Summary
Здесь представлен протокол для применения пептида CD47 (pepCD47) к металлическим стентам с использованием химии полибисфосфоната. Функционализация металлических стентов с использованием pepCD47 предотвращает вложение и активацию воспалительных клеток, улучшая тем самым их биосовместимость.
Abstract
Ключевыми осложнениями, связанными с голыми металлическими стентами и противоопухоленными стентами, являются стент-ретеноз и тромбоз позднего стента, соответственно. Таким образом, улучшение биосовместимости металлических стентов остается важной проблемой. Целью этого протокола является описание надежной техники модификации поверхности металла биологически активными пептидами для повышения биосовместимости контактных с кровью медицинских имплантатов, включая эндоваскулярные стенты. CD47 является иммунологическим видом-специфическим маркером себя и имеет противовоспалительные свойства. Исследования показали, что 22 аминокислотный пептид, соответствующий домену Ig CD47 во внеклеточной области (pepCD47), имеет противовоспалительные свойства, такие как белок в полный рост. Исследования In vivo на крысах и исследования ex vivo в экспериментальных системах крови кролика и человека из нашей лаборатории показали, что иммобилизация pepCD47 на металлы улучшает их биосовместимость, предотвращая воспалительную клеточную привязанность и активацию. В этом документе описывается пошаговая протокола для функционализации металлических поверхностей и пептидного крепления. Металлические поверхности модифицируются с использованием полиаллиламин бисфосфата с скрытыми группами тиола (PABT), а затем депротекторции тиолов и усиления тиол-реактивных сайтов через реакцию с полиэтиленемин установлен с пиридилдитио групп (PEI-PDT). Наконец, pepCD47, включающий остатки терминального цистея, подключенные к последовательности пептида ядра через двойной 8-амино-3,6-диокса-октанойловый промеец, прикрепляются к металлической поверхности через дисульфидные связи. Эта методология пептидного крепления к металлической поверхности эффективна и относительно недорога и, таким образом, может быть применена для улучшения биосовместимости нескольких металлических биоматериалов.
Introduction
Перкутанное коронарное вмешательство является первой линией терапии для лечения ишемической болезни сердца (КАД) и в первую очередь включает стентирование больных артерий. Тем не менее, стент рестиденоз (ISR) и тромбоз стента являются общими осложнениями, связанными с стентом развертывания1. Взаимодействие крови в интерфейсе кровеутного стента характеризуется почти немедленной асорпцией плазменных белков на металлической поверхности, за которой следуют тромбоциты и воспалительные клеточныевложения и активация 2. Высвобождение воспалительных цитокинов и хемокиных из активированных воспалительных клеток приводит к фенотипической модификации сосудистых гладких мышечных клеток (ВКС) в туниках и вызывает их центропротезную миграцию в интимальный отсек. Пролиферация активированного VSMC в интиме приводит к утолщению интимального слоя, сужению люмена и стентному реренозу3. Для предотвращения распространения VSMC были разработаны противомедикаментозные стенты (DES); однако, эти препараты имеют внецелевое цитотоксическое воздействие на эндотелиальныеклетки 4,,5. Таким образом, поздний тромбоз стента является распространенным осложнением, связанным с DES6,7. Стенты из биоразлагаемых полимеров, таких как поли-L-лактид показали много перспектив в экспериментах на животных и первоначальных клинических испытаний, но в конечномитогенапомнил, когда "реальной жизни" клиническое использование продемонстрировали свою неполноценность 3-го поколения DES 8 .rd Таким образом, необходимо улучшить биосовместимость голых металлических стентов для улучшения исходов пациентов.
CD47 является повсеместно выраженным трансмембранным белком, который подавляет врожденный иммунный ответ, когда связан с его конгнатным рецептором Signal Regulatory Protein alpha (SIRP)9. Рецептор SIRP имеет иммунную клетку ингибиторный мотив (ITIM) домена и сигнальных событий на SIRP - CD47 взаимодействия в конечном итоге привести к downregulation воспалительнойактивации клеток 10,11,12,13. Исследования в нашей лаборатории показали, что рекомбинантный CD47 или его пептидная производная, соответствующая 22 аминокислота Ig домен внеклеточной области CD47 (pepCD47), может уменьшить иммунный ответ хозяина на ряд клиническизначимых биоматериалов 14,15,16. Недавно мы продемонстрировали, что pepCD47 может быть обездвижен до стентных поверхностей из нержавеющей стали и значительно уменьшить патофизиологическую реакцию, связанную с ретенозом. Следует отметить, что модифицированные поверхности pepCD47 подложки для соответствующих условий использования, таких как долгосрочное хранение и стерилизацияоксида этилена 17. С этой целью pepCD47 может быть полезной терапевтической мишенью для устранения клинических ограничений эндоваскулярных стентов.
Стратегия ковалентного крепления pepCD47 к металлической поверхности включает в себя ряд новых химических модификаций металлической поверхности. Металлические поверхности сначала покрыты полиаллиламин бисфосфонатом с скрытыми группами тиола (PABT), а затем депротекторцией тиол и креплением полиэтилена (PEI) с установленными группами пиридилдиотио (PDT). PDT групп PEI unconsumed в реакции с deprotected PABT тиолы затем реагировали с pepCD47 включения тиолов в терминале остатков цистеин, в результате чего связывание pepCD47 к металлической поверхности черездисульфид связи 14,17,18. Мы использовали флюорофор конъюгированный pepCD47 (TAMRA-pepCD47) для определения входной концентрации пептида, что приводит к максимальной иммобилизации поверхности пептида. Наконец, мы оценили острую и хроническую противовоспалительную способность металлических поверхностей с покрытием pepCD47, ex vivo, используя аппарат петли Чендлера, и анализ расширения моноцитов/макрофагов, соответственно.
В настоящем документе содержится систематический протокол крепления изолированных пептидов к металлической поверхности; определение максимальной плотности иммобилизации пептида; и оценки противовоспалительных свойств металлических поверхностей с покрытием pepCD47, подверженных воздействию всей крови и изолированных моноцитов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все образцы человека для этого эксперимента были получены в соответствии с IRB Детской больницы Филадельфии. Все эксперименты на животных были проведены по одобрению МАКУК Детской больницы Филадельфии.
1. Покрытие голых металлических поверхностей PEI-PDT
- Вымойте купоны из фольги из нержавеющей стали (1 см х 1 см или 0,65 см х 1 см) или сетчатые диски из нержавеющей стали с 2-изопропанолом в шейкере (60 градусов по Цельсию, скорость 200 об/мин) за 5 мин. Выполните этот шаг 2x. Затем мыть 2x с хлороформом (60 градусов по Цельсию, скорость 200 об / мин) в течение 10 минут каждый.
- Поместите очищенные образцы из нержавеющей стали в духовку при температуре 220 градусов по Цельсию в течение 30 минут.
- Подготовка 5 мл 0,5% раствора PABT путем растворения 25 мг полиаллиламин бисфосфоната с скрытыми группами тиола (PABT) и 5 мг бикарбоната калия (KHCO3) в 5 мл DDW и инкубировать при 72 градусов по Цельсию в шейкере при 200 об/мин в течение 30 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для синтеза PABT обратитесь к ранее опубликованной литературе18. - Погрузите запеченную фольгу или сетчатые диски в 0,5% аквозного раствора PABT и инкубировать в шейкере (72 градуса по Цельсию, скорость 200 об/мин) за 1 ч.
- Вымойте PABT-модифицированные образцы с деионизированной дистиллированной водой (DDW) для 5x, передать образцы в новый флакон и мыть снова с DDW для 5x.
- Подготовь в общей сложности 5 мл раствора TCEP (12 мг/мл) путем растворения 60 мг триса (2-карбоксиэтила) фосфина соляного хлорида (TCEP) в 5 мл 0,1 М ацетического буфера (0,57 мл ледниковой уксусной кислоты, 820 мг ацетата натрия в 100 мл DDW).
- Лечить PABT-модифицированных образцов с TCEP в течение 15 минут при комнатной температуре (RT) на шейкере.
ПРИМЕЧАНИЕ: TCEP используется для депротекирования групп тиола. - Дега DDW в круглой нижней колбе с помощью вакуумного генерирующих устройств, таких как лиофилизатор и мыть TCEP обработанные фольги или сетчатые диски с дегазации DDW для 5x. Передача образцов в новый флакон, и дополнительно мыть 5x с дегазации DDW.
ПРИМЕЧАНИЕ: Крайне важно работать быстро, чтобы предотвратить окисление тиола на металлической поверхности атмосферным кислородом. - Приготовьте 5 мл 1% раствора PEI-PDT, разбавляя 212,5 мл бульона PEI-PDT и 125 МКЛ 0,4 М ацетата натрия в дегазации DDW. Выполнить шаг 1.9 одновременно с шагом 1.8, чтобы свести к минимуму воздействие образцов в атмосферный воздух.
ПРИМЕЧАНИЕ: Синтез PEI-PDT описан в ранее опубликованной литературе18. - Инкубировать вымытые образцы из нержавеющей стали с 1% PEI-PDT. Замените воздух аргоном, запечатайте флаконы герметично и перемешайте на шейкере в RT в течение 1 ч. Либо немедленно приступить к спряжению пептида или хранить при 4 градусов по Цельсию до 1 недели.
2. Присоединение и качественная/количественная оценка флюорофорной конъюгированных pepCD47 удержания на металлической поверхности с использованием флуоресцентной микроскопии и флуориметрии
- Вымойте фольги купоны или сетчатые диски подготовлены, как описано в разделе 1, шаги 1,1-1,10 выше с DDW 5x. Перенесите образцы на новый флакон и вымойте DDW для дополнительного 5x. Наконец мыть 2x с дегазатным этанолом и 2x с дегазатным диметилформамидом (DMF).
- Приготовьте тетраметилродамин (TAMRA)-конъюгированный раствор бульона pepCD47 путем растворения порошка TAMRA-конъюгированный pepCD47 в дегазированной диметилформамиде (DMF) до конечной концентрации 1 мг/мл. Aliquot решение акций в 1 мл ассигнований. Хранить в хорошо запечатанных трубках в атмосфере аргона при -20 градусов по Цельсию.
- Разбавить 1 мг/мл запасного раствора TAMRA-конъюгированных pepCD47 с использованием дегазированных DMF для подготовки следующих концентраций фторфора конъюгированных pepCD47 - 10, 30, 100 и 200 мкг/мл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если TAMRA-спряженный pepCD47, как представляется, осаждается, уменьшить запас TAMRA-спряженных pepCD47 решение с использованием TCEP шарики в соотношении 1:1, на RT в течение 20 минут. Обратите внимание, что прежде чем добавить TAMRA-спряженный pepCD47 к бисеру TCEP, спина TCEP бисера решение, удалить супернатант, а затем приступить к добавлению TAMRA-спряженных pepCD47. - Инкубировать PEI-PDT модифицированной фольги купоны с 10, 30, 100 или 200 мкг / мл ТАМРА-конъюгированных pepCD47 в тройном для каждого условия на шейкер в RT под аргоновой атмосфере в течение 1 часа. Инкубировать PEI-PDT модифицированные сетчатые диски, а также сетчатый диск, не модифицированный за шагом 1.2 (голые металлические элементы управления) со 100 мкг/мл TAMRA-спряженного pepCD47 в трипликатах в RT под аргоной атмосферой на шейкере в течение 1 ч.
ПРИМЕЧАНИЕ: С этого шага флаконы завернуты в алюминиевую фольгу, чтобы защитить содержимое от света. - Вымойте флюорофор конъюгированных pepCD47 покрытием поверхностей для удаления нековалентно прилагается пептид в следующем порядке: DMF (3x), DMF / DDW в 1:1, DDW (3x), 0.3% SDS в 20 mM Tris pH 7.4 (3x, 5 min каждое на 70 C на шейкере), DDW (3x), флаконы изменения, и окончательная стирка DDW.
- Поместите контроль и ковалентно спряженные сетчатые диски на микроскопьное стекло, добавьте 50 МКЛ PBS и поместите крышку. Диски сетки изображений с помощью перевернутого флуоресцентного микроскопа, оснащенного набором фильтров родамина. Возьмите репрезентативные изображения при 100-х увеличении.
- Приготовьте 15 мл раствора TCEP 12 мг/мл, растворив 180 мг TCEP в смеси метанола 1:1 v/v и 0,1 М уксусного буфера.
- Инкубировать каждую промытую фольгу с 1 мл раствора TCEP на шейкере в RT в течение 15 минут.
- Подготовь следующие стандарты, последовательно разбавляя запасы PEPCD47 (1 мг/мл) - 100 мкг/мл, 10 мкг/мл, 1 мкг/мл, 0,1 мкг/мл и 0,01 мкг/мл. Используйте решение TCEP в качестве размино.
- Проанализируйте спряченный TAMRA pepCD47, выпущенный с металлической поверхности, на фоне кривой калибровки, генерируемой с использованием стандартов фторметрии при возбуждении 544/590 нм и длинах волн выбросов.
3. Присоединение человека pepCD47 к PEI-PDT модифицированных поверхностей
- Вымойте PEI-PDT покрытием образцы сформулированы, как описано в разделе 1, шаги 1.1-1.10 выше, с дегазацией DDW 5x, изменить флакон и мыть с дегазированных DDW 5x.
- Подготовка человека pepCD47 фондовый раствор (1 мг/мл) путем растворения человека pepCD47 порошок в дегазации 50% уксусной кислоты для достижения концентрации 1 мг/ мл.
- Подготовь рабочую концентрацию человеческого pepCD47 (100 мкг/мл) путем растворения 500 МКЛ запаса человеческого pepCD47 в 4500 МКЛ дегазации 1x фосфата буферного солевого раствора (PBS).
- Инкубировать вымытые образцы PEI-PDT покрытием со 100 мкг/мл pepCD47 на RT с встряхивания в течение 1 ч.
- Вымойте человека pepCD47 покрытием образцов для удаления избыточного пептида в следующем порядке PBS (3x), DDW (3x), 0,2% Tween-20 (3x, 5 мин каждый), DDW (3x), изменение флаконов и окончательного DDW мыть.
ПРИМЕЧАНИЕ: Поверхности с покрытием человека pepCD47 могут храниться сухими при 4 градусах Цельсия в течение 6 месяцев.
4. Покрытие модифицированных поверхностей PEI-PDT скремблированной последовательностью (Scr)
- Растворите скремблированный порошок последовательности в дегазации 0,1% уксусной кислоты, чтобы подготовить раствор бульона 1 мг/мл.
- Приготовьте раствор 100 мкг/мл скремблированных пептидов, растворив 500 МКЛ в 4500 МКЛ дегазированных 0,1% уксусной кислоты.
- Пальто промывают PEI-PDT образцов с 100 мкг / мл скремблированных пептида на RT с встряхивания в течение 1 ч.
- Чтобы удалить непривязанный пептид, мыть поверхности в следующем порядке 0,01% уксусной кислоты (3x), DDW (3x), 0,2% Tween-20 (3x, 5 мин), DDW (3x), изменение флаконов и один DDW мыть.
5. Петля Чендлера для анализа клеточного крепления к металлическим поверхностям
- Пальто металлической фольги (0,65 см х 1 см) либо с человеком pepCD47 или омлет пептид в соответствии с описанием на разделе 1 следуют 3 или 4.
- Разрежьте 1/4" ПВХ трубки на три 38 см в длину штук.
- Вставьте до 8 неизмененных, скремблированных пептидов или пепКД47 модифицированных металлических фольг в трех различных трубках.
- Соберите 30 мл крови у здоровых доноров человека, свободных от каких-либо анти-тромбоцитов лекарства в соответствии с институциональным протоколом IRB. Предзагрузить шприц с 1 мл 4% цитрата натрия, чтобы предотвратить коагуляцию собранной крови.
- Положите 10 мл крови в каждую трубку с помощью шприца 10 мл и соедините концы металлическими адаптерами. Поместите заполненные кровью трубки на колеса петельного аппарата Чендлера.
- Передать кровь вдоль металлической фольги путем вращения колес при 37 градусов по Цельсию на скорости, рассчитанной на производство стрижки 25 династий/см2 на 4 ч.
- Слейте кровь из труб и распоряжаться кровью в соответствии с требованиями IRB.
- Вырезать трубки с помощью скальпеля для получения фольги из каждой трубки.
- Приготовьте 2% раствора глутаралдегида, разбавляя 10 мл раствора 4% глутаралдегида с помощью 10 мл буфера какодилата натрия с хлоридом натрия 0,1 М.
- Инкубировать фольги в 2% glutaraldehyde раствор в течение 15 мин и хранить при 4 градусов по Цельсию на ночь. Перед анализом, мыть металлические фольги 3x с PBS.
6. Анализ клеточного крепления к металлическим поверхностям с использованием красителя CFDA
- Теплый 8 мл PBS в 15 мл трубки в водяной бане установлен на 37 градусов по Цельсию.
- Приготовьте раствор красителя CFDA (карбокси-фторцеиновый диацетат, сукчинимидил эстер) следующим образом - добавьте 90 мкл DMSO к одному флакону красителя CFDA для достижения концентрации запасов 10 мМ. Затем подготовь рабочую концентрацию в 93,75 МКМ, добавив 75 МКЛ запаса CFDA к 8 мл теплого PBS. Смешайте путем инвертирования труб несколько раз и покрыть трубку алюминиевой фольгой.
ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется только что подготовить краситель CFDA перед каждым использованием. - Инкубировать каждую фольгу с 1 мл красителя CFDA в 24 хорошо пластины. Обложка пластины с алюминиевой фольгой и инкубировать пластины при 37 градусов по Цельсию в течение 15 минут.
- Вымойте металлическую фольгу 3x с PBS, чтобы удалить избыток красителя. Изображение с помощью перевернутого флуоресцентного микроскопа.
7. Моноцитное крепление и расширение макрофагов на модифицированных и голых металлических поверхностях pepCD47
- Соберите 10 мл периферической крови через доступ к вене кавы во время жертвоприношения крысы Sprague-Dawley 400-450 г самца. Смешайте сразу с 1000 МЕ гепарина натрия, чтобы предотвратить коагуляцию.
- Pipette 10 мл градиентной среды плотности в коническую трубку 50 мл. Смешайте кровь с 5 мл PBS, и тщательно слой разбавленной крови над плотностью градиента среды с помощью пастер пипетки. Центрифуга в качающихся роторе ведра при 800 x g и 18-25 C в течение 20 минут с минимальными настройками ускорения и замедления.
- Используя пипетки Pasteur, соберите непрозрачный слой баффи пальто на интерфейсе между плазмой и Ficoll. Разбавить баффи пальто 1:3 с PBS и центрифуги на 550 х г и 4 градусов по Цельсию в течение 10 мин до баффи клетки пальто.
- Повторно приостановить баффи клетки пальто в 3 мл буфера лиза ACK для лиза загрязняющих эритроцитов. Инкубировать на льду в течение 4 мин. Добавьте 12 мл буфера разделения клеток (CSB; 0.5% BSA, 0.5% FBS, 2 mM EDTA/PBS).
- Центрифуга при 550 х г и 4 градусов по Цельсию в течение 10 мин. Повторно приостанавливайте гранулы в 10 мл CSB.
- Центрифуга при 200 х г и 4 градусов по Цельсию в течение 10 мин для устранения тромбоцитов. Повторите дважды.
- Повторно приостанавливайте гранулы в 500 МКЛ CSB. Добавьте по 10 мкг каждого из следующих антител мыши: CD8a (клон OX-8), anti-CD5 (клон OX-19), anti-CD45RA (клон OX-33) и anti-CD6 (клон OX-52).
- Инкубировать при 4 градусов по Цельсию на вертикальном трубчатом ротаторе в течение 1 ч. Добавьте 9,5 мл CSB. Центрифуга при 300 х г и 4 градусов по Цельсию в течение 10 мин. Откажитесь от супернатанта, повторно приостановьте гранулы в 10 мл CSB и повторите центрифугу.
- Повторно приостанавливайте гранулы в 500 МКЛ CSB. Добавьте 150 мкл козьих антимошейных микробусов IgG. Инкубировать при 4 градусов по Цельсию на вертикальном трубчатом ротаторе в течение 20 мин. Добавьте 9,5 мл CSB. Центрифуга при 300 х г и 4 градусов по Цельсию в течение 10 мин.
- Откажитесь от супернатанта. Повторно приостанавливайте гранулы в 1 мл CSB.
- Поместите колонку LS в магнитный сепаратор. Премьер LS колонке с 3 мл CSB. Отбросьте пропускную способность столбца. Добавьте 1 мл повторно приостановленных клеточных гранул из шага 7.10. Начните собирать пропускную способность. После остановки потока добавьте 5 мл CSB и продолжайте собирать пропускную способность столбца до тех пор, пока поток не остановится.
- Центрифуза черезпуть столбца (6 мл), содержащая отрицательно отобранные моноциты при 300 х г и 4 градусов по Цельсию в течение 10 мин. Повторно приостановить полученные небольшие гранулы в 2 мл RPMI-1640 среднего дополняется 10% FCS, 1% пера / стрептококка и 100 нг / мл крысы макрофаг колонии стимулирующий фактор (M-CSF).
- Подсчитайте моноциты с помощью гемоцитометра. Отрегулируйте концентрацию моноцитов до 5 х10 5 клеток/мл.
- Добавьте 1 мл объемов моноцитов подвески к отдельным скважинам 12 пластины скважины с голыми образцами фольги из нержавеющей стали (N-3) или образцами из нержавеющей стали, модифицированными с крысиным pepCD47 (N-3) в соответствии с 1,1-1,10 и 3,1-3,6.
- Изменение среды на дни 3 и 5 после посева. На 6-й день после посева мыть клетки с PBS и исправить с 4% параформальдегид при комнатной температуре в течение 15 минут. Вымойте дважды с PBS в течение 5 минут.
- Удалите фольги из нержавеющей стали и поместите их индивидуально в новую пластину 12 хорошо. Не переворачивать фольгу.
- Инкубация в 0,5% Tween-20/PBS в течение 15 минут, чтобы пронизать клетки. Вымойте дважды с PBS в течение 5 минут.
- Блок в 10% козьей сыворотки / PBS в течение 20 мин. Аспирировать сыворотку. Не мыть. Добавьте антитела мыши anti-rat CD68 (разбавленное 1:100 в 1%BSA/PBS). Инкубация при комнатной температуре 1 ч. Вымойте 3x в PBS в течение 5 минут каждый.
- Добавить козу против мыши IgG Alexa Fluor 546 (разбавленный 1:200 в 1% BSA/PBS). Инкубировать в темноте при комнатной температуре в течение 45 мин. Вымойте в PBS в течение 5 минут. Счетчик с 1 мкг /мл Hoechst 33342 красителя в темноте при комнатной температуре в течение 10 мин. Вымойте 3x в PBS в течение 5 минут каждый.
- Переверните фольгу и изображение с помощью флуоресцентного микроскопа с перевернутой оптикой. Захват изображений при увеличении в 200 раз с синими и красными настройками фильтра.
- Подсчитайте прикрепленные моноциты в отдельных изображениях и вычислили средние показатели группы и стандартные отклонения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Металлические поверхности оказываются тиол-реактивными для пептидного крепления с помощью ряда химических модификаций, как показано на рисунке 1. Инкубация PABT с последующим лечением PEI-PDT делает металлическую поверхность подложной для пептидного крепления. Пептид CD47 (pepCD47), содержащий остатки цистеина в C-термине, присоединенный к основной последовательности pepCD47 через гибкий двойной мост AEEAc, ковалентно крепится к тиол-реактивным поверхностям через дисульфидные связи. Используя этот протокол, мы продемонстрировали, что pepCD47 остается стабильно прикреплены к металлической поверхности на срок до шести месяцев и может выдержать нормальный физиологический стресс стрижки истерилизации процедур 17.
Максимальная задержка пептида была определена путем приложения TAMRA-спряженного pepCD47 к металлической поверхности с последующим обширным мытьем для устранения нековалентно связанного пептида, расщепления TAMRA-pepCD47 за счет уменьшения дисульфидных мостов, привязывающих пептид к поверхности, и аналитической количественной оценки с использованием фторметрического анализа. В частности, увеличение входного количества TAMRA-конъюгированных pepD47 (1 мл раствора 10 - 200 мкг/мл) было приковано к поверхностям с покрытием PEI-PDT и промыто несколько раз, чтобы удалить нековалентно связанный пептид. Концентрация ковалентно связанного TAMRA-спряженного pepCD47 была определена с помощью уменьшаемого агента TCEP для высвобождения ковалентно прикрепленного пептида и оценки его флуоресценции в отношении стандартов. Концентрация входного сигнала 10, 30, 100 и 200 мкг/мл продемонстрировала удержание пептида 28 ± 2, 78 ± 2, 182 ± 14 и 157 ± 25нг/см 2 соответственно (рисунок 2). Таким образом, максимальная плотность иммобилизации pepCD47 на металлической поверхности была обнаружена примерно 180нг/см 2, которая была достигнута с входной концентрацией 100 мкг/мл. Надлежащая иммобилизация TAMRA-конъюгированных pepCD47 на PABT/PEI-PDT-модифицированных металлических поверхностей была дополнительно подтверждена флуоресцентной микроскопией(рисунок 3), которая продемонстрировала однородную флуоресценцию, испускаемую с поверхности СпрА-спряженных pepCD47-обработанных сетчатыхдисков (рисунок 3A). Только минимальная флуоресценция была обнаружена на поверхности контрольных сеток, в которых отсутствовала модификация PABT/PEI-PDT(рисунок 3B),тем самым исключая не связанный TAMRA-спряженный pepCD47 в качестве основного источника флуоресценции.
Далее, мы оценили способность pepCD47 покрытием поверхностей для предотвращения острого кроветворных клеток вложения по сравнению с неизмененной и вскарабкался последовательности пептид модифицированных поверхностей. Пептид схватки имеет тот же аминокислотный состав, что и pepCD47, но вдругом порядке 14,17. Присоединение клеток крови оценивалось путем вращения крови здоровых добровольцев человека через неизмененные, скремблированные и модифицированные поверхности pepCD47 в аппарате петли Чендлера, а затем стирка для удаления непривязанных клеток, фиксация и окрашивание красителем CFDA. Поверхности визуализировались с помощью микроскопии флуоресценции. В соответствии с нашими ранееопубликованными данными 14,17 pepCD47 покрытием поверхностей показывают резкое сокращение вложения клеток, передающихся через кровь по сравнению с скремблированных модифицированных и неизмененных элементов управления (Рисунок 4).
Чтобы расширить влияние модификации поверхности pepCD47 на воспалительное присоединение клеток и пролиферацию, мы использовали отрицательный иммуновыбор клеток крысиного баффи пальто, чтобы изолироватьмоноциты 19, и культурировали изолированные моноциты на голом металле и pepCD47-модифицированных фольгах из нержавеющей стали в течение 6 дней в присутствии M-CSF. Результаты этого исследования показывают комбинированное 58% затухание острой моноцитной привязанности, их фенотипическое преобразование в макрофаги и пролифажное пролиферация на функциональных поверхностях pepCD47(рисунок 5A) по сравнению с голыми металлическими управлениями(рисунок 5 B,C).
Рисунок 1: Схематическое представление шагов, участвующих в приложении pepCD47 к металлическим поверхностям. (A)Образцы чистого металла были испечены при 220 градусах по Цельсию для окисления металлической поверхности. Бисфосфонатные группы полаллиламин бисфосфоната с скрытыми группами тиола (PABT) сформировали координированные связи с оксидами металла и покрывают металлические поверхности, чтобы сформировать функциональный монослой. Металлические поверхности с покрытием PABT были дополнительно обработаны TCEP для депротекторной деятельности групп тиола. (B)Структура PEI-PDT и символическое представление. (C) PABT покрытием и TCEP уменьшенные поверхности были обработаны PEI-PDT, который усилил общее количество тиол-реактивных групп, доступных для крепления тиадийного пептида. Наконец, поверхности с покрытием PEI-PDT реагировали с помощью терминальных групп цистеин pepCD47, и пептид был прикреплен к поверхности через дисульфидные связи. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Определение плотности иммобилизации pepCD47 на металлической поверхности. 1 см х 1 см металлической фольги были изменены с использованием увеличения концентрации (10, 30, 100 и 200 мкг/мл) фторфора конъюгированных pepCD47. Избыток пептида был удален с помощью нескольких шагов стирки затем обрабатываются 1 мл TCEP решение расщеплять фторфора конъюгированных флюорофор. Концентрация пептида, ковалентно прикрепленного к металлической поверхности, была проанализирована флюориметрически с использованием стандартной кривой, подготовленной с определенными концентрациями флюорофора, конъюгированных pepCD47. Плотность иммобилизации была представлена как ng/cm2 пептида, прикрепленного к металлической поверхности. Данные выражаются как среднее ± SEM и являются репрезентативными по крайней мере в трех независимых экспериментах. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Флуоресценция микроскопии изображения поверхности из нержавеющей стали изменены с TAMRA-конъюгированных pepCD47. Нержавеющая сталь сетки диски, последовательно изменены с PABT, TCEP, PEI-PDT (A) или неизмененных (B) были прореагированы с TAMRA-спряженных pepCD47. Правильно спряженные и контроль голые металлические сетки были широко промывают и изображения на 100x увеличение. Длина бара шкалы составляет 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть более широкую версию этой цифры.
Рисунок 4: Оценка острых противовоспалительных и противоисктотических функций pepCD47. 0,65 см х 1 см металлической фольги были покрыты 100 мкг / мл либо человека pepCD47 или вскарабкался пептид и подвергаются воздействию крови в аппарате петли Чендлера. Несырьевые клетки были удалены путем мытья с PBS и фольги были зафиксированы в 2% глутаралдегид. Неизмененные, скремблированные модифицированные и модифицированные поверхности человека pepCD47 затем инкубировали красителем CFDA в течение 15 минут при 37 градусов по Цельсию, промыли PBS и проанализировали с помощью флуоресцентного микроскопа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5: Распространенность CD68-положительных макрофагов на голых и пепКД47-функциональных металлических поверхностях. Крысиные периферические моноциты, полученные из крови, были выделены центрифугированием градиентной плотности с последующим отрицательным иммуновыбором с помощью магнитных микробусов. 5 х 105 моноцитов были добавлены в скважины 12 пластины скважины с индивидуально размещенными голыми образцами металлической фольги (N-3) или образцами, полученными с крысиным pepCD47. Дифференциация макрофагов стимулировалась 100 нг/мл M-CSF. Через шесть дней после посева клетки были зафиксированы, и иммунотеинированы анти-крысы CD68 антитела, вторичные Alexa Fluor-546 (красный) конъюгированных антител и противоядие с Hoechst 33342 ядерного красителя (синий). Репрезентативные изображения поверхностей гологометалла (A)и pepCD47(B) были захвачены при увеличении и сливах в 200 раз.B Длина бара шкалы составляет 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть более широкую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Мы демонстрируем и описываем относительно новую химическую стратегию для применения терапевтических пептидных moieties к поверхности из нержавеющей стали с общей целью снижения реактивности поверхности с воспалительными клетками, найденными в крови. Химия бисфосфоната, описанная в этом, включает в себя координацию формирования связей между оксидами металла и бисфосфонатных групп PABT. Толщина однослойного полибисфосфоната, образовавшегося на поверхности металла, не превышает5 нм 18,а значит, несущественное для потенциального провоспалительных эффектов толстых полимерныхпокрытий 20. Депротекторция скрытой группы тиола в алифатических боковых цепях PABT премьеры металлических поверхностей для дальнейшей химической модификации с тиол-реактивных соединений. PEI-PDT является разветвленной полиэтиленеймин (в среднем Mw'25,000), в котором 20% этиленеймин ссылки модифицируются с тиол-реактивных пиридилдитио групп. Так как только меньшинство pdt групп в PEI-PDT потребляются в реакции с PABT полученных тиолов, поверхностная химия после PEI-PDT привязывания изменен на тиол-реактивный, чтобы вложение тиал пептидов18. Эта химическая стратегия была разработана и широко используется в нашей лаборатории для присоединения нескольких биомолекул, таких какрекомбинантные белки 14,пептиды 14,,17и вирусные векторыгенов 18 к металлической поверхности. Хотя, на протяжении большей части нашей работы мы использовали поверхности из нержавеющей стали, PABT можетвзаимодействовать с другими металлическими сплавами 21 и, таким образом, имеет потенциал для улучшения биосовместимости и терапевтического потенциала широкого спектра металлических биоматериалов.
Наша текущая методология показывает, что максимальная плотность иммобилизации флюорофора конъюгированных pepCD47 на металлических поверхностях составляет 180нг/см 2, что меньше по сравнению с нашими ранее опубликованнымиданными 17. Мы приписываем это несоответствие различным стратегиям стирки, используемым в обоих исследованиях. В нашем текущем протоколе мы использовали SDS, который полностью удаляет нековалентно связанные пептиды по сравнению с Tween-20, который был использован в наших первоначальных исследованиях. Тем не менее, 180нг/см 2 соответствует примерно 4х 10 6 молекул /м 2 pepCD47. Эта плотность иммобилизации намного выше, чем физиологические уровни CD47 на поверхностях клеток, которые составляют примерно 390 молекул /мкм 2,22. Таким образом, мы прогнозируем, что строгие условия стирки не будут существенно влиять на противовоспалительные свойства модифицированных металлических поверхностей pepCD47.
Эта методология крепления pepCD47 к металлу очень воспроизводится, однако есть несколько этапов в протоколе, которые нуждаются в тщательном внимании. Во-первых, после покрытия металлической поверхности с PABT и уменьшения его с помощью TCEP, тиолы склонны к окислению при воздействии воздуха. Таким образом, крайне важно, чтобы поверхности всегда погружались в дегазированную воду. По этой же причине раствор PEI-PDT делается в дегазацию воды и аргон добавляется во флаконы во время инкубации фольги, покрытой PEI-PDT. Во-вторых, необходимо учитывать возможность выпадения солубилизованных пептидов. PepCD47 имеет терминал остатков цистеин, а также остатки цистеин в последовательности. Таким образом, при неправильном хране существует высокая вероятность того, что пептиды полимеризируются и выходят из раствора. Для решения этой потенциальной проблемы рекомендуется уменьшить пептиды с помощью бусин TCEP в течение 20 мин до 1 ч до инкубации с поверхностями с покрытием PEI-PDT. TCEP поможет уменьшить пептиды и увеличить их солуство в их соответствующих разбомбов. Также рекомендуется вытеснять окружающий воздух аргоном во флаконах во время инкубации образцов PEI-PDT с тиадиным пептидом.
Если следовать вышеупомянутым мерам предосторожности, метод покрытия воспроизводится, и единственным потенциальным ограничением для такого подхода является коммерческая не доступность реагентов PABT и PEI-PDT.
Мы использовали аппарат петли Чендлера, чтобы обеспечить ex vivo доказательство концептуального анализа, чтобы понять взаимодействие модифицированных металлических поверхностей pepCD47 с кровянымиклетками,и он был успешно использован нашей лабораторией, чтобы показать противовоспалительные свойства поверхностей pepCD47 спокрытием 14,15,17,23. В этом исследовании мы использовали краситель CFDA, который флуоресцирует только после входа в клетки, когда ацетатные группы красителя расщепляются внутриклеточной эстеразой. Преимущества этой процедуры окрашивания в том, что он окрашивает ануклеированные тромбоциты и красные кровяные тельца, как колодцы, как нуклеированные клетки, такие как лейкоциты. Таким образом, использование красителя CFDA дает оценку как острых противотомботических, так и антиклейных свойств поверхностей с покрытием pepCD47. Более подробную оценку можно получить путем сканирования электронной микроскопии и/или иммуностимулятора, оба из которых мы подробно описалиранее 24. Результаты текущего исследования подтверждают, что металлические поверхности с покрытием человека pepCD47 являются антитомботической и антиклейной по сравнению с неизмененными и скремблированными контролями последовательности.
Для дальнейшего изучения ли pepCD47-модифицированных поверхностей изменить характеристики роста прилагается воспалительных клеток, голые металлические фольги из нержавеющей стали или фольги, сформулированные с pepCD47 подверглись воздействию изолированных моноцитов крысы в присутствии сингенеических M-CSF. Клетки были выудены в стационарных условиях в течение 6 дней, чтобы фенотипическое преобразование и расширение макрофагов. В соответствии с нашими предыдущими результатами, наблюдаемыми вразличных экспериментальных условиях 14, глубокое снижение числа воспалительных клеток на функциональных поверхностях pepCD47 было продемонстрировано в текущем исследовании.
Таким образом, наши исследования в конечном итоге доказать, что новый полибисфосфонат химии для покрытия металлов с pepCD47 является эффективным способом улучшения биосовместимости металлических поверхностей и могут быть применены в других биомедицинских приложений, таких как искусственные суставы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторов нечего раскрывать.
Acknowledgments
Разработка протокола и исследования, представленные в настоящем документе, были поддержаны финансированием NIH (NBIB) R01 (является EB023921) ИФ и SJS, а также финансированием R01 (NHLBI) (No HL137762) ДЛЯ и RJL.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 M Tris-HCL | Invitrogen | 15567-027 | pH - 7.5 |
| 4% Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16539-07 | |
| 4% Sodium Citrate | Sigma | S5770 | |
| ACK lysing buffer | Quality Biologicals | 118-156-721 | |
| anti-CD45RA Ab (mouse anti-rat; clone OX-19) | Biolegend | 202301 | |
| anti-CD5 Ab (mouse anti-rat; clone OX-19) | Biolegend | 203501 | |
| anti-CD6 Ab (mouse anti-rat; clone OX-52) | BD Biosciences | 550979 | |
| anti-CD68 Ab (mouse anti-rat; clone ED-1) | BioRad | MCA341 | |
| anti-CD8a Ab (mouse anti-rat; clone OX-8) | Biolegend | 201701 | |
| Chloroform Certified ACS | Fisher Chemical | C298-500 | |
| Dimethyl Formammide (DMF) | Alfa Aesar | 39117 | |
| Embra stainless steel grid | Electron Microscopy Sciences | E200-SS | stainless steel mesh mesh disks |
| Ficoll Hypaque | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| Glacial acetic acid | ACROS organic | 148930025 | |
| goat anti-mouse IgG Alexa Fluor | ThermoFisher | A11030 | |
| Heparin sodium | Sagent Pharmaceuticals | 402-01 | |
| Human pepCD47 | Bachem | 4099101 | |
| Isopropanol | Fisher Chemical | A426P-4 | |
| Metal adapters | Leur Fitting | 6515IND | 1 way adapter 316 ss 1/4"-5/16" hoes end |
| Methanol | RICCA chemical company | 4829-32 | |
| Microscope | Nikon Eclipse | TE300 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | 14190-136 | |
| Pottasium Bicarbonate (KHCO3) | Fisher Chemical | P184-500 | |
| PVC tubes | Terumo-CVS | 60050 | 1/4" X 1/16 8' |
| sodium cacodylate buffer with 0.1M sodium chloride | Electron Microscopy Sciences | 11653 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Bio-Rad laboratories | 161-0302 | |
| Sodum actetate (C2H3NaO2) | Alfa Aesar | A13184 | |
| Src peptide | Bachem | 4092599 | |
| Stainless steel (AISI 304) cylinder-shaped samples with a lumen | Microgroup, Medway, MA | 20097328 | 1 cm X 6 mm OD |
| Stainless steel foils (AISI 316L) | Goodfellow, Coraopolis, PA | 100 mm X 100 mm X 0.05 mm | |
| Tetramethylrhodamine-conjugated pepCD47 (TAMRA-pepCD47) | Bachem | 4100277 | |
| TMB (3,3’ ,5,5’ -tetramethylbenzidine) substrate and tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride (TCEP) | Thermo Scientific | PG82089 | |
| Tween-20 | Bio-Rad laboratories | 170-6531 | |
| Vybrant CFDA SE Cell Tracer Kit | Invitrogen | V12883 |
References
- Buccheri, D., Piraino, D., Andolina, G., Cortese, B. Understanding and managing in-stent restenosis: a review of clinical data, from pathogenesis to treatment. Journal Thoracic Disease. 8 (10), 1150-1162 (2016).
- van Oeveren, W.
- Mitra, A. K., Agrawal, D. K. In stent restenosis: bane of the stent era. Journal of Clinical Pathology. 59 (3), 232-239 (2006).
- Iqbal, J., Gunn, J., Serruys, P. W. Coronary stents: historical development, current status and future directions. British Medical Bulletin. 106, 193-211 (2013).
- Hoffmann, R., et al. Patterns and mechanisms of in-stent restenosis. A serial intravascular ultrasound study. Circulation. 94 (6), 1247-1254 (1996).
- Stefanini, G. G., Windecker, S. Stent thrombosis: no longer an issue with newer-generation drug-eluting stents. Circulation: Cardiovascular Interventions. 5 (3), 332-335 (2012).
- Palmerini, T., et al. Clinical outcomes with bioabsorbable polymer- versus durable polymer-based drug-eluting and bare-metal stents: evidence from a comprehensive network meta-analysis. Journal of the American College of Cardiology. 63 (4), 299-307 (2014).
- Omar, W. A., Kumbhani, D. J. The Current Literature on Bioabsorbable Stents: a Review. Current Atherosclerosis Reports. 21 (12), 54 (2019).
- Slee, J. B., Christian, A. J., Levy, R. J., Stachelek, S. J. Addressing the Inflammatory Response to Clinically Relevant Polymers by Manipulating the Host Response Using ITIM Domain-Containing Receptors. Polymers (Basel). 6 (10), 2526-2551 (2014).
- Oldenborg, P. A., et al. Role of CD47 as a marker of self on red blood cells. Science. 288 (5473), 2051-2054 (2000).
- vanden Berg, T. K., vander Schoot, C. E. Innate immune 'self' recognition: a role for CD47-SIRPalpha interactions in hematopoietic stem cell transplantation. Trends in Immunology. 29 (5), 203-206 (2008).
- Tengood, J. E., Levy, R. J., Stachelek, S. J. The use of CD47-modified biomaterials to mitigate the immune response. Experimental Biology Medicine (Maywood). 241 (10), 1033-1041 (2016).
- Tsai, R. K., Rodriguez, P. L., Discher, D. E. Self inhibition of phagocytosis: the affinity of 'marker of self' CD47 for SIRPalpha dictates potency of inhibition but only at low expression levels. Blood Cells, Molecules and Diseases. 45 (1), 67-74 (2010).
- Slee, J. B., et al. Enhanced biocompatibility of CD47-functionalized vascular stents. Biomaterials. 87, 82-92 (2016).
- Finley, M. J., et al. Diminished adhesion and activation of platelets and neutrophils with CD47 functionalized blood contacting surfaces. Biomaterials. 33 (24), 5803-5811 (2012).
- Stachelek, S. J., et al. The effect of CD47 modified polymer surfaces on inflammatory cell attachment and activation. Biomaterials. 32 (19), 4317-4326 (2011).
- Inamdar, V. V., et al. Stability and bioactivity of pepCD47 attachment on stainless steel surfaces. Acta Biomaterialia. 104, 231-240 (2020).
- Fishbein, I., et al. Local delivery of gene vectors from bare-metal stents by use of a biodegradable synthetic complex inhibits in-stent restenosis in rat carotid arteries. Circulation. 117 (16), 2096-2103 (2008).
- Moser, K. V., Humpel, C. Primary rat monocytes migrate through a BCEC-monolayer and express microglia-markers at the basolateral side. Brain Research Bulletin. 74 (5), 336-343 (2007).
- vander Giessen, W. J., et al. Marked inflammatory sequelae to implantation of biodegradable and nonbiodegradable polymers in porcine coronary arteries. Circulation. 94 (7), 1690-1697 (1996).
- Fishbein, I., et al. Bisphosphonate-mediated gene vector delivery from the metal surfaces of stents. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (1), 159-164 (2006).
- Mouro-Chanteloup, I., et al. Evidence that the red cell skeleton protein 4.2 interacts with the Rh membrane complex member CD47. Blood. 101 (1), 338-344 (2003).
- Finley, M. J., Clark, K. A., Alferiev, I. S., Levy, R. J., Stachelek, S. J. Intracellular signaling mechanisms associated with CD47 modified surfaces. Biomaterials. 34 (34), 8640-8649 (2013).
- Slee, J. B., Alferiev, I. S., Levy, R. J., Stachelek, S. J. The use of the ex vivo Chandler Loop Apparatus to assess the biocompatibility of modified polymeric blood conduits. Journal of Visualized Experiments. (90), e51871 (2014).
