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Biology

오가노이드 배양을 위한 인간 폐 상피 전구 세포의 분리 및 농축

Published: July 21, 2020 doi: 10.3791/61541
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Lung and Regenerative Medicine Institutes, Department of Medicine, Cedars-Sinai Medical Center

Summary

이 기사는 인간 폐의 근위 및 원위 영역으로부터 생존 가능한 상피 세포의 농축을 허용하는 조직 해리 및 세포 분획화 접근법에 대한 상세한 방법론을 제공한다. 본원에서 이러한 접근법은 3D 오가노이드 배양 모델의 사용을 통한 폐 상피 전구 세포의 기능적 분석에 적용된다.

Abstract

상피 오가노이드 모델은 장기 시스템의 기본 생물학을 연구하고 질병 모델링을 연구하는 데 유용한 도구 역할을합니다. 오가노이드로서 성장할 때, 상피 전구 세포는 생체 내 대응물과 유사한 세포 기능을 나타내는 분화 자손을 스스로 갱신하고 생성할 수 있다. 여기에서 우리는 인간 폐에서 지역 특정 선조를 분리하고 실험 및 검증 도구로서 3D 오가노이드 배양물을 생성하는 단계별 프로토콜을 설명합니다. 우리는 영역 특이적 전구 세포를 분리하는 것을 목표로 폐의 근위 및 원위 영역을 정의합니다. 우리는 폐와 기관으로부터 전체 세포를 분리하기 위해 효소 및 기계적 해리의 조합을 이용했습니다. 이어서, 특정 전구 세포를 기저 세포를 분류하기 위한 NGFR 및 폐포 유형 II 세포를 분류하기 위한 HTII-280과 같은 세포 유형 특이적 표면 마커에 기초한 형광 관련 세포 분류 (FACS)를 사용하여 근위 또는 원위 기원 세포로부터 분획화하였다. 분리된 기저 또는 폐포 유형 II 전구물질을 사용하여 3D 오가노이드 배양물을 생성하였다. 원위 및 근위 선조는 모두 30 일째에 5000 세포 / 웰을 도금 할 때 원위 영역에서 9-13 %, 근위 영역에서 7-10 %의 콜로니 형성 효율을 가진 오가노이드를 형성했습니다. 원위 오가노이드는 배양물에서 HTII-280+ 폐포 유형 II 세포를 유지한 반면, 근위 오가노이드는 30일째까지 섬모 및 분비 세포로 분화되었다. 이러한 3D 오가노이드 배양은 폐 상피 및 상피 중간엽 상호작용의 세포 생물학을 연구하기 위한 실험 도구로서뿐만 아니라, 질병에서 상피 기능장애를 표적으로 하는 치료 전략의 개발 및 검증을 위한 실험 도구로 사용될 수 있다.

Introduction

인간 호흡 시스템의 공역은 크게 가스의 수송과 상피 - 미세 혈관 장벽을 가로 지르는 후속 교환을 매개하는 전도 구역과 호흡 영역으로 나눌 수 있습니다. 전도 기도에는 기관지, 기관지, 세기관지 및 말단 세기관지가 포함되며 호흡기 공기 공간에는 호흡기 세기관지, 폐포관 및 폐포가 포함됩니다. 이러한 영공의 상피 라이닝은 각 기능적으로 구별되는 구역의 고유한 요구 사항을 수용하기 위해 근위축을 따라 구성이 바뀝니다. 기관지 기도의 의사 층화 상피는 브러시, 신경 내분비 및 이온성 세포 1,2,3을 포함한 덜 풍부한 세포 유형 외에도 기저, 분비 및 섬모의 세 가지 주요 세포 유형으로 구성됩니다. Bronchiolar 기도는 형태학적으로 유사한 상피 세포 유형을 가지고 있지만, 풍부함과 기능적 특성에는 구별이 있습니다. 예를 들어, 기저 세포는 기관지 기도 내에 덜 풍부하며, 분비 세포는 기관지-기관지 기도에서 우세한 장액성 및 잔 세포에 비해 클럽 세포의 더 큰 비율을 포함한다.  호흡 영역의 상피 세포는 폐포관 및 폐포 1,4의 폐포 유형 I (ATI) 및 유형 II (ATII) 세포 이외에 호흡 세기관지에서 잘못 정의된 입방체 세포 유형을 포함한다.

각 구역에서 상피의 유지 및 재생에 기여하는 상피 줄기 및 전구 세포 유형의 동일성은 불완전하게 기술되고 동물 모델 5,6,7,8의 연구로부터 크게 추론된다. 생쥐에 대한 연구에 따르면 의사 층화 된 기도의 기저 세포 또는 기관지 기도의 클럽 세포 또는 폐포 상피의 ATII 세포는 무제한의 자기 재생 및 분화 능력을 기반으로 상피 줄기 세포 역할을한다는 것을 보여주었습니다 7,9,10,11,12 . 인간 폐 상피 세포 유형의 줄기를 평가하기 위해 유전 적 혈통 추적 연구를 수행 할 수 없음에도 불구하고, 상피 줄기 및 전구 세포의 기능적 잠재력을 평가하기위한 오가노이드 기반 배양 모델의 가용성은 마우스와 인간 13,14,15,16,17 사이의 비교 연구를위한 도구를 제공합니다.

우리는 인간 폐의 다른 영역에서 상피 세포 유형을 분리하는 방법과 지역 세포 유형을 재조정하기 위해 3D 오가노이드 시스템을 사용하여 배양하는 방법을 설명합니다. 유사한 방법들이 다른 기관 시스템들로부터의 상피 세포의 기능적 분석 및 질병 모델링을 위해 개발되었다 18,19,20,21. 이러한 방법은 지역 상피 전구 세포의 확인, 그들의 조절 및 미세 환경을 조사하는 기계론적 연구를 수행하고, 질병 모델링 및 약물 발견을 가능하게하는 플랫폼을 제공합니다. 동물 모델에서 수행된 폐 상피 전구 세포에 대한 연구가 생체내 또는 시험관내 분석으로부터 이익을 얻을 수 있음에도 불구하고, 인간 폐 상피 전구 세포의 동일성에 대한 통찰력은 모델 유기체로부터의 외삽에 크게 의존해 왔다. 따라서 이러한 방법은 인간 폐 상피 세포 유형의 정체성과 행동을 줄기 / 전구 세포의 조절을 조사하는 연구와 관련시키는 다리를 제공합니다.

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Protocol

인간의 폐 조직은 국제 의학 진흥 연구소 (IIAM)가 개발 한 동의 절차에 따라 사망 한 조직 기증자로부터 얻었으며 Cedars-Sinai Medical Center 내부 검토위원회의 승인을 받았습니다.

1. 기관지 또는 소기도/실질(소기도 및 폐포) 부위에서 폐 세포를 분리하기 위한 조직 처리

  1. 세포 격리 하루 전에 모든 해부 장비, 유리 제품 및 적절한 솔루션을 준비하고 오토클레이브하십시오.
  2. 폐 조직을 받으면 근위 및 원위 영역을 확인하고 분리하십시오. 기관과 기관지는 "근위"로 간주됩니다. 이 프로토콜의 목적을 위해, 기관과 기관지의 처음 2-3 세대는 해부되어 "근위"기도 상피의 분리에 사용됩니다. 직경이 2mm 이하의 작은 기도와 주변 실질 조직은 이 프로토콜의 목적을 위해 "원위" 폐 상피로 간주된다(도 1A).
    참고 : 인간 폐 조직 처리와 관련된 모든 절차는 적절한 개인 보호 장비를 사용하여 생물 안전 캐비닛에서 수행해야합니다.

2. 원위 폐 조직으로부터의 작은 기도 및 폐포 상피 전구 세포의 농축 및 하위설정

  1. 원위 조직 준비
    1. 원위 폐 조직을 멸균 페트리 접시 (150 x 15 mm)에 넣으십시오. 주사위 조직을 약 1cm3 조각으로 넣고 깨끗한 50 mL 튜브에 넣습니다.
    2. 조직을 차가운 HBSS로 3배 세척하고, 매번 HBSS 세척을 버리고 혈액 및 상피 안감액을 제거한다.
    3. 조직을 새로운 페트리 접시에 넣고 멸균 된 보풀 방지 물티슈로 닦으십시오. 포셉과 가위를 사용하여 가능한 한 많은 내장 흉막 (폐의 표면을 덮는 섬세한 투명 막)을 제거하십시오.
    4. 가위를 사용하여 조직을 직경 약 2mm의 조각으로 다듬습니다. 다진 티슈를 깨끗한 페트리 접시에 옮기고 멸균 단면 면도날로 약 1mm의 크기로 잘라서 더 다듬습니다.
  2. 효소 소화
    참고: Liberase 원액은 5 mg/mL (100x)이고 DNase 스톡은 2.5 mg/mL (100x)입니다 (물차표).
    1. 50 μg/mL 리베라아제 및 25 μg/mL DNase를 50 mL 코니컬 튜브의 멸균 HBSS에 첨가하십시오.
    2. 약 2-3g의 다진 조직을 리베라아제와 DNase가 포함된 HBSS 25mL가 있는 새로운 50mL 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 900 rpm으로 설정된 혼합기를 사용하여 연속 진탕하면서 37°C에서 40-60분 동안 인큐베이션한다. 인큐베이션 30분 후, 트리투레이트 소화된 조직을 바늘이 없는 30 mL 주사기를 사용하여 덩어리의 형성을 피하고 인큐베이션을 계속한다.
      참고: 효소를 사용한 배양 시간은 조직의 유형이나 상태에 따라 달라질 수 있습니다. 예를 들어, 정상 조직의 효소 소화에는 약 45분이 소요된다. 그러나, 특발성 폐 섬유증 샘플로부터의 섬유성 조직은 최대 60분의 더 긴 인큐베이션 시간을 필요로 할 수 있다. 따라서이 단계에서 조직을 신중하게 모니터링하여 FACS에 중요한 표면 마커의 손상을 방지하십시오.
  3. 단일 세포 분리
    1. 30 mL 주사기에 장착된 16 G 바늘을 통해 5x를 그리면서 조직을 트리트레이트한다. 조직 현탁액을 넓은 보어 피펫에 끌어당기고 진공 압력 하에서 일련의 세포 스트레이너 (500 μm, 300 μm, 100 μm, 70 μm, 40 μm)를 통과시킨다. 스트레이너를 HBSS+ 버퍼 20mL로 세척하여 남은 세포를 수집합니다. HBSS+ 버퍼의 제조법은 재료 표에서 찾을 수 있습니다.
    2. 동일한 부피의 HBSS+ 완충액을 여액에 45분 후에 첨가하여 Liberase 활성을 억제하고 과다 소화를 방지합니다.
    3. 여액을 4°C에서 5분 동안 500 x g 에서 원심분리한다. 조심스럽게 상청액을 제거하고 버리십시오. 펠렛에 적혈구(RBC) 용해 완충액 1mL를 첨가하고, 튜브를 부드럽게 흔들어 펠렛을 빼내고 얼음 위에서 1분 동안 배양한다.
      참고 : RBC 용해 용액의 양과 시간은 펠렛의 크기에 따라 다릅니다. 세포를 얼음 위에 유지하고 RBC 용해 용액의 시간을 신중하게 모니터링하여 표적 세포의 용해를 방지하는 것이 중요합니다. RBC 용해가 불충분하면 단계를 반복하십시오.
    4. 10-20 mL의 HBSS+ 완충액을 첨가하여 RBC 용해 완충액을 중화시킨다. 여액을 4°C에서 5분 동안 500 x g 에서 원심분리한다.
    5. 용해된 적혈구(유령 세포)가 세포 펠릿 위에 흐린 층을 형성하면, 10 mL의 HBSS+ 완충액에 펠렛을 재현탁시키고 70 μm 세포 스트레이너를 통해 현탁액을 변형시켜 유령 세포를 제거한다. 여액을 4°C에서 5분 동안 500 x g 에서 원심분리하고 추가 단계를 진행한다.
  4. 면역 세포 및 내피 세포의 고갈 (선택적 단계)
    1. 제조사의 프로토콜에 따라 모노클로날 항인간 CD31 및 CD45 항체(이소타입 마우스 IgG1) 및 LS 컬럼에 접합된 CD31 및 CD45 마이크로비드를 사용하여 전체 세포 풀로부터 CD31+ 내피 세포 및 CD45+ 면역 세포를 고갈시킨다(표 of Materials).
    2. 상피 및 기질 세포로 주로 구성된 유동을 신선한 멸균 튜브에서 수집하고, 이를 4°C에서 5분 동안 500 x g 에서 원심분리한다. 셀 카운트를 수행하여 흐름에서 총 셀 수를 확인합니다.
  5. 형광 관련 세포 분류를 위한 세포 표면 염색 (FACS)
    1. HBSS+ 완충액 1mL당 1 x 107 세포를 재현탁하십시오. 필요한 농도에서 일차 항체를 첨가하고, 세포를 어둠 속에서 4°C에서 30분 동안 인큐베이션한다. 본 연구에서, 달리 언급되지 않는 한, 형광단 접합된 일차 항체가 사용되었다. 항체 공급원 및 역가에 대한 세부사항은 표 of Materials에 기재되어 있다.
      참고: HTII-280은 현재 원위 폐 세포를 우세한 기도 (HTII-280-) 및 폐포 유형 2 (HTII-280+) 세포 분획으로 서브셋팅할 수 있는 최고의 표면 반응성 항체입니다. 이 전략에 대한주의 사항은 AT1 세포가이 방법을 사용하여 염색되지 않고 취약성으로 인해 제대로 표현되지 않는다는 것입니다. 그러나, AT1 세포는 원위 폐 제제에서 저조하게 나타나는데, 아마도 FACS에 의한 생존 가능한 세포의 선택 동안 그들의 취약성 및 손실로 인해 그리고 따라서 기도 세포 분획의 희귀한 오염물만을 나타낸다.
    2. HBSS+ 완충액 3 mL를 첨가하고 4°C에서 5분 동안 500 x g 에서 원심분리하여 세포를 세척한다.
    3. 접합되지 않은 일차 항체를 사용하는 경우, 적절한 형광단 접합된 이차 항체의 필요한 농도를 첨가하고, 얼음 상에서 30분 동안 인큐베이션한다. 3 mL의 HBSS+ 완충액을 첨가하고 4°C에서 5분 동안 500 x g 에서 원심분리하여 과량의 이차 항체를 세척한다.
    4. 상청액을 버리고 세포를 HBSS+ 완충액 당 1 x 10 7 세포/mL에 재현탁시킨다. 스트레이너 캡을 통해 세포를 5mL 폴리스티렌 튜브로 필터링하여 단일 세포 현탁액의 형성을 보장합니다. DAPI (1 μg / mL)를 추가하여 투과성 (죽은) 세포를 염색하십시오.
      참고: FACS 동안 위양성을 최소화하기 위해 적절한 단색 및 형광 마이너스 하나(FMO) 대조군(즉, 항체 염색 칵테일에서 각각 하나의 항체를 뺀 것)을 사용하는 것이 중요합니다. 이 연구에서, 양성 및 음성 선택 비드가 형광단 사이의 방출 스펙트럼의 중첩에 대한 경험적 보상을 위해 사용되었다 (표 물질). FACS는 관심있는 세포 유형을 풍부하게합니다. 생존 가능한 상피 세포는 DAPI에 대한 그들의 CD45 음성, CD31 음성, CD236 양성 세포 표면 표현형 및 음성 염색에 기초하여 농축된다. 이러한 상피 세포 분획은 AT2 세포에 대해 농축되는 HTII-280 양성 세포에 대한 특이적 염색과 같은 세포 유형별 표면 마커에 대한 염색에 기초하여 추가로 하위세트될 수 있다. 대조적으로, HTII-280에 대한 음성 선택은 클럽 및 섬모 세포와 같은 작은 기도 상피 세포의 농축을 허용한다 (그림 2).

3. 기관지 기도에서 상피 전구 세포의 농축 및 서브 세팅

  1. 조직 준비
    1. 폐에서 근위기도 (기관 / 기관지)를 해부하십시오. 가위를 사용하여 길이를 따라 기도를 열어 루멘을 노출시키고 50 μg/mL Liberase를 추가하여 조직을 완전히 덮습니다.
    2. 900 rpm으로 설정된 열 혼합기를 사용하여 연속 진탕하면서 37°C에서 20분 동안 인큐베이션한다.
    3. 원심분리 튜브에서 근위 기도를 제거하고 멸균 페트리 접시 (150 x 15 mm)에 넣으십시오. 메스를 사용하여 기도의 표면을 부드럽게 긁어 조직에서 발광 상피 세포를 완전히 제거합니다.
    4. 페트리 접시를 멸균 HBSS+ 버퍼 5mL로 세척하여 모든 탈락된 발광 상피 세포를 수집하고 탈락된 세포를 50mL 원뿔형 원심분리 튜브로 옮깁니다. 현탁액을 10 mL 주사기에 끼워 넣은 16 G 바늘 및 18 G 바늘을 통해 5x 드로잉하여 트리튜레이트하여 단일 세포 현탁액을 얻는다.
    5. 현탁액을 4°C에서 5분 동안 500 x g 에서 원심분리한다. 펠렛을 신선한 HBSS+ 버퍼에 재현탁하고 이러한 발광 기도 세포를 얼음 위에 보관하여 다음 단계에서 다진 근위 기도에서 생성된 단일 세포 현탁액과 결합할 수 있도록 준비합니다.
    6. 가위를 사용하여 고리를 따라 남아있는 기관 기관지 조직을 잘라 작은 조직 스트립을 생성하고 스트립을 신선한 페트리 접시로 옮깁니다. 작은 조각을 만들기 위해 단면 면도날을 사용하여 조직 스트립을 다듬습니다.
      참고: 근위 기도는 연골성이기 때문에 원위 폐 조직만큼 미세하게 다듬을 수 없습니다.
    7. 다진 조직을 C 튜브로 옮기고 2 mL의 Liberase를 튜브에 첨가하여 조직이 물에 잠기도록하십시오. C 튜브를 자동 해리기에 로드하고 인간 폐 프로토콜-2를 실행하여 조직을 기계적으로 더 해리시킵니다.
      참고: 이 프로토콜에 사용되는 해리제는 이 특정 용도에 대해 인간 폐 프로토콜-2라는 최적화된 프로그램을 제공합니다( 재료 표 참조).
  2. 효소 소화 및 단일 세포 분리
    1. 다진 근위 조직 약 2g을 C 튜브에서 각 50mL 원뿔형 원심분리 튜브로 옮기고 50μg/mL Liberase 및 25μg/mL DNase 용액을 각 튜브에 첨가합니다.
      참고: 효율적인 해리를 위해 튜브를 30mL 마크 이상으로 채워서는 안 됩니다.
    2. 다진 조직을 900 rpm으로 설정된 믹서를 사용하여 연속 진탕하면서 37°C에서 45분 동안 인큐베이션한다.
    3. 해리된 조직 현탁액을 상기 언급된 바와 같이 진공 압력 하에서 일련의 세포 스트레이너 (500 μm, 300 μm, 100 μm, 70 μm, 40 μm)를 통해 통과시키고, 유동을 수집한다. 스트레이너를 HBSS+ 버퍼 20mL로 세척하여 남은 세포를 수집합니다.
      참고: 근위 조직은 원위 조직에 비해 연골 및 부피가 크기 때문에 필터가 막힐 가능성이 더 큽니다. 깔때기를 사용하면 스트레이너를 통과하는 동안 액체가 넘쳐나는 것을 방지하는 데 도움이 될 수 있습니다.
    4. 여액에 동일한 부피의 HBSS+ 완충액을 첨가하여 Liberase 활성을 억제하고 과다 소화를 방지합니다. 이 단계에서 3.1.5에서 분리된 발광 근위 기도 세포를 세포 현탁액에 첨가한다.
    5. 합한 세포 현탁액을 500 x g에서 10분 동안 원심분리한다. 상청액을 제거하고 HBSS+ 완충액에서 세포 세척을 반복한다. 2.4에서 상기 언급된 바와 같이 CD45+ 면역 세포 및 CD31+ 내피 세포의 고갈을 수행한다(선택적인 단계).
    6. 염색을 위한 방법은 원위 폐 조직과 유사하며, 2.5의 단계를 따른다. DAPI에 대한 그들의 CD45 음성, CD31 음성, CD236 양성 세포 표면 표현형 및 음성 염색에 기초하여 생존가능한 상피 세포를 풍부하게 한다.
    7. 또한 상피 세포 분획을 NGFR과 같은 세포 유형 특이적 표면 마커에 대한 염색에 기초하여, 기저 (NGFR 양성) 및 비기저 (NGFR 음성; 분비, 섬모, 신경내분비) 세포 유형의 농축을 허용한다 (도 3).

4. 오가노이드 문화

  1. 5,000 (이 숫자는 상피 오가노이드의 원하는 밀도를 산출하도록 조정될 수 있음)을 7.5 x 104 MRC-5 세포 (인간 폐 섬유아세포 세포주)와 함께 멸균된 1.5 mL 튜브에 분류된 근위 또는 원위 상피 세포에 첨가한다. 상피-중간엽 상호작용은 전구 세포의 확장에 매우 중요하다.
  2. 4°C에서 5분 동안 500 x g 에서 원심분리한다.
    참고: 정확한 오가노이드 콜로니 형성 효율을 보장하기 위해 분류기에서 얻은 세포 수를 수동으로 확인하는 것이 중요합니다.
  3. 조심스럽게 상청액을 제거하고 버리고 세포 펠렛을 항생제가 보충 된 50 μL의 얼음처럼 차가운 배지에 재현탁하십시오. 세포 현탁액을 얼음 위에 보관하십시오.
  4. 50 μL의 얼음 차가운 1x 성장 인자 고갈 기저막 매트릭스 배지를 바이알에 첨가하고, 현탁액을 얼음 위에 부드럽게 피펫하여 혼합한다.
    참고 : 얼음 차가운 배지를 사용하고 얼음 위에 세포를 유지하여 기저막 매트릭스 배지의 조기 중합을 피하는 것이 중요합니다.
  5. 세포 현탁액을 24 웰 플레이트 (1.4 x 104 cells/cm2)의 0.4 μm 기공 크기 세포 배양 인서트 상에 옮기고, 기포의 도입을 피하기 위해 주의를 기울인다.
  6. 매트릭스가 응고되도록 30-45분 동안 37°C에서 인큐베이션한다.
  7. 600 μL의 예열된 성장 배지를 웰에 첨가한다.
    주: 배지는 시딩 후 처음 24시간 동안 항균제(0.4%)와 펜스트렙(1%)으로 보충되었고, 처음 72시간 동안 10 μM Rho 키나제 억제제를 보충하였다.
  8. 5%CO2 배양기에서 37°C에서 30일 동안 배양하고, 이 시간 동안 배지는 매 48시간마다 변화되어야 한다.
    참고: 배양 기간은 실험의 목적에 따라 변경될 수 있습니다. 더 긴 종점은 분화를 연구하는 데 사용되는 반면, 7 일, 14 일 등의 짧은 종점은 실험의 목적이 완전한 분화를 달성하지 못하는 경우 사용할 수 있습니다.
  9. 10 μM TGFβ 억제제를 15일 동안 배양 배지에 첨가하여 세포를 증식 단계에서 유지하고 섬유아세포의 과증식을 억제한다.
    참고: 결과는 분석에 사용된 배양 배지에 따라 다릅니다. 예를 들어, 본원에 나타낸 결과는 Pneumacult-ALI 배지를 사용하여 생성되었으며, 이는 원위 폐로부터 큰 오가노이드의 생성을 초래하고, 잘 분화되고 근위 폐로부터 더 큰 오가노이드를 초래한다.

5. 오가노이드 염색

  1. 오가노이드의 고정 및 임베딩
    1. 상부 및 하부 막횡단 삽입 챔버 둘 다로부터의 흡인물 배지를 따뜻한 PBS로 한 번 헹구십시오.
    2. 300μL의 PFA(2% w/v)를 인서트에 넣고 500μL를 웰에 넣고 37°C에서 1시간 동안 배양물을 고정합니다. 고정제를 제거하고 따뜻한 PBS로 헹구어 basememt 막 매트릭스 플러그를 뽑지 않도록주의하십시오.
      참고: 고정 오가노이드는 추가 단계를 시작하기 전에 일주일에서 2주 동안 4°C에서 PBS에 침수하여 저장할 수 있습니다.
    3. PBS를 흡인하고, 인서트를 반전시키고, 조심스럽게 그 둘레에 인서트 멤브레인을 절단한다. 포셉을 사용하여 트랜스웰 멤브레인을 제거하고 매트릭스 플러그를 방해하지 않도록주의하십시오.
    4. 페트리 접시에서 인서트를 탭하여 매트릭스 플러그를 복구하십시오.
    5. 히스토겔(37°C로 유지)과 같은 시편 처리 겔의 방울을 매트릭스 플러그에 첨가하고, 겔이 응고될 때까지 4°C에서 유지한다.
    6. 플러그를 임베딩 카세트로 옮기고, 에탄올 (70, 90 및 100 %)의 농도 증가를 통해 탈수시키고, 자일렌에서 맑게하고 파라핀 왁스에 임베드하십시오.
    7. 마이크로톰에서 7 μm 절편을 절단하고 양전하를 띤 슬라이드에 수집하십시오.
  2. 오가노이드의 면역 형광 염색
    1. 슬라이드를 65°C에서 30분 동안 디왁스하여 놓는다.
    2. 자일렌에 침지하여 절편을 탈파라핀화하고 에탄올의 농도 감소를 통해 재수화시킨다.
    3. 항원 마스크 해제 용액에서 고온 항원 검색을 수행하고, 시트르산 염기는 시판되는 리트리버를 사용하여 15분 동안 슬라이드를 용액에 침지시킨다(표 of Materials).
    4. pap 펜을 사용하여 소수성 장벽으로 조직을 둘러 쌉니다.
    5. 블로킹 버퍼에서 인큐베이션함으로써 일차 항체와 조직 사이의 비특이적 염색을 차단한다.
    6. 절편을 가습된 챔버에서 4°C에서 하룻밤 동안 인큐베이션 용액에 희석된 일차 항체의 적절한 농도로 인큐베이션한다.
    7. 세척 완충액으로 실온에서 섹션 3x를 헹구십시오.
    8. 실온에서 1시간 동안 플루오크롬 컨쥬게이션된 이차 항체의 적절한 농도에서 인큐베이션한다.
    9. 절편을 실온에서 0.1% 트윈 20-TBS로 3배 헹구십시오. 절편을 DAPI(1μg/mL)에서 5분 동안 인큐베이션합니다. 절편을 0.1% 트윈 20으로 TBS(트리스 완충 식염수)로 한 번 헹구고 건조시키고 장착 용액에 장착합니다(그림 4 및 그림 5).
      참고: 면역형광 염색에 사용되는 일차 및 이차 항체의 공급원 및 최적 작동 희석은 물질 표에 포함되어 있습니다.

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Representative Results

근원 폐 조직
기관 및 폐외 기관지 (도 1A)를 근위 기도 상피 세포의 단리와 근위 오가노이드의 후속 생성을 위한 공급원 조직으로서 사용하였다. 실질종 및 직경 2mm 미만의 작은 기도를 모두 포함하는 원위 폐 조직(도 1A)은 작은 기도 및 폐포 상피 세포(원위 폐 상피)의 단리와 작은 기도 또는 폐포 오가노이드의 생성을 위해 사용되었다. 의사층화된 상피에 의해 줄 지어 있는 근위 기도는 막 단백질 NGFR에 대해 면역반응성인 풍부한 기저 전구 세포를 포함한다(도 1B,C). 대조적으로, 폐포를 라이닝하는 상피 세포는 HTII-280 모노클로날 항체와의 정점막 면역반응성을 나타내는 하위세트를 포함하였고, 이는 그들의 폐포 유형 2 세포 (AT2) 동일성을 암시한다 (도 1B, D). 이들 표면 마커는 근위 또는 원위 영역으로부터 단리된 상피 세포의 단일 세포 현탁액을 서브세트하는데 사용되었다.

조직 해리 및 세포 분획화
전체 세포의 단일 세포 현탁액을 인간 폐 조직의 근위 또는 원위 영역으로부터 단리하고, 자기 비드 및 FACS 둘 다를 사용하여 분별하여 농축된 상피 세포 집단을 수득하였다(도 2 및 도 3). 적혈구, 면역 세포 및 내피 세포를 포함한 풍부한 오염 세포 유형을 각각 CD235a, CD45 및 CD31에 대한 항체를 사용하여 염색한 다음, 폐 세포의 전체 풀에서 이러한 세포 유형의 고갈을 위해 자기 관련 세포를 분류하였다. 생성된 "고갈된" 세포 현탁액은 원위 (도 2E) 및 근위 (도 3E) 조직 샘플 둘 다에서 상피 세포 집단에 대해 유의하게 농축되었고, 상응하는 FACS 효율의 증가가 있었다.  CD45 및 CD31 마이크로비드를 사용한 CD235a/CD45/CD31 양성 세포의 고갈 후 원위 집단에서 CD31-/CD45-/CD235a-의 비율이 14%(도 2 A,B)에서 51.7%(도 2E,F)로 증가하였다. CD235a, CD45 또는 CD31에 대해 양성으로 염색된 세포의 FACS 고갈, DAPI에 대한 양성 염색으로 세포의 제거 및 상피 세포 표면 마커 CD326에 대한 양성 선택은 7%에 비해 33.5%(도 2 E,G)를 차지하는 고도로 농축된 원위 세포 집단을 초래하였다(도 2A, C ) 부정적인 인구의 고갈 전에. 원위 상피 세포 집단의 추가의 하위설정은 각각 HTII-280 모노클로날 항체 (도 2 D, H)를 사용한 표면 염색에 기초한 분획화에 의해 달성되었다. 따라서, 원위 폐 상피 세포는 4.3% HTII-280+ 및 2.6% HTII-280-서브세트(CD31/CD45/CD235a의 고갈이 없는 도 2D) 및 30% HTII-280+ 및 3.6% HTII-280-서브세트(CD31/CD45/CD235a의 고갈 후 도 2H)를 포함하였다.

근위 영역으로부터 분리된 총 세포는 CD45 및 CD31 마이크로비드를 사용하여 CD235a/CD45/CD31 양성 세포에 대해 고갈되었고, CD31-/CD45-/CD235a-의 백분율은 17%(도 3 A,B)에서 56.6%로 증가하였다(도 3 E,F). 근위 영역으로부터 분리된 세포에서 상피 세포 표면 마커 CD326에 대한 양성 선택은 음성 집단의 고갈이 없는 9.3%(도 3A,C)에 비해 총 폐 세포 분획의 38%(도 3E,G)를 차지하는 고도로 농축된 근위 세포 집단으로 이어졌다. 근위 상피 세포 집단의 추가의 하위설정은 각각 NGFR에 대한 항체로 표면 염색에 기초한 분획화에 의해 달성되었다 (도 3D, H). 따라서, 근위 폐 상피 세포는 2.7% NGFR+ 및 6.5% NGFR-서브세트(CD31/CD45/CD235a의 고갈을 갖지 않은 도 3D)를 포함하였고, 13%는 NGFR+ 및 25% NGFR-(CD31/CD45/CD235a의 고갈 후 도 3H)이었다.

폐 오가노이드 문화
원위 폐 상피 오가노이드는 오가노이드 성장 및 분화를 최적화하기 위해 경험적으로 시험된 배지에서 성장 인자 고갈 기저막 매트릭스 내에서 배양되었다. PneumaCult-ALI 배지, 소형 기도 상피 세포 성장 배지 (SAECG 배지) 및 마우스 기저 배지를 포함하는 세 가지 상이한 배지를 평가하였다. 최적의 오가노이드 성장은 PneumaCult-ALI 배지를 사용하여 수득되었고, 이는 추가 연구를 위해 선택되었다. HTII-280+ 원위 폐 상피 세포의 배양은 10%의 평균 콜로니 형성 효율을 갖는 빠르게 팽창하는 오가노이드를 산출하였다(도 4A, B). HTII-280 및 SPC 모노클로날 항체를 이용한 배양 30일째의 면역형광 염색은 HTII-280+ 및 SPC+ 원위 폐 상피 세포의 우세하게 구성된 루멘 함유 오가노이드를 밝혀냈다(도 4의 C, C' 및 도 4D,D'). 원위 폐 상피 HTII-280-세포의 배양물은 작은 기도의 그것과 유사한 의사층화된 상피로 구성된 오가노이드를 산출하였다 (도시되지 않음).

근위 폐 상피 오가노이드를 마트리겔에 시딩된 NGFR+ 세포로부터 배양하고 PneumaCult-ALI 배지에서 30일 동안 배양하였다. 7.8%의 평균 콜로니 형성 효율로 큰 루멘 함유 오가노이드가 관찰되었다(도 5D, E, F). 오가노이드는 자가재생 Krt5+ 및 NGFR+ 기저 세포(도 5D, 5E)와 FoxJ1+ 섬모 세포 및 MUC5AC+ 분비 세포를 포함하는 분화된 발광 세포 유형으로 구성된 의사층화된 상피로 구성되었다(도 5D, E).

Figure 1
도 1: 인간 폐 조직의 샘플링. (a) 세포 단리를 위한 근위 및 원위 영역을 샘플링하기 위한 전략을 나타내는 인간 폐의 개략적 표현. (B) 폐의 근위 및 원위 영역의 H&E 염색. (C,D) 기관지 기도의 기저막에서 NGFR+ 기저 전구 세포 (적색) 및 폐포에서 HTII-280+ 폐포 유형 II 전구 세포 (녹색)를 나타내는 상응하는 영역의 면역 형광 염색. 스케일 바 = 50 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
그림 2: 원위 폐 세포에 대한 대표적인 분류 전략. (A, E) 하나의 생물학적 샘플로부터 폐의 원위 영역에서 CD31 및 CD45 자기 비드를 사용하는 CD45+ 및 CD31+ 집단의 고갈 전후의 다양한 세포 집단의 백분율. (B,F) CD31/CD45/CD235a 양성 집단의 고갈 전후의 CD31/CD45-/CD235a-양성 집단(C,G) Epcam+ 집단의 고갈 전후의 원위 CD31-/CD45-/CD235a-집단의 게이팅 전략을 보여주는 FACS 플롯의 대표적인 이미지. (D, H) HTII-280+/- CD31/CD45/CD235a 양성 세포의 고갈 전후 집단. 패널 A-D는 동일한 생물학적 샘플로부터, 패널 E-H는 동일한 생물학적 샘플로부터의 것이다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 3
도 3: 근위 폐 세포에 대한 대표적인 분류 전략. (A,E) 폐의 근위 영역에서 CD31 및 CD45 자기 비드를 사용하는 CD45+ 및 CD31+ 집단의 고갈 전후의 다양한 세포 집단의 백분율. (B,F) CD31/CD45/CD235a 양성 집단의 고갈 전후의 CD31/CD45-/CD235a-양성 집단(C,G) 엡캄+ 집단의 고갈 전후의 근위 CD31-/CD45-/CD235a-집단의 게이팅 전략을 보여주는 FACS 플롯의 대표적인 이미지. (D, H) NGFR+/- CD31/CD45/CD235a 양성 세포의 고갈 전후의 집단. 패널 A-D 및 E-H는 두 개의 상이한 생물학적 샘플로부터 제조되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 4
그림 4: 원위 폐 오가노이드의 특성화. (a) PneumaCult-ALI 배지에서 배양된 인간 원위 오가노이드의 대표적인 이미지(2x 배율). (B) 콜로니 형성 효율(%CFE)은 두 개의 상이한 생물학적 샘플로부터 유래된 오가노이드의 삼중 웰에 대해 계산되었다. (C, C') ALI 배지에서 배양된 상응하는 원위 오가노이드의 면역형광 염색은 HTII-280+ AT2 세포(녹색)를 나타낸다. (D, D') 본 연구에서 AT2 세포의 단리에 사용된 마커는, HTII-280이 또 다른 잘 특성화된 AT2 세포 마커, SPC(적색)에 대해 코스테인(녹색)한다. 스케일 바 = 50um. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 5
도 5: 인간 근위 폐로부터의 근위 오가노이드의 특성화. (A, B) PneumaCult-ALI 배지 스케일 바50 μm에서 배양된 인간 근위 오가노이드의 대표적인 이미지. (C) 두 개의 상이한 생물학적 샘플로부터 유래된 오가노이드의 삼중 웰에서 콜로니 형성 효율(%CFE)의 백분율을 계산하였다. 30일째에 분화된 근위 오가노이드를 (D) Krt5+ 기저 세포(녹색), FoxJ1+ 섬모 세포(적색) (E) Krt5+ 기저 세포(녹색) 및 MUC5AC+ 잔 세포(적색)로 면역형광 염색하였다. (f) 본 연구에서 기저 세포의 단리에 사용된 마커는, NGFR(녹색) 공동-특징화된 기저 세포 마커인 Krt5(적색)에 대한 공동-염색이다. 배율 막대 = 50μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

우리는 분자 또는 기능적 분석 및 질병 모델링을 위해 인간 폐 조직으로부터 폐 세포의 정의 된 하위 집단을 분리하기위한 신뢰할 수있는 방법을 설명합니다. 방법의 중요한 요소에는 갓 분리된 세포의 항체 매개 농축을 허용하는 표면 에피토프의 보존과 함께 조직 해리를 달성하는 능력, 및 영역 특이적 상피 오가노이드의 효율적인 생성을 위한 배양 방법의 최적화가 포함된다. 우리는 입체 배양에서 기질 지지 세포와 재결합 할 때 오가노이드를 형성 할 수있는 상피 전구 세포의 회복과 농축에 중점을 둡니다. 비록 우리가 이들 배양물에서 오가노이드의 클로날리티를 정의하지는 않았지만, 단리된 마우스 폐 상피 전구 세포를 사용하여 수행된 유사한 연구는 뚜렷한 형광 리포터를 보유하는 세포의 혼합 배양물의 사용에 기초한 것으로 나타났다22,23.

본원에 기재된 방법은 소화된 폐 조직으로부터의 세포 회복을 개선시키기 위한 적응을 포함한다. 소화된 샘플은 16게이지 바늘을 통과하여 남아있는 소화되지 않은 덩어리를 추가로 파쇄하고 균질한 세포 현탁액을 달성한다. 압출된 게놈 DNA에 의한 세포 응집은 DNase I을 첨가함으로써 완화되었으며, 이는 FACS 단리 동안 중단되지 않은 유체학 스트림을 제공하는 동질적인 세포 제제를 생성하였다. 이러한 간단한 변형은 함께 표적 세포 집단의 회복을 향상시키고 FACS 농축 동안 응집으로 인한 지연을 피한다.

이전의 프로토콜은 엘라스타제, 디스파아제 및 트립신/2 mM EDTA를 사용한 조직 소화를 요구하여 세포 분리 4,5 전에 단일 세포 현탁액을 산출한다. 그러나, 프로테아제의 이러한 조합은 표면 단백질의 손실을 초래하고, 세포가 항체 염색 및 FACS 이전에 표면 단백질의 재발현을 위해 퍼콜 코팅된 배양 접시 상에서 밤새 배양되도록 요구한다. 대조적으로, 폐 조직을 부드럽게 교란시키기 위한 리베라아제와 기계적 교반의 조합은 항체 염색 및 FACS 농축을 위한 표면 에피토프를 보존하면서 보다 신속하게 수행될 수 있는 보다 효율적이면서도 온화한 해리 프로토콜을 제공한다. 따라서 전체 조직 처리 시간이 응축되고 FACS 단리가 조직 해리 직후에 수행 될 수 있습니다.

이들 방법은 그들의 기원 영역을 대표하는 특수한 자손을 산출하는 상피 전구 세포의 단리 및 시험관내 배양을 허용한다. 그러나, 이들 방법은 면역, 혈관 및 기질 세포 유형과 같은 다른 세포 집단의 확인 및 농축에 유사하게 적용될 수 있다. 이는 혈관 및 상피 구획의 모델링 및 면역 세포24,25,26과 같은 다른 세포 유형의 도입을 허용하는 국소 폐 상피 온칩 시스템의 개발에 특히 적용될 수 있다. 최근 연구에서, 우리는이 방법론을 사용하여 생성 된 폐포 상피의 3D 오가노이드 배양물을 사용하여 폐의 COVID 19 모델링을 연구하고 SARS-CoV-2 감염에 대한 치료 표적을 스크리닝하는 도구로 사용되었습니다. 27

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Disclosures

저자는 공개 할 것이 없습니다.

Acknowledgments

IFC 및 H 및 E 염색을 위한 Mizuno Takako, 조직 절편을 위한 Vanessa Garcia, 원고 준비를 도와준 Anika S Chandrasekaran의 지원에 감사드립니다. 이 작업은 국립 보건원 (5RO1HL135163-04, PO1HL108793-08) 및 Celgene IDEAL 컨소시엄의 지원을 받습니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cell Isolation
10 mL Sterile syringes, Luer-Lok Tip Fisher scientific BD 309646
30 mL Sterile syringes, Luer-Lok Tip VWR BD302832
Biohazard bags VWR 89495-440
Biohazard bags VWR 89495-440
connecting ring Pluriselect 41-50000-03
Deoxyribonuclease (lot#SLBF7798V) sigma Aldrich DN25-1G
Disposable Petri dishes Corning/Falcon 25373-187
Funnel Pluriselect 42-50000
HBSS Corning 21-023
Liberase TM Research Grade sigma Aldrich 5401127001
needle 16G VWR 305198
needle 18G VWR 305199
PluriStrainer 100 µm (Cell Strainer) Pluriselect 43-50100-51
PluriStrainer 300 µm (Cell Strainer) Pluriselect 43-50300-03
PluriStrainer 40 µm (Cell Strainer) Pluriselect 43-50040-51
PluriStrainer 500 µm (Cell Strainer) Pluriselect 43-50500-03
PluriStrainer 70 µm (Cell Strainer) Pluriselect 43-50070-51
Razor blades VWR 55411-050
Red Blood Cell lysis buffer eBioscience 00-4333-57
Equipment’s
GentleMACS C Tubes MACS Miltenyi Biotec 130-096-334
GentleMACS Octo Dissociator MACS Miltenyi Biotec 130-095-937
Leica ASP 300s Tissue processor
LS Columns MACS Miltenyi Biotec 130-042-401
MACS MultiStand** Miltenyi Biotech 130-042-303
Thermomixer Eppendorf 05-412-503
Thermomixer Eppendorf 05-412-503
HBSS+ Buffer
Amphotericin B Thermo fisher scientific 15290018 2ml
EDTA (0.5 M), pH 8.0, RNase-free Thermo fisher scientific AM9260G 500µl
Fetal Bovine Serum Gemini Bio-Products 100-106 10ml
HBSS Hank's Balanced Salt Solution 1X 500 ml VWR 45000-456 500ml bottle
HEPES (1 M) Thermo fisher scientific 15630080 5ml
Penicillin-Streptomycin-Neomycin (PSN) Antibiotic Mixture Thermo fisher scientific 15640055 5ml
List of antibodies for FACS
Alexa Fluor 647 anti-human CD326 (EpCAM) Antibody BioLegend 369820 1:50
BD CompBead Anti-Mouse Ig, K/ Negative control particles set Fisher Scientific BDB552843
CD31 MicroBead Kit, human Miltenyi Biotec 130-091-935 20µl/ 107 total cells
CD45 MicroBeads, human Miltenyi Biotec 130-045-801 20µl/ 107 total cells
DAPI Sigma Aldrich D9542-10MG 1:10000
FITC anti-human CD235a BioLegend 349104 1:100
FITC anti-human CD31 BioLegend 303104 1:100
FITC anti-human CD45 BioLegend 304054 1:100
FITC anti-mouse IgM Antibody BioLegend 406506 1:500
Mouse IgM anti human HT2-280 Terrace Biotech TB-27AHT2-280 1:300
PE anti-human CD271(NGFR) BioLegend 345106 1:50
Composition of Organoid Culture mediums
MRC-5 ATCC CCL-171
PneumaCult -ALI Medium Stemcell Technologies 5001
Small Airway Epithelial Cell Growth Medium PromoCell C-21170
ThinCert Tissue Culture Inserts, Sterile Greiner Bio-One 662641
Y-27632 (ROCK inhibitor) 100mM stock (1000x) Stemcell Technologies 72302
Mouse Basal medium:
Amphotericin B Thermo fisher scientific 15290018 50 µl
DMEM/F-12, HEPES ThermoFisher scientific 11330032 50 ml
Fetal Bovine Serum Gemini Bio-Products 100-106 5 ml
Insulin-Transferrin-Selenium (ITS -G) (100X) ThermoFisher scientific 41400045 500 µl
Penicillin-Streptomycin-Neomycin (PSN) Antibiotic Mixture Thermo fisher scientific 15640055 500 µl
SB431542 TGF-β pathway inhibitor (stock 100 mM) Stem cell 72234 5 µl
List of antibodies for Immunohistochemistry
Antigen unmasking solution, citric acid based Vector H-3300 937 µl in 100ml water
Histogel Thermo Scientific HG-4000-012
Primary Antibodies
Anti HT2-280 Terracebiotech TB-27AHT2-280 1:500
FOXJ1 Monoclonal Antibody (2A5) Thermo Fisher Scientific 14-9965-82 1:300
Human Uteroglobin/SCGB1A1 Antibody R and D systems MAB4218 1:300
Keratin 5 Polyclonal Chicken Antibody, Purified [Poly9059] Biolegend 905901 1:500
MUC5AC Monoclonal Antibody (45M1) Thermo Fisher Scientific MA5-12178 1:300
PDPN / Podoplanin Antibody (clone 8.1.1) LifeSpan Biosciences LS-C143022-100 1:300
Purified Mouse Anti-E-Cadherin BD biosciences 610182 1:1000
Sox-2 Antibody Santa Cruz biotechnologies sc-365964 1:300
Secondary Antibodies
Donkey anti-rabbit lgG, 488 Thermo Fisher Scientific A-21206 1:500
FITC anti-mouse IgM Antibody BioLegend 406506 1:500
Goat anti-Hamster IgG (H+L), Alexa Fluor 594 Thermo Fisher Scientific A-21113 1:500
Goat anti-Mouse IgG1 Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Scientific A-21121 1:500
Goat anti-Mouse IgG2a Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Scientific A-21131 1:500
Goat anti-Mouse IgG2a Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 Thermo Fisher Scientific A-21134 1:500
Goat anti-Mouse IgG2b Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 Thermo Fisher Scientific A-21144 1:500
Buffers
Immunohistochemistry Blocking Solution 3% BSA, o.4% Triton-x100 in TBS (Tris based saline)
Immunohistochemistry Incubation Solution 3% BSA, ).1% Triton-X100 in TBS
Immunohistochemistry Washing Solution TBS with 0.1% Tween 20

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References

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생물학 문제 161 폐 상피 오가노이드 배양 질병 모델링 폐포 유형 II 세포 FACS
오가노이드 배양을 위한 인간 폐 상피 전구 세포의 분리 및 농축
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Konda, B., Mulay, A., Yao, C., Beil, … More

Konda, B., Mulay, A., Yao, C., Beil, S., Israely, E., Stripp, B. R. Isolation and Enrichment of Human Lung Epithelial Progenitor Cells for Organoid Culture. J. Vis. Exp. (161), e61541, doi:10.3791/61541 (2020).

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