Detta protokoll ger ett omfattande förfarande för att fabricera mänskliga iPS cell-härledda motor nerv organoid genom spontan montering av en robust bunt axons utvidgas från en sfäroid i en vävnad kultur chip.
En fascicle av axlar är ett av de viktigaste strukturella motiven som observeras i nervsystemet. Störningar av axon fascicles kan orsaka utvecklingsmässiga och neurodegenerativa sjukdomar. Även om många studier av axoner har utförts, är vår förståelse av bildandet och dysfunktionen av axon fascicles fortfarande begränsad på grund av bristen på robusta tredimensionella in vitro-modeller. Här beskriver vi ett steg-för-steg-protokoll för snabbgenerering av en motorisk nervorganoid (MNO) från mänskliga inducerade pluripotenta stamceller (iPS) i ett mikrofluidiskt baserat vävnadskulturchip. För det första beskrivs tillverkning av chips som används för metoden. Från mänskliga iPS-celler bildas en motorisk neuronsfäroid (MNS). Därefter överförs den differentierade MNS till chippet. Därefter växer axoner spontant ut ur sfäroiden och monteras i en fascicle inom en mikrokanal utrustad i chipet, vilket genererar en MNO-vävnad som bär en bunt axoner som förlängs från sfäroiden. För nedströmsanalysen kan MNOs tas ut ur chipet som ska fixeras för morfologiska analyser eller dissekeras för biokemiska analyser, liksom kalciumavbildning och multielektrodmatrisinspelningar. MNOs som genereras med detta protokoll kan underlätta drogtester och screening och kan bidra till förståelse för mekanismer som ligger till grund för utveckling och sjukdomar hos axonfascicles.
Spinal motor nervceller (MN) utvidgar axlar till skelettmuskler för att kontrollera kroppens rörelse. Deras axonalbanor är mycket organiserade och reglerade i utvecklingsprocessen. Trots många studier om axon förlängning och vägledning1, mekanismer för organiserad axon bunt bildas är fortfarande under utredning. Axons av motoriska nervceller skadas ofta av neurodegenerativa sjukdomar såsom amyotrofisk lateral skleros (ALS)2, men patofysiologiska mekanismer för skador på axon fascicles är dåligt förstådda. Således krävs en fysiologisk och patologisk modell för att rekapitulera axon bunt bildas och regression i fältet.
En mänsklig stamcellsbaserad motorisk neuron är en lovande plattform för att förstå utveckling och sjukdomar som ALS3. Mänskliga inducerade pluripotenta stamceller (iPS-celler) kan användas för att modellera sjukdomar med hjälp av patientbaserade celler. Hittills har olika differentieringsmetoder från pluripotenta stamceller till MN rapporterats4,5,6. Axons av nervceller i tvådimensionell kultur är dock slumpmässigt orienterade och rekapitulerar inte in vivo mikromiljö inom utveckla nerver där axoner är enkelriktade monterade genom täta axo-axonal interaktioner7. För att övervinna denna fråga har vi utvecklat en teknik för att generera en tredimensionell vävnad som liknar motornerv från mänskliga iPS-celler8, och namngav vävnaden som motorisk nervorganoid (MNO). MNO består av cellkroppar belägna i en motorisk neuronsfäroid (MNS) och en axonal fascicle utsträckt från sfäroiden. Axonerna i fascicle är enkelriktade orienterade, vilket liknar axoner i att utveckla motoriska nerver. Därför ger MNOs unikt en fysiologisk axonal mikromiljö, vilket inte gjordes av några andra tidigare utvecklade neuronal kulturmetoder.
I detta protokoll beskriver vi metoder för vävnad kultur chips tillverkning, snabb motor neuron differentiering och motor nerv organoid bildas i utvecklade chips. Vårt mjukpapperskulturchip är mycket enkelt, och det innehåller bara ett fack för att acceptera en sfäroid, en mikrokanal för att bilda ett axonpaket och ett fack för att inhysa axonterminaler. Enheten innehåller inte komplexa strukturer inklusive mikrogroover eller mikroporfilter som ofta används för att separera axoner och cellkroppar efter storlek9,10. Därför kan våra enheter enkelt tillverkas genom att följa stegen som beskrivs i detta protokoll om en fotolitografiinställning är tillgänglig.
Snabb differentiering av mänskliga iPS-celler uppnås med en optimerad kombination av inducerande och mönstringsfaktorer (SB431542, LDN-193189, retinsyra (RA) och utjämnade agonist (SAG)) och accelerationsfaktorer (SU5402 och DAPT). Det har rapporterats att kombinationen av SU5402 och DAPT påskyndar differentiering av perifera nervceller och neurala vapenceller11. I det här protokollet erbjuder vi tre olika metoder för att generera MNOs, så att läsarna kan bestämma en metod som är mest anpassad till deras behov. Vi rekommenderar att du utför differentiering av mänskliga iPS-celler efter att ha bildat en sfäroid (3D-metoden), eftersom den differentierade MNS kan överföras direkt till ett vävnadskulturchip. Alternativt kan mänskliga iPS-celler differentieras till motoriska nervceller i monolayer (2D) kultur, och sedan skapas till tredimensionella motoriska neuron sfäroider som vi tidigare rapporterat8. Vi har uppdaterat protokollet, och med den tredimensionella differentieringsmetod som beskrivs i detta protokoll kan övergången från 2D till 3D undvikas och MNOs kan erhållas med kortare differentieringstid, färre steg och minskade tekniska risker utan dissociationssteget. Kommersiellt tillgängliga nervceller kan också användas för att generera MNS för att minska tiden för differentiering.
För att generera en MNO odlade vi en MNS i vävnadskulturchipet. Axonerna sträcker sig från sfäroiden och sträcker sig in i mikrokanal där axoner samlas och justerar enkelriktat. Detta underlättar axo-axonal interaktion och spontan bildning av en tätt sammansatt enkelriktad bunt vävnad av axoner i mikrokanal, vilket uppnås unikt genom detta protokoll, medan antingen spontan buntbildning eller guidad axonal orientering ensam kan uppnås genom andra protokoll12,13,14. I ett typiskt experiment migrerar få celler ut från sfäroider till mikrokanal och de flesta celler stannar i närheten av sfäroider. Denna metod gör det möjligt att spontant separera axoner från sfäroiderna utan att använda storleksberoende fysiska barriärer (t.ex. mikrogroover eller mikroporfilter) för att separera axoner från cellkroppar.
Den resulterande MNO kan genomgå olika undersökningar, inklusive morfologiska, biokemiska och fysiska analyser. Cellkroppen och den förlängda axonbunten kan isoleras fysiskt genom skärning och kan analyseras separat för nedströmsexperiment, t.ex. biokemiska analyser. Biologiska material inklusive RNA och protein kan isoleras från bara några axon buntar för regelbundna biokemiska analyser inklusive RT-PCR och western blotting. Här beskriver vi ett protokoll för att generera motorisk nervorganoid från iPS-celler, som erbjuder en attraktiv fysiologisk och patologisk modell för att studera den mekanism som ligger till grund för utveckling och sjukdom hos axonfascicles.
Detta protokoll beskriver bildandet av en motorisk nerv organoid (MNO) som har en axon bunt utvidgas från en motor neuron sfäroid genereras från mänskliga iPS celler. Det bildade axonpaketet är tjockt, flexibelt och välorganiserat i enkelriktade strukturer. Genom att dissekera axonbunten kan axonalt protein med hög renhet och RNA erhållas tillräckligt för biokemiska analyser. Neuronal aktivitet kan mätas i axon buntar och sfäroider med kalcium imaging. Förorening av nukleära och dendritiska proteiner i axonal lysat upptäcktes inte av västra blotting, vilket visar att vår metod effektivt separerade axoner från cellkroppar och dendriter.
En av fördelarna med detta protokoll är den snabba differentiering och generering av MNO utrustad med ett axon-paket, där alla processer kan göras på 4 veckor med 3D-protokollet och 5-6 veckor med 2D-protokollet. Detta är kort jämfört med andra protokoll som vanligtvis tar 3-4 veckor att helt enkelt skilja i MN från embryonala stamceller och iPS-celler17 och det tar ytterligare 2-4 veckor att få axonal förlängning. 3D-protokollet föredras i allmänhet framför 2D-protokollet på grund av kortare differentieringstid, färre steg och minskade tekniska risker utan dissociationssteget jämfört med 2D-protokollet. Det mikrofluidiska vävnadskulturchipet utformades på ett sätt så att MNS axoner kan förlängas mot det andra facket genom mikrokanal, vilket underlättar bildandet av en bunt axoner genom att inducera axo-axonal interaktioner och affinitet mellan axoner. På grund av den enkla experimentella uppsättningen kan alla protokoll som beskrivs här inte bara utföras av bioengineers, som är bekanta med manipulering av ett vävnadskulturchip, utan också biologer och neuroforskare som inte är bekanta med mikrofluidik och mikrotillverkningstekniker. Det bör noteras att steg 1 och 2 också kan utföras med hjälp av en extern tillverkningstjänst.
Ett av de kritiska stegen för att utföra protokollet är en sekventiell förändring av kulturmediet. Det rekommenderas att helt ändra kulturmediet vid varje steg under differentiering så att faktorer i det använda mediet inte stör MN-differentiering. En annan kritisk punkt i detta protokoll är att upprätthålla odifferentierade iPS-celler i god kvalitet. Kvaliteten på den ursprungliga iPS-cellkulturen påverkar avsevärt effektiviteten för att erhålla motoriska nervceller och MNO. En annan punkt är att diametern på MNS ska vara mindre än storleken på chipets hål (1,5 mm). Större sfäroider kan inte komma in i kammaren, och potentiellt uppleva allvarlig hypoxisk nekros i mitten delen. Storleken på MNSs kan styras genom att ändra ett initialt såddnummer av iPS-celler (i 3D-protokoll) eller motoriska nervceller (i 2D-protokoll). Cellernas såddtäthet bör optimeras för varje iPS-cellinje.
Compartmentalized mikrofluidic enheter med mikrogrooves och små por filter har använts i stor utsträckning för att separera axoner från cellkroppar och dendriter. Denna teknik kan också skilja axoner från cellkroppar och dendrit, med överlägsen överflöd av axoner i buntade vävnader. Jämfört med de andra metoderna är en viktig begränsning av denna metod att den inte kan separera två olika odlingsmedier i den nuvarande utformningen av vävnadskulturchipet, vilket hindrar förmågan att samkultur av två olika celler som kräver två distinkta medier. En annan begränsning är att PDMS-chippet satte förutbestämda begränsningar för vävnadens storlek. En sfäroid som är större än hålet kan inte komma in i kammaren, och axon-bunten kan inte bli tjockare än bredden på mikrofluidkanalen.
Denna metod kan tillämpas på andra typer av nervceller. Vår grupp har visat förmåga att modellera ett cerebralt område med hjälp av en modifierad metod i kombination med cerebrala organoid tekniker18. När sfäroider infördes i båda facken och axons spontant långsträckta ömsesidigt mot varje sfäroid, och därefter en axon bunt bildas spontant. Som ett resultat kan två när sfäroider anslutas genom en axon bunt, och vävnaden kan erhållas som en bit. Detta visar att tillvägagångssättet är mycket mångsidigt för att bilda axon bunt vävnader oavsett neuronala celltyper. I detta protokoll användes mänskliga iPS-celler, men andra stamceller inklusive mänskliga ES-celler och mänskliga neurala stamceller kan användas med modifieringar av det presenterade protokollet. 3D-sfäroider av nervceller kan genereras av olika protokoll19,20. Denna metod för att göra vävnader med ett axon-paket kan potentiellt kombineras i framtiden med de andra differentieringsprotokollen för att göra 3D MN-sfäroid. Dessutom kan axonpaketets tjocklek och längd styras genom att helt enkelt ändra bredden och höjden på mikrokanalerna i vävnadskulturchipet för framtida utveckling.
Vi tror att detta protokoll kan användas för drogtester och screening och kan bidra till förståelsen av mekanismer som ligger till grund för utvecklingen och sjukdomarna hos axonfascicles.
The authors have nothing to disclose.
Denna studie stöddes av Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) Grants-in-Aid for Scientific Research 17H05661 och 18K19903, Core-2-core program och Beyond AI institute.
(Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl)-1-trichlorosilane | Sigma | 440302 | |
16% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
200µl Wide Bore Pipet Tips | BMBio | BMT-200WRS | |
6-well plates | Violamo | 2-8588-01 | |
Accutase | ICT | AT104 | |
B-27 Supplement (50X) | Gibco | 17504044 | |
Bovine serum albumin | Sigma | A6003 | |
Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) | Wako | 020-12913 | |
CO2 incubator | Panasonic | MCO-18AIC | |
Cryostor CS10 | Stem Cell Technologies | 07959 | |
DAPT | Sigma | D5942 | |
DMEM/F12 | Sigma | D8437 | |
Fluo-4 AM | Dojindo Laboratories | CS22 | |
GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050-061 | |
Growth factor reduced Matrigel (basement membrane matrix) | Corning | 354230 | |
HB9 Antibody | Santa Cruz | sc-22542 | |
HBSS | Wako | 085-09355 | |
Hoechst 33342 | Sigma | 14533 | |
iCell motor neuron (commercially available human iPS cell-derived motor neurons) | Cellular Dynamics | R1051 | |
Isopropyl alcohol (IPA) | Wako | 166-04836 | |
Knock Out Serum Replacement | Gibco | 10828028 | |
LDN193189 | Sigma | SML0559 | |
MEA probe | Alpha MED Scientific inc | MED-P5004A | |
MEM Non-essential Amino Acid Solution (100x) (NEAA) | Sigma | M7145 | |
Microscope Glass | Matsunami | S9111 | |
mTeSR Plus | Stem Cell Technologies | 05825 | |
N2 supplement | Wako | 141-08941 | |
Neurobasal medium | Gibco | 21103049 | |
Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140122 | |
Photoresist SU-8 2100 | Microchem | #SU-8 2100 | |
Prime surface 96U | Sumitomo Bakelite | MS-9096U | |
ReLeSR (passaging reagent) | Stem Cell Technologies | 05872 | |
Retinoic acid | Wako | 186-01114 | |
SAG | Sigma | SML1314 | |
SB431542 | Wako | 192-16541 | |
Silicon wafer | SUMCO | PW-100-100 | |
Silpot 184 w/c kit | Dow Toray | Silpot 184 w/c kit | |
Smi32 Antibody | Biolegend | 801701 | |
SU5402 | Sigma | SML0443 | |
SU-8 Developer | Microchem | Y020100 | |
Synapsin I Antibody | Millipore | Ab1543 | |
TrypLE Express liquid without phenol red (dissociation solution) | Gibco | 12604-021 | |
Tuj1 Antibody | Biolegend | 801202 | |
Y-27632 | Wako | 030-24021 |