tracheo-bronchiali è composto da tre tipi di cellule principali, basale, secretoria e ciliata, oltre ai tipi cellulari meno abbondanti tra cui pennello, neuroendocrino e ionocita 1,2,3. Le vie aeree bronchiolari ospitano tipi di cellule epiteliali morfologicamente simili, sebbene vi siano distinzioni nella loro abbondanza e proprietà funzionali. Ad esempio, le cellule basali sono meno abbondanti all'interno delle vie aeree bronchiolari e le cellule secretorie includono una percentuale maggiore di cellule club rispetto alle cellule sierose e calici che predominano nelle vie aeree tracheo-bronchiali. Le cellule epiteliali della zona respiratoria includono un tipo di cellule cuboidali scarsamente definito nei bronchioli respiratori, oltre alle cellule alveolari di tipo I (ATI) e di tipo II (ATII) dei dotti alveolari e degli alveoli 1,4.
L'identità dei tipi di cellule staminali epiteliali e progenitrici che contribuiscono al mantenimento e al rinnovamento degli epiteli in ciascuna zona è descritta in modo incompleto e ampiamente dedotta da studi su modelli animali 5,6,7,8. Studi sui topi hanno dimostrato che le cellule basali delle vie aeree pseudostratificate, o le cellule club delle vie aeree bronchiolari o le cellule ATII dell'epitelio alveolare, fungono da cellule staminali epiteliali basate sulla capacità di auto-rinnovamento illimitato e differenziazione multipotente 7,9,10,11,12 . Nonostante l'incapacità di eseguire studi di tracciamento del lignaggio genetico per valutare la staminalità dei tipi di cellule epiteliali polmonari umane, la disponibilità di modelli di coltura basati su organoidi per valutare il potenziale funzionale delle cellule staminali epiteliali e progenitrici fornisce uno strumento per studi comparativi tra topo e uomo 13,14,15,16,17.
Descriviamo metodi per l'isolamento di tipi di cellule epiteliali da diverse regioni del polmone umano e la loro coltura utilizzando un sistema organoide 3D per ricapitolare i tipi di cellule regionali. Metodi simili sono stati sviluppati per l'analisi funzionale e la modellazione della malattia di cellule epiteliali da altri sistemi di organi 18,19,20,21. Questi metodi forniscono una piattaforma per l'identificazione di cellule progenitrici epiteliali regionali, per eseguire studi meccanicistici che indagano la loro regolazione e microambiente e per consentire la modellazione della malattia e la scoperta di farmaci. Anche se gli studi sulle cellule progenitrici epiteliali polmonari eseguiti in modelli animali possono trarre beneficio dall'analisi, sia in vivo che in vitro, le intuizioni sull'identità delle cellule progenitrici epiteliali polmonari umane sono state in gran parte dipendenti dall'estrapolazione da organismi modello. Come tali, questi metodi forniscono un ponte per mettere in relazione l'identità e il comportamento dei tipi di cellule epiteliali polmonari umane con i loro studi che studiano la regolazione delle cellule staminali / progenitrici.
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Protocol
Il tessuto polmonare umano è stato ottenuto da donatori di tessuto deceduti in conformità con le procedure di consenso sviluppate dall'International Institute for the Advancement of Medicine (IIAM) e approvate dal Cedars-Sinai Medical Center Internal Review Board.
1. Trattamento tissutale per l'isolamento di cellule polmonari da regioni tracheo-bronchiali o piccole vie aeree / parenchimali (piccole vie aeree e alveoli)
- Preparare e autoclave tutti gli strumenti di dissezione, vetreria e le soluzioni appropriate un giorno prima dell'isolamento cellulare.
- Dopo aver ricevuto il tessuto polmonare, identificare e separare le regioni prossimale e distale. La trachea e i bronchi sono considerati "prossimali". Ai fini di questo protocollo, la trachea e le prime 2-3 generazioni di bronchi vengono sezionate e utilizzate per l'isolamento dell'epitelio delle vie aeree "prossimale". Le piccole vie aeree di 2 mm o meno di diametro e il tessuto parenchimale circostante sono, ai fini di questo protocollo, considerati epitelio polmonare "distale" (Figura 1A).
NOTA: Tutte le procedure che comportano il trattamento del tessuto polmonare umano devono essere eseguite in un armadietto di biosicurezza con l'uso di adeguati dispositivi di protezione individuale.
2. Arricchimento e subimpostazione di piccole cellule progenitrici epiteliali delle vie aeree e alveolari dal tessuto polmonare distale
- Preparazione del tessuto distale
- Posizionare il tessuto polmonare distale in una capsula di Petri sterile (150 x 15 mm). Tagliare il tessuto in circa 1 cme 3 pezzi e metterlo in un tubo pulito da 50 ml.
- Lavare il tessuto 3 volte con HBSS refrigerato, scartando ogni volta il lavaggio HBSS per rimuovere il sangue e il liquido di rivestimento epiteliale.
- Mettere il tessuto in una nuova capsula di Petri e asciugare con salviette sterili anti-lanugine. Usando pinze e forbici, rimuovere quanta più pleura viscerale (una delicata membrana trasparente che copre la superficie del polmone) possibile.
- Utilizzare le forbici per tritare il tessuto in pezzi di circa 2 mm di diametro. Trasferire il tessuto tritato in una capsula di Petri pulita e tritarlo ulteriormente tagliandolo a una dimensione approssimativa di 1 mm con una lama di rasoio sterile su un solo lato.
- Digestione enzimatica
NOTA: la soluzione madre di Liberase è di 5 mg/mL (100x) e la DNasi è di 2,5 mg/mL (100x) (Tabella dei materiali).- Aggiungere 50 μg/mL Liberase e 25 μg/mL DNasi in HBSS sterile in un tubo conico da 50 mL.
- Trasferire circa 2-3 g di tessuto tritato in un nuovo tubo conico da 50 mL con 25 mL di HBSS, contenente Liberase e DNasi. Incubare per 40-60 min a 37 °C con agitazione continua utilizzando un miscelatore impostato a 900 giri/min. Dopo 30 minuti di incubazione, triturare il tessuto digerito utilizzando una siringa da 30 ml senza ago per evitare la formazione di grumi e continuare con l'incubazione.
NOTA: Il tempo di incubazione con gli enzimi può variare a seconda del tipo o delle condizioni del tessuto. Ad esempio, la digestione enzimatica del tessuto normale richiede circa 45 minuti. Tuttavia, il tessuto fibrotico da campioni di fibrosi polmonare idiopatica può richiedere un tempo di incubazione più lungo fino a 60 minuti. Pertanto, monitorare attentamente il tessuto durante questa fase per prevenire danni ai marcatori di superficie, che è fondamentale per FACS.
- Isolamento a cella singola
- Triturare il tessuto disegnando 5 volte attraverso un ago da 16 G montato su una siringa da 30 ml. Aspirare la sospensione tissutale in una pipetta a foro largo e passare attraverso una serie di filtri cellulari (500 μm, 300 μm, 100 μm, 70 μm, 40 μm) sotto pressione di vuoto. Lavare il filtro con 20 ml di tampone HBSS+ per raccogliere le cellule rimanenti. La ricetta per il buffer HBSS+ può essere trovata in Tabella dei materiali.
- Aggiungere un volume uguale di tampone HBSS+, dopo 45 minuti al filtrato per inibire l'attività liberasa e prevenire la digestione eccessiva.
- Centrifugare filtrati a 500 x g per 5 min a 4 °C. Rimuovere con cura e scartare il surnatante. Aggiungere 1 mL di tampone di lisi dei globuli rossi (RBC) al pellet, scuotere delicatamente il tubo per rimuovere il pellet e incubare sul ghiaccio per 1 minuto.
NOTA: la quantità e il tempo nella soluzione di lisi RBC dipendono dalle dimensioni del pellet. È importante mantenere le cellule sul ghiaccio e monitorare attentamente il tempo nella soluzione di lisi RBC per prevenire la lisi delle cellule bersaglio. Se la lisi dei globuli rossi è insufficiente, ripetere il passaggio. - Aggiungere 10-20 ml di buffer HBSS+ per neutralizzare il buffer di lisi RBC. Centrifugare filtrati a 500 x g per 5 min a 4 °C.
- Se i globuli rossi lisati (cellule fantasma) formano uno strato torbido sopra il pellet cellulare, risospesare il pellet in 10 ml di tampone HBSS + e filtrare la sospensione attraverso un filtro cellulare da 70 μm per eliminare le cellule fantasma. Centrifugare il filtrato a 500 x g per 5 min a 4 °C e procedere con ulteriori passaggi.
- Esaurimento delle cellule immunitarie e delle cellule endoteliali (fase opzionale)
- Esaurire le cellule endoteliali CD31+ e le cellule immunitarie CD45+ dal pool di cellule totali utilizzando le microsfere CD31 e CD45 coniugate agli anticorpi monoclonali anti-umani CD31 e CD45 (isotipo topo IgG1) e alle colonne LS in conformità con il protocollo del produttore (Tabella dei materiali).
- Raccogliere il flusso attraverso, costituito principalmente da cellule epiteliali e stromali, in un tubo sterile fresco e centrifugarlo a 500 x g per 5 minuti a 4 °C. Eseguire un conteggio delle celle per accertare il numero totale di celle nel flusso attraversato.
- Colorazione della superficie cellulare per lo smistamento cellulare associato alla fluorescenza (FACS)
- Risospendare 1 x 107 celle per 1 mL di buffer HBSS+. Aggiungere gli anticorpi primari alla concentrazione richiesta e incubare le cellule per 30 minuti a 4 °C al buio. In questo studio, sono stati utilizzati anticorpi primari coniugati con fluoroforo, salvo diversa indicazione. I dettagli delle fonti di anticorpi e dei titoli sono descritti nella Tabella dei materiali.
NOTA: HTII-280 è attualmente il miglior anticorpo reattivo di superficie che consente la sottoimpostazione delle cellule polmonari distali in frazioni cellulari prevalentemente aeree (HTII-280-) e alveolari di tipo 2 (HTII-280+). Un avvertimento a questa strategia è che le cellule AT1 non sono macchiate usando questo metodo e sono scarsamente rappresentate a causa della loro fragilità. Tuttavia, le cellule AT1 sono scarsamente rappresentate nelle preparazioni polmonari distali, presumibilmente a causa della loro fragilità e perdita durante la selezione delle cellule vitali da parte di FACS e quindi rappresentano solo un raro contaminante della frazione cellulare delle vie aeree. - Lavare le celle aggiungendo 3 mL di tampone HBSS+ e centrifugare a 500 x g per 5 min a 4 °C.
- Se si utilizzano anticorpi primari non coniugati, aggiungere la concentrazione richiesta di un anticorpo secondario coniugato fluoroforo appropriato e incubare per 30 minuti sul ghiaccio. Lavare via l'eccesso di anticorpi secondari aggiungendo 3 mL di tampone HBSS+ e centrifugare a 500 x g per 5 minuti a 4 °C.
- Scartare le cellule surnanti e risospese nel tampone HBSS+ per 1 x 107 cellule/ml. Filtrare le celle in tubi di polistirene da 5 ml attraverso un tappo filtrante per garantire la formazione di una sospensione a cella singola. Aggiungere DAPI (1 μg/mL) per macchiare le cellule permeabili (morte).
NOTA: È essenziale utilizzare controlli monocolore e fluorescenza meno uno (FMO) appropriati (ad esempio, cocktail di colorazione anticorpale meno un anticorpo ciascuno), per ridurre al minimo i falsi positivi durante la FACS. In questo studio, sono state utilizzate perle di selezione positive e negative per la compensazione empirica della sovrapposizione di spettri di emissione tra fluorofori (Table of Materials). FACS arricchisce i tipi di cellule di interesse. Le cellule epiteliali vitali sono arricchite in base al fenotipo della superficie cellulare CD45-negativo, CD31-negativo, CD236-positivo e alla colorazione negativa per DAPI. Questa frazione cellulare epiteliale può essere ulteriormente sottoinsiemizzata in base alla colorazione per marcatori di superficie specifici del tipo cellulare, come la colorazione specifica per le cellule HTII-280-positive che sono arricchite per le cellule AT2. Al contrario, la selezione negativa per HTII-280 consente l'arricchimento di piccole cellule epiteliali delle vie aeree come le cellule club e ciliate (Figura 2).
- Risospendare 1 x 107 celle per 1 mL di buffer HBSS+. Aggiungere gli anticorpi primari alla concentrazione richiesta e incubare le cellule per 30 minuti a 4 °C al buio. In questo studio, sono stati utilizzati anticorpi primari coniugati con fluoroforo, salvo diversa indicazione. I dettagli delle fonti di anticorpi e dei titoli sono descritti nella Tabella dei materiali.
3. Arricchimento e subimpostazione di cellule progenitrici epiteliali da vie aeree tracheo-bronchiali
- Preparazione dei tessuti
- Sezionare le vie aeree prossimali (trachea/bronchi) dai polmoni. Aprire le vie aeree lungo la loro lunghezza usando le forbici per esporre il lume e aggiungere 50 μg / mL Liberase per coprire completamente il tessuto.
- Incubare per 20 minuti a 37 °C con agitazione continua utilizzando un termoconscelatore impostato a 900 giri/min.
- Rimuovere le vie aeree prossimali dal tubo della centrifuga e metterlo in una capsula di Petri sterile (150 x 15 mm). Raschiare delicatamente la superficie delle vie aeree usando un bisturi per rimuovere completamente le cellule epiteliali luminali dal tessuto.
- Lavare la capsula di Petri con 5 mL di tampone HBSS+ sterile per raccogliere tutte le cellule epiteliali luminali spostate e trasferire le cellule spostate in un tubo conico centrifugo da 50 mL. Triturare la sospensione prelevando da 5 aghi da 16 G a 16 G e da 18 G montati su una siringa da 10 mL per ottenere una sospensione monocellulare.
- Centrifugare la sospensione a 500 x g per 5 min a 4 °C. Risospesciare il pellet nel tampone HBSS+ fresco e conservare queste cellule luminali delle vie aeree sul ghiaccio, pronte per essere combinate con la sospensione monocellulare generata dalle vie aeree prossimali tritate nelle prossime fasi.
- Usando le forbici, tagliare il tessuto tracheo-bronchiale rimanente lungo i suoi anelli per generare piccole strisce di tessuto e trasferire le strisce in una fresca capsula di Petri. Tritare le strisce di tessuto usando una lama di rasoio a lato singolo per creare pezzi più piccoli.
NOTA: Poiché le vie aeree prossimali sono cartilaginee, non possono essere tritate finemente come il tessuto polmonare distale. - Trasferire il tessuto tritato nei tubi C, aggiungere 2 mL di Liberase al tubo assicurandosi che il tessuto sia sommerso. Caricare il tubo C sul dissociatore automatico ed eseguire human lung Protocol-2 per dissociare meccanicamente il tessuto.
NOTA: Il dissociatore utilizzato in questo protocollo offre un programma ottimizzato chiamato human lung protocol-2 per questa specifica applicazione (vedi Tabella dei materiali).
- Digestione enzimatica e isolamento monocellulare
- Trasferire circa 2 g di tessuto prossimale tritato dal tubo C in ogni tubo centrifugo conico da 50 mL e aggiungere 50 μg/mL liberasi e 25 μg/mL di DNasi a ciascun tubo.
NOTA: per garantire una dissociazione efficiente, i tubi non devono essere riempiti oltre i 30 ml. - Incubare il tessuto tritato per 45 minuti a 37 °C con agitazione continua utilizzando un miscelatore impostato a 900 giri/min.
- Passare la sospensione tissutale dissociata attraverso una serie di filtri cellulari (500 μm, 300 μm, 100 μm, 70 μm, 40 μm) sotto pressione di vuoto come menzionato sopra e raccogliere il flusso attraverso. Lavare il filtro con 20 ml di tampone HBSS+ per raccogliere le cellule rimanenti.
NOTA: Poiché il tessuto prossimale è cartilagineo e voluminoso rispetto al tessuto distale, vi è una maggiore possibilità di intasamento dei filtri. L'uso di un imbuto può aiutare a prevenire il trabocco del liquido durante il passaggio attraverso i filtri. - Aggiungere un volume uguale di tampone HBSS+ al filtrato per inibire l'attività liberasi e prevenire la digestione eccessiva. Aggiungere le cellule luminali delle vie aeree prossimali isolate da 3.1.5 alla sospensione cellulare in questa fase.
- Centrifugare la sospensione cellulare combinata a 500 x g per 10 min. Rimuovere il surnatante e ripetere il lavaggio cellulare nel tampone HBSS+. Eseguire l'esaurimento delle cellule immunitarie CD45+ e delle cellule endoteliali CD31+ come menzionato sopra in 2.4 (passaggio opzionale).
- I metodi per la colorazione sono simili al tessuto polmonare distale, seguire i passaggi in 2.5. Arricchire le cellule epiteliali vitali in base al fenotipo della superficie cellulare CD45-negativo, CD31-negativo, CD236-positivo e alla colorazione negativa per DAPI.
- Ulteriore sottoinsieme della frazione cellulare epiteliale basata sulla colorazione per marcatori di superficie specifici del tipo cellulare, come NGFR, consentendo l'arricchimento di tipi di cellule basali (NGFR positive) e non basali (NGFR negative; secretorie, ciliate, neuroendocrine) (Figura 3).
- Trasferire circa 2 g di tessuto prossimale tritato dal tubo C in ogni tubo centrifugo conico da 50 mL e aggiungere 50 μg/mL liberasi e 25 μg/mL di DNasi a ciascun tubo.
4. Coltura organoide
- Aggiungere 5.000 (questo numero può essere regolato per ottenere la densità desiderata di organoidi epiteliali) cellule epiteliali prossimali o distali selezionate in tubo sterile da 1,5 ml insieme a 7,5 x 104 cellule MRC-5 (linea cellulare di fibroblasti polmonari umani). Le interazioni epiteliali-mesenchimali sono fondamentali per l'espansione delle cellule progenitrici.
- Centrifugare a 500 x g per 5 min a 4 °C.
NOTA: è importante confermare manualmente il conteggio delle cellule ottenuto dalla selezionatrice al fine di garantire l'accuratezza dell'efficienza di formare colonie organoidiche. - Rimuovere con cura ed eliminare il surnatante e risospese il pellet cellulare in 50 μL di mezzi ghiacciati integrati con antibiotici. Mantenere la sospensione cellulare sul ghiaccio.
- Aggiungere 50 μL di ghiaccio freddo 1x fattore di crescita impoverito della membrana basale media al flaconcino e pipettare delicatamente la sospensione su ghiaccio per mescolare.
NOTA: È importante utilizzare mezzi ghiacciati e mantenere le cellule sul ghiaccio per evitare la polimerizzazione prematura del mezzo della matrice della membrana basale. - Trasferire la sospensione cellulare su un inserto di coltura cellulare di dimensioni dei pori da 0,4 μm in una piastra a 24 pozzetti (1,4 x 104 celle/cm2), avendo cura di evitare l'introduzione di bolle d'aria.
- Incubare a 37 °C per 30-45 min per permettere alla matrice di solidificarsi.
- Aggiungere 600 μL di terreno di coltura preriscaldato al pozzo.
NOTA: Media è stato integrato con agenti antimicotici (0,4%) e pen streptococco (1%) per le prime 24 ore dopo la semina e 10 μM di inibitore della Rho chinasi per le prime 72 ore. - Coltura a 37 °C in un incubatore a CO2 al 5% per 30 giorni, durante i quali il supporto deve essere cambiato ogni 48 ore.
NOTA: la durata della coltura può essere modificata in base allo scopo dell'esperimento. Gli endpoint più lunghi vengono utilizzati per studiare la differenziazione, mentre gli endpoint più brevi di 7 giorni, 14 giorni, ecc., Possono essere utilizzati se lo scopo dell'esperimento non è quello di ottenere una differenziazione completa. - Aggiungere 10 μM di inibitore del TGFβ al terreno di coltura per 15 giorni per mantenere le cellule nella fase proliferativa e sopprimere la crescita eccessiva dei fibroblasti.
NOTA: i risultati variano a seconda del terreno di coltura utilizzato per il test. Ad esempio, i risultati mostrati qui sono stati generati utilizzando Pneumacult-ALI Medium, che si traduce nella generazione di grandi organoidi dal polmone distale, organoidi ben differenziati e più grandi dal polmone prossimale.
5. Colorazione organoide
- Fissaggio e incorporamento di organoidi
- Aspirare i fluidi dalle camere di inserimento transmembrana superiore e inferiore e risciacquare una volta con PBS caldo.
- Fissare le colture posizionando 300 μL di PFA (2% p/v) nell'inserto e 500 μL nel pozzetto per 1 ora a 37°C. Rimuovere il fissativo e risciacquare con PBS caldo facendo attenzione a non rimuovere il tappo della matrice di membrana basememt.
NOTA: gli organoidi fissi possono essere conservati immersi in PBS a 4 °C per una o due settimane prima di iniziare ulteriori passaggi. - Aspirare PBS, invertire l'inserto e tagliare con cura la membrana dell'inserto attorno alla sua periferia. Usando la pinza, rimuovere la membrana transwell, facendo attenzione a non disturbare il tappo della matrice.
- In una capsula di Petri, toccare l'inserto per recuperare la spina della matrice.
- Aggiungere una goccia di gel per la lavorazione del campione come Histogel (mantenuto a 37 °C) al tappo della matrice e mantenere a 4 °C fino a quando il gel non si solidifica.
- Trasferire la spina in una cassetta di incorporamento, disidratare attraverso concentrazioni crescenti di etanolo (70, 90 e 100%), trasparente in xilene e incorporare nella cera di paraffina.
- Tagliare sezioni da 7 μm su un microtomo e raccogliere su vetrini caricati positivamente.
- Colorazione immunofluorescenza degli organoidi
- Posizionare i vetrini a 65 °C per 30 minuti a deceratura.
- Deparaffinizzare le sezioni per immersione in xilene e reidratare diminuendo le concentrazioni di etanolo.
- Eseguire il recupero dell'antigene ad alta temperatura in soluzione di smascheramento dell'antigene, acido citrico base utilizzando un retriever disponibile in commercio immergendo i vetrini nella soluzione per 15 minuti (Tabella dei materiali).
- Circondare il tessuto con una barriera idrofoba usando una pap pen.
- Bloccare la colorazione non specifica tra gli anticorpi primari e il tessuto, incubando in tampone bloccante.
- Incubare sezioni nella concentrazione appropriata di anticorpi primari diluiti in soluzione di incubazione durante la notte a 4 °C in una camera umidificata.
- Risciacquare le sezioni 3 volte a temperatura ambiente con un tampone di lavaggio.
- Incubare nella concentrazione appropriata di anticorpo secondario coniugato al fluorocromo per 1 ora a temperatura ambiente.
- Risciacquare le sezioni 3 volte a temperatura ambiente con 0,1% tween 20-TBS. Incubare le sezioni per 5 minuti in DAPI (1 μg/mL). Risciacquare le sezioni una volta in TBS (soluzione salina tamponata con Tris) con 0,1% tween 20, asciugare e montare in una soluzione di montaggio (Figura 4 e Figura 5).
NOTA: La fonte e la diluizione ottimale di lavoro degli anticorpi primari e secondari utilizzati per la colorazione dell'immunofluorescenza sono incluse nella Tabella dei materiali.
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Representative Results
Tessuto polmonare sorgente
La trachea e il bronco extrapolmonare (Figura 1A) sono stati utilizzati come tessuto di origine per l'isolamento delle cellule epiteliali delle vie aeree prossimali e la successiva generazione di organoidi prossimali. Il tessuto polmonare distale che comprende sia il parenchima che le piccole vie aeree di diametro inferiore a 2 mm (Figura 1A) è stato utilizzato per l'isolamento di piccole cellule epiteliali delle vie aeree e alveolari (epitelio polmonare distale) e la generazione di piccole vie aeree o organoidi alveolari. Le vie aeree prossimali rivestite da un epitelio pseudostratificato includono abbondanti cellule progenitrici basali immunoreattive per la proteina di membrana NGFR (Figura 1B,C). Al contrario, le cellule epiteliali che rivestivano alveoli includevano un sottogruppo che mostrava immunoreattività della membrana apicale con l'anticorpo monoclonale HTII-280, suggestivo della loro identità alveolare di cellule di tipo 2 (AT2) (Figura 1B, D). Questi marcatori di superficie sono stati utilizzati per sottoimpostare sospensioni monocellulari di cellule epiteliali isolate da regioni prossimali o distali.
Dissociazione tissutale e frazionamento cellulare
Le sospensioni monocellulari di cellule totali sono state isolate da regioni prossimali o distali del tessuto polmonare umano e frazionate utilizzando sia perle magnetiche che FACS per produrre popolazioni di cellule epiteliali arricchite (Figura 2 e Figura 3). Abbondanti tipi di cellule contaminanti tra cui globuli rossi, cellule immunitarie e cellule endoteliali sono stati colorati utilizzando anticorpi contro CD235a, CD45 e CD31, rispettivamente, seguiti da smistamento cellulare associato magnetico per l'esaurimento di questi tipi di cellule dal pool totale di cellule polmonari. Le sospensioni cellulari "impoverite" risultanti sono state significativamente arricchite per le popolazioni di cellule epiteliali in campioni di tessuto sia distale (Figura 2E) che prossimale (Figura 3E), con corrispondente aumento dell'efficienza FACS. Dopo l'esaurimento delle cellule CD235a/CD45/CD31 positive utilizzando microsfere CD45 e CD31, la percentuale di CD31-/CD45-/CD235a- è aumentata dal 14% (Figura 2A,B) al 51,7% (Figura 2E,F) nella popolazione distale. L'ulteriore deplezione FACS delle cellule che si colorano positivamente per CD235a, CD45 o CD31, l'eliminazione delle cellule con colorazione positiva per DAPI e la selezione positiva per il marcatore di superficie cellulare epiteliale CD326, ha portato a una popolazione di cellule distali altamente arricchita che rappresentava il 33,5% (Figura 2E,G) rispetto al 7% (Figura 2A,C ) prima dell'esaurimento della popolazione negativa. Un'ulteriore sottoimpostazione delle popolazioni di cellule epiteliali distali è stata ottenuta mediante frazionamento basato sulla colorazione superficiale con l'anticorpo monoclonale HTII-280 (Figura 2D,H), rispettivamente. Di conseguenza, le cellule epiteliali polmonari distali includevano il 4,3% di HTII-280+ e il 2,6% di HTII-280- sottoinsiemi (Figura 2D senza esaurimento di CD31/CD45/CD235a) e del 30% di HTII-280+ e del 3,6% di HTII-280- (Figura 2H dopo l'esaurimento di CD31/CD45/CD235a).
Le cellule totali isolate dalla regione prossimale sono state impoverite per le cellule CD235a/CD45/CD31 positive utilizzando microsfere CD45 e CD31 e la percentuale di CD31-/CD45-/CD235a- è aumentata dal 17% (Figura 3A,B) al 56,6% (Figura 3E,F). La selezione positiva per il marcatore di superficie cellulare epiteliale CD326 in cellule isolate dalla regione prossimale, ha portato a una popolazione cellulare prossimale altamente arricchita che rappresentava il 38% (Figura 3E,G) delle frazioni cellulari polmonari totali rispetto al 9,3% (Figura 3A,C) senza esaurimento della popolazione negativa, rispettivamente. Un'ulteriore sottoimpostazione delle popolazioni di cellule epiteliali prossimali è stata ottenuta mediante frazionamento basato sulla colorazione superficiale con anticorpi contro NGFR (Figura 3D, H), rispettivamente. Di conseguenza, le cellule epiteliali polmonari prossimali includevano il 2,7% di NGFR+ e il 6,5% di sottoinsiemi di NGFR(Figura 3D senza esaurimento di CD31/CD45/CD235a) e il 13% erano NGFR+ e il 25% NGFR- (Figura 3H dopo esaurimento di CD31/CD45/CD235a).
Colture organoidi polmonari
Gli organoidi epiteliali polmonari distali sono stati coltivati all'interno della matrice della membrana basale impoverita dal fattore di crescita in mezzi che sono stati empiricamente testati per ottimizzare la crescita e la differenziazione degli organoidi. Sono stati valutati tre diversi mezzi, tra cui PneumaCult-ALI medium, small airway epithelial cell growth medium (SAECG medium) e mouse Basal medium. La crescita ottimale degli organoidi è stata ottenuta utilizzando il mezzo PneumaCult-ALI, che è stato selezionato per ulteriori studi. Le colture di cellule epiteliali polmonari distali HTII-280+ hanno prodotto organoidi in rapida espansione con un'efficienza media di formazione delle colonie del 10% (Figura 4A, B). La colorazione di immunofluorescenza di colture al giorno 30 utilizzando l'anticorpo monoclonale HTII-280 e SPC ha rivelato organoidi contenenti lumen composti prevalentemente da cellule epiteliali polmonari distali HTII-280+ e SPC+ (Figura 4C,C' e Figura 4D,D'). Le colture di cellule HTII-280- epiteliali polmonari distali hanno prodotto organoidi composti da un epitelio pseudostratificato simile a quello delle piccole vie aeree (non mostrato).
Gli organoidi epiteliali polmonari prossimali sono stati coltivati da cellule NGFR+ seminate in Matrigel e coltivate per 30 giorni in pneumaCult-ALI. Sono stati osservati grandi organoidi contenenti lumen (Figura 5D,E,F) con un'efficienza media di formazione delle colonie del 7,8% (Figura 5A,B,C). Gli organoidi erano composti da un epitelio pseudostratificato composto da cellule basali Krt5+ e NGFR+ auto-rinnovanti (Figura 5D, 5E) e tipi di cellule luminali differenziate tra cui cellule ciliate FoxJ1+ e cellule secretorie MUC5AC+ (Figura 5D,E).
Figura 1: Campionamento del tessuto polmonare umano. (A) Rappresentazione schematica del polmone umano che mostra la strategia per il campionamento delle regioni prossimali e distali per l'isolamento cellulare. (B) Colorazione H&E delle regioni prossimale e distale del polmone. (C,D) Colorazione immunofluorescente delle regioni corrispondenti che mostrano cellule progenitrici basali NGFR+ (rosse) sulla membrana basale delle vie aeree bronchiali e progenitori alveolari HTII-280+ di tipo II (verde) negli alveoli. barra della scala = 50 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Strategia di ordinamento rappresentativa per le cellule polmonari distali. (A,E) Percentuale di varie popolazioni cellulari prima e dopo l'esaurimento della popolazione CD45+ e CD31+ utilizzando perline magnetiche CD31 e CD45 nelle regioni distali del polmone da un campione biologico. (B,F) Immagine rappresentativa del grafico FACS che mostra la strategia di gating della popolazione distale CD31-/CD45-/CD235a- prima e dopo l'esaurimento della popolazione CD31/CD45/CD235a positiva (C,G) Popolazione Epcam+ prima e dopo l'esaurimento della popolazione CD31/CD45/CD235a positiva. (D,H) HTII-280+/- popolazione prima e dopo l'esaurimento delle cellule CD31/CD45/CD235a positive. I pannelli A-D provengono dallo stesso campione biologico e i pannelli E-H provengono dallo stesso campione biologico. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Strategia di ordinamento rappresentativa per le cellule polmonari prossimali. (A,E) Percentuale di varie popolazioni cellulari prima e dopo l'esaurimento della popolazione CD45+ e CD31+ utilizzando perline magnetiche CD31 e CD45 nelle regioni prossimali del polmone. (B,F) Immagine rappresentativa del grafico FACS che mostra la strategia di gating della popolazione prossimale CD31-/CD45-/CD235a- prima e dopo l'esaurimento della popolazione CD31/CD45/CD235a positiva (C,G) Popolazione Epcam+ prima e dopo l'esaurimento della popolazione CD31/CD45/CD235a positiva. (D,H) NGFR+/- popolazione prima e dopo l'esaurimento delle cellule CD31/CD45/CD235a positive. I pannelli A-D ed E-H sono stati preparati da due diversi campioni biologici. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Caratterizzazione di organoidi polmonari distali. (A) Immagine rappresentativa degli organoidi distali umani coltivati in mezzo PneumaCult-ALI (ingrandimento 2x). (B) L'efficienza di formazione delle colonie (%CFE) è stata calcolata su pozzetti triplicati di organoidi derivati da due diversi campioni biologici. (C, C') Colorazione immunofluorescente di corrispondenti organoidi distali coltivati in terreno ALI che mostrano cellule HTII-280+ AT2 (verde). (D, D') Il marcatore utilizzato per l'isolamento delle cellule AT2 in questo studio, le costaine HTII-280 (verde) per l'altro marcatore di cellule AT2 ben caratterizzato, SPC (rosso). Barra della scala = 50um. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Caratterizzazione di organoidi prossimali dal polmone prossimale umano. (A,B) Immagine rappresentativa degli organoidi prossimali umani coltivati in PneumaCult-ALI barra di media scala 50 μm. (C) La percentuale di efficienza di formazione delle colonie (%CFE) è stata calcolata su pozzetti triplicati di organoidi derivati da due diversi campioni biologici. Colorazione immunofluorescente di organoidi prossimali differenziati al giorno 30 con (D) cellule basali Krt5+ (verde), cellule ciliate FoxJ1+ (rosso) (E) cellule basali Krt5+ (verde) e cellule calici MUC5AC+ (rosso). (F) Il marcatore utilizzato per l'isolamento delle cellule basali in questo studio, co-macchie NGFR (verde) per il marcatore di cellule basali ben caratterizzato, Krt5 (rosso). Barra della scala = 50 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Descriviamo un metodo affidabile per l'isolamento di sottopopolazioni definite di cellule polmonari dal tessuto polmonare umano per l'analisi molecolare o funzionale e la modellazione della malattia. Gli elementi critici dei metodi includono la capacità di ottenere la dissociazione dei tessuti con la conservazione degli epitopi superficiali, che consentono l'arricchimento mediato da anticorpi di cellule appena isolate, e l'ottimizzazione dei metodi di coltura per la generazione efficiente di organoidi epiteliali specifici della regione. Ci concentriamo sul recupero e l'arricchimento di cellule progenitrici epiteliali in grado di formare organoidi quando ricombinate con cellule di supporto stromale in coltura tridimensionale. Anche se non abbiamo definito la clonalità degli organoidi in queste colture, studi simili condotti utilizzando cellule progenitrici epiteliali polmonari di topo isolate hanno dimostrato di essere clonalmente basate sull'uso di colture miste di cellule che ospitano distinti reporter fluorescenti22,23.
I metodi descritti nel presente documento includono adattamenti destinati a migliorare il recupero cellulare dal tessuto polmonare digerito. I campioni digeriti vengono fatti passare attraverso un ago calibro 16 per interrompere ulteriormente eventuali grumi non digeriti rimanenti e per ottenere una sospensione cellulare omogenea. L'aggregazione cellulare causata dal DNA genomico estruso è stata mitigata con l'aggiunta di DNasi I, che ha prodotto una preparazione cellulare omogenea che fornisce un flusso fluidico ininterrotto durante l'isolamento FACS. Insieme, queste semplici modifiche migliorano il recupero delle popolazioni di cellule bersaglio ed evitano ritardi dovuti all'aggregazione durante l'arricchimento FACS.
I protocolli precedenti richiedono la digestione dei tessuti con Elastasi, dispasi e tripsina/2 mM EDTA per produrre una sospensione monocellulare prima dell'isolamento cellulare 4,5. Tuttavia, questa combinazione di proteasi porta alla perdita di proteine di superficie e richiede che le cellule vengano coltivate durante la notte su piatti di coltura rivestiti di purcol per la riespressione delle proteine di superficie prima della colorazione degli anticorpi e del FACS. Al contrario, la combinazione di Liberase e agitazione meccanica per interrompere delicatamente il tessuto polmonare fornisce un protocollo di dissociazione più efficiente, ma più mite, che può essere eseguito più rapidamente preservando gli epitopi superficiali per la colorazione degli anticorpi e l'arricchimento FACS. In questo modo il tempo totale di lavorazione dei tessuti viene condensato e l'isolamento FACS può essere eseguito immediatamente dopo la dissociazione dei tessuti.
Questi metodi consentono l'isolamento e la coltura in vitro di cellule progenitrici epiteliali che producono progenie specializzata rappresentativa della loro regione di origine. Tuttavia, questi metodi possono essere applicati in modo simile all'identificazione e all'arricchimento di altre popolazioni cellulari come i tipi di cellule immunitarie, vascolari e stromali. Ciò potrebbe essere particolarmente applicabile allo sviluppo di sistemi regionali di epitelio-on-chip polmonare che consentono la modellazione di compartimenti vascolari ed epiteliali e l'introduzione di altri tipi di cellule come le cellule immunitarie 24,25,26. In un recente studio, abbiamo utilizzato colture organoidi 3D di epitelio alveolare generate utilizzando questa metodologia sono state utilizzate come strumento per studiare la modellazione COVID 19 del polmone e per lo screening di bersagli terapeutici contro l'infezione da SARS-CoV-2. 27 anni
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Apprezziamo il supporto di Mizuno Takako per la colorazione IFC e H ed E, Vanessa Garcia per il sezionamento dei tessuti e Anika S Chandrasekaran per l'aiuto nella preparazione del manoscritto. Questo lavoro è supportato dal National Institutes of Health (5RO1HL135163-04, PO1HL108793-08) e dal Celgene IDEAL Consortium.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell Isolation | |||
| 10 mL Sterile syringes, Luer-Lok Tip | Fisher scientific | BD 309646 | |
| 30 mL Sterile syringes, Luer-Lok Tip | VWR | BD302832 | |
| Biohazard bags | VWR | 89495-440 | |
| Biohazard bags | VWR | 89495-440 | |
| connecting ring | Pluriselect | 41-50000-03 | |
| Deoxyribonuclease (lot#SLBF7798V) | sigma Aldrich | DN25-1G | |
| Disposable Petri dishes | Corning/Falcon | 25373-187 | |
| Funnel | Pluriselect | 42-50000 | |
| HBSS | Corning | 21-023 | |
| Liberase TM Research Grade | sigma Aldrich | 5401127001 | |
| needle 16G | VWR | 305198 | |
| needle 18G | VWR | 305199 | |
| PluriStrainer 100 µm (Cell Strainer) | Pluriselect | 43-50100-51 | |
| PluriStrainer 300 µm (Cell Strainer) | Pluriselect | 43-50300-03 | |
| PluriStrainer 40 µm (Cell Strainer) | Pluriselect | 43-50040-51 | |
| PluriStrainer 500 µm (Cell Strainer) | Pluriselect | 43-50500-03 | |
| PluriStrainer 70 µm (Cell Strainer) | Pluriselect | 43-50070-51 | |
| Razor blades | VWR | 55411-050 | |
| Red Blood Cell lysis buffer | eBioscience | 00-4333-57 | |
| Equipment’s | |||
| GentleMACS C Tubes | MACS Miltenyi Biotec | 130-096-334 | |
| GentleMACS Octo Dissociator | MACS Miltenyi Biotec | 130-095-937 | |
| Leica ASP 300s Tissue processor | |||
| LS Columns | MACS Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| MACS MultiStand** | Miltenyi Biotech | 130-042-303 | |
| Thermomixer | Eppendorf | 05-412-503 | |
| Thermomixer | Eppendorf | 05-412-503 | |
| HBSS+ Buffer | |||
| Amphotericin B | Thermo fisher scientific | 15290018 | 2ml |
| EDTA (0.5 M), pH 8.0, RNase-free | Thermo fisher scientific | AM9260G | 500µl |
| Fetal Bovine Serum | Gemini Bio-Products | 100-106 | 10ml |
| HBSS Hank's Balanced Salt Solution 1X 500 ml | VWR | 45000-456 | 500ml bottle |
| HEPES (1 M) | Thermo fisher scientific | 15630080 | 5ml |
| Penicillin-Streptomycin-Neomycin (PSN) Antibiotic Mixture | Thermo fisher scientific | 15640055 | 5ml |
| List of antibodies for FACS | |||
| Alexa Fluor 647 anti-human CD326 (EpCAM) Antibody | BioLegend | 369820 | 1:50 |
| BD CompBead Anti-Mouse Ig, K/ Negative control particles set | Fisher Scientific | BDB552843 | |
| CD31 MicroBead Kit, human | Miltenyi Biotec | 130-091-935 | 20µl/ 107 total cells |
| CD45 MicroBeads, human | Miltenyi Biotec | 130-045-801 | 20µl/ 107 total cells |
| DAPI | Sigma Aldrich | D9542-10MG | 1:10000 |
| FITC anti-human CD235a | BioLegend | 349104 | 1:100 |
| FITC anti-human CD31 | BioLegend | 303104 | 1:100 |
| FITC anti-human CD45 | BioLegend | 304054 | 1:100 |
| FITC anti-mouse IgM Antibody | BioLegend | 406506 | 1:500 |
| Mouse IgM anti human HT2-280 | Terrace Biotech | TB-27AHT2-280 | 1:300 |
| PE anti-human CD271(NGFR) | BioLegend | 345106 | 1:50 |
| Composition of Organoid Culture mediums | |||
| MRC-5 | ATCC | CCL-171 | |
| PneumaCult -ALI Medium | Stemcell Technologies | 5001 | |
| Small Airway Epithelial Cell Growth Medium | PromoCell | C-21170 | |
| ThinCert Tissue Culture Inserts, Sterile | Greiner Bio-One | 662641 | |
| Y-27632 (ROCK inhibitor) 100mM stock (1000x) | Stemcell Technologies | 72302 | |
| Mouse Basal medium: | |||
| Amphotericin B | Thermo fisher scientific | 15290018 | 50 µl |
| DMEM/F-12, HEPES | ThermoFisher scientific | 11330032 | 50 ml |
| Fetal Bovine Serum | Gemini Bio-Products | 100-106 | 5 ml |
| Insulin-Transferrin-Selenium (ITS -G) (100X) | ThermoFisher scientific | 41400045 | 500 µl |
| Penicillin-Streptomycin-Neomycin (PSN) Antibiotic Mixture | Thermo fisher scientific | 15640055 | 500 µl |
| SB431542 TGF-β pathway inhibitor (stock 100 mM) | Stem cell | 72234 | 5 µl |
| List of antibodies for Immunohistochemistry | |||
| Antigen unmasking solution, citric acid based | Vector | H-3300 | 937 µl in 100ml water |
| Histogel | Thermo Scientific | HG-4000-012 | |
| Primary Antibodies | |||
| Anti HT2-280 | Terracebiotech | TB-27AHT2-280 | 1:500 |
| FOXJ1 Monoclonal Antibody (2A5) | Thermo Fisher Scientific | 14-9965-82 | 1:300 |
| Human Uteroglobin/SCGB1A1 Antibody | R and D systems | MAB4218 | 1:300 |
| Keratin 5 Polyclonal Chicken Antibody, Purified [Poly9059] | Biolegend | 905901 | 1:500 |
| MUC5AC Monoclonal Antibody (45M1) | Thermo Fisher Scientific | MA5-12178 | 1:300 |
| PDPN / Podoplanin Antibody (clone 8.1.1) | LifeSpan Biosciences | LS-C143022-100 | 1:300 |
| Purified Mouse Anti-E-Cadherin | BD biosciences | 610182 | 1:1000 |
| Sox-2 Antibody | Santa Cruz biotechnologies | sc-365964 | 1:300 |
| Secondary Antibodies | |||
| Donkey anti-rabbit lgG, 488 | Thermo Fisher Scientific | A-21206 | 1:500 |
| FITC anti-mouse IgM Antibody | BioLegend | 406506 | 1:500 |
| Goat anti-Hamster IgG (H+L), Alexa Fluor 594 | Thermo Fisher Scientific | A-21113 | 1:500 |
| Goat anti-Mouse IgG1 Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-21121 | 1:500 |
| Goat anti-Mouse IgG2a Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-21131 | 1:500 |
| Goat anti-Mouse IgG2a Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A-21134 | 1:500 |
| Goat anti-Mouse IgG2b Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A-21144 | 1:500 |
| Buffers | |||
| Immunohistochemistry Blocking Solution | 3% BSA, o.4% Triton-x100 in TBS (Tris based saline) | ||
| Immunohistochemistry Incubation Solution | 3% BSA, ).1% Triton-X100 in TBS | ||
| Immunohistochemistry Washing Solution | TBS with 0.1% Tween 20 |
References
- Rackley, C. R., Stripp, B. R. Building and maintaining the epithelium of the lung. Journal of Clinical Investigation. 122 (8), 2724-2730 (2012).
- Montoro, D. T., et al. A revised airway epithelial hierarchy includes CFTR-expressing ionocytes. Nature. 560 (7718), 319-324 (2018).
- Plasschaert, L. W., et al. A single-cell atlas of the airway epithelium reveals the CFTR-rich pulmonary ionocyte. Nature. 560 (7718), 377-381 (2018).
- Barkauskas, C. E., et al. Type 2 alveolar cells are stem cells in adult lung. Journal of Clinical Investigation. 123 (7), 3025-3036 (2013).
- Barkauskas, C. E., et al. Lung organoids: current uses and future promise. Development. 144 (6), 986-997 (2017).
- Leeman, K. T., Fillmore, C. M., Kim, C. F. Lung Stem and Progenitor Cells in Tissue Homeostasis and Disease. Stem Cells in Development and Disease. 107, 207-233 (2014).
- Rawlins, E. L., et al. The Role of Scgb1a1(+) Clara Cells in the Long-Term Maintenance and Repair of Lung Airway but Not Alveolar, Epithelium. Cell Stem Cell. 4 (6), 525-534 (2009).
- Rock, J. R., et al. Basal cells as stem cells of the mouse trachea and human airway epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (31), 12771-12775 (2009).
- Chang, W. I., et al. Bmp4 is essential for the formation of the vestibular apparatus that detects angular head movements. Plos Genetics. 4 (4), 1000050 (2008).
- McQualter, J. L., Bertoncello, I. Concise Review: Deconstructing the Lung to Reveal Its Regenerative Potential. Stem Cells. 30 (5), 811-816 (2012).
- Gonzalez, R. F., Allen, L., Gonzales, L., Ballard, P. L., Dobbs, L. G. HTII-280, a Biomarker Specific to the Apical Plasma Membrane of Human Lung Alveolar Type II Cells. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 58 (10), 891-901 (2010).
- Rock, J. R., et al. Notch-Dependent Differentiation of Adult Airway Basal Stem Cells. Cell Stem Cell. 8 (6), 639-648 (2011).
- Page, H., Flood, P., Reynaud, E. G. Three-dimensional tissue cultures: current trends and beyond. Cell and Tissue Research. 352 (1), 123-131 (2013).
- Hynds, R. E., Giangreco, A. Concise Review: The Relevance of Human Stem Cell-Derived Organoid Models for Epithelial Translational Medicine. Stem Cells. 31 (3), 417-422 (2013).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), (2014).
- Weber, C. Organoids test drug response. Nature Cell Biology. 20 (6), 634 (2018).
- Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. Organoids as an in vitro model of human development and disease. Nature Cell Biology. 18 (3), 246-254 (2016).
- Nikolic, M. Z., Rawlins, E. L. Lung Organoids and Their Use To Study Cell-Cell Interaction. Current Pathobiology Reports. 5 (2), 223-231 (2017).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Reynolds, B. A., Rietze, R. L. Neural stem cells and neurospheres--re-evaluating the relationship. Nature Methods. 2 (5), 333-336 (2005).
- Chua, C. W., et al. Single luminal epithelial progenitors can generate prostate organoids in culture. Nature Cell Biology. 16 (10), 951-961 (2014).
- Teisanu, R. M., et al. Functional analysis of two distinct bronchiolar progenitors during lung injury and repair. American Journal of Respiratory and Cellular Molecular Biology. 44 (6), 794-803 (2011).
- Chen, H., et al. Airway epithelial progenitors are region specific and show differential responses to bleomycin-induced lung injury. Stem Cells. 30 (9), 1948-1960 (2012).
- Benam, K. H., et al. Small airway-on-a-chip enables analysis of human lung inflammation and drug responses in vitro. Nature Methods. 13 (2), 151-157 (2016).
- Huh, D., et al. Reconstituting organ-level lung functions on a chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).
- Jain, A., et al. Primary Human Lung Alveolus-on-a-chip Model of Intravascular Thrombosis for Assessment of Therapeutics. Clinical Pharmacology & Therapeutics. 103 (2), 332-340 (2018).
- Mulay, A., et al. SARS-CoV-2 infection of primary human lung epithelium for COVID-19 modeling and drug discovery. bioRxiv. , (2020).
