Summary
Denne artikkelen gir en detaljert metodikk for vevsdissosiasjon og cellulære fraksjoneringsmetoder som tillater anrikning av levedyktige epitelceller fra proksimale og distale regioner i den humane lungen. Her brukes disse tilnærmingene for funksjonell analyse av lungeepiteliale stamceller ved bruk av 3D-organoidkulturmodeller.
Abstract
Epitelorganoidmodeller tjener som verdifulle verktøy for å studere den grunnleggende biologien til et organsystem og for sykdomsmodellering. Når de vokser som organoider, kan epiteliale stamceller selvfornye og generere differensierende avkom som utviser cellulære funksjoner som ligner på deres in vivo-kolleger . Her beskriver vi en trinnvis protokoll for å isolere regionspesifikke forfedre fra menneskelig lunge og generere 3D-organoidkulturer som et eksperimentelt og valideringsverktøy. Vi definerer proksimale og distale regioner i lungen med mål om å isolere regionspesifikke stamceller. Vi benyttet en kombinasjon av enzymatisk og mekanisk dissosiasjon for å isolere totalceller fra lunge og luftrør. Spesifikke stamceller ble deretter fraksjonert fra proksimale eller distale opprinnelsesceller ved bruk av fluorescensassosiert cellesortering (FACS) basert på celletypespesifikke overflatemarkører, for eksempel NGFR for sortering av basalceller og HTII-280 for sortering av alveolære type II-celler. Isolerte basale eller alveolære type II-forfedre ble brukt til å generere 3D-organoidkulturer. Både distale og proksimale stamceller dannet organoider med en kolonidannende virkningsgrad på 9-13 % i distale regioner og 7-10 % i proksimal region når de ble belagt med 5000 celler/brønner på dag 30. Distale organoider opprettholdt HTII-280+ alveolære type II-celler i kultur, mens proksimale organoider differensierte til cilierte og sekretoriske celler innen dag 30. Disse 3D-organoidkulturene kan brukes som et eksperimentelt verktøy for å studere cellebiologien til lungeepitel og epiteliale mesenkymale interaksjoner, samt for utvikling og validering av terapeutiske strategier rettet mot epiteldysfunksjon i en sykdom.
Introduction
Luftrom i det humane luftveiene kan grovt deles inn i ledende og respiratoriske soner som formidler transport av gasser og deres påfølgende utveksling over henholdsvis epitel-mikrovaskulær barriere. De ledende luftveiene inkluderer luftrør, bronkier, bronkioler og terminale bronkioler, mens respiratoriske luftrom inkluderer respiratoriske bronkioler, alveolære kanaler og alveoler. Epitelforingen av disse luftrommene endres i sammensetningen langs proximo-distalaksen for å imøtekomme de unike kravene til hver funksjonelt distinkte sone. Det pseudostratifiserte epitelet i trakeo-bronkiale luftveier består av tre hovedcelletyper, basal, sekretorisk og ciliert, i tillegg til de mindre tallrike celletypene, inkludert børste, nevroendokrin og ionocyt 1,2,3. Bronkiolære luftveier har morfologisk lignende epitelcelletyper, selv om det er forskjeller i deres overflod og funksjonelle egenskaper. For eksempel er basalceller mindre rikelig i bronkiolære luftveier, og sekretoriske celler inkluderer en større andel klubbceller versus serøse og begerceller som dominerer i trakeo-bronkiale luftveier. Epitelceller i respiratorisk sone inkluderer en dårlig definert kuboidal celletype i respiratoriske bronkioler, i tillegg til alveolære type I (ATI) og type II (ATII) celler av alveolære kanaler og alveoler 1,4.
Identiteten til epitelstamme og stamcelletyper som bidrar til vedlikehold og fornyelse av epitel i hver sone er ufullstendig beskrevet og i stor grad utledet fra studier i dyremodeller 5,6,7,8. Studier på mus har vist at enten basalceller i pseudostratifiserte luftveier, eller klubbceller i bronkiolære luftveier eller ATII-celler i det alveolære epitelepitelet, tjener som epitelstamceller basert på kapasitet for ubegrenset selvfornyelse og multipotent differensiering 7,9,10,11,12 . Til tross for manglende evne til å utføre genetiske avstamningssporingsstudier for å vurdere stamme av humane lungeepitelcelletyper, gir tilgjengeligheten av organoidbaserte kulturmodeller for å vurdere det funksjonelle potensialet til epitelstamme- og stamceller et verktøy for komparative studier mellom mus og menneske 13,14,15,16,17.
Vi beskriver metoder for isolering av epitelcelletyper fra forskjellige regioner i den menneskelige lungen og deres kultur ved hjelp av et 3D-organoid system for å rekapitulere de regionale celletypene. Lignende metoder er utviklet for funksjonsanalyse og sykdomsmodellering av epitelceller fra andre organsystemer 18,19,20,21. Disse metodene gir en plattform for identifisering av regionale epiteliale stamceller, for å utføre mekanistiske studier som undersøker regulering og mikromiljø, og for å muliggjøre sykdomsmodellering og narkotikaforskning. Selv om studier av lungeepiteliale stamceller utført i dyremodeller kan dra nytte av analysen, enten in vivo eller in vitro, har innsikt i identiteten til humane lungeepitelceller i stor grad vært avhengig av ekstrapolering fra modellorganismer. Som sådan gir disse metodene en bro for å forholde seg til identiteten og oppførselen til humane lungeepitelcelletyper med sine studier som undersøker regulering av stamceller / stamceller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Humant lungevev ble innhentet fra avdøde vevsdonorer i samsvar med samtykkeprosedyrer utviklet av International Institute for the Advancement of Medicine (IIAM) og godkjent av Cedars-Sinai Medical Center Internal Review Board.
1. Vevsbehandling for isolering av lungeceller fra enten trakeo-bronkiale eller små luftveier / parenkymale (små luftveier og alveoler) regioner
- Forbered og autoklaver alle disseksjonsinstrumenter, glassvarer og passende løsninger en dag før celleisolering.
- Ved mottak av lungevev, identifiser og separer de proksimale og distale områdene. Luftrøret og bronkiene betraktes som "proksimale". I forbindelse med denne protokollen blir luftrøret og de første 2-3 generasjonene bronkier disectedert og brukt til isolering av "proksimalt" luftveisepitel. Små luftveier på 2 mm eller mindre i diameter og omkringliggende parenkymalt vev regnes i denne protokollen som "distalt" lungeepitel (figur 1A).
MERK: Alle prosedyrer som involverer behandling av humant lungevev skal utføres i et biosikkerhetsskap med bruk av egnet personlig verneutstyr.
2. Anrikning og subsetting av små luftveier og alveolære epiteliale stamceller fra distalt lungevev
- Distalt vev forberedelse
- Plasser det distale lungevevet i en steril petriskål (150 x 15 mm). Terningvev i ca 1 cm3 stykker og legg i et rent 50 ml rør.
- Vask vevet 3x med kjølt HBSS, kast HBSS vask hver gang for å fjerne blod og epitelforingsvæske.
- Legg vevet i en ny petriskål og tørk med sterile våtservietter mot lo. Bruk tang og saks, fjern så mye visceral pleura (en delikat gjennomsiktig membran som dekker overflaten av lungen) som mulig.
- Bruk saks til å hakke vev i biter med ca. 2 mm diameter. Overfør hakket vev til en ren petriskål og hakk videre ved å hakke den til en omtrentlig størrelse på 1 mm med et sterilt ensidig barberblad.
- Enzym fordøyelse
MERK: Liberase stamløsning er 5 mg/ml (100x) og DNase lager er 2,5 mg/ml (100x) (materialtabell).- Tilsett 50 mikrogram / ml Liberase og 25 mikrogram / ml DNase i steril HBSS i et 50 ml konisk rør.
- Overfør ca. 2-3 g hakket vev til et nytt 50 ml konisk rør med 25 ml HBSS, inneholdende Liberase og DNase. Rug i 40-60 min ved 37 °C med kontinuerlig risting ved hjelp av en mikser satt til 900 o/min. Etter 30 minutters inkubasjon triturerer triturat fordøyd vev ved hjelp av en 30 ml sprøyte uten nål for å unngå dannelse av klumper og fortsette med inkubasjonen.
MERK: Inkubasjonstid med enzymer kan variere avhengig av type eller tilstand av vevet. For eksempel tar enzymatisk fordøyelse av normalt vev omtrent 45 minutter. Imidlertid kan fibrotisk vev fra idiopatisk lungefibrose prøver krever en lengre inkubasjonstid på opptil 60 min. Overvåk derfor vevet nøye under dette trinnet for å forhindre skade på overflatemarkørene, noe som er avgjørende for FACS.
- Enkeltcellet isolasjon
- Triturer vevet ved å trekke 5x gjennom en 16 G kanyle montert på en 30 ml sprøyte. Trekk vevssuspensjonen inn i en bredborende pipette og pass gjennom en serie cellesiler (500 μm, 300 μm, 100 μm, 70 μm, 40 μm) under vakuumtrykk. Vask silen med 20 ml HBSS+-buffer for å samle opp gjenværende celler. Oppskriften på HBSS + buffer finner du i Materialtabell.
- Legg til et likt volum HBSS + buffer, etter 45 minutter til filtratet for å hemme Liberase-aktivitet og forhindre overfordøyelse.
- Sentrifugefiltrater ved 500 x g i 5 minutter ved 4 °C. Fjern og kast supernatanten forsiktig. Tilsett 1 ml røde blodlegemer (RBC) lysisbuffer til pelleten, vugg forsiktig røret for å løsne pelleten og inkubere på is i 1 min.
MERK: Mengden og tiden i RBC-lysisløsningen avhenger av størrelsen på pelleten. Det er viktig å opprettholde cellene på is og overvåke tiden i RBC lysis løsning nøye for å forhindre lysis av målceller. Hvis RBC-lysis ikke er tilstrekkelig, gjenta trinnet. - Tilsett 10-20 ml HBSS+ buffer for å nøytralisere RBC lysisbuffer. Sentrifugefiltrater ved 500 x g i 5 minutter ved 4 °C.
- Hvis lysede røde blodlegemer (spøkelsesceller) danner et uklar lag over cellepelleten, resuspenderer pellet i 10 ml HBSS + buffer og spenne suspensjonen gjennom 70 μm celle sil for å eliminere spøkelsescellene. Sentrifuger filtratet ved 500 x g i 5 minutter ved 4 °C og fortsett med ytterligere trinn.
- Uttømming av immunceller og endotelcelle (valgfritt trinn)
- Tøm CD31+ endotelceller og CD45+ -immunceller fra bassenget av totale celler ved hjelp av CD31 &CD45 mikroperler konjugert til monoklonale anti-humane CD31- og CD45-antistoffer (isotypemus IgG1) og LS-kolonner i samsvar med produsentens protokoll (Materialtabell).
- Samle gjennomstrømningen, som hovedsakelig består av epitel- og stromale celler, i et friskt sterilt rør og sentrifuger det ved 500 x g i 5 minutter ved 4 ° C. Utfør en celletelling for å fastslå det totale antallet celler i gjennomstrømningen.
- Celleoverflatefarging for fluorescensassosiert cellesortering (FACS)
- Resuspend 1 x 107 celler per 1 ml HBSS + buffer. Tilsett primære antistoffer ved ønsket konsentrasjon og inkuber cellene i 30 minutter ved 4 °C i mørket. I denne studien ble fluoroforkonjugerte primære antistoffer brukt med mindre annet er angitt. Detaljer om antistoffkilder og titere er beskrevet i materialtabellen.
MERK: HTII-280 er for tiden det beste overflatereaktive antistoffet som tillater subsetting av distale lungeceller i overveiende luftveier (HTII-280-) og alveolære type 2 (HTII-280 +) cellefraksjoner. En advarsel til denne strategien er at AT1-celler ikke er farget ved hjelp av denne metoden og er dårlig representert på grunn av deres skjøthet. Imidlertid er AT1-celler dårlig representert i distale lungepreps, antagelig på grunn av deres skjøthet og tap under valg av levedyktige celler av FACS og representerer dermed bare en sjelden forurensning av luftveiscellefraksjonen. - Vask celler ved å tilsette 3 ml HBSS+-buffer og sentrifuge ved 500 x g i 5 minutter ved 4 °C.
- Ved bruk av ukonjugerte primære antistoffer, tilsett nødvendig konsentrasjon av et egnet fluoroforkonjugert sekundært antistoff og inkuber i 30 minutter på is. Vask av overflødig sekundært antistoff ved å tilsette 3 ml HBSS+ buffer og sentrifuge ved 500 x g i 5 minutter ved 4 °C.
- Kast supernatant- og resuspendcellene i HBSS+-buffer per 1 x 107 celler/ml. Filtrer celler i 5 ml polystyrenrør gjennom en silhette for å sikre dannelse av en enkeltcellesuspensjon. Tilsett DAPI (1 μg/ml) for å farge permeable (døde) celler.
MERK: Det er viktig å bruke passende enfarget og fluorescens minus en (FMO) kontroller (dvs. antistofffarging cocktail minus ett antistoff hver), for å minimere falske positiver under FACS. I denne studien ble positive og negative seleksjonsperler brukt som empirisk kompensasjon for overlapping av utslippsspektra mellom fluoroforer (Materialtabell). FACS beriker celletyper av interesse. Levedyktige epitelceller berikes basert på deres CD45-negative, CD31-negative, CD236-positive celleoverflatefenotype og negativ farging for DAPI. Denne epitelcellefraksjonen kan videre subsetteres basert på farging for celletypespesifikke overflatemarkører, for eksempel spesifikk farging for HTII-280-positive celler som er beriket for AT2-celler. I motsetning til dette tillater negativt utvalg for HTII-280 anrikning av små luftveisepitelceller som klubbe og cilierte celler (figur 2).
- Resuspend 1 x 107 celler per 1 ml HBSS + buffer. Tilsett primære antistoffer ved ønsket konsentrasjon og inkuber cellene i 30 minutter ved 4 °C i mørket. I denne studien ble fluoroforkonjugerte primære antistoffer brukt med mindre annet er angitt. Detaljer om antistoffkilder og titere er beskrevet i materialtabellen.
3. Anrikning og subsetting av epiteliale stamceller fra trakeo-bronkiale luftveier
- Forberedelse av vev
- Dissekere ut proksimale luftveier (luftrør/bronkier) fra lungene. Åpne luftveiene langs lengden ved hjelp av saks for å eksponere lumen og tilsett 50 μg / ml Liberase for å dekke vevet helt.
- Rug i 20 minutter ved 37 °C med kontinuerlig risting ved hjelp av en termoblander satt til 900 o/min.
- Fjern den proksimale luftveien fra sentrifugerøret og legg den i en steril petriskål (150 x 15 mm). Skrap forsiktig overflaten av luftveien ved hjelp av en skalpell for å fjerne luminale epitelceller helt fra vevet.
- Vask petriskålen med 5 ml steril HBSS+-buffer for å samle opp alle løsrivede luminale epitelceller og overfør de løsnede cellene til 50 ml konisk sentrifugerør. Triturer suspensjonen ved å trekke 5x til 16 G kanyl og 18 G kanyl montert på en 10 ml sprøyte for å få encellet suspensjon.
- Sentrifuger suspensjonen ved 500 x g i 5 minutter ved 4 °C. Resuspender pelleten i fersk HBSS+-buffer og lagre disse luminale luftveiscellene på is, klare til å kombineres med encellesuspensjonen som genereres fra de hakkede proksimale luftveiene i de kommende trinnene.
- Bruk saks, kutt gjenværende trakeo-bronkialt vev langs ringene for å generere små strimler av vev, og overfør strimlene til en fersk petriskål. Hakk vevsstrimlene ved hjelp av et ensidig barberblad for å lage mindre biter.
MERK: Siden de proksimale luftveiene er brusk, kan de ikke hakkes så fint som det distale lungevevvet. - Overfør hakket vev inn i C-rørene, tilsett 2 ml Liberase til røret slik at vevet er nedsenket. Last C-røret på den automatiserte dissosiatoren og kjør Human Lung Protocol-2 for å mekanisk dissosiere vev ytterligere.
MERK: Dissosiatoren som brukes i denne protokollen tilbyr et optimalisert program kalt human lung protocol-2 for denne spesifikke applikasjonen (se Materialtabell).
- Enzymfordøyelse og enkeltcelleisolasjon
- Overfør ca. 2 g hakket proksimalt vev fra C-røret til hvert 50 ml konisk sentrifugerør og tilsett 50 μg / ml Liberase og 25 μg / ml DNase-oppløsning til hvert rør.
MERK: For å sikre effektiv dissosiasjon, bør rør ikke fylles utover 30 ml-merket. - Inkuber det hakkede vevet i 45 minutter ved 37 °C med kontinuerlig risting ved hjelp av en mikser satt til 900 o/min.
- Pass den dissosierte vevssuspensjonen gjennom en serie cellesiler (500 μm, 300 μm, 100 μm, 70 μm, 40 μm) under vakuumtrykk som nevnt ovenfor og samle strømmen gjennom. Vask silen med 20 ml HBSS+-buffer for å samle opp gjenværende celler.
MERK: Siden proksimalt vev er brusk og klumpete sammenlignet med det distale vevet, er det større mulighet for tilstopping av filtrene. Ved hjelp av en trakt kan bidra til å forhindre overløp av væsken mens du passerer gjennom silene. - Legg til et likt volum HBSS + buffer til filtratet for å hemme Liberase-aktivitet og forhindre overfordøyelse. Legg de isolerte luminale proksimale luftveiscellene fra 3,1,5 til cellesuspensjonen på dette trinnet.
- Sentrifuger den kombinerte cellesuspensjonen ved 500 x g i 10 minutter. Fjern supernatanten og gjenta cellevasken i HBSS+-buffer. Utfør uttømming av CD45+ immunceller og CD31+ endotelceller som nevnt ovenfor i 2.4 (valgfritt trinn).
- Metoder for farging ligner distalt lungevev, følg trinnene i 2,5. Berik levedyktige epitelceller basert på deres CD45-negative, CD31-negative, CD236-positive celleoverflatefenotype og negativ farging for DAPI.
- Videre submengderer epitelcellefraksjonen basert på farging for celletypespesifikke overflatemarkører, som NGFR, som tillater anrikning av basale (NGFR-positive) og ikke-basale (NGFR-negative; sekretoriske, cilierte, nevroendokrine) celletyper (figur 3).
- Overfør ca. 2 g hakket proksimalt vev fra C-røret til hvert 50 ml konisk sentrifugerør og tilsett 50 μg / ml Liberase og 25 μg / ml DNase-oppløsning til hvert rør.
4. Organoid kultur
- Tilsett 5000 (dette tallet kan justeres for å gi ønsket tetthet av epitelorganoider) sorterte proksimale eller distale epitelceller til sterile 1,5 ml rør sammen med 7,5 x 104 MRC-5 celler (human lungefibroblastcellelinje). Epitel-mesenkymale interaksjoner er kritiske for utvidelse av stamceller.
- Sentrifuge ved 500 x g i 5 min ved 4 °C.
MERK: Det er viktig å manuelt bekrefte celletallet oppnådd fra sorteringsmaskinen for å sikre nøyaktighet organoidkoloniformingseffektivitet. - Fjern og kast supernatanten forsiktig og resuspender cellepelleten i 50 μL iskalde medier supplert med antibiotika. Hold celleopphenget på is.
- Tilsett 50 μL iskald 1x vekstfaktor utarmet kjellermembranmatrisemedium til hetteglasset og pipetter suspensjonen forsiktig på is for å blande.
MERK: Det er viktig å bruke iskalde medier og vedlikeholde celler på is for å unngå for tidlig polymerisering av kjellermembranmatrisemediet. - Overfør cellesuspensjonen til 0,4 μm porestørrelse cellekulturinnsats i en 24 brønnplate (1,4 x 104 celler / cm2), pass på å unngå innføring av luftbobler.
- Inkuber ved 37 °C i 30-45 min for å la matrisen størkne.
- Tilsett 600 μL forvarmet vekstmedium til brønnen.
MERK: Media ble supplert med antimykotiske midler (0,4%) og Pen strep (1%) de første 24 timene etter såing og 10 μM Rho kinasehemmer for de første 72 timene. - Dyrk ved 37 °C i en 5 % CO2-inkubator i 30 dager, og i løpet av denne tiden bør mediet skiftes hver 48. time.
MERK: Kulturvarigheten kan endres basert på formålet med eksperimentet. Lengre endepunkter brukes til å studere differensiering, mens kortere endepunkter på 7 dager, 14 dager osv. kan brukes hvis formålet med eksperimentet ikke er å oppnå fullstendig differensiering. - Tilsett 10 μM TGFβ-hemmer til kulturmediet i 15 dager for å opprettholde cellene i den proliferative fasen og undertrykke overvekst av fibroblaster.
MERK: Resultatene varierer i henhold til kulturmediet som brukes til analysen. For eksempel ble resultatene vist her generert ved bruk av Pneumacult-ALI Medium, noe som resulterer i generering av store organoider fra distale lunger, godt differensierte og større organoider fra proksimal lunge.
5. Organoid farging
- Festing og innebygging av organoider
- Aspirer media fra både øvre og nedre transmembraninnsatskamre og skyll en gang med varm PBS.
- Fiks kulturene ved å plassere 300 μL PFA (2 % w/v) i innsatsen og 500 μL i brønnen i 1 time ved 37 °C. Fjern fikseringsmiddel og skyll med varm PBS, pass på at du ikke løsner basememtmembranmatrisepluggen.
MERK: Faste organoider kan lagres nedsenket i PBS ved 4 ° C i en til to uker før du starter ytterligere trinn. - Aspirer PBS, snu innsatsen og kutt forsiktig innsatsmembranen rundt periferien. Bruk tang, fjern transwell membran, pass på at du ikke forstyrrer matrikspluggen.
- Trykk på innsatsen i en petriskål for å gjenopprette matrikspluggen.
- Tilsett en dråpe prøvebehandlingsgel som Histogel (opprettholdt ved 37 °C) i matrikspluggen og hold den ved 4 °C til gelen stivner.
- Overfør pluggen til en innebygd kassett, dehydrer gjennom økende konsentrasjoner av etanol (70, 90 og 100%), klar i xylen og innebygd i parafinvoks.
- Klipp 7 μm seksjoner på en mikrotom og samle på positivt ladede lysbilder.
- Immunfluorescensfarging av organoider
- Plasser lysbilder ved 65 °C i 30 minutter for å avvokse.
- Deparaffiniserer seksjonene ved nedsenking i xylen og rehydrerer gjennom reduserte konsentrasjoner av etanol.
- Utfør høytemperatur antigenuthenting i antigenmaskeringsløsning, sitronsyrebase ved hjelp av en kommersielt tilgjengelig retriever ved å dyppe lysbilder i løsningen i 15 minutter (Materialtabell).
- Omgi vevet med en hydrofob barriere ved hjelp av en penn.
- Blokker uspesifikk farging mellom de primære antistoffene og vevet, ved å inkubere i blokkeringsbuffer.
- Inkuber seksjoner i passende konsentrasjon av primære antistoffer fortynnet i inkubasjonsoppløsning over natten ved 4 °C i et fuktet kammer.
- Skyll seksjoner 3x ved romtemperatur med en vaskebuffer.
- Inkuberes i passende konsentrasjon av fluorkromkonjugert sekundært antistoff i 1 time ved romtemperatur.
- Skyll seksjoner 3x ved romtemperatur med 0,1 % tween 20-TBS. Inkuber seksjoner i 5 minutter i DAPI (1 mikrogram/ml). Skyll seksjoner en gang i TBS (Tris-bufret saltvann) med 0,1% Tween 20, tørk og monter i en monteringsløsning (figur 4 og figur 5).
MERK: Kilde og optimal arbeidsfortynning av primære og sekundære antistoffer som brukes til immunfluorescensfarging er inkludert i materialtabellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kilde lungevev
Luftrøret og den ekstrapulmonale bronkusen (figur 1A) ble brukt som kildevev for isolering av proksimale luftveisepitelceller og påfølgende generasjon av proksimale organoider. Distalt lungevev som inkluderer både parenkym og små luftveier under 2 mm i diameter (figur 1A) ble brukt til isolering av små luftveier og alveolære epitelceller (distalt lungeepitel) og generering av enten små luftveier eller alveolære organoider. Proksimale luftveier foret av et pseudostratifisert epitel inkluderer rikelig basale stamceller som er immunreaktive for membranproteinet NGFR (figur 1B, C). I motsetning til dette inkluderte epitelceller som fôrer alveoler en undergruppe som viste apikal membranimmunreaktivitet med HTII-280 monoklonalt antistoff, noe som tyder på deres alveolære type 2-celle (AT2) identitet (figur 1B, D). Disse overflatemarkørene ble brukt til å subsetere enkeltcellesuspensjoner av epitelceller isolert fra enten proksimale eller distale regioner.
Vevsdissosiasjon og cellefraksjonering
Enkeltcellesuspensjoner av totalceller ble isolert fra enten proksimale eller distale regioner av humant lungevev og fraksjonert ved bruk av både magnetisk perle og FACS for å gi berikede epitelcellepopulasjoner (figur 2 og figur 3). Rikelig forurensende celletyper, inkludert røde blodlegemer, immunceller og endotelceller, ble farget ved hjelp av antistoffer mot henholdsvis CD235a, CD45 og CD31, etterfulgt av magnetisk assosiert cellesortering for uttømming av disse celletypene fra den totale poolen av lungeceller. De resulterende "utarmede" cellesuspensjonene ble signifikant beriket for epitelcellepopulasjoner i både distale (figur 2E) og proksimale (figur 3E) vevsprøver, med tilsvarende økning i FACS-effektivitet. Etter deplesjon av CD235a/CD45/CD31 positive celler ved bruk av CD45 &CD31 mikroperler økte prosentandelen av CD31-/CD45-/CD235a- fra 14 % (figur 2A,B) til 51,7 % (figur 2E,F) i den distale populasjonen. Ytterligere FACS-uttømming av celler som farget positivt for enten CD235a, CD45 eller CD31, eliminering av celler med positiv farging for DAPI og positiv seleksjon for epitelcelleoverflatemarkøren CD326, førte til en svært beriket distal cellepopulasjon som utgjorde 33,5 % (figur 2E,G) sammenlignet med 7 % (figur 2A,C ) før uttømming av negativ befolkning. Ytterligere subsetting av distale epitelcellepopulasjoner ble oppnådd ved fraksjonering basert på overflatefarging med HTII-280 monoklonalt antistoff (figur 2D,H). Følgelig inkluderte distale lungeepitelceller 4,3 % HTII-280+ og 2,6 % HTII-280-undergrupper (figur 2D uten deplesjon av CD31/CD45/CD235a) og 30 % HTII-280+ og 3,6 % HTII-280-undergrupper (figur 2H etter deplesjon av CD31/CD45/CD235a).
Totale celler isolert fra den proksimale regionen ble utarmet for CD235a/CD45/CD31-positive celler ved bruk av CD45 &CD31 mikroperler, og prosentandelen CD31-/CD45-/CD235a- økte fra 17 % (figur 3A,B) til 56,6 % (figur 3E,F). Positiv seleksjon for epitelcelleoverflatemarkøren CD326 i celler isolert fra den proksimale regionen, førte til en svært beriket proksimal cellepopulasjon som utgjorde henholdsvis 38 % (figur 3E,G) av totale lungecellefraksjoner sammenlignet med 9,3 % (figur 3A,C) uten uttømming av negativ populasjon. Ytterligere subsetting av proksimale epitelcellepopulasjoner ble oppnådd ved fraksjonering basert på overflatefarging med antistoffer mot henholdsvis NGFR (figur 3D,H). Følgelig inkluderte proksimale lungeepitelceller 2,7 % NGFR+ og 6,5 % NGFR-undergrupper (figur 3D uten deplesjon av CD31/CD45/CD235a) og 13 % var NGFR+ og 25 % NGFR- (figur 3H etter deplesjon av CD31/CD45/CD235a).
Lungeorganoid kulturer
Distale lungeepitelorganoider ble dyrket innenfor vekstfaktorutarmet kjellermembranmatrise i medier som ble empirisk testet for å optimalisere for organoid vekst og differensiering. Tre ulike medier ble evaluert, inkludert PneumaCult-ALI medium, små luftveisepitelcellevekstmedium (SAECG medium) og mus Basal medium. Optimal organoid vekst ble oppnådd ved bruk av PneumaCult-ALI-medium, som ble valgt for videre studier. Kulturer av HTII-280+ distale lungeepitelceller ga raskt voksende organoider med en gjennomsnittlig kolonidannende effektivitet på 10% (figur 4A,B). Immunfluorescensfarging av dag 30-kulturer ved bruk av HTII-280 og SPC monoklonalt antistoff viste lumenholdige organoider sammensatt hovedsakelig av HTII-280+ og SPC+ distale lungeepitelceller (figur 4C, C' og figur 4D,D'). Kulturer av distale lungeepitel HTII-280-celler ga organoider som var sammensatt av et pseudostratifisert epitel som ligner på små luftveier (ikke vist).
Proksimale lungeepitelorganoider ble dyrket fra NGFR+ -celler sådd til Matrigel og dyrket i 30 dager i PneumaCult-ALI-medium. Store lumenholdige organoider ble observert (figur 5D, E, F) med en gjennomsnittlig kolonidannende effektivitet på 7,8% (figur 5A, B, C). Organoider var sammensatt av et pseudostratifisert epitel sammensatt av selvfornyende Krt5+ og NGFR+ basalceller (figur 5D, 5E) og differensierte luminale celletyper inkludert FoxJ1+ cilierte celler og MUC5AC+- sekretoriske celler (figur 5D,E).
Figur 1: Prøvetaking av humant lungevev. (A) Skjematisk fremstilling av den humane lungen som viser strategi for prøvetaking av proksimale og distale regioner for celleisolering. (B) H&E-farging av de proksimale og distale delene av lungen. (C,D) Immunfluorescerende farging av tilsvarende regioner som viser NGFR + basale stamceller (rød) ved kjellermembranen i bronkial luftveier og HTII-280+ alveolære type II-stamceller (grønn) i alveolene. skala bar = 50 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2 Representativ sorteringsstrategi for distale lungeceller. (A,E) Prosentandel av ulike cellepopulasjoner før og etter deplesjon av CD45+ og CD31+-populasjonen ved bruk av CD31- og CD45-magnetiske perler i distale lungeregioner fra én biologisk prøve. (B,F) Representativt bilde av FACS-plott som viser gatingstrategi for distal CD31-/CD45-/CD235a-populasjon før og etter uttømming av CD31/CD45/CD235a positiv populasjon (C,G) Epcam+-populasjon før og etter uttømming av CD31/CD45/CD235a positiv populasjon. (D,H) HTII-280+/- populasjon før og etter deplesjon av CD31/CD45/CD235a-positive celler. Paneler A-D er fra samme biologiske prøve og paneler E-H er fra samme biologiske prøve. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Representativ sorteringsstrategi for proksimale lungeceller. (A,E) Prosentandel av ulike cellepopulasjoner før og etter uttømming av CD45+ og CD31+-populasjonen ved bruk av CD31- og CD45-magnetiske perler i proksimale lungeområder. (B,F) Representativt bilde av FACS-plott som viser gatingstrategi for proksimal CD31-/CD45-/CD235a-populasjon før og etter uttømming av CD31/CD45/CD235a positiv populasjon (C,G) Epcam+-populasjon før og etter uttømming av CD31/CD45/CD235a positiv populasjon. (D,H) NGFR+/- populasjon før og etter deplesjon av CD31/CD45/CD235a-positive celler. Panelene A-D og E-H ble fremstilt fra to forskjellige biologiske prøver. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4 Karakterisering av distale lungeorganoider. (A) Representativt bilde av de menneskelige distale organoider dyrket i PneumaCult-ALI medium (2x forstørrelse). (B) Kolonidannelseseffektiviteten (% CFE) ble beregnet på tredoble brønner av organoider avledet fra to forskjellige biologiske prøver. (C, C') Immunfluorescerende farging av tilsvarende distale organoider dyrket i ALI-medium som viser HTII-280+ AT2-celler (grønn). (D, D') Markøren som ble brukt til isolering av AT2-celler i denne studien, HTII-280 costains (grønn) for den andre godt karakteriserte AT2-cellemarkøren , SPC (rød). Skala bar = 50um. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Karakterisering av proksimale organoider fra human proksimal lunge. (A,B) Representativt bilde av de humane proksimale organoider dyrket i PneumaCult-ALI mellomskala bar 50 μm. (C) Prosentkolonidannende effektivitet (% CFE) ble beregnet på tredoble brønner av organoider avledet fra to forskjellige biologiske prøver. Immunfluorescerende farging av differensierte proksimale organoider på dag 30 med (D) Krt5+ basalceller (grønn), FoxJ1+ cilierte celler (rød) (E) Krt5+ basalceller (grønn) og MUC5AC+ begerceller (rød). (F) Markøren som ble brukt til isolering av basalceller i denne studien, NGFR (grønn) co-flekker for den godt karakteriserte basalcellemarkøren, Krt5 (rød). Skalalinje = 50 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi beskriver en pålitelig metode for isolering av definerte subpopulasjoner av lungeceller fra humant lungevev for enten molekylær eller funksjonell analyse og sykdomsmodellering. Kritiske elementer i metoder inkluderer evnen til å oppnå vevsdissosiasjon med bevaring av overflateepiteler, som tillater antistoffmediert anrikning av ferskt isolerte celler, og optimalisering av kulturmetoder for effektiv generering av regionspesifikke epitelorganoider. Vi fokuserer på utvinning og anrikning av epiteliale stamceller som er i stand til å danne organoider når de rekombineres med stromale støtteceller i tredimensjonal kultur. Selv om vi ikke definerte klonaliteten til organoider i disse kulturene, ble lignende studier utført ved bruk av isolerte muselungeepitelceller vist å være klonalt basert på bruk av blandede kulturer av celler som inneholder forskjellige fluorescerende reportere22,23.
Metoder beskrevet her inkluderer tilpasninger som er ment å forbedre celleutvinning fra fordøyd lungevev. Fordøyede prøver føres gjennom en 16-gauge nål for ytterligere å forstyrre eventuelle gjenværende ufordøyd klumper og for å oppnå en homogen celle suspensjon. Celleaggregering forårsaket av ekstrudert genomisk DNA ble redusert ved å tilsette DNase I, som produserte et homogent cellepreparat som gir en uavbrutt fluidikkstrøm under FACS-isolasjon. Sammen øker disse enkle modifikasjonene utvinningen av målcellepopulasjonene og unngår forsinkelser på grunn av klumping under FACS-anrikning.
Tidligere protokoller krever vevsfordøyelse med elastase, dispase og tripsin / 2 mM EDTA for å gi en enkeltcellesuspensjon før celleisolasjon 4,5. Imidlertid fører denne kombinasjonen av proteaser til tap av overflateproteiner og krever at celler dyrkes over natten på purkolbelagte kulturskåler for represjon av overflateproteiner før antistofffarging og FACS. Derimot gir kombinasjonen av Liberase og mekanisk agitasjon for forsiktig å forstyrre lungevev en mer effektiv, men mildere dissosiasjonsprotokoll som kan utføres raskere samtidig som overflateepitoper bevares for antistofffarging og FACS-anrikning. Dermed kondenseres total vevsbehandlingstid og FACS-isolasjon kan utføres umiddelbart etter vevsdissosiasjon.
Disse metodene tillater isolasjon og in vitro-kultur av epiteliale stamceller som gir spesialisert avkom som er representativ for deres opprinnelsesregion. Imidlertid kan disse metodene på samme måte brukes til identifisering og anrikning av andre cellepopulasjoner som immun-, vaskulære og stromale celletyper. Dette kan være spesielt aktuelt for utvikling av regionale lungeepitel-på-chip-systemer som tillater modellering av vaskulære og epiteliale rom og innføring av andre celletyper som immunceller 24,25,26. I en nylig studie brukte vi 3D-organoidkulturer av alveolært epitel generert ved hjelp av denne metoden ble brukt som et verktøy for å studere COVID 19-modellering av lungen og for å screene terapeutiske mål mot SARS-CoV-2-infeksjon. 27
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfattere har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi setter pris på støtte fra Mizuno Takako for IFC- og H- og E-farging, Vanessa Garcia for vevssnitt og Anika S Chandrasekaran for å hjelpe til med manuskriptforberedelse. Dette arbeidet støttes av National Institutes of Health (5RO1HL135163-04, PO1HL108793-08) og Celgene IDEAL Consortium.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell Isolation | |||
| 10 mL Sterile syringes, Luer-Lok Tip | Fisher scientific | BD 309646 | |
| 30 mL Sterile syringes, Luer-Lok Tip | VWR | BD302832 | |
| Biohazard bags | VWR | 89495-440 | |
| Biohazard bags | VWR | 89495-440 | |
| connecting ring | Pluriselect | 41-50000-03 | |
| Deoxyribonuclease (lot#SLBF7798V) | sigma Aldrich | DN25-1G | |
| Disposable Petri dishes | Corning/Falcon | 25373-187 | |
| Funnel | Pluriselect | 42-50000 | |
| HBSS | Corning | 21-023 | |
| Liberase TM Research Grade | sigma Aldrich | 5401127001 | |
| needle 16G | VWR | 305198 | |
| needle 18G | VWR | 305199 | |
| PluriStrainer 100 µm (Cell Strainer) | Pluriselect | 43-50100-51 | |
| PluriStrainer 300 µm (Cell Strainer) | Pluriselect | 43-50300-03 | |
| PluriStrainer 40 µm (Cell Strainer) | Pluriselect | 43-50040-51 | |
| PluriStrainer 500 µm (Cell Strainer) | Pluriselect | 43-50500-03 | |
| PluriStrainer 70 µm (Cell Strainer) | Pluriselect | 43-50070-51 | |
| Razor blades | VWR | 55411-050 | |
| Red Blood Cell lysis buffer | eBioscience | 00-4333-57 | |
| Equipment’s | |||
| GentleMACS C Tubes | MACS Miltenyi Biotec | 130-096-334 | |
| GentleMACS Octo Dissociator | MACS Miltenyi Biotec | 130-095-937 | |
| Leica ASP 300s Tissue processor | |||
| LS Columns | MACS Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| MACS MultiStand** | Miltenyi Biotech | 130-042-303 | |
| Thermomixer | Eppendorf | 05-412-503 | |
| Thermomixer | Eppendorf | 05-412-503 | |
| HBSS+ Buffer | |||
| Amphotericin B | Thermo fisher scientific | 15290018 | 2ml |
| EDTA (0.5 M), pH 8.0, RNase-free | Thermo fisher scientific | AM9260G | 500µl |
| Fetal Bovine Serum | Gemini Bio-Products | 100-106 | 10ml |
| HBSS Hank's Balanced Salt Solution 1X 500 ml | VWR | 45000-456 | 500ml bottle |
| HEPES (1 M) | Thermo fisher scientific | 15630080 | 5ml |
| Penicillin-Streptomycin-Neomycin (PSN) Antibiotic Mixture | Thermo fisher scientific | 15640055 | 5ml |
| List of antibodies for FACS | |||
| Alexa Fluor 647 anti-human CD326 (EpCAM) Antibody | BioLegend | 369820 | 1:50 |
| BD CompBead Anti-Mouse Ig, K/ Negative control particles set | Fisher Scientific | BDB552843 | |
| CD31 MicroBead Kit, human | Miltenyi Biotec | 130-091-935 | 20µl/ 107 total cells |
| CD45 MicroBeads, human | Miltenyi Biotec | 130-045-801 | 20µl/ 107 total cells |
| DAPI | Sigma Aldrich | D9542-10MG | 1:10000 |
| FITC anti-human CD235a | BioLegend | 349104 | 1:100 |
| FITC anti-human CD31 | BioLegend | 303104 | 1:100 |
| FITC anti-human CD45 | BioLegend | 304054 | 1:100 |
| FITC anti-mouse IgM Antibody | BioLegend | 406506 | 1:500 |
| Mouse IgM anti human HT2-280 | Terrace Biotech | TB-27AHT2-280 | 1:300 |
| PE anti-human CD271(NGFR) | BioLegend | 345106 | 1:50 |
| Composition of Organoid Culture mediums | |||
| MRC-5 | ATCC | CCL-171 | |
| PneumaCult -ALI Medium | Stemcell Technologies | 5001 | |
| Small Airway Epithelial Cell Growth Medium | PromoCell | C-21170 | |
| ThinCert Tissue Culture Inserts, Sterile | Greiner Bio-One | 662641 | |
| Y-27632 (ROCK inhibitor) 100mM stock (1000x) | Stemcell Technologies | 72302 | |
| Mouse Basal medium: | |||
| Amphotericin B | Thermo fisher scientific | 15290018 | 50 µl |
| DMEM/F-12, HEPES | ThermoFisher scientific | 11330032 | 50 ml |
| Fetal Bovine Serum | Gemini Bio-Products | 100-106 | 5 ml |
| Insulin-Transferrin-Selenium (ITS -G) (100X) | ThermoFisher scientific | 41400045 | 500 µl |
| Penicillin-Streptomycin-Neomycin (PSN) Antibiotic Mixture | Thermo fisher scientific | 15640055 | 500 µl |
| SB431542 TGF-β pathway inhibitor (stock 100 mM) | Stem cell | 72234 | 5 µl |
| List of antibodies for Immunohistochemistry | |||
| Antigen unmasking solution, citric acid based | Vector | H-3300 | 937 µl in 100ml water |
| Histogel | Thermo Scientific | HG-4000-012 | |
| Primary Antibodies | |||
| Anti HT2-280 | Terracebiotech | TB-27AHT2-280 | 1:500 |
| FOXJ1 Monoclonal Antibody (2A5) | Thermo Fisher Scientific | 14-9965-82 | 1:300 |
| Human Uteroglobin/SCGB1A1 Antibody | R and D systems | MAB4218 | 1:300 |
| Keratin 5 Polyclonal Chicken Antibody, Purified [Poly9059] | Biolegend | 905901 | 1:500 |
| MUC5AC Monoclonal Antibody (45M1) | Thermo Fisher Scientific | MA5-12178 | 1:300 |
| PDPN / Podoplanin Antibody (clone 8.1.1) | LifeSpan Biosciences | LS-C143022-100 | 1:300 |
| Purified Mouse Anti-E-Cadherin | BD biosciences | 610182 | 1:1000 |
| Sox-2 Antibody | Santa Cruz biotechnologies | sc-365964 | 1:300 |
| Secondary Antibodies | |||
| Donkey anti-rabbit lgG, 488 | Thermo Fisher Scientific | A-21206 | 1:500 |
| FITC anti-mouse IgM Antibody | BioLegend | 406506 | 1:500 |
| Goat anti-Hamster IgG (H+L), Alexa Fluor 594 | Thermo Fisher Scientific | A-21113 | 1:500 |
| Goat anti-Mouse IgG1 Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-21121 | 1:500 |
| Goat anti-Mouse IgG2a Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-21131 | 1:500 |
| Goat anti-Mouse IgG2a Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A-21134 | 1:500 |
| Goat anti-Mouse IgG2b Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A-21144 | 1:500 |
| Buffers | |||
| Immunohistochemistry Blocking Solution | 3% BSA, o.4% Triton-x100 in TBS (Tris based saline) | ||
| Immunohistochemistry Incubation Solution | 3% BSA, ).1% Triton-X100 in TBS | ||
| Immunohistochemistry Washing Solution | TBS with 0.1% Tween 20 |
References
- Rackley, C. R., Stripp, B. R. Building and maintaining the epithelium of the lung. Journal of Clinical Investigation. 122 (8), 2724-2730 (2012).
- Montoro, D. T., et al. A revised airway epithelial hierarchy includes CFTR-expressing ionocytes. Nature. 560 (7718), 319-324 (2018).
- Plasschaert, L. W., et al. A single-cell atlas of the airway epithelium reveals the CFTR-rich pulmonary ionocyte. Nature. 560 (7718), 377-381 (2018).
- Barkauskas, C. E., et al. Type 2 alveolar cells are stem cells in adult lung. Journal of Clinical Investigation. 123 (7), 3025-3036 (2013).
- Barkauskas, C. E., et al. Lung organoids: current uses and future promise. Development. 144 (6), 986-997 (2017).
- Leeman, K. T., Fillmore, C. M., Kim, C. F. Lung Stem and Progenitor Cells in Tissue Homeostasis and Disease. Stem Cells in Development and Disease. 107, 207-233 (2014).
- Rawlins, E. L., et al. The Role of Scgb1a1(+) Clara Cells in the Long-Term Maintenance and Repair of Lung Airway but Not Alveolar, Epithelium. Cell Stem Cell. 4 (6), 525-534 (2009).
- Rock, J. R., et al. Basal cells as stem cells of the mouse trachea and human airway epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (31), 12771-12775 (2009).
- Chang, W. I., et al. Bmp4 is essential for the formation of the vestibular apparatus that detects angular head movements. Plos Genetics. 4 (4), 1000050 (2008).
- McQualter, J. L., Bertoncello, I. Concise Review: Deconstructing the Lung to Reveal Its Regenerative Potential. Stem Cells. 30 (5), 811-816 (2012).
- Gonzalez, R. F., Allen, L., Gonzales, L., Ballard, P. L., Dobbs, L. G. HTII-280, a Biomarker Specific to the Apical Plasma Membrane of Human Lung Alveolar Type II Cells. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 58 (10), 891-901 (2010).
- Rock, J. R., et al. Notch-Dependent Differentiation of Adult Airway Basal Stem Cells. Cell Stem Cell. 8 (6), 639-648 (2011).
- Page, H., Flood, P., Reynaud, E. G. Three-dimensional tissue cultures: current trends and beyond. Cell and Tissue Research. 352 (1), 123-131 (2013).
- Hynds, R. E., Giangreco, A. Concise Review: The Relevance of Human Stem Cell-Derived Organoid Models for Epithelial Translational Medicine. Stem Cells. 31 (3), 417-422 (2013).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), (2014).
- Weber, C.
- Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. Organoids as an in vitro model of human development and disease. Nature Cell Biology. 18 (3), 246-254 (2016).
- Nikolic, M. Z., Rawlins, E. L. Lung Organoids and Their Use To Study Cell-Cell Interaction. Current Pathobiology Reports. 5 (2), 223-231 (2017).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Reynolds, B. A., Rietze, R. L. Neural stem cells and neurospheres--re-evaluating the relationship. Nature Methods. 2 (5), 333-336 (2005).
- Chua, C. W., et al. Single luminal epithelial progenitors can generate prostate organoids in culture. Nature Cell Biology. 16 (10), 951-961 (2014).
- Teisanu, R. M., et al. Functional analysis of two distinct bronchiolar progenitors during lung injury and repair. American Journal of Respiratory and Cellular Molecular Biology. 44 (6), 794-803 (2011).
- Chen, H., et al. Airway epithelial progenitors are region specific and show differential responses to bleomycin-induced lung injury. Stem Cells. 30 (9), 1948-1960 (2012).
- Benam, K. H., et al. Small airway-on-a-chip enables analysis of human lung inflammation and drug responses in vitro. Nature Methods. 13 (2), 151-157 (2016).
- Huh, D., et al. Reconstituting organ-level lung functions on a chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).
- Jain, A., et al. Primary Human Lung Alveolus-on-a-chip Model of Intravascular Thrombosis for Assessment of Therapeutics. Clinical Pharmacology & Therapeutics. 103 (2), 332-340 (2018).
- Mulay, A., et al. SARS-CoV-2 infection of primary human lung epithelium for COVID-19 modeling and drug discovery. bioRxiv. , (2020).
