Summary
Hier gepresenteerd is een protocol voor het toevoegen van peptide CD47 (pepCD47) aan metalen stents met behulp van polybisfosfonaat chemie. Functionalisatie van metalen stents met behulp van pepCD47 voorkomt de bevestiging en activering van ontstekingscellen waardoor hun biocompatibiliteit wordt verbeterd.
Abstract
De belangrijkste complicaties geassocieerd met bare metal stents en drug eluting stents zijn in-stent restenose en late stent trombose, respectievelijk. Het verbeteren van de biocompatibiliteit van metaalstenten blijft dus een belangrijke uitdaging. Het doel van dit protocol is om een robuuste techniek van metalen oppervlaktemodificatie te beschrijven door biologisch actieve peptiden om de biocompatibiliteit te vergroten van bloedcontacten met medische implantaten, waaronder endovasculaire stents. CD47 is een immunologische soortspecifieke marker van het zelf en heeft ontstekingsremmende eigenschappen. Studies hebben aangetoond dat een 22 aminozuur peptide die overeenkomt met het Ig-domein van CD47 in het extracellulaire gebied (pepCD47), ontstekingsremmende eigenschappen heeft, zoals het volledige eiwit. In vivo studies bij ratten, en ex vivo studies in konijn en menselijk bloed experimentele systemen van ons lab hebben aangetoond dat pepCD47 immobilisatie op metalen verbetert hun biocompatibiliteit door het voorkomen van inflammatoire cel gehechtheid en activering. Dit artikel beschrijft het stapsgewijze protocol voor de functionalisering van metalen oppervlakken en peptidebevestiging. De metalen oppervlakken worden gewijzigd met behulp van polyallylamine bisfosfaat met latente thiolgroepen (PABT), gevolgd door deprotectie van thiolen en versterking van thiol-reactieve locaties via reactie met polyethyleenimine geïnstalleerd met pyridyldithio groepen (PEI-PDT). Ten slotte worden pepCD47, waarin terminale cysteïneresten zijn opgenomen die via een dubbele 8-amino-3,6-dioxa-octanoyl-spacer op het metalen oppervlak zijn aangesloten, aan het metalen oppervlak bevestigd. Deze methode van peptide bevestiging aan metalen oppervlak is efficiënt en relatief goedkoop en kan dus worden toegepast om de biocompatibiliteit van verschillende metalen biomaterialen te verbeteren.
Introduction
Percutane coronaire interventie is de eerste lijn van de therapie voor de behandeling van coronaire hartziekten (CAD) en in de eerste plaats gaat stenting de zieke slagaders. Echter, in-stent restenose (ISR) en stent trombose zijn veel voorkomende complicaties in verband met stent inzet1. Bloedinteractie bij de bloedstentinterface wordt gekenmerkt door een bijna onmiddellijke adsorptie van plasma-eiwitten op het metalen oppervlak, gevolgd door bloedplaatjes en ontstekingscelbevestiging en activering2. Het vrijkomen van de inflammatoire cytokines en chemokines uit geactiveerde ontstekingscellen leidt tot de fenotypische modificatie van de vasculaire gladde spiercellen (VSMC's) in de tunica-media en activeert hun centrimentale migratie naar het intimale compartiment. Proliferatie van geactiveerde VSMC in de intima resulteert in intimale laagverdikking, lumenvernauwing en in-stent restenose3. Drug eluting stents (DES) werden ontwikkeld om VSMC proliferatie te voorkomen; deze geneesmiddelen hebben echter een off-target cytotoxisch effect op de endotheelcellen4,5. Daarom is late stenttrombose een veel voorkomende complicatie in verband met DES6,7. Stents gemaakt van biologisch afbreekbare polymeren, zoals poly-L-lactide hebben aangetoond veel belofte in de dierproeven en de eerste klinische proeven, maar werden uiteindelijk herinnerd toen de "real-life" klinisch gebruik aangetoond hun minderwaardigheid aan de3e generatie DES8. Daarom is er een noodzaak om de biocompatibiliteit van bare metal stents te verbeteren voor betere patiëntresultaten.
CD47 is een alomtegenwoordig uitgedrukt transmembrane eiwit dat de aangeboren immuunrespons remt wanneer gebonden aan zijn cognate receptor Signal Regulatory Protein alpha (SIRPα)9. De SIRPα-receptor heeft een itosineremmend motief (ITIM) en de signaleringsgebeurtenissen op SIRPα - CD47-interactie resulteert uiteindelijk in de downregulatie van ontstekingscelactivering10,11,12,13. Onderzoek in ons lab heeft aangetoond dat recombinant CD47 of zijn peptidederivaat, wat overeenkomt met het 22 aminozuur Ig-domein van het extracellulaire gebied van CD47 (pepCD47), de immuunrespons van de gastheer kan verminderen op een reeks klinisch relevante biomaterialen14,15,16. Onlangs hebben we aangetoond dat pepCD47 kan worden geïmmobiliseerd tot roestvrijstalen stentoppervlakken en de pathofysiologische respons die gepaard gaat met restenose aanzienlijk verminderen. Van belang, de pepCD47 gemodificeerde oppervlakken zijn vatbaar voor relevante gebruiksomstandigheden zoals langdurige opslag en ethyleenoxide sterilisatie17. Daartoe kan pepCD47 een nuttig therapeutisch doel zijn om de klinische beperkingen van endovasculaire stents aan te pakken.
De strategie voor de covalente bevestiging van pepCD47 aan een metalen oppervlak omvat een reeks nieuwe chemische modificaties van het metalen oppervlak. De metalen oppervlakken worden eerst bekleed met polyallylamine bisfosfonaat met latente thiolgroepen (PABT), gevolgd door de deprotectie van de thiolen en de bevestiging van polyethyleenimine (PEI) met geïnstalleerde pyridyldithiogroepen (PDT). PDT-groepen PEI die niet zijn ingenomen in de reactie met onbeschermde PABT-thiolen worden vervolgens gereageerd met pepCD47 waarin thiolen in de terminale cysteïneresiduen zijn verwerkt, wat resulteert in binding van pepCD47 aan het metalen oppervlak via een disulfide-binding14,17,18. We gebruikten een fluorofofoër geconjugeerde pepCD47 (TAMRA-pepCD47) om de inputconcentratie van peptide te bepalen die resulteert in de maximale oppervlakteimmobilisatie van het peptide. Ten slotte evalueerden we de acute en chronische ontstekingsremmende capaciteit van de met pepCD47 gecoate metalen oppervlakken, ex vivo, met behulp van respectievelijk het Chandler-lusapparaat en monocytenbevestiging/macrofaagexpansietest.
Dit document biedt een systematisch protocol voor de bevestiging van thiolated peptiden aan het metalen oppervlak; het bepalen van de maximale immobilisatiedichtheid van het peptide; en het beoordelen van de ontstekingsremmende eigenschappen van gecoat metalen pepcD47-oppervlakken die zijn blootgesteld aan volbloed en geïsoleerde monocyten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle menselijke monsters voor dit experiment werden verkregen in overeenstemming met de IRB van het Children's Hospital van Philadelphia. Alle dierproeven werden uitgevoerd na goedkeuring door IACUC van het Children's Hospital van Philadelphia.
1. Coating kale metalen oppervlakken met PEI-PDT
- Was de roestvrijstalen foliebonnen (1 cm x 1 cm of 0,65 cm x 1 cm) of roestvrijstalen meshschijven met 2-isopropanol in een shaker (60 °C, snelheid van 200 rpm) gedurende 5 minuten. Voer deze stap 2x uit. Was vervolgens 2x met chloroform (60 °C, snelheid van 200 tpm) gedurende 10 min per stuk.
- Plaats de gereinigde roestvrijstalen monsters in een oven op 220 °C gedurende 30 minuten.
- Bereid 5 mL van 0,5% PABT-oplossing voor door 25 mg polyallylaminesiofosfonaat op te lossen met latente thiolgroepen (PABT) en 5 mg kaliumbicarbonaat (KHCO3) in 5 mL DDW en incuto bij 72 °C in een shaker bij 200 tpm voor 30 min.
LET OP: Voor PABT synthese verwijzen naar eerder gepubliceerde literatuur18. - Dompel de gebakken folies of mesh schijven onder in 0,5% waterige oplossing van PABT en incubaal in een shaker (72 °C, snelheid van 200 rpm) gedurende 1 uur.
- Was de PABT-gemodificeerde monsters met gedeïsmiseerd gedestilleerd water (DDW) voor 5x, breng de exemplaren in een nieuw flesje en was opnieuw met DDW voor 5x.
- Bereid in totaal 5 mL TCEP-oplossing (12 mg/mL) voor door 60 mg Tris (2-carboxyethyl) fosfinehydrchloride (TCEP) op te lossen in 5 mL van 0,1 M azijnbuffer (0,57 mL glaciale azijnzuur, 820 mg natriumacetaat in 100 mL DDW).
- Behandel de PABT-gemodificeerde monsters met TCEP gedurende 15 minuten op kamertemperatuur (RT) op een shaker.
OPMERKING: TCEP wordt gebruikt om de thiolgroepen te beschermen. - Ontgas DDW in een ronde bodemkolf met behulp van een vacuümgender apparaat, zoals een lyofiel en was de TCEP behandelde folies of mesh schijven met ontgaste DDW voor 5x. Breng de monsters in een nieuw flesje, en bovendien wassen 5x met ontgast DDW.
OPMERKING: Het is van het grootste belang om snel te werken om oxidatie van thiolen op het metalen oppervlak door atmosferische zuurstof te voorkomen. - Bereid 5 mL van 1% PEI-PDT-oplossing voor door 212,5 μL voorraad PEI-PDT en 125 μL natriumacetaat van 0,4 M in ontgaste DDW te verdunnen. Voer stap 1.9 gelijktijdig uit met stap 1.8 om de blootstelling van de monsters aan atmosferische lucht te minimaliseren.
OPMERKING: De synthese van PEI-PDT wordt beschreven in eerder gepubliceerde literatuur18. - Incubeer de gewassen roestvrijstalen exemplaren met 1% PEI-PDT. Vervang lucht door argongas, sluit de flesjes luchtdicht af en meng op een shaker bij RT voor 1 uur. Ga onmiddellijk verder met de peptide vervoeging of bewaar op 4 °C tot 1 week.
2. Bijlage en kwalitatieve/kwantitatieve beoordeling van fluorofofoër geconjugeerde pepCD47 retentie op metalen oppervlak met behulp van fluorescentiemicroscopie en fluorimetrie
- Was folie coupons of mesh schijven bereid zoals beschreven in de sectie 1, stappen 1.1-1.10 hierboven met DDW 5x. Breng de monsters naar een nieuw flesje en was met DDW voor extra 5x. Tot slot wassen 2x met ontgaste ethanol en 2x met ontgast dimethyl formamide (DMF).
- Bereid tetramethylrhodamine (TAMRA)-geconjugeerde pepCD47 voorraadoplossing door tamra-geconjugeerd pepCD47-poeder in ontgassen dimethylformamide (DMF) op te lossen tot een uiteindelijke concentratie van 1 mg/mL. Aliquot de voorraad oplossing in 1 mL toewijzingen. Bewaar in goed afgesloten buizen onder argonatmosfeer bij -20 °C.
- Verdun 1 mg/mL van de voorraadoplossing van TAMRA-geconjugeerde pepCD47 met ontgaste DMF om de volgende concentraties fluorofophore vervoeging pepCD47 - 10, 30, 100 en 200 μg/mL voor te bereiden.
OPMERKING: Als TAMRA-geconjugeerde pepCD47 lijkt te zijn neergeslagen, verminder de voorraad TAMRA-geconjugeerde pepCD47 oplossing met behulp van TCEP kralen in verhouding 1:1, bij RT voor 20 min. Merk op dat voordat u de TAMRA-geconjugeerde pepCD47 toevoegt aan de TCEP-kralen, de TCEP-kralenoplossing draait, de supernatant verwijdert en vervolgens verder gaat met de toevoeging van de TAMRA-geconjugeerde pepCD47. - Incubeer de PEI-PDT gemodificeerde folie coupons met 10, 30, 100 of 200 μg/mL tamra-gevoegde pepCD47 in drievouden voor elke aandoening op een shaker bij RT onder argon atmosfeer gedurende 1 uur. Incubate PEI-PDT gemodificeerde mesh schijven, evenals mesh schijf niet gewijzigd dan stap 1.2 (bare metal controls) met 100 μg/mL tamra-conjugated pepCD47 in drievouden bij RT onder argon atmosfeer op een shaker voor 1 h.
LET OP: Vanaf deze stap worden de flesjes verpakt in aluminiumfolie om de inhoud tegen licht te beschermen. - Was de fluorofofofore geconjugeerde pepCD47-gecoate oppervlakken om het niet-covalente aangebrachte peptide in de volgende volgorde te verwijderen: DMF (3x), DMF/DDW om 1:1, DDW (3x), 0,3% SDS in 20 mM Tris pH 7.4 (3x, 5 min elk bij 70 °C op een shaker), DDW (3x), wissel flesjes en een laatste DDW-was.
- Plaats de besturing en covalently geconjugeerde mesh schijven op een microscoop glas, voeg 50 μL PBS en plaats een coverslip. Image mesh schijven met behulp van een omgekeerde fluorescentie microscoop uitgerust met een rhodamine filter set. Neem representatieve beelden bij 100x vergroting.
- Bereid 15 mL van 12 mg/mL TCEP-oplossing door 180 mg TCEP op te lossen in 1:1 v mengsel van methanol en 0,1 M azijnbuffer.
- Incubeer elke gewassen folie met 1 mL TCEP-oplossing op een shaker bij RT gedurende 15 minuten.
- Bereid de volgende normen voor door de TAMRA-vervoegde pepCD47-voorraad (1 mg/mL) – 100 μg/mL, 10 μg/mL, 1 μg/mL, 0,1 μg/mL en 0,01 μg/mL in de serie te verdunnen. Gebruik de TCEP-oplossing als verdunningsmiddel.
- Analyseer de TAMRA-conjugated pepCD47 die vrijkomt van het metalen oppervlak tegen de kalibratiecurve gegenereerd met behulp van de normen door fluorimetrie op 544/590 nm excitatie en emissie golflengten.
3. Het bevestigen van menselijke pepCD47 aan PEI-PDT gemodificeerde oppervlakken
- Was PEI-PDT gecoate monsters geformuleerd zoals beschreven in sectie 1, stappen 1.1-1.10 hierboven, met ontgastE DDW 5x, verander de flacon en was met ontgastE DDW 5x.
- Bereid menselijke pepCD47 voorraadoplossing (1 mg/mL) door het oplossen van menselijk pepCD47 poeder in ontgast 50% azijnzuur om een concentratie van 1 mg/mL te bereiken.
- Bereid de werkconcentratie van menselijke pepCD47 (100 μg/mL) voor door 500 μL van de voorraad menselijke pepCD47 op te lossen in 4.500 μL ontgast 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
- Incubeer de gewassen PEI-PDT gecoate monsters met 100 μg/mL pepCD47 bij RT met 1 h schudden.
- Was de menselijke pepCD47-gecoate monsters om overtollig peptide te verwijderen in de volgende volgorde PBS (3x), DDW (3x), 0,2% Tween-20 (3x, 5 min per stuk), DDW (3x), wissel flesjes en de uiteindelijke DDW was.
OPMERKING: Menselijke pepCD47 gecoate oppervlakken kunnen tot 6 maanden droog worden opgeslagen bij 4 °C.
4. Coating van de PEI-PDT gemodificeerde oppervlakken met vervormde sequentie (Scr)
- Los het roerige sequentiepoeder op in ontgast 0,1% azijnzuur om een voorraadoplossing van 1 mg/mL voor te bereiden.
- Bereid een oplossing van 100 μg/mL roerei door 500 μL van de in 4.500 μL ontgaste 0,1% azijnzuur op te lossen.
- Bedek de gewassen PEI-PDT exemplaren met 100 μg/mL roerei bij RT met schudden gedurende 1 uur.
- Om ongebonden roerei te verwijderen, was de oppervlakken in de volgende volgorde 0,01% azijnzuur (3x), DDW (3x), 0,2% Tween-20 (3x, 5 min), DDW (3x), wissel flesjes en een DDW-was.
5. Chandler lus voor het analyseren van cellulaire bevestiging aan metalen oppervlakken
- Bedek de metalen folies (0,65 cm x 1cm) met menselijke pepCD47 of roerei peptide volgens de beschrijving op sectie 1 gevolgd door 3 of 4.
- Snijd 1/4" PVC buizen in drie 38 cm lange stukken.
- Plaats tot 8 ongewijzigde, roerei of pepCD47 gemodificeerde metalen folies in drie verschillende buizen.
- Verzamel 30 mL bloed van gezonde menselijke donoren vrij van anti-bloedplaatjes medicijnen volgens institutionele IRB protocol. Preload spuit met 1 mL van 4% natriumcitraat om stolling van verzameld bloed te voorkomen.
- Doe 10 mL bloed in elke buis met behulp van een spuit van 10 mL en sluit de uiteinden aan met metalen adapters. Plaats de met bloed gevulde buizen op de wielen van het Chandler loop apparaat.
- Geef het bloed langs de metalen folies door wielrotatie bij 37 °C bij de snelheid berekend om de schaar van 25 dyns/cm2 voor 4 uur te produceren.
- Giet het bloed uit de buizen en gooi het bloed volgens de IRB-eisen weg.
- Snijd de buizen met behulp van de scalpel om de folies te halen uit elke buis.
- Bereid 2% glutaraldehydeoplossing voor door de 10 ml glutaraldehydeoplossing van 10 ml te verdunnen met behulp van 10 mL natriumcaanoodylaatbuffer met 0,1 M natriumchloride.
- Incubeer de folies in 2% glutaraldehydeoplossing gedurende 15 minuten en bewaar 's nachts op 4 °C. Voor het analyseren, was de metalen folies 3x met PBS.
6. Het analyseren van cellulaire bevestiging aan metalen oppervlakken met behulp van CFDA kleurstof
- Warm 8 mL PBS in 15 mL buis in een waterbad ingesteld op 37 °C.
- Bereid de CFDA -kleurstofoplossing (carboxy-fluorescein diacetaat, succinimidylester) als volgt voor - voeg 90 μL DMSO toe aan één CFDA-kleurstoffluis om een voorraadconcentratie van 10 mM te bereiken. Bereid vervolgens de werkconcentratie van 93,75 μM voor door 75 μL van de boude CFDA toe te voegen aan 8 mL warme PBS. Meng door de buizen een paar keer om te keren en bedek de buis met aluminiumfolie.
LET OP: Het is raadzaam om de CFDA-kleurstof voor elk gebruik vers te bereiden. - Incubeer elke folie met 1 mL CFDA kleurstof in een 24 putplaat. Bedek de plaat met aluminiumfolie en broed de plaat 15 min op 37 °C.
- Was de metalen folies 3x met PBS om overtollige kleurstof te verwijderen. Beeld met behulp van de omgekeerde fluorescentie microscoop.
7. Monocyte bevestiging en macrofaag uitzetting op de pepCD47-gemodificeerde en kale metalen oppervlakken
- Verzamel 10 mL perifeer bloed via de vena cava toegang tijdens het offeren van een 400-450 g mannelijke Sprague-Dawley rat. Meng onmiddellijk met 1.000 IE natriumheparine om stolling te voorkomen.
- Pipette 10 mL dichtheidsgradiënt medium in een conische buis van 50 mL. Meng het bloed met 5 mL PBS, en zorgvuldig laag verdund bloed over de dichtheid gradiënt medium met behulp van een Pasteur pipet. Centrifuge in een swingende emmerrotor bij 800 x g en 18-25 °C voor 20 minuten met minimale instellingen van acceleratie en vertraging.
- Met behulp van een Pasteur pipet, het verzamelen van een ondoorzichtige laag van buffy jas op de interface tussen plasma en Ficoll. Verdun buffy coat 1:3 met PBS en centrifuge bij 550 x g en 4 °C gedurende 10 minuten tot buffy coat cells.
- Schorsen buffy coat cellen in 3 mL van ACK lyse buffer om lyse besmetten erythrocyten. Incubeer op ijs voor 4 min. Voeg 12 mL celscheidingsbuffer (CSB; 0,5% BSA, 0,5% FBS, 2 mM EDTA/PBS) toe.
- Centrifuge bij 550 x g en 4 °C gedurende 10 minuten. Schort de pellet opnieuw op in 10 mL CSB.
- Centrifuge bij 200 x g en 4 °C gedurende 10 minuten om bloedplaatjes te elimineren. Herhaal het twee keer.
- Schort de pellet opnieuw op in 500 μL CSB. Voeg 10 μg toe van elk van de volgende antiratantilichamen van de muis: CD8a (kloon OX-8), anti-CD5 (kloon OX-19), anti-CD45RA (kloon OX-33) en anti-CD6 (kloon OX-52).
- Incubeer bij 4 °C op een verticale buisdrammer gedurende 1 uur. Voeg 9,5 mL CSB toe. Centrifuge bij 300 x g en 4 °C gedurende 10 minuten. Gooi supernatant weg, schort de pellet opnieuw op in 10 mL CSB en herhaal centrifugatie.
- Schort de pellet opnieuw op in 500 μL CSB. Voeg 150 μL geitenantimuis IgG microbeads toe. Incubeer bij 4 °C op een verticale buisdrammer gedurende 20 min. Voeg 9,5 mL CSB toe. Centrifuge bij 300 x g en 4 °C gedurende 10 minuten.
- Gooi de supernatant weg. Schort de pellet opnieuw op in 1 mL CSB.
- Plaats een LS-kolom in een magnetische scheidingsteken. Prime de LS kolom met 3 mL CSB. Gooi de kolomdoorvoer weg. Voeg 1 mL opnieuw opgehangen celpellet toe aan stap 7.10. Begin met het verzamelen van de doorvoer. Nadat de stroom stopt, voegt u 5 mL CSB toe en blijft u de kolomdoorvoer verzamelen totdat de stroom stopt.
- Centrifugeer de kolomdoorvoer (6 mL) met negatief geselecteerde monocyten bij 300 x g en 4 °C gedurende 10 min. Schort de resulterende kleine pellet opnieuw op in 2 mL RPMI-1640 medium aangevuld met 10% FCS, 1% pen/strep en 100 ng/mL rat macrofaag kolonie stimulerende factor (M-CSF).
- Tel de monocyten met hemocytometer. Stel de monocytconcentratie in op 5 x 105 cellen/mL.
- Voeg 1 mL-volumes monocytpensuspensie toe aan de afzonderlijke putten van een 12 putplaat met de kale roestvrijstalen foliemonsters (N=3) of roestvrijstalen monsters die zijn aangepast met rattenpeptCD47 (N=3) per 1.1-1.10 en 3.1-3.6.
- Verander het medium op dag 3 en 5 na het zaaien. Op dag 6 was je de cellen na het zaaien met PBS en bevestig je met 4% paraformaldehyde bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten. Was twee maal met PBS gedurende 5 minuten.
- Verwijder de roestvrijstalen folies en plaats ze individueel in een nieuwe 12 putplaat. Draai de folies niet om.
- Incubeer in 0,5% Tween-20/PBS gedurende 15 minuten om de cellen te permeabiliseren. Was twee maal met PBS gedurende 5 minuten.
- Blok in 10% geitenserum/PBS gedurende 20 minuten. Het serum aanzuigen. Niet wassen. Voeg muis anti-rat CD68 antilichaam (verdund 1:100 in 1%BSA/ PBS). Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 1 uur. Was 3x in PBS gedurende 5 minuten per stuk.
- Voeg geit anti-muis IgG Alexa Fluor 546 (verdund 1:200 in 1% BSA/ PBS). Incubeer in het donker bij kamertemperatuur gedurende 45 minuten. Was in PBS gedurende 5 minuten. Counterstain met 1 μg/mL Hoechst 33342 kleurstof in het donker bij kamertemperatuur gedurende 10 min. Was 3x in PBS gedurende 5 minuten per stuk.
- Draai de folies en het beeld met behulp van een fluorescerende microscoop met de omgekeerde optiek. Leg afbeeldingen vast bij 200x vergroting met blauwe en rode filterinstellingen.
- Tel de bijgevoegde monocyten in de afzonderlijke afbeeldingen en berekende de groepsgemiddelden en standaarddeviaties.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De metalen oppervlakken worden thiol-reactief gemaakt voor peptidebevestiging via een reeks chemische modificaties, zoals geïllustreerd in figuur 1. PABT incubatie gevolgd door PEI-PDT behandeling maakt het metalen oppervlak vatbaar voor peptide bevestiging. Peptide CD47 (pepCD47) met cysteïne residu op C-terminus verbonden met de kern pepCD47 sequentie door middel van een flexibele dubbele AEEAc brug is covalent bevestigd aan de thiol-reactieve oppervlakken via disulfide obligaties. Met behulp van dit protocol hebben we aangetoond dat pepCD47 tot zes maanden stabiel aan het metalen oppervlak blijft en bestand is tegen normale fysiologische afschuifspanning en sterilisatieprocedures17.
De maximale peptide retentie werd bepaald door toe te rusten TAMRA-conjugated pepCD47 aan het metalen oppervlak, gevolgd door de uitgebreide wassen om niet-covalente gebonden peptide te elimineren, decolleté van TAMRA-pepCD47 door vermindering van disulfide bruggen tethering het peptide aan het oppervlak, en analytische kwantificering met behulp van een fluorimetrische test. Specifiek werden steeds grotere input hoeveelheden TAMRA-conjugated pepD47 (1 mL van 10 - 200 μg/mL oplossing) toegevoegd aan de PEI-PDT gecoate oppervlakken en meerdere malen gewassen om het niet-covalente gebonden peptide te verwijderen. De concentratie van covalently gebonden TAMRA-geconjugeerde pepCD47 werd bepaald door het gebruik van een reducerend middel TCEP om het covalent bevestigd peptide vrij te geven en de fluorescentie tegen de normen te beoordelen. De inputconcentratie van 10, 30, 100 en 200 μg/mL toonde peptideretentie van respectievelijk 28 ± 2, 78 ± 2, 182 ± 14 en 157 ± 25 ng/cm2 (figuur 2). Zo bleek de maximale immobilisatiedichtheid van pepCD47 op het metalen oppervlak ongeveer 180 ng/cm2 te zijn, wat werd bereikt met een invoerconcentratie van 100 μg/mL. De juiste immobilisatie van TAMRA-geconjugeerde pepCD47 op de PABT/PEI-PDT-gemodificeerde metalen oppervlakken werd verder bevestigd door fluorescentie microscopie (Figuur 3) dat een uniforme fluorescentie uitgestoten van het oppervlak van TAMRA-geconjugeerde pepCD47-behandelde mesh schijven (Figuur 3A) aangetoond . Slechts minimale fluorescentie werd gedetecteerd op het oppervlak van de controlemanetten die ontbrakEN PABT /PEI-PDT wijziging (Figuur 3B), waardoor een niet-specifiek gebonden TAMRA-geconjugeerde pepCD47 als de belangrijkste bron van fluorescentie.
Vervolgens evalueerden we het vermogen van de pepCD47 gecoate oppervlakken om acute bloedgedragen celbevestiging te voorkomen in vergelijking met de ongewijzigde en roerei sequentie peptide gemodificeerde oppervlakken. De scramble peptide heeft dezelfde aminozuur samenstelling als pepCD47, maar in een andere volgorde14,17. De bloedgedragen cel gehechtheid werd geëvalueerd door rotatie van bloed van gezonde menselijke vrijwilligers over ongewijzigde, roerei, en pepCD47 gemodificeerde oppervlakken in de Chandler lus apparaat gevolgd door wassen om niet-verbonden cellen, fixatie, en vlekken met CFDA kleurstof te verwijderen. De oppervlakken werden gevisualiseerd door fluorescentie microscopie. In overeenstemming met onze eerder gepubliceerde gegevens14,17 pepCD47 gecoate oppervlakken tonen een drastische vermindering van de door bloed overgedragen celbevestiging in vergelijking met de roerei gewijzigde en ongewijzigde controles ( figuur4).
Om de effecten van pepCD47 oppervlaktemodificatie op ontstekingscelbevestiging en proliferatie uit te breiden, gebruikten we negatieve immunoselectie van rattenbuffy coat cells om monocyten19te isoleren, en kweekten we de geïsoleerde monocyten op bare metal en pepCD47-gemodificeerde roestvrijstalen folies gedurende 6 dagen in aanwezigheid van M-CSF. De resultaten van deze studie tonen een gecombineerde 58% demping van acute monocyten bevestiging, hun fenotypische conversie naar macrofagen, en macrofaag proliferatie op de pepCD47 gefunctionaliseerde oppervlakken (Figuur 5A) in vergelijking met de bare metal controles (Figuur 5 B, C).
Figuur 1: Schematische weergave van de stappen die betrokken zijn bij het toevoegen van pepCD47 aan metalen oppervlakken. AA) De stalen van schone metalen werden gebakken bij 220 °C om het metalen oppervlak te oxideren. De bisfosfonaatgroepen van polallylamine bisfosfolaat met latente thiolgroepen (PABT) vormden gecoördineerde banden met de metaaloxiden en bedekken de metaaloppervlakten om een gefunctionaliseerde monolayer te vormen. De PABT gecoate metaaloppervlakten werden verder behandeld met TCEP voor deprotectie van de thiolgroepen. (B) De structuur van PEI-PDT en symbolische vertegenwoordiging. (C) De met pabt gecoate en met TCEP verlaagde oppervlakken werden behandeld met PEI-PDT, waardoor het totale aantal thiolreactieve groepen die beschikbaar waren voor bevestiging van het thiolide. Ten slotte werden PEI-PDT gecoate oppervlakken gereageerd met terminale cysteïnegroepen van pepCD47, en het peptide werd via disulfidebindingen aan het oppervlak bevestigd. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Het bepalen van de immobilisatiedichtheid van pepCD47 op het metalen oppervlak. 1 cm x 1cm metalen folies werden gewijzigd met behulp van toenemende concentraties (10, 30, 100 en 200 μg/mL) van fluorofofofore geconjugedeerde pepCD47. Het overtollige peptide werd verwijderd met behulp van verschillende wasstappen vervolgens behandeld met 1 mL TCEP oplossing om de fluorofofoër geconjugeerde fluorofophore cleave. De concentratie van het peptide covalently bevestigd aan het metalen oppervlak werd fluorimetrisch geanalyseerd met behulp van een standaard curve bereid met gedefinieerde concentraties van fluorofofofore geconjugeerde pepCD47. De immobilisatiedichtheid werd vertegenwoordigd als ng/cm² peptide dat aan het metaaloppervlak wordt bevestigd. De gegevens worden uitgedrukt als gemiddelde ± SEM en zijn representatief voor ten minste drie onafhankelijke experimenten. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Fluorescentie microscopie beeldvorming van het roestvrijstalen oppervlak gewijzigd met TAMRA-geconjugeerde pepCD47. Roestvrijstalen mesh schijven, achtereenvolgens gewijzigd met PABT, TCEP, PEI-PDT (A) of ongewijzigde (B) werden gereageerd met TAMRA-geconjugeerde pepCD47. De goed geconjugeerde en controle kale metalen mazen werden uitgebreid gewassen en afgebeeld op 100x vergroting. De lengte van de schaalbalk is 100 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: Evaluatie van acute ontstekingsremmende en antitrombotische functies van pepCD47. 0,65 cm x 1cm metalen folies werden bekleed met 100 μg/mL van menselijke pepCD47 of roerei peptide en blootgesteld aan bloed in de Chandler lus apparaat. De niet-gebonden cellen werden verwijderd door het wassen met PBS en de folies werden vastgesteld in 2% glutaraldehyde. De ongewijzigde, roerei gemodificeerde en menselijke pepCD47 gemodificeerde oppervlakken werden vervolgens geïncubeerd met de CFDA kleurstof voor 15 minuten bij 37 °C, gewassen met PBS en geanalyseerd met behulp van een fluorescentie microscoop. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: Een prevalentie van CD68-positieve macrofagen op de kale en pepCD47-gefunctionaliseerde metalen oppervlakken. Rat perifere bloed-afgeleide monocyten werden geïsoleerd door gradiënt dichtheid centrifugatie gevolgd door negatieve immunoselectie met magnetische microbeads. 5 x 105 monocyten werden toegevoegd in de putten van een 12 put plaat met individueel geplaatste bare metal folie monsters (N = 3) of de monsters afgeleid met rat pepCD47. Macrofaagdifferentiatie werd gestimuleerd door 100 ng/ml M-CSF. Zes dagen na het zaaien werden de cellen bevestigd, en immunostained met anti-rat CD68 antilichaam, secundaire Alexa Fluor-546 (rood) geconjugeerd antilichaam en tegengehouden met Hoechst 33342 nucleaire kleurstof (blauw). Representatieve beelden van de kale metalen(A) en pepCD47-gefunctionaliseerde(B)oppervlakken werden vastgelegd bij 200x vergroting en samengevoegd. De lengte van de schaalbalk is 100 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
We demonstreren en beschrijven een relatief nieuwe chemische strategie om therapeutische peptidemoieties toe te brengen aan een roestvrijstalen oppervlak met het overkoepelende doel om de reactiviteit van het oppervlak te verminderen met ontstekingscellen in bloed. De hierin beschreven bisfosfonaatchemie omvat coördinerende bindingsvorming tussen de metaaloxiden en bisfosfonaatgroepen van PABT. De dikte van polybisfosfonaatmonolaag gevormd op het metalen oppervlak bedraagt niet meer dan 5 nm18, en is daarom onbelangrijk voor de potentiële pro-inflammatoire effecten van de dikke polymeercoatings20. Deprotectie van latente thiolgroep in de aliphatische zijketens van PABT priemt de metalen oppervlakken voor verdere chemische modificatie met thiol-reactieve verbindingen. PEI-PDT is vertakt polyethyleenimine (gemiddelde Mw=25.000) waarin ~ 20% van ethyleimineverbindingen worden gewijzigd met thiolreactieve pyridyldithiogroepen. Aangezien slechts een minderheid van PDT-groepen in PEI-PDT worden verbruikt in de reactie met de PABT-afgeleide thiolen, wordt de oppervlaktechemie na PEI-PDT-tethering veranderd in thiol-reactief om gehechtheid van thiolated peptiden mogelijk te maken18. Deze chemische strategie werd ontwikkeld en op grote schaal gebruikt in ons lab voor de bevestiging van verschillende biomoleculen, zoals recombinante eiwitten14, peptiden14,17, en virale genvectoren18 aan het metalen oppervlak. Hoewel, voor het grootste deel van ons werk hebben we roestvrij stalen oppervlakken gebruikt, PABT kan interageren met andere metaallegeringen21 en heeft dus het potentieel om de biocompatibiliteit en therapeutisch potentieel van een breed scala van metalen biomaterialen te verbeteren.
Onze huidige methodologie geeft aan dat de maximale immobilisatiedichtheid van fluorofoof conjugated pepCD47 op metalen oppervlakken 180 ng/cm2is, wat minder is in vergelijking met onze eerder gepubliceerde gegevens17. We schrijven deze discrepantie toe aan de verschillende wasstrategieën die in beide studies worden gebruikt. In ons huidige protocol hebben we gebruik gemaakt van SDS die volledig verwijdert niet-covalente gebonden peptiden in vergelijking met Tween-20 die werd gebruikt in onze eerste studies. 180 ng/cm2 komt echter overeen met ongeveer 4 x 106 moleculen/μm2 van pepCD47. Deze immobilisatiedichtheid is veel hoger dan de fysiologische niveaus van CD47 op celoppervlakken die ongeveer 390 moleculen/μm2,22zijn. Zo voorspellen we dat strenge wasomstandigheden de ontstekingsremmende eigenschappen van pepCD47 gemodificeerde metalen oppervlakken niet significant zouden beïnvloeden.
Deze methode van bevestiging van pepCD47 aan metaal is zeer reproduceerbaar, maar er zijn verschillende stappen in het protocol die zorgvuldige aandacht nodig hebben. Ten eerste, na het coaten van het metalen oppervlak met PABT en het verminderen met behulp van TCEP, zijn de thiolen gevoelig voor oxidatie bij blootstelling aan lucht. Het is dus van het grootste belang dat de oppervlakken altijd ondergedompeld worden in ontgast water. Om dezelfde reden wordt de PEI-PDT-oplossing gemaakt in ontgasseerd water en wordt argon toegevoegd aan de flacons tijdens het incubatiewerk van folies bekleed met PEI-PDT. Ten tweede moet men rekening houden met de kans op neerslag van oplospte peptiden. PepCD47 heeft een terminale cysteïneresidu, evenals cysteïneresten in de sequentie. Dus, wanneer ten onrechte opgeslagen, is er een grote kans dat de peptiden polymeriseren en neerslaan uit de oplossing. Om dit potentiële probleem aan te pakken, wordt aanbevolen dat de peptiden moeten worden verminderd met behulp van TCEP kralen voor 20 min tot 1 uur voorafgaand aan incubatie met PEI-PDT gecoate oppervlakken. TCEP zou helpen om de peptiden te verminderen en hun oplosbaarheid in hun respectieve verdunningsprobleem te verhogen. Het wordt ook aanbevolen om omgevingslucht te verplaatsen met argon in de flesjes, terwijl het uitbroeden van de PEI-PDT gecoate monsters met thiolated peptide.
Als de bovengenoemde voorzorgsmaatregelen worden gevolgd, is de coatingtechniek reproduceerbaar en de enige mogelijke beperking voor deze aanpak is de commerciële niet-beschikbaarheid van reagentia PABT en PEI-PDT.
We gebruikten een Chandler loop-apparaat om ex vivo proof of concept analyse te bieden om de interactie van pepCD47 gemodificeerde metalen oppervlakken met bloedcellen te begrijpen en het is met succes gebruikt door ons lab om de ontstekingsremmende eigenschappen van pepCD47 gecoate oppervlakken14,15,17,23te tonen. In deze studie gebruikten we CFDA-kleurstof die pas fluorescert nadat ze de cellen zijn binnengevaren wanneer de acetaatgroepen van de kleurstof worden gespleten door de intracellulaire esterase. De voordelen van deze kleuring procedure zijn dat het vlekken op de anucleated bloedplaatjes en rode bloedcellen evenals de nucleated cellen zoals leukocyten. Dus, met behulp van CFDA kleurstof biedt een beoordeling van zowel acute anti-trombotische en anti-lijm eigenschappen van pepCD47 gecoate oppervlakken. Meer gedetailleerde beoordeling kan worden verkregen door het scannen van elektronenmicroscopie en/of immunostaining, die we beide eerder hebben beschreven24. Resultaten van de huidige studie valideren dat de menselijke pepCD47 gecoate metalen oppervlakken zijn anti-trombotische en anti-lijm in vergelijking met de ongewijzigde en vervormde sequentie controles.
Om verder te onderzoeken of pepCD47-gemodificeerde oppervlakken de groeikenmerken van bijgevoegde ontstekingscellen veranderen, werden roestvrijstalen folies van bare metal of folies die met pepCD47 zijn geformuleerd, blootgesteld aan geïsoleerde rattenmonocyten in aanwezigheid van syngeneic M-CSF. De cellen werden gekweekt onder stationaire omstandigheden voor 6 dagen om de fenotypische conversie en uitbreiding van macrofagen mogelijk te maken. In overeenstemming met onze eerdere resultaten waargenomen in de verschillende experimentele instellingen14, werd een diepgaande afname van het ontstekingscelnummer op pepCD47 gefunctionaliseerde oppervlakken aangetoond in de huidige studie.
Zo bewijzen onze studies uiteindelijk dat de nieuwe polybisfosfonaatchemie voor coatingmetalen met pepCD47 een effectieve manier is om de biocompatibiliteit van metalen oppervlakken te verbeteren en kan worden toegepast in andere biomedische toepassingen, zoals kunstmatige gewrichten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Protocol ontwikkeling en studies gepresenteerd in dit document werden ondersteund door NIH (NBIB) R01 financiering (# EB023921) aan IF en SJS, en NIH (NHLBI) R01 financiering (# HL137762) aan IF en RJL.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 M Tris-HCL | Invitrogen | 15567-027 | pH - 7.5 |
| 4% Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16539-07 | |
| 4% Sodium Citrate | Sigma | S5770 | |
| ACK lysing buffer | Quality Biologicals | 118-156-721 | |
| anti-CD45RA Ab (mouse anti-rat; clone OX-19) | Biolegend | 202301 | |
| anti-CD5 Ab (mouse anti-rat; clone OX-19) | Biolegend | 203501 | |
| anti-CD6 Ab (mouse anti-rat; clone OX-52) | BD Biosciences | 550979 | |
| anti-CD68 Ab (mouse anti-rat; clone ED-1) | BioRad | MCA341 | |
| anti-CD8a Ab (mouse anti-rat; clone OX-8) | Biolegend | 201701 | |
| Chloroform Certified ACS | Fisher Chemical | C298-500 | |
| Dimethyl Formammide (DMF) | Alfa Aesar | 39117 | |
| Embra stainless steel grid | Electron Microscopy Sciences | E200-SS | stainless steel mesh mesh disks |
| Ficoll Hypaque | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| Glacial acetic acid | ACROS organic | 148930025 | |
| goat anti-mouse IgG Alexa Fluor | ThermoFisher | A11030 | |
| Heparin sodium | Sagent Pharmaceuticals | 402-01 | |
| Human pepCD47 | Bachem | 4099101 | |
| Isopropanol | Fisher Chemical | A426P-4 | |
| Metal adapters | Leur Fitting | 6515IND | 1 way adapter 316 ss 1/4"-5/16" hoes end |
| Methanol | RICCA chemical company | 4829-32 | |
| Microscope | Nikon Eclipse | TE300 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | 14190-136 | |
| Pottasium Bicarbonate (KHCO3) | Fisher Chemical | P184-500 | |
| PVC tubes | Terumo-CVS | 60050 | 1/4" X 1/16 8' |
| sodium cacodylate buffer with 0.1M sodium chloride | Electron Microscopy Sciences | 11653 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Bio-Rad laboratories | 161-0302 | |
| Sodum actetate (C2H3NaO2) | Alfa Aesar | A13184 | |
| Src peptide | Bachem | 4092599 | |
| Stainless steel (AISI 304) cylinder-shaped samples with a lumen | Microgroup, Medway, MA | 20097328 | 1 cm X 6 mm OD |
| Stainless steel foils (AISI 316L) | Goodfellow, Coraopolis, PA | 100 mm X 100 mm X 0.05 mm | |
| Tetramethylrhodamine-conjugated pepCD47 (TAMRA-pepCD47) | Bachem | 4100277 | |
| TMB (3,3’ ,5,5’ -tetramethylbenzidine) substrate and tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride (TCEP) | Thermo Scientific | PG82089 | |
| Tween-20 | Bio-Rad laboratories | 170-6531 | |
| Vybrant CFDA SE Cell Tracer Kit | Invitrogen | V12883 |
References
- Buccheri, D., Piraino, D., Andolina, G., Cortese, B. Understanding and managing in-stent restenosis: a review of clinical data, from pathogenesis to treatment. Journal Thoracic Disease. 8 (10), 1150-1162 (2016).
- van Oeveren, W. Obstacles in haemocompatibility testing. Scientifica. 2013, Cairo. 392584 (2013).
- Mitra, A. K., Agrawal, D. K. In stent restenosis: bane of the stent era. Journal of Clinical Pathology. 59 (3), 232-239 (2006).
- Iqbal, J., Gunn, J., Serruys, P. W. Coronary stents: historical development, current status and future directions. British Medical Bulletin. 106, 193-211 (2013).
- Hoffmann, R., et al. Patterns and mechanisms of in-stent restenosis. A serial intravascular ultrasound study. Circulation. 94 (6), 1247-1254 (1996).
- Stefanini, G. G., Windecker, S. Stent thrombosis: no longer an issue with newer-generation drug-eluting stents. Circulation: Cardiovascular Interventions. 5 (3), 332-335 (2012).
- Palmerini, T., et al. Clinical outcomes with bioabsorbable polymer- versus durable polymer-based drug-eluting and bare-metal stents: evidence from a comprehensive network meta-analysis. Journal of the American College of Cardiology. 63 (4), 299-307 (2014).
- Omar, W. A., Kumbhani, D. J. The Current Literature on Bioabsorbable Stents: a Review. Current Atherosclerosis Reports. 21 (12), 54 (2019).
- Slee, J. B., Christian, A. J., Levy, R. J., Stachelek, S. J. Addressing the Inflammatory Response to Clinically Relevant Polymers by Manipulating the Host Response Using ITIM Domain-Containing Receptors. Polymers (Basel). 6 (10), 2526-2551 (2014).
- Oldenborg, P. A., et al. Role of CD47 as a marker of self on red blood cells. Science. 288 (5473), 2051-2054 (2000).
- vanden Berg, T. K., vander Schoot, C. E. Innate immune 'self' recognition: a role for CD47-SIRPalpha interactions in hematopoietic stem cell transplantation. Trends in Immunology. 29 (5), 203-206 (2008).
- Tengood, J. E., Levy, R. J., Stachelek, S. J. The use of CD47-modified biomaterials to mitigate the immune response. Experimental Biology Medicine (Maywood). 241 (10), 1033-1041 (2016).
- Tsai, R. K., Rodriguez, P. L., Discher, D. E. Self inhibition of phagocytosis: the affinity of 'marker of self' CD47 for SIRPalpha dictates potency of inhibition but only at low expression levels. Blood Cells, Molecules and Diseases. 45 (1), 67-74 (2010).
- Slee, J. B., et al. Enhanced biocompatibility of CD47-functionalized vascular stents. Biomaterials. 87, 82-92 (2016).
- Finley, M. J., et al. Diminished adhesion and activation of platelets and neutrophils with CD47 functionalized blood contacting surfaces. Biomaterials. 33 (24), 5803-5811 (2012).
- Stachelek, S. J., et al. The effect of CD47 modified polymer surfaces on inflammatory cell attachment and activation. Biomaterials. 32 (19), 4317-4326 (2011).
- Inamdar, V. V., et al. Stability and bioactivity of pepCD47 attachment on stainless steel surfaces. Acta Biomaterialia. 104, 231-240 (2020).
- Fishbein, I., et al. Local delivery of gene vectors from bare-metal stents by use of a biodegradable synthetic complex inhibits in-stent restenosis in rat carotid arteries. Circulation. 117 (16), 2096-2103 (2008).
- Moser, K. V., Humpel, C. Primary rat monocytes migrate through a BCEC-monolayer and express microglia-markers at the basolateral side. Brain Research Bulletin. 74 (5), 336-343 (2007).
- vander Giessen, W. J., et al. Marked inflammatory sequelae to implantation of biodegradable and nonbiodegradable polymers in porcine coronary arteries. Circulation. 94 (7), 1690-1697 (1996).
- Fishbein, I., et al. Bisphosphonate-mediated gene vector delivery from the metal surfaces of stents. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (1), 159-164 (2006).
- Mouro-Chanteloup, I., et al. Evidence that the red cell skeleton protein 4.2 interacts with the Rh membrane complex member CD47. Blood. 101 (1), 338-344 (2003).
- Finley, M. J., Clark, K. A., Alferiev, I. S., Levy, R. J., Stachelek, S. J. Intracellular signaling mechanisms associated with CD47 modified surfaces. Biomaterials. 34 (34), 8640-8649 (2013).
- Slee, J. B., Alferiev, I. S., Levy, R. J., Stachelek, S. J. The use of the ex vivo Chandler Loop Apparatus to assess the biocompatibility of modified polymeric blood conduits. Journal of Visualized Experiments. (90), e51871 (2014).
