Summary
Cet article fournit une méthodologie détaillée pour les approches de dissociation tissulaire et de fractionnement cellulaire permettant l’enrichissement de cellules épithéliales viables à partir de régions proximales et distales du poumon humain. Ici, ces approches sont appliquées pour l’analyse fonctionnelle des cellules progénitrices épithéliales pulmonaires grâce à l’utilisation de modèles de culture d’organoïdes 3D.
Abstract
Les modèles organoïdes épithéliaux sont des outils précieux pour étudier la biologie fondamentale d’un système d’organes et pour la modélisation de la maladie. Lorsqu’elles sont cultivées sous forme d’organoïdes, les cellules progénitrices épithéliales peuvent s’auto-renouveler et générer une progéniture différenciante qui présente des fonctions cellulaires similaires à celles de leurs homologues in vivo . Nous décrivons ici un protocole étape par étape pour isoler les progéniteurs spécifiques à une région du poumon humain et générer des cultures organoïdes 3D en tant qu’outil expérimental et de validation. Nous définissons les régions proximales et distales du poumon dans le but d’isoler les cellules progénitrices spécifiques à la région. Nous avons utilisé une combinaison de dissociation enzymatique et mécanique pour isoler les cellules totales du poumon et de la trachée. Des cellules progénitrices spécifiques ont ensuite été fractionnées à partir des cellules d’origine proximale ou distale à l’aide du tri cellulaire associé à la fluorescence (FACS) basé sur des marqueurs de surface spécifiques au type cellulaire, tels que le NGFR pour le tri des cellules basales et LE HTII-280 pour le tri des cellules alvéolaires de type II. Des progéniteurs isolés basaux ou alvéolaires de type II ont été utilisés pour générer des cultures organoïdes 3D. Les progéniteurs distaux et proximaux ont formé des organoïdes avec une efficacité de formation de colonies de 9 à 13% dans la région distale et de 7 à 10% dans la région proximale lorsqu’ils sont plaqués 5000 cellules / puits au jour 30. Les organoïdes distaux ont maintenu en culture des cellules alvéolaires HTII-280+ de type II, tandis que les organoïdes proximaux se sont différenciés en cellules ciliées et sécrétoires au jour 30. Ces cultures organoïdes 3D peuvent être utilisées comme outil expérimental pour étudier la biologie cellulaire de l’épithélium pulmonaire et les interactions mésenchymateuses épithéliales, ainsi que pour le développement et la validation de stratégies thérapeutiques ciblant le dysfonctionnement épithélial dans une maladie.
Introduction
Les espaces aériens du système respiratoire humain peuvent être largement divisés en zones conductrices et respiratoires qui interviennent dans le transport des gaz et leur échange ultérieur à travers la barrière épithéliale-microvasculaire, respectivement. Les voies respiratoires conductrices comprennent la trachée, les bronches, les bronchioles et les bronchioles terminales, tandis que les espaces respiratoires comprennent les bronchioles respiratoires, les canaux alvéolaires et les alvéoles. La muqueuse épithéliale de ces espaces aériens change de composition le long de l’axe proximo-distal pour répondre aux exigences uniques de chaque zone fonctionnellement distincte. L’épithélium pseudostratifié des voies respiratoires trachéo-bronchiques est composé de trois principaux types de cellules, basale, sécrétoire et ciliée, en plus des types cellulaires moins abondants, y compris la brosse, le neuroendocrinien et l’ionocyte 1,2,3. Les voies respiratoires bronchiolaires abritent des types de cellules épithéliales morphologiquement similaires, bien qu’il existe des distinctions dans leur abondance et leurs propriétés fonctionnelles. Par exemple, les cellules basales sont moins abondantes dans les voies respiratoires bronchiolaires, et les cellules sécrétoires comprennent une plus grande proportion de cellules club par rapport aux cellules séreuses et gobelet qui prédominent dans les voies respiratoires trachéo-bronchiques. Les cellules épithéliales de la zone respiratoire comprennent un type de cellules cuboïdes mal défini dans les bronchioles respiratoires, en plus des cellules alvéolaires de type I (ATI) et de type II (ATII) des canaux alvéolaires et des alvéoles 1,4.
L’identité des types de cellules souches épithéliales et progénitrices qui contribuent au maintien et au renouvellement des épithéliums dans chaque zone est incomplètement décrite et largement déduite des études sur des modèles animaux 5,6,7,8. Des études chez la souris ont montré que les cellules basales des voies respiratoires pseudostratifiées, ou les cellules club des voies respiratoires bronchiolaires ou les cellules ATII de l’épithélium alvéolaire, servent de cellules souches épithéliales en fonction de la capacité d’auto-renouvellement illimité et de différenciation multipotente 7,9,10,11,12 . Malgré l’incapacité d’effectuer des études de traçage génétique de la lignée pour évaluer la souche des types de cellules épithéliales pulmonaires humaines, la disponibilité de modèles de culture organoïdes pour évaluer le potentiel fonctionnel des cellules souches épithéliales et progénitrices fournit un outil pour des études comparatives entre la souris et l’homme 13,14,15,16,17.
Nous décrivons des méthodes pour isoler les types de cellules épithéliales de différentes régions du poumon humain et leur culture en utilisant un système organoïde 3D pour récapituler les types de cellules régionales. Des méthodes similaires ont été développées pour l’analyse fonctionnelle et la modélisation de la maladie des cellules épithéliales d’autres systèmes d’organes 18,19,20,21. Ces méthodes fournissent une plate-forme pour l’identification des cellules progénitrices épithéliales régionales, pour effectuer des études mécanistes sur leur régulation et leur microenvironnement, et pour permettre la modélisation de la maladie et la découverte de médicaments. Même si les études sur les cellules progénitrices épithéliales pulmonaires réalisées dans des modèles animaux peuvent bénéficier de l’analyse, in vivo ou in vitro, les connaissances sur l’identité des cellules progénitrices épithéliales pulmonaires humaines ont été largement dépendantes de l’extrapolation à partir d’organismes modèles. En tant que telles, ces méthodes fournissent un pont pour relier l’identité et le comportement des types de cellules épithéliales pulmonaires humaines avec leurs études portant sur la régulation des cellules souches / progénitrices.
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Protocol
Le tissu pulmonaire humain a été obtenu auprès de donneurs de tissus décédés conformément aux procédures de consentement élaborées par l’Institut international pour l’avancement de la médecine (IIAM) et approuvées par le Conseil d’examen interne du Centre médical Cedars-Sinaï.
1. Traitement des tissus pour l’isolement des cellules pulmonaires des régions trachéo-bronchiques ou des petites voies respiratoires/parenchymateuses (petites voies respiratoires et alvéoles)
- Préparez et autoclavez tous les instruments de dissection, la verrerie et les solutions appropriées un jour avant l’isolement cellulaire.
- Lors de la réception de tissu pulmonaire, identifiez et séparez les régions proximale et distale. La trachée et les bronches sont considérées comme « proximales ». Aux fins de ce protocole, la trachée et les 2-3 premières générations de bronches sont disectées et utilisées pour l’isolement de l’épithélium « proximal » des voies respiratoires. Les petites voies respiratoires de 2 mm ou moins de diamètre et le tissu parenchymateux environnant sont, aux fins du présent protocole, considérés comme un épithélium pulmonaire « distal » (figure 1A).
REMARQUE: Toutes les procédures impliquant le traitement du tissu pulmonaire humain doivent être effectuées dans une armoire de biosécurité avec l’utilisation de l’équipement de protection individuelle approprié.
2. Enrichissement et sous-réglage des petites voies respiratoires et des cellules progénitrices épithéliales alvéolaires du tissu pulmonaire distal
- Préparation des tissus distaux
- Placez le tissu pulmonaire distal dans une boîte de Petri stérile (150 x 15 mm). Découpez le tissu en environ 1 cm3 morceaux et placez-le dans un tube propre de 50 mL.
- Lavez le tissu 3x avec du HBSS réfrigéré, en jetant le lavage HBSS à chaque fois pour éliminer le sang et le liquide de la muqueuse épithéliale.
- Placez le tissu dans une nouvelle boîte de Petri et épongez-le avec des lingettes anti-peluches stériles. À l’aide de pinces et de ciseaux, retirez autant de plèvre viscérale (une membrane transparente délicate qui recouvre la surface du poumon) que possible.
- Utilisez des ciseaux pour hacher les tissus en morceaux d’environ 2 mm de diamètre. Transférer le tissu haché dans une boîte de Petri propre et hacher davantage en le coupant à une taille approximative de 1 mm avec une lame de rasoir stérile simple face.
- Digestion enzymatique
REMARQUE: La solution mère de liberase est de 5 mg / mL (100x) et la souche de DNase est de 2,5 mg / mL (100x) (table des matériaux).- Ajouter 50 μg/mL de liberase et 25 μg/mL de DNase dans du HBSS stérile dans un tube conique de 50 mL.
- Transférer environ 2 à 3 g de tissu haché dans un nouveau tube conique de 50 mL contenant 25 mL de HBSS, contenant de la libérase et de la DNase. Incuber pendant 40-60 min à 37 °C en agitant en continu à l’aide d’un mélangeur réglé à 900 tr/min. Après 30 min d’incubation, triturer les tissus digérés à l’aide d’une seringue de 30 mL sans aiguille pour éviter la formation d’amas et poursuivre l’incubation.
REMARQUE: Le temps d’incubation avec les enzymes peut varier en fonction du type ou de l’état du tissu. Par exemple, la digestion enzymatique des tissus normaux prend environ 45 minutes. Cependant, le tissu fibrotique provenant d’échantillons de fibrose pulmonaire idiopathique peut nécessiter un temps d’incubation plus long allant jusqu’à 60 minutes. Par conséquent, surveillez attentivement les tissus pendant cette étape pour éviter d’endommager les marqueurs de surface, ce qui est crucial pour FACS.
- Isolation d’une seule cellule
- Triturez le tissu en tirant 5x à travers une aiguille de 16 G montée sur une seringue de 30 mL. Aspirer la suspension tissulaire dans une pipette à large alésage et passer à travers une série de crépines cellulaires (500 μm, 300 μm, 100 μm, 70 μm, 40 μm) sous pression sous vide. Lavez la passoire avec 20 mL de tampon HBSS+ pour recueillir les cellules restantes. La recette du tampon HBSS+ se trouve dans le tableau des matériaux.
- Ajouter un volume égal de tampon HBSS+, après 45 min au filtrat pour inhiber l’activité de la liberase et éviter une digestion excessive.
- Centrifugeuse filtre à 500 x g pendant 5 min à 4 °C. Retirez et jetez soigneusement le surnageant. Ajouter 1 mL de tampon de lyse des globules rouges (GLOBULES ROUGES) à la pastille, bercer doucement le tube pour déloger la pastille et incuber sur de la glace pendant 1 min.
REMARQUE: La quantité et le temps dans la solution de lyse RBC dépendent de la taille de la pastille. Il est important de maintenir les cellules sur la glace et de surveiller soigneusement le temps passé dans la solution de lyse des globules rouges afin d’éviter la lyse des cellules cibles. Si la lyse des globules rouges est insuffisante, répétez l’étape. - Ajouter 10 à 20 mL de tampon HBSS+ pour neutraliser le tampon de lyse RBC. Centrifugeuse filtre à 500 x g pendant 5 min à 4 °C.
- Si les globules rouges lysés (cellules fantômes) forment une couche trouble au-dessus de la pastille cellulaire, remettez en suspension la pastille dans 10 mL de tampon HBSS+ et filtrez la suspension à travers une passoire cellulaire de 70 μm pour éliminer les cellules fantômes. Centrifuger le filtrat à 500 x g pendant 5 min à 4 °C et procéder à d’autres étapes.
- Épuisement des cellules immunitaires et des cellules endothéliales (étape facultative)
- Épuiser les cellules endothéliales CD31+ et les cellules immunitaires CD45+ du pool de cellules totales à l’aide des microbilles CD31 et CD45 conjuguées aux anticorps monoclonal anti-humains CD31 et CD45 (isotype souris IgG1) et aux colonnes LS conformément au protocole du fabricant (Table des matériaux).
- Recueillir le flux, composé principalement de cellules épithéliales et stromales, dans un tube stérile frais et le centrifuger à 500 x g pendant 5 min à 4 °C. Effectuez un comptage de cellules pour déterminer le nombre total de cellules dans le flux traversant.
- Coloration de la surface cellulaire pour le tri cellulaire associé à la fluorescence (FACS)
- Remettez en suspension 1 x 107 cellules par 1 mL de tampon HBSS+. Ajouter les anticorps primaires à la concentration requise et incuber les cellules pendant 30 min à 4 °C dans l’obscurité. Dans cette étude, des anticorps primaires conjugués au fluorophore ont été utilisés, sauf indication contraire. Les détails des sources d’anticorps et des titres sont décrits dans le Tableau des matériaux.
REMARQUE: HTII-280 est actuellement le meilleur anticorps réactif de surface qui permet le sous-réglage des cellules pulmonaires distales en fractions cellulaires principalement des voies respiratoires (HTII-280-) et alvéolaires de type 2 (HTII-280+). Une mise en garde à cette stratégie est que les cellules AT1 ne sont pas colorées à l’aide de cette méthode et sont mal représentées en raison de leur fragilité. Cependant, les cellules AT1 sont mal représentées dans les préparations pulmonaires distales, probablement en raison de leur fragilité et de leur perte lors de la sélection de cellules viables par FACS et ne représentent donc qu’un contaminant rare de la fraction cellulaire des voies respiratoires. - Lavez les cellules en ajoutant 3 mL de tampon HBSS+ et centrifugez à 500 x g pendant 5 min à 4 °C.
- Si vous utilisez des anticorps primaires non conjugués, ajouter la concentration requise d’un anticorps secondaire conjugué au fluorophore approprié et incuber pendant 30 min sur de la glace. Laver l’excès d’anticorps secondaires en ajoutant 3 mL de tampon HBSS+ et centrifuger à 500 x g pendant 5 min à 4 °C.
- Jetez les cellules surnageantes et resuspendez dans le tampon HBSS+ par 1 x 107 cellules / mL. Filtrer les cellules dans des tubes de polystyrène de 5 mL à travers un capuchon de crépine pour assurer la formation d’une suspension à cellule unique. Ajouter le DAPI (1 μg/mL) aux cellules perméables (mortes) colorantes.
REMARQUE: Il est essentiel d’utiliser des témoins appropriés d’une seule couleur et de fluorescence moins un (FMO) (c.-à-d. cocktail de coloration d’anticorps moins un anticorps chacun), afin de minimiser les faux positifs pendant le FACS. Dans cette étude, des billes de sélection positives et négatives ont été utilisées pour compenser empiriquement le chevauchement des spectres d’émission entre les fluorophores (Table des matériaux). FACS enrichir les types de cellules d’intérêt. Les cellules épithéliales viables sont enrichies en fonction de leur phénotype de surface cellulaire CD45 négatif, CD31 négatif, CD236 positif et de la coloration négative pour DAPI. Cette fraction de cellules épithéliales peut être sous-définie en fonction de la coloration pour les marqueurs de surface spécifiques au type de cellule, tels que la coloration spécifique pour les cellules HTII-280 positives qui sont enrichies pour les cellules AT2. En revanche, la sélection négative pour HTII-280 permet l’enrichissement de petites cellules épithéliales des voies respiratoires telles que les cellules club et ciliées (Figure 2).
- Remettez en suspension 1 x 107 cellules par 1 mL de tampon HBSS+. Ajouter les anticorps primaires à la concentration requise et incuber les cellules pendant 30 min à 4 °C dans l’obscurité. Dans cette étude, des anticorps primaires conjugués au fluorophore ont été utilisés, sauf indication contraire. Les détails des sources d’anticorps et des titres sont décrits dans le Tableau des matériaux.
3. Enrichissement et sous-réglage des cellules progénitrices épithéliales des voies respiratoires trachéo-bronchiques
- Préparation des tissus
- Disséquer les voies respiratoires proximales (trachée/bronches) des poumons. Ouvrez les voies respiratoires sur toute leur longueur à l’aide de ciseaux pour exposer la lumière et ajoutez 50 μg / mL de libérase pour couvrir complètement le tissu.
- Incuber pendant 20 min à 37 °C en secouant en continu à l’aide d’un thermo mélangeur réglé à 900 tr/min.
- Retirez les voies respiratoires proximales du tube de centrifugeuse et placez-les dans une boîte de Petri stérile (150 x 15 mm). Grattez doucement la surface des voies respiratoires à l’aide d’un scalpel pour dépouiller complètement les cellules épithéliales luminales du tissu.
- Lavez la boîte de Petri avec 5 mL de tampon HBSS+ stérile pour recueillir toutes les cellules épithéliales luminales délogées et transférer les cellules délogées dans un tube de centrifugeuse conique de 50 mL. Triturez la suspension en tirant une aiguille de 5 à 16 G et une aiguille de 18 G montée sur une seringue de 10 mL pour obtenir une suspension à cellule unique.
- Centrifuger la suspension à 500 x g pendant 5 min à 4 °C. Remettez en suspension la pastille dans un tampon HBSS+ frais et stockez ces cellules des voies respiratoires luminales sur de la glace, prêtes à être combinées avec la suspension à cellule unique générée par les voies respiratoires proximales hachées dans les étapes à venir.
- À l’aide de ciseaux, coupez le tissu trachéo-bronchique restant le long de ses anneaux pour générer de petites bandes de tissu et transférez les bandes dans une boîte de Pétri fraîche. Hachez les bandes de tissu à l’aide d’une lame de rasoir simple face pour en faire de plus petits morceaux.
REMARQUE: Étant donné que les voies respiratoires proximales sont cartilagineuses, elles ne peuvent pas être hachées aussi finement que le tissu pulmonaire distal. - Transférer le tissu haché dans les tubes C, ajouter 2 mL de liberase au tube en veillant à ce que le tissu soit submergé. Chargez le tube C sur le dissociateur automatisé et exécutez le protocole pulmonaire humain-2 pour dissocier mécaniquement davantage les tissus.
REMARQUE: Le dissociateur utilisé dans ce protocole offre un programme optimisé appelé protocole pulmonaire humain-2 pour cette application spécifique (voir tableau des matériaux).
- Digestion enzymatique et isolement unicellulaire
- Transférer environ 2 g de tissu proximal haché du tube C dans chaque tube de centrifugeuse conique de 50 mL et ajouter 50 μg/mL de liberase et 25 μg/mL de solution de DNase à chaque tube.
REMARQUE: Pour assurer une dissociation efficace, les tubes ne doivent pas être remplis au-delà de la marque de 30 mL. - Incuber le tissu haché pendant 45 min à 37 °C en agitant continuellement à l’aide d’un mélangeur réglé à 900 tr/min.
- Passer la suspension tissulaire dissociée à travers une série de crépines cellulaires (500 μm, 300 μm, 100 μm, 70 μm, 40 μm) sous pression sous vide comme mentionné ci-dessus et recueillir le flux à travers. Lavez la passoire avec 20 mL de tampon HBSS+ pour recueillir les cellules restantes.
REMARQUE: Étant donné que le tissu proximal est cartilagineux et volumineux par rapport au tissu distal, il existe une plus grande possibilité de colmatage des filtres. L’utilisation d’un entonnoir peut aider à prévenir le débordement du liquide lors du passage à travers les passoires. - Ajouter un volume égal de tampon HBSS+ au filtrat pour inhiber l’activité de la libérase et prévenir la digestion excessive. Ajouter les cellules proximales proximales luminales isolées de 3.1.5 à la suspension cellulaire à cette étape.
- Centrifuger la suspension de cellule combinée à 500 x g pendant 10 min. Retirez le surnageant et répétez le lavage des cellules dans le tampon HBSS+. Effectuer l’épuisement des cellules immunitaires CD45+ et des cellules endothéliales CD31+ comme mentionné ci-dessus au point 2.4 (étape facultative).
- Les méthodes de coloration sont similaires au tissu pulmonaire distal, suivez les étapes décrites au point 2.5. Enrichir les cellules épithéliales viables en fonction de leur phénotype de surface cellulaire CD45 négatif, CD31 négatif, CD236 positif et de la coloration négative pour le DAPI.
- Sous-ensemble supplémentaire de la fraction cellulaire épithéliale basé sur la coloration des marqueurs de surface spécifiques au type cellulaire, tels que le NGFR, permettant l’enrichissement des types cellulaires basaux (NGFR positifs) et non basaux (NGFR négatif; sécrétoires, ciliés, neuroendocriniens) (Figure 3).
- Transférer environ 2 g de tissu proximal haché du tube C dans chaque tube de centrifugeuse conique de 50 mL et ajouter 50 μg/mL de liberase et 25 μg/mL de solution de DNase à chaque tube.
4. Culture organoïde
- Ajouter 5 000 (ce nombre peut être ajusté pour donner la densité souhaitée d’organoïdes épithéliaux) des cellules proximales ou épithéliales distales triées dans un tube stérile de 1,5 mL avec 7,5 x 104 cellules MRC-5 (lignée cellulaire de fibroblastes pulmonaires humains). Les interactions épithéliales-mésenchymateuses sont essentielles à l’expansion des cellules progénitrices.
- Centrifuger à 500 x g pendant 5 min à 4 °C.
REMARQUE: Il est important de confirmer manuellement le nombre de cellules obtenues à partir du trieur afin d’assurer la précision de l’efficacité de la formation de colonies organoïdes. - Retirez et jetez soigneusement le surnageant et remettez en suspension la pastille cellulaire dans 50 μL de milieux glacés complétés par des antibiotiques. Gardez la suspension cellulaire sur la glace.
- Ajouter 50 μL de milieu de matrice de membrane basale glacé 1x appauvri en facteur de croissance au flacon et pipeter doucement la suspension sur de la glace pour mélanger.
REMARQUE: Il est important d’utiliser un milieu glacé et de maintenir les cellules sur la glace pour éviter la polymérisation prématurée du milieu de la matrice de la membrane basale. - Transférer la suspension cellulaire sur un insert de culture cellulaire de 0,4 μm de la taille d’un pore dans une plaque de 24 puits (1,4 x 104 cellules/cm2), en prenant soin d’éviter l’introduction de bulles d’air.
- Incuber à 37 °C pendant 30-45 min pour permettre à la matrice de se solidifier.
- Ajouter 600 μL de milieu de croissance préchauffé au puits.
NOTE: Le milieu a été complété par des agents antimycotiques (0,4%) et un streptocoque Pen (1%) pendant les 24 premières heures après l’ensemencement et un inhibiteur de rho kinase de 10 μM pendant les 72 premières heures. - Culture à 37 °C dans un incubateur à 5% de CO2 pendant 30 jours, période pendant laquelle les milieux doivent être changés toutes les 48 h.
REMARQUE: La durée de la culture peut être modifiée en fonction du but de l’expérience. Des critères d’évaluation plus longs sont utilisés pour étudier la différenciation, tandis que des critères plus courts de 7 jours, 14 jours, etc., peuvent être utilisés si le but de l’expérience n’est pas d’obtenir une différenciation complète. - Ajouter 10 μM d’inhibiteur de TGFβ au milieu de culture pendant 15 jours pour maintenir les cellules dans la phase proliférative et supprimer la prolifération des fibroblastes.
REMARQUE: Les résultats diffèrent selon le milieu de culture utilisé pour le test. Par exemple, les résultats présentés ici ont été générés à l’aide de Pneumacult-ALI Medium, ce qui entraîne la génération de gros organoïdes à partir du poumon distal, d’organoïdes bien différenciés et plus gros à partir du poumon proximal.
5. Coloration organoïde
- Fixation et incorporation d’organoïdes
- Aspirer les milieux des chambres d’insertion transmembranaire supérieure et inférieure et rincer une fois avec du PBS chaud.
- Fixer les cultures en plaçant 300 μL de PFA (2 % p/v) dans l’insert et 500 μL dans le puits pendant 1 h à 37 °C. Retirez le fixateur et rincez avec du PBS chaud en prenant soin de ne pas déloger le bouchon de matrice de membrane basememt.
REMARQUE: Les organoïdes fixes peuvent être stockés immergés dans du PBS à 4 ° C pendant une à deux semaines avant d’entamer d’autres étapes. - Aspirez PBS, inversez l’insert et coupez soigneusement la membrane de l’insert autour de sa périphérie. À l’aide d’une pince, retirez la membrane transpuite, en prenant soin de ne pas déranger le bouchon de matrice.
- Dans une boîte de Pétri, appuyez sur l’insert pour récupérer le bouchon de matrice.
- Ajouter une goutte de gel de traitement d’échantillon tel que Histogel (maintenu à 37 ° C) au bouchon de matrice et maintenir à 4 ° C jusqu’à ce que le gel se solidifie.
- Transférer le bouchon dans une cassette d’incorporation, déshydrater en augmentant les concentrations d’éthanol (70, 90 et 100%), clair dans le xylène et incorporé dans la cire de paraffine.
- Coupez des sections de 7 μm sur un microtome et collectez sur des lames chargées positivement.
- Coloration par immunofluorescence des organoïdes
- Placer les glissières à 65 °C pendant 30 min pour les dégazer.
- Déparaffiniser les sections par immersion dans le xylène et réhydrater en diminuant les concentrations d’éthanol.
- Effectuer la récupération d’antigènes à haute température dans une solution de démasquage d’antigène, base d’acide citrique à l’aide d’un récupérateur disponible dans le commerce en trempant des lames dans la solution pendant 15 min (Tableau des matériaux).
- Entourez le tissu d’une barrière hydrophobe à l’aide d’un stylo pap.
- Bloquer la coloration non spécifique entre les anticorps primaires et le tissu, en incubant dans le tampon bloquant.
- Incuber des sections à la concentration appropriée d’anticorps primaires dilués dans une solution d’incubation pendant la nuit à 4 °C dans une chambre humidifiée.
- Rincer les sections 3x à température ambiante avec un tampon de lavage.
- Incuber à la concentration appropriée d’anticorps secondaire conjugué au fluorochrome pendant 1 h à température ambiante.
- Rincer les sections 3x à température ambiante avec 0,1% Tween 20-TBS. Incuber les sections pendant 5 min dans DAPI (1 μg/mL). Rincer les sections une fois dans TBS (solution saline tamponnée Tris) avec 0,1 % Tween 20, sécher et monter dans une solution de montage (Figure 4 et Figure 5).
REMARQUE : La source et la dilution de travail optimale des anticorps primaires et secondaires utilisés pour la coloration par immunofluorescence sont incluses dans la Table des matériaux.
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Representative Results
Tissu pulmonaire source
La trachée et la bronche extrapulmonaire (figure 1A) ont été utilisées comme tissu source pour l’isolement des cellules épithéliales proximales des voies respiratoires et la génération subséquente d’organoïdes proximaux. Le tissu pulmonaire distal qui comprend à la fois le parenchyme et les petites voies respiratoires de moins de 2 mm de diamètre (figure 1A) a été utilisé pour l’isolement des petites cellules épithéliales et alvéolaires des voies respiratoires (épithélium pulmonaire distal) et la génération de petites voies respiratoires ou d’organoïdes alvéolaires. Les voies respiratoires proximales tapissées d’un épithélium pseudostratifié comprennent des cellules progénitrices basales abondantes qui sont immunoréactives pour la protéine membranaire NGFR (Figure 1B, C). En revanche, les cellules épithéliales tapissant les alvéoles comprenaient un sous-ensemble montrant une immunoréactivité de la membrane apicale avec l’anticorps monoclonal HTII-280, suggérant leur identité alvéolaire de type 2 (AT2) (Figure 1B,D). Ces marqueurs de surface ont été utilisés pour sous-ensemble des suspensions unicellulaires de cellules épithéliales isolées de régions proximales ou distales.
Dissociation tissulaire et fractionnement cellulaire
Des suspensions unicellulaires de cellules totales ont été isolées dans des régions proximales ou distales du tissu pulmonaire humain et fractionnées à l’aide de billes magnétiques et de FACS pour produire des populations de cellules épithéliales enrichies (figure 2 et figure 3). Des types abondants de cellules contaminantes, y compris les globules rouges, les cellules immunitaires et les cellules endothéliales, ont été colorés à l’aide d’anticorps dirigés contre CD235a, CD45 et CD31, respectivement, suivis d’un tri cellulaire associé au magnétisme pour l’épuisement de ces types de cellules du pool total de cellules pulmonaires. Les suspensions cellulaires « épuisées » qui en ont résulté ont été significativement enrichies pour les populations de cellules épithéliales dans des échantillons de tissus distaux (Figure 2E) et proximaux (Figure 3E), avec une augmentation correspondante de l’efficacité du FACS. Après épuisement des cellules CD235a/CD45/CD31 positives utilisant des microbilles CD45 et CD31, le pourcentage de lymphocytes CD31-/CD45-/CD235a- est passé de 14 % (Figure 2A,B) à 51,7 % (Figure 2E,F) dans la population distale. L’épuisement supplémentaire des cellules colorant positivement pour CD235a, CD45 ou CD31, l’élimination des cellules avec coloration positive pour DAPI et la sélection positive pour le marqueur de surface cellulaire épithéliale CD326, ont conduit à une population de cellules distales hautement enrichie qui représentait 33,5% (Figure 2E,G) contre 7% (Figure 2A,C ) avant l’épuisement de la population négative. Un sous-réglage supplémentaire des populations de cellules épithéliales distales a été obtenu par fractionnement basé sur la coloration de surface avec l’anticorps monoclonal HTII-280 (Figure 2D,H), respectivement. En conséquence, les cellules épithéliales pulmonaires distales comprenaient 4,3 % de sous-ensembles HTII-280+ et 2,6 % HTII-280- (Figure 2D sans épuisement de CD31/CD45/CD235a) et 30 % de SOUS-ensembles HTII-280+ et HTII-280- à 3,6 % (Figure 2H après épuisement de CD31/CD45/CD235a).
Le nombre total de cellules isolées de la région proximale a été épuisé pour les cellules POSITIVES CD235a/CD45/CD31 utilisant des microbilles CD45 et CD31 et le pourcentage de CD31-/CD45-/CD235a- est passé de 17 % (Figure 3A,B) à 56,6 % (Figure 3E,F). La sélection positive du marqueur de surface des cellules épithéliales CD326 dans des cellules isolées de la région proximale a conduit à une population de cellules proximales hautement enrichie qui représentait 38% (Figure 3E,G) des fractions totales de cellules pulmonaires contre 9,3% (Figure 3A,C) sans épuisement de la population négative, respectivement. Un sous-réglage supplémentaire des populations de cellules épithéliales proximales a été obtenu par fractionnement basé sur une coloration de surface avec des anticorps dirigés contre le NGFR (Figure 3D,H), respectivement. En conséquence, les cellules épithéliales pulmonaires proximales comprenaient 2,7 % de sous-ensembles NGFR+ et 6,5 % de NGFR- (figure 3D sans épuisement de CD31/CD45/CD235a) et 13 % étaient NGFR+ et 25 % NGFR- (figure 3H après épuisement de CD31/CD45/CD235a).
Cultures organoïdes pulmonaires
Les organoïdes épithéliaux pulmonaires distaux ont été cultivés dans une matrice de membrane basale appauvrie en facteur de croissance dans des milieux qui ont été testés empiriquement pour optimiser la croissance et la différenciation organoïdes. Trois milieux différents ont été évalués, dont le milieu PneumaCult-ALI, le milieu de croissance des petites cellules épithéliales des voies respiratoires (milieu SAECG) et le milieu basal de souris. La croissance organoïde optimale a été obtenue en utilisant le milieu PneumaCult-ALI, qui a été sélectionné pour d’autres études. Des cultures de cellules épithéliales pulmonaires distales HTII-280+ ont donné des organoïdes en expansion rapide avec une efficacité moyenne de formation de colonies de 10 % (Figure 4A,B). La coloration par immunofluorescence de cultures de jour 30 à l’aide de l’anticorps monoclonal HTII-280 et SPC a révélé des organoïdes contenant de la lumière composés principalement de cellules épithéliales pulmonaires distales HTII-280+ et SPC+ (Figure 4C,C’et Figure 4D,D'). Des cultures de cellules HTII-280- épithéliales pulmonaires distales ont donné des organoïdes composés d’un épithélium pseudostratifié ressemblant à celui de petites voies respiratoires (non montré).
Des organoïdes épithéliaux pulmonaires proximaux ont été cultivés à partir de cellules NGFR+ ensemencées dans Matrigel et cultivées pendant 30 jours dans un milieu PneumaCult-ALI. De grands organoïdes contenant de la lumière ont été observés (figure 5D, E, F) avec une efficacité moyenne de formation de colonies de 7,8 % (figure 5A, B, C). Les organoïdes étaient composés d’un épithélium pseudostratifié composé de cellules basales Krt5+ et NGFR+ auto-renouvelantes (Figure 5D, 5E) et de types de cellules luminales différenciées comprenant des cellules ciliées FoxJ1+ et des cellules sécrétoires MUC5AC+ (Figure 5D,E).
Figure 1 : Échantillonnage de tissu pulmonaire humain. (A) Représentation schématique du poumon humain montrant la stratégie d’échantillonnage des régions proximales et distales pour l’isolement cellulaire. (B) Coloration H & E des régions proximales et distales du poumon. (C,D) Coloration immunofluorescente des régions correspondantes montrant des cellules progénitrices basales NGFR+ (rouges) au niveau de la membrane basale des voies respiratoires bronchiques et des progéniteurs alvéolaires HTII-280+ de type II (verts) dans les alvéoles. barre d’échelle = 50 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Stratégie de tri représentative des cellules pulmonaires distales. (A,E) Pourcentage de diverses populations cellulaires avant et après l’épuisement de la population cd45+ et cd31+ utilisant des billes magnétiques CD31 et CD45 dans les régions distales du poumon à partir d’un échantillon biologique. (B,F) Image représentative du diagramme FACS montrant la stratégie de contrôle de la population distale CD31-/CD45-/CD235a- avant et après l’épuisement de la population positive CD31/CD45/CD235a (C,G) De la population Epcam+ avant et après l’épuisement de la population positive CD31/CD45/CD235a. (D,H) HTII-280+/- avant et après épuisement des cellules CD31/CD45/CD235a positives. Les panels A-D proviennent du même échantillon biologique et les panneaux E-H proviennent du même échantillon biologique. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Stratégie de tri représentative des cellules pulmonaires proximales. (A,E) Pourcentage de diverses populations cellulaires avant et après épuisement de la population CD45+ et CD31+ à l’aide de billes magnétiques CD31 et CD45 dans les régions proximales du poumon. (B,F) Image représentative du diagramme FACS montrant la stratégie de contrôle de la population proximale CD31-/CD45-/CD235a- avant et après l’épuisement de la population positive CD31/CD45/CD235a (C,G) Epcam+ avant et après l’épuisement de la population positive CD31/CD45/CD235a. (D,H) Population de NGFR+/- avant et après épuisement des cellules CD31/CD45/CD235a positives. Les panels A-D et E-H ont été préparés à partir de deux échantillons biologiques différents. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Caractérisation des organoïdes pulmonaires distaux. (A) Image représentative des organoïdes distaux humains cultivés en milieu PneumaCult-ALI (grossissement 2x). (B) L’efficacité de formation des colonies (%CFE) a été calculée sur des puits triples d’organoïdes provenant de deux échantillons biologiques différents. (C, C') Coloration immunofluorescente des organoïdes distaux correspondants cultivés dans un milieu ALI montrant des cellules HTII-280+ AT2 (vert). (D, D') Le marqueur utilisé pour l’isolement des cellules AT2 dans cette étude, htII-280 costaines (vert) pour l’autre marqueur cellulaire AT2 bien caractérisé, SPC (rouge). Barre d’échelle = 50um. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Caractérisation des organoïdes proximaux du poumon proximal humain. (A,B) Image représentative des organoïdes proximaux humains cultivés dans la barre à moyenne échelle PneumaCult-ALI 50 μm. (C) Le pourcentage d’efficacité de formation de colonies (%CFE) a été calculé sur des puits triples d’organoïdes dérivés de deux échantillons biologiques différents. Coloration immunofluorescente d’organoïdes proximaux différenciés au jour 30 avec (D) des cellules basales Krt5+ (vert), des cellules ciliées FoxJ1+ (rouges) (E) des cellules basales Krt5+ (vertes) et des cellules gobelets MUC5AC+ (rouges). (F) Le marqueur utilisé pour l’isolement des cellules basales dans cette étude, les co-colorations NGFR (vert) pour le marqueur basocellulaire bien caractérisé, Krt5 (rouge). Barre d’échelle = 50 μm. Veuillez cliquer ici pour afficher une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Nous décrivons une méthode fiable pour l’isolement de sous-populations définies de cellules pulmonaires du tissu pulmonaire humain pour l’analyse moléculaire ou fonctionnelle et la modélisation de la maladie. Les éléments critiques des méthodes comprennent la capacité d’obtenir la dissociation tissulaire avec préservation des épitopes de surface, qui permettent l’enrichissement par anticorps de cellules fraîchement isolées, et l’optimisation des méthodes de culture pour la génération efficace d’organoïdes épithéliaux spécifiques à la région. Nous nous concentrons sur la récupération et l’enrichissement des cellules progénitrices épithéliales capables de former des organoïdes lorsqu’elles sont recombinées avec des cellules de soutien stromales en culture tridimensionnelle. Même si nous n’avons pas défini la clonalité des organoïdes dans ces cultures, des études similaires réalisées à l’aide de cellules progénitrices épithéliales pulmonaires isolées de souris se sont avérées clonales basées sur l’utilisation de cultures mixtes de cellules hébergeant des rapporteurs fluorescents distincts22,23.
Les méthodes décrites ici comprennent des adaptations destinées à améliorer la récupération cellulaire du tissu pulmonaire digéré. Les échantillons digérés sont passés à travers une aiguille de calibre 16 pour perturber davantage les amas non digérés restants et pour obtenir une suspension cellulaire homogène. L’agrégation cellulaire causée par l’ADN génomique extrudé a été atténuée par l’ajout de DNase I, qui a produit une préparation cellulaire homogène qui fournit un flux fluidique ininterrompu pendant l’isolement FACS. Ensemble, ces modifications simples améliorent la récupération des populations cellulaires cibles et évitent les retards dus à l’agglutination pendant l’enrichissement du FACS.
Les protocoles précédents prévoient une digestion tissulaire avec de l’élastase, de la dispase et de la tripsine/2 mM d’EDTA pour produire une suspension unicellulaire avant l’isolement cellulaire 4,5. Cependant, cette combinaison de protéases entraîne une perte de protéines de surface et nécessite que les cellules soient cultivées pendant la nuit sur des boîtes de culture enrobées de purcol pour la réexpression des protéines de surface avant la coloration des anticorps et le FACS. En revanche, la combinaison de la liberase et de l’agitation mécanique pour perturber en douceur le tissu pulmonaire fournit un protocole de dissociation plus efficace, mais plus doux, qui peut être effectué plus rapidement tout en préservant les épitopes de surface pour la coloration des anticorps et l’enrichissement du FACS. Ainsi, le temps total de traitement des tissus est condensé et l’isolement FACS peut être effectué immédiatement après la dissociation des tissus.
Ces méthodes permettent l’isolement et la culture in vitro de cellules progénitrices épithéliales qui produisent une progéniture spécialisée représentative de leur région d’origine. Cependant, ces méthodes peuvent être appliquées de la même manière à l’identification et à l’enrichissement d’autres populations cellulaires telles que les types de cellules immunitaires, vasculaires et stromales. Cela pourrait être particulièrement applicable au développement de systèmes régionaux d’épithélium pulmonaire sur puce qui permettent la modélisation des compartiments vasculaires et épithéliaux et l’introduction d’autres types de cellules telles que les cellules immunitaires 24,25,26. Dans une étude récente, nous avons utilisé des cultures organoïdes 3D d’épithélium alvéolaire générées à l’aide de cette méthodologie qui ont été utilisées comme outil pour étudier la modélisation COVID 19 du poumon et pour dépister des cibles thérapeutiques contre l’infection par le SRAS-CoV-2. 27
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Nous apprécions le soutien de Mizuno Takako pour la coloration IFC et H et E, Vanessa Garcia pour la section des tissus et Anika S Chandrasekaran pour l’aide à la préparation du manuscrit. Ce travail est soutenu par les National Institutes of Health (5RO1HL135163-04, PO1HL108793-08) et le Consortium Celgene IDEAL.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell Isolation | |||
| 10 mL Sterile syringes, Luer-Lok Tip | Fisher scientific | BD 309646 | |
| 30 mL Sterile syringes, Luer-Lok Tip | VWR | BD302832 | |
| Biohazard bags | VWR | 89495-440 | |
| Biohazard bags | VWR | 89495-440 | |
| connecting ring | Pluriselect | 41-50000-03 | |
| Deoxyribonuclease (lot#SLBF7798V) | sigma Aldrich | DN25-1G | |
| Disposable Petri dishes | Corning/Falcon | 25373-187 | |
| Funnel | Pluriselect | 42-50000 | |
| HBSS | Corning | 21-023 | |
| Liberase TM Research Grade | sigma Aldrich | 5401127001 | |
| needle 16G | VWR | 305198 | |
| needle 18G | VWR | 305199 | |
| PluriStrainer 100 µm (Cell Strainer) | Pluriselect | 43-50100-51 | |
| PluriStrainer 300 µm (Cell Strainer) | Pluriselect | 43-50300-03 | |
| PluriStrainer 40 µm (Cell Strainer) | Pluriselect | 43-50040-51 | |
| PluriStrainer 500 µm (Cell Strainer) | Pluriselect | 43-50500-03 | |
| PluriStrainer 70 µm (Cell Strainer) | Pluriselect | 43-50070-51 | |
| Razor blades | VWR | 55411-050 | |
| Red Blood Cell lysis buffer | eBioscience | 00-4333-57 | |
| Equipment’s | |||
| GentleMACS C Tubes | MACS Miltenyi Biotec | 130-096-334 | |
| GentleMACS Octo Dissociator | MACS Miltenyi Biotec | 130-095-937 | |
| Leica ASP 300s Tissue processor | |||
| LS Columns | MACS Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| MACS MultiStand** | Miltenyi Biotech | 130-042-303 | |
| Thermomixer | Eppendorf | 05-412-503 | |
| Thermomixer | Eppendorf | 05-412-503 | |
| HBSS+ Buffer | |||
| Amphotericin B | Thermo fisher scientific | 15290018 | 2ml |
| EDTA (0.5 M), pH 8.0, RNase-free | Thermo fisher scientific | AM9260G | 500µl |
| Fetal Bovine Serum | Gemini Bio-Products | 100-106 | 10ml |
| HBSS Hank's Balanced Salt Solution 1X 500 ml | VWR | 45000-456 | 500ml bottle |
| HEPES (1 M) | Thermo fisher scientific | 15630080 | 5ml |
| Penicillin-Streptomycin-Neomycin (PSN) Antibiotic Mixture | Thermo fisher scientific | 15640055 | 5ml |
| List of antibodies for FACS | |||
| Alexa Fluor 647 anti-human CD326 (EpCAM) Antibody | BioLegend | 369820 | 1:50 |
| BD CompBead Anti-Mouse Ig, K/ Negative control particles set | Fisher Scientific | BDB552843 | |
| CD31 MicroBead Kit, human | Miltenyi Biotec | 130-091-935 | 20µl/ 107 total cells |
| CD45 MicroBeads, human | Miltenyi Biotec | 130-045-801 | 20µl/ 107 total cells |
| DAPI | Sigma Aldrich | D9542-10MG | 1:10000 |
| FITC anti-human CD235a | BioLegend | 349104 | 1:100 |
| FITC anti-human CD31 | BioLegend | 303104 | 1:100 |
| FITC anti-human CD45 | BioLegend | 304054 | 1:100 |
| FITC anti-mouse IgM Antibody | BioLegend | 406506 | 1:500 |
| Mouse IgM anti human HT2-280 | Terrace Biotech | TB-27AHT2-280 | 1:300 |
| PE anti-human CD271(NGFR) | BioLegend | 345106 | 1:50 |
| Composition of Organoid Culture mediums | |||
| MRC-5 | ATCC | CCL-171 | |
| PneumaCult -ALI Medium | Stemcell Technologies | 5001 | |
| Small Airway Epithelial Cell Growth Medium | PromoCell | C-21170 | |
| ThinCert Tissue Culture Inserts, Sterile | Greiner Bio-One | 662641 | |
| Y-27632 (ROCK inhibitor) 100mM stock (1000x) | Stemcell Technologies | 72302 | |
| Mouse Basal medium: | |||
| Amphotericin B | Thermo fisher scientific | 15290018 | 50 µl |
| DMEM/F-12, HEPES | ThermoFisher scientific | 11330032 | 50 ml |
| Fetal Bovine Serum | Gemini Bio-Products | 100-106 | 5 ml |
| Insulin-Transferrin-Selenium (ITS -G) (100X) | ThermoFisher scientific | 41400045 | 500 µl |
| Penicillin-Streptomycin-Neomycin (PSN) Antibiotic Mixture | Thermo fisher scientific | 15640055 | 500 µl |
| SB431542 TGF-β pathway inhibitor (stock 100 mM) | Stem cell | 72234 | 5 µl |
| List of antibodies for Immunohistochemistry | |||
| Antigen unmasking solution, citric acid based | Vector | H-3300 | 937 µl in 100ml water |
| Histogel | Thermo Scientific | HG-4000-012 | |
| Primary Antibodies | |||
| Anti HT2-280 | Terracebiotech | TB-27AHT2-280 | 1:500 |
| FOXJ1 Monoclonal Antibody (2A5) | Thermo Fisher Scientific | 14-9965-82 | 1:300 |
| Human Uteroglobin/SCGB1A1 Antibody | R and D systems | MAB4218 | 1:300 |
| Keratin 5 Polyclonal Chicken Antibody, Purified [Poly9059] | Biolegend | 905901 | 1:500 |
| MUC5AC Monoclonal Antibody (45M1) | Thermo Fisher Scientific | MA5-12178 | 1:300 |
| PDPN / Podoplanin Antibody (clone 8.1.1) | LifeSpan Biosciences | LS-C143022-100 | 1:300 |
| Purified Mouse Anti-E-Cadherin | BD biosciences | 610182 | 1:1000 |
| Sox-2 Antibody | Santa Cruz biotechnologies | sc-365964 | 1:300 |
| Secondary Antibodies | |||
| Donkey anti-rabbit lgG, 488 | Thermo Fisher Scientific | A-21206 | 1:500 |
| FITC anti-mouse IgM Antibody | BioLegend | 406506 | 1:500 |
| Goat anti-Hamster IgG (H+L), Alexa Fluor 594 | Thermo Fisher Scientific | A-21113 | 1:500 |
| Goat anti-Mouse IgG1 Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-21121 | 1:500 |
| Goat anti-Mouse IgG2a Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-21131 | 1:500 |
| Goat anti-Mouse IgG2a Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A-21134 | 1:500 |
| Goat anti-Mouse IgG2b Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A-21144 | 1:500 |
| Buffers | |||
| Immunohistochemistry Blocking Solution | 3% BSA, o.4% Triton-x100 in TBS (Tris based saline) | ||
| Immunohistochemistry Incubation Solution | 3% BSA, ).1% Triton-X100 in TBS | ||
| Immunohistochemistry Washing Solution | TBS with 0.1% Tween 20 |
References
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