Summary
Hier wird ein Protokoll zum Anhängen von Peptid CD47 (pepCD47) an Metallstents mit Polybisphosphonatchemie vorgestellt. Die Funktionalisierung von Metallstents mit pepCD47 verhindert die Anhaftung und Aktivierung von Entzündungszellen und verbessert so deren Biokompatibilität.
Abstract
Die wichtigsten Komplikationen im Zusammenhang mit Bare-Metal-Stents und Drogen-Eluing-Stents sind In-Stent-Restenose bzw. späte Stentthrombose. Daher bleibt die Verbesserung der Biokompatibilität von Metallstents eine große Herausforderung. Das Ziel dieses Protokolls ist es, eine robuste Technik der Metalloberflächenmodifikation durch biologisch aktive Peptide zu beschreiben, um die Biokompatibilität von Blutkontakten mit medizinischen Implantaten, einschließlich endovaskulärer Stents, zu erhöhen. CD47 ist ein immunologischer artenspezifischer Selbstmarker und hat entzündungshemmende Eigenschaften. Studien haben gezeigt, dass ein 22 Aminosäurepeptid, das der Ig-Domäne von CD47 im extrazellulären Bereich (pepCD47) entspricht, entzündungshemmende Eigenschaften wie das Volllängenprotein aufweist. In vivo-Studien an Ratten und Ex-vivo-Studien an Kaninchen- und humanen Blutversuchssystemen aus unserem Labor haben gezeigt, dass die Immobilisierung von PepCD47 auf Metallen ihre Biokompatibilität verbessert, indem sie die anhängliche Zellanhaftung und -aktivierung verhindert. In diesem Artikel wird das Schritt-für-Schritt-Protokoll zur Funktionalisierung von Metalloberflächen und Peptidbefestigung beschrieben. Die Metalloberflächen werden mit Polyallamin-Bisphosphat mit latenten Thiolgruppen (PABT) modifiziert, gefolgt von Deprotection von Thiolen und Amplifikation von Thiol-reaktiven Stellen durch Reaktion mit Polyethylenimin, das mit Pyridyldithio-Gruppen (PEI-PDT) installiert ist. Schließlich wird pepCD47, das terminale Cysteinrückstände enthält, die über einen dualen 8-Amino-3,6-Dioxa-Octanoyl-Abstandser mit der Kernpeptidsequenz verbunden sind, über Disulfidbindungen an der Metalloberfläche befestigt. Diese Methode der Peptidbefestigung an der Metalloberfläche ist effizient und relativ kostengünstig und kann daher angewendet werden, um die Biokompatibilität mehrerer metallischer Biomaterialien zu verbessern.
Introduction
Perkutane koronare Intervention ist die erste Therapielinie zur Behandlung von koronaren Herzkrankheiten (CAD) und beinhaltet in erster Linie das Stents der erkrankten Arterien. In-Stent-Restenose (ISR) und Stentthrombose sind jedoch häufige Komplikationen im Zusammenhang mit stent Deployment1. Die Blutinteraktion an der Blut-Stent-Schnittstelle ist durch eine fast sofortige Adsorption von Plasmaproteinen auf der Metalloberfläche gekennzeichnet, gefolgt von Thrombozyten- und Entzündungszellanhaftung und Aktivierung2. Die Freisetzung der entzündlichen Zytokine und Chemokine aus aktivierten Entzündungszellen führt zur phänotypischen Veränderung der vaskulären glatten Muskelzellen (VSMCs) in den Tunikamedien und löst deren zentripetale Migration in das Intimfach aus. Die Proliferation des aktivierten VSMC in der Intima führt zu Intimschichtverdickung, Lumenverengung und In-Stent-Restenose3. Drug Eluing Stents (DES) wurden entwickelt, um VSMC Proliferation zu verhindern; jedoch haben diese Medikamente eine off-target zytotoxische Wirkung auf die Endothelzellen4,5. Daher ist die späte Stentthrombose eine häufige Komplikation im Zusammenhang mit DES6,7. Stents aus biologisch abbaubaren Polymeren, wie Poly-L-Laktid, haben in den Tierversuchen und ersten klinischen Studien viel Versprechen gezeigt, wurden aber schließlich zurückgerufen, als die klinische Anwendung im "realen Leben" ihre Unterlegenheit gegenüber der3. Generation des8zeigte. Daher ist es notwendig, die Biokompatibilität von Bare-Metal-Stents für bessere Patientenergebnisse zu verbessern.
CD47 ist ein allgegenwärtig exprimiertes Transmembranprotein, das die angeborene Immunantwort hemmt, wenn es an seinen Kognanorezeptor Signal Regulatory Protein alpha (SIRP)9gebunden ist. Der SIRP-Rezeptor hat eine Immunzell-Tyrosin-Hemmende Motiv (ITIM) Domäne und die Signalereignisse auf SIRP - CD47 Interaktion führen letztlich in der Downregulation der entzündlichen Zellaktivierung10,11,12,13. Untersuchungen in unserem Labor haben gezeigt, dass rekombinantes CD47 oder sein Peptidderivat, das der 22-Aminosäure-Ig-Domäne der extrazellulären Region CD47 (pepCD47) entspricht, die Immunantwort des Wirts auf eine Reihe klinisch relevanter Biomaterialien14,15,16reduzieren kann. Kürzlich haben wir gezeigt, dass pepCD47 auf Edelstahl-Stentoberflächen immobilisiert werden kann und die pathophysiologische Reaktion im Zusammenhang mit Derenose deutlich reduzieren kann. Bemerkenswert ist, dass die pepCD47 modifizierten Oberflächen für relevante Einsatzbedingungen wie Langzeitlagerung und Ethylenoxidsterilisation17geeignet sind. Zu diesem Zweck kann pepCD47 ein nützliches therapeutisches Ziel sein, um die klinischen Einschränkungen von endovaskulären Stents anzugehen.
Die Strategie für die kovalente Befestigung von pepCD47 an einer Metalloberfläche beinhaltet eine Reihe neuartiger chemischer Modifikationen der Metalloberfläche. Die Metalloberflächen werden zunächst mit Polyallaminbisphosphonat mit latenten Thiolgruppen (PABT) beschichtet, gefolgt vom Deschutz der Thiole und der Befestigung von Polyethyleneimin (PEI) mit installierten Pyridyldithio-Gruppen (PDT). PDT-Gruppen von PEI, die in der Reaktion mit degeschützten PABT-Thiolen nicht verbraucht werden, werden dann mit PepCD47 reagiert, die Thiole in die terminalen Cysteinrückstände einbeziehen, was zu einer Bindung von pepCD47 an die Metalloberfläche über eine Disulfidbindung14,17,18führt. Wir verwendeten ein fluorophorkonjugiertes pepCD47 (TAMRA-pepCD47), um die Eingangskonzentration von Peptid zu bestimmen, die zu einer maximalen Oberflächenimmobilisierung des Peptids führt. Schließlich bewerteten wir die akute und chronische entzündungshemmende Kapazität der pepCD47 beschichteten Metalloberflächen ex vivo mit dem Chandler-Loop-Apparat bzw. Monozytenaufsatz/Makrophagen-Expansionstest.
Dieses Papier enthält ein systematisches Protokoll für die Befestigung von thiolierten Peptiden an der Metalloberfläche; Bestimmung der maximalen Immobilisierungsdichte des Peptids; und Bewertung der entzündungshemmenden Eigenschaften von pepCD47 beschichteten Metalloberflächen, die Vollblut und isolierten Monozyten ausgesetzt sind.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle menschlichen Proben für dieses Experiment wurden in Übereinstimmung mit dem IRB des Children es Hospital of Philadelphia gewonnen. Alle Tierversuche wurden nach Genehmigung der IACUC des Children es Hospital of Philadelphia durchgeführt.
1. Beschichten von Blankmetalloberflächen mit PEI-PDT
- Waschen Sie die Edelstahlfolien-Coupons (1 cm x 1 cm oder 0,65 cm x 1 cm) oder Edelstahl-Mesh-Scheiben mit 2-Isopropanol in einem Shaker (60 °C, Geschwindigkeit 200 Rpm) für 5 min. Führen Sie diesen Schritt 2x aus. Dann 2x mit Chloroform (60 °C, Drehzahl 200 Rpm) für jeweils 10 min waschen.
- Die gereinigten Edelstahlproben 30 min bei 220 °C in einen Ofen stellen.
- Bereiten Sie 5 ml 0,5% der PABT-Lösung vor, indem Sie 25 mg Polyallaminbisphosphonat mit latenten Thiolgruppen (PABT) und 5 mg Kaliumbicarbonat (KHCO3) in 5 ml DDW auflösen und bei 72 °C in einem Shaker bei 200 Umdrehungen pro Minute für 30 min inkubieren.
HINWEIS: Für DIE PABT-Synthese beziehen Sie sich auf zuvor veröffentlichte Literatur18. - Die gebackenen Folien oder Netzscheiben in 0,5% wässrige Lösung von PABT eintauchen und in einem Shaker (72 °C, Geschwindigkeit 200 Umdrehungen pro Minute) für 1 h inkubieren.
- Die PABT-modifizierten Proben mit entionisiertem destilliertem Wasser (DDW) 5x waschen, die Proben in eine neue Durchstechflasche geben und mit DDW 5x erneut waschen.
- Bereiten Sie insgesamt 5 ml TCEP-Lösung (12 mg/ml) vor, indem Sie 60 mg Tris (2-Carboxyethyl)-Phosphinhydrochlorid (TCEP) in 5 ml mit 0,1 M Essigpuffer (0,57 ml Eisessigsäure, 820 mg Natriumacetat in 100 ml DDW) auflösen.
- Behandeln Sie die PABT-modifizierten Proben mit TCEP 15 min bei Raumtemperatur (RT) auf einem Shaker.
HINWEIS: TCEP wird verwendet, um die Thiolgruppen zu entschützen. - Degas DDW in einem runden Bodenkolben mit einem Vakuum-Erzeugungsgerät, wie einem Lyophilisator und waschen Sie die TCEP behandelten Folien oder Netzscheiben mit entgastem DDW für 5x. Die Proben in eine neue Durchstechflasche überführen und zusätzlich 5x mit entgastem DDW waschen.
HINWEIS: Es ist von größter Bedeutung, schnell zu arbeiten, um die Oxidation von Thiolen auf der Metalloberfläche durch Luftsauerstoff zu verhindern. - Bereiten Sie 5 ml 1% PEI-PDT-Lösung vor, indem Sie 212,5 l DES Lagers PEI-PDT und 125 l 0,4 M Natriumacetat in entgaster DDW verdünnen. Führen Sie Schritt 1.9 gleichzeitig mit Schritt 1.8 durch, um die Exposition der Proben gegenüber atmosphärischer Luft zu minimieren.
HINWEIS: Die Synthese von PEI-PDT wird in der zuvor veröffentlichten Literatur18beschrieben. - Inkubieren Sie die gewaschenen Edelstahlproben mit 1% PEI-PDT. Ersetzen Sie Luft durch Argongas, versiegeln Sie die Fläschchen luftdicht und mischen Sie auf einem Shaker bei RT für 1 h. Entweder sofort mit der Peptidkonjugation fortfahren oder bei 4 °C bis zu 1 Woche lagern.
2. Anlage und qualitative/quantitative Bewertung der fluorophorkonjugierten PepCD47-Retention auf Metalloberflächen mittels Fluoreszenzmikroskopie und Fluorimemetrie
- Waschfolien-Coupons oder Netzscheiben, wie in Abschnitt 1, Schritte 1.1-1.10 oben mit DDW 5x beschrieben. Die Proben in eine neue Durchstechflasche überführen und zusätzlich 5x mit DDW waschen. 2x mit entgastem Ethanol und 2x mit entgastem Dimethylformamid (DMF) waschen.
- Bereiten Sie Tetramethylrhodin (TAMRA)-konjugierte PepCD47-Stammlösung vor, indem Sie TAMRA-konjugiertes PepCD47-Pulver in entgastem Dimethylformamid (DMF) auf eine Endkonzentration von 1 mg/ml auflösen. Aliquot die Lagerlösung in 1 ml Zuteilungen. In gut verschlossenen Rohren unter Argonatmosphäre bei -20 °C lagern.
- Verdünnen Sie 1 mg/ml der Stammlösung von TAMRA-konjugiertem PepCD47 mit entgastem DMF, um die folgenden Konzentrationen von fluorophor konjugierter PepCD47 - 10, 30, 100 und 200 g/ml vorzubereiten.
HINWEIS: Wenn TAMRA-konjugierte pepCD47 scheint gefällt zu sein, reduzieren Sie den Bestand TAMRA-konjugierte pepCD47 Lösung mit TCEP Perlen im Verhältnis 1:1, bei RT für 20 min. Beachten Sie, dass vor dem Hinzufügen des TAMRA-konjugierten pepCD47 zu den TCEP-Perlen die TCEP-Perlenlösung drehen, den Überstand entfernen und dann mit dem TAMRA-konjugierten pepCD47 fortfahren. - Inkubieren Sie die PEI-PDT modifizierten Foliencoupons mit 10, 30, 100 oder 200 g/ml TAMRA-konjugierten pepCD47 in Dreisprachigen für jede Bedingung auf einem Shaker bei RT unter Argonatmosphäre für 1 Stunde. Pei-PDT modifizierte Netzscheiben sowie Netzscheiben, die nicht über Schritt 1.2 hinaus modifiziert wurden (Bare-Metal-Steuerungen) mit 100 g/ml TAMRA-konjugierter pepCD47 in Triplicaten bei RT unter Argonatmosphäre auf einem Shaker für 1 h.
HINWEIS: Ab diesem Schritt werden die Fläschchen in Aluminiumfolie eingewickelt, um den Inhalt vor Licht zu schützen. - Waschen Sie die fluorophorkonjugierten pepCD47-beschichteten Oberflächen, um das nicht kovalent befestigte Peptid in folgender Reihenfolge zu entfernen: DMF (3x), DMF/DDW bei 1:1, DDW (3x), 0,3% SDS in 20 mM Tris pH 7,4 (3x, 5 min je bei 70 °C auf einem Shaker), DDW (3x), Wechselfläschchen und eine abschließende DDW-Wäsche.
- Steuer- und kovalent konjugierte Netzscheiben auf ein Mikroskopglas legen, 50 L PBS hinzufügen und einen Deckelschlupf platzieren. Bildnetzscheiben mit einem invertierten Fluoreszenzmikroskop, das mit einem Rhodamine-Filter-Set ausgestattet ist. Nehmen Sie repräsentative Bilder mit 100-facher Vergrößerung auf.
- Bereiten Sie 15 ml 12 mg/ml TCEP-Lösung vor, indem Sie 180 mg TCEP in 1:1 v/v-Mischung aus Methanol und 0,1 M Essigpuffer auflösen.
- Jede gewaschene Folie mit 1 ml TCEP-Lösung auf einem Shaker bei RT für 15 min inkubieren.
- Bereiten Sie die folgenden Standards vor, indem Sie den TAMRA-konjugierten PepCD47-Bestand (1 mg/ml) seriell verdünnen – 100 g/ml, 10 g/ml, 1 g/ml, 0,1 g/ml und 0,01 g/ml. Verwenden Sie die TCEP-Lösung als Verdünner.
- Analysieren Sie die TAMRA-konjugierte pepCD47, die von der Metalloberfläche freigesetzt wird, mit der Kalibrierkurve, die mit den Standards durch Fluoridmetrie bei 544/590 nm Anregungs- und Emissionswellenlängen erzeugt wird.
3. Anbringen von humanem PepCD47 an PEI-PDT modifizierten Oberflächen
- PEI-PDT-beschichtete Proben wie im Abschnitt 1, Schritte 1.1-1.10 oben beschrieben, mit entgastem DDW 5x waschen, die Durchstechflasche wechseln und mit entgastem DDW 5x waschen.
- Bereiten Sie menschliche pepCD47-Lagerlösung (1 mg/ml) vor, indem Sie humanes PepCD47-Pulver in entgaster 50% Essigsäure auflösen, um eine Konzentration von 1 mg/ml zu erreichen.
- Bereiten Sie die Arbeitskonzentration des menschlichen PepCD47 (100 g/ml) vor, indem Sie 500 l des Bestands an humanem PepCD47 in 4.500 l entgaster 1x phosphatgepufferter Saline (PBS) auflösen.
- Inkubieren Sie die gewaschenen PEI-PDT-beschichteten Proben mit 100 g/ml pepCD47 bei RT mit Schütteln für 1 h.
- Waschen Sie die humanen pepCD47-beschichteten Proben, um überschüssiges Peptid in der folgenden Reihenfolge PBS (3x), DDW (3x), 0,2% Tween-20 (3x, je 5 min), DDW (3x), Wechselfläschchen und abschließende DDW-Wäsche zu entfernen.
HINWEIS: Humane pepCD47 beschichtete Oberflächen können bis zu 6 Monate trocken bei 4 °C gelagert werden.
4. Beschichtung der PEI-PDT modifizierten Oberflächen mit Rührsequenz (Scr)
- Lösen Sie das Rührsequenzpulver in entgaster 0,1% Essigsäure auf, um eine Stammlösung von 1 mg/ml herzustellen.
- Bereiten Sie eine Lösung von 100 g/ml Rührpeptid vor, indem Sie 500 l der in 4.500 l entgasten 0,1% Essigsäure auflösen.
- Beschichten Sie die gewaschenen PEI-PDT-Proben mit 100 g/ml Rührpeptid bei RT mit Schütteln für 1 h.
- Um unbefestigtes Rührpeptid zu entfernen, waschen Sie die Oberflächen in der folgenden Reihenfolge 0,01% Essigsäure (3x), DDW (3x), 0,2% Tween-20 (3x, 5 min), DDW (3x), Durchstechflaschen und eine DDW-Wäsche wechseln.
5. Chandler-Schleife zur Analyse der zellulären Befestigung an Metalloberflächen
- Beschichten Sie die Metallfolien (0,65 cm x 1cm) entweder mit humanem PepCD47 oder Rührpeptid gemäß der Beschreibung auf Abschnitt 1 gefolgt von 3 oder 4.
- Schneiden Sie 1/4" PVC-Rohre in drei 38 cm lange Stücke.
- Legen Sie bis zu 8 unveränderte, verknurrte Peptid- oder pepCD47-modifizierte Metallfolien in drei verschiedene Tuben ein.
- Sammeln Sie 30 ml Blut von gesunden menschlichen Spendern frei von Anti-Thrombozyten-Medikamenten gemäß dem institutionellen IRB-Protokoll. Spritze vorladen mit 1 ml 4% Natriumcitrat, um die Gerinnung von gesammeltem Blut zu verhindern.
- Mit einer 10 ml Spritze 10 ml Blut in jedes Rohr geben und die Enden mit Metalladaptern verbinden. Legen Sie die blutgefüllten Schläuche auf die Räder des Chandler-Schlaufesgeräts.
- Übergeben Sie das Blut entlang der Metallfolien durch Raddrehung bei 37 °C bei der Geschwindigkeit berechnet, um die Schere von 25 Dyns/cm2 für 4 h zu produzieren.
- Das Blut aus den Röhrchen ableiten und gemäß den IRB-Anforderungen entsorgen.
- Schneiden Sie die Rohre mit dem Skalpell, um die Folien aus jedem Rohr zu holen.
- Bereiten Sie 2% Glutaraldehydlösung vor, indem Sie die 10 ml 4% Glutaraldehydlösung mit 10 ml Natriumkacodylatpuffer mit 0,1 M Natriumchlorid verdünnen.
- Die Folien in 2% Glutaraldehydlösung für 15 min inkubieren und bei 4 °C über Nacht lagern. Waschen Sie vor der Analyse die Metallfolien 3x mit PBS.
6. Analyse der zellulären Befestigung an Metalloberflächen mit CFDA-Farbstoff
- 8 ml PBS in 15 ml Rohr in einem Auf 37 °C eingestellten Wasserbad erwärmen.
- Bereiten Sie die CFDA-Farblösung CFDA (Carboxy-Fluorescein-Diacetat, Succinimidylester) wie folgt vor - fügen Sie 90 L DMSO zu einer CFDA-Farbdurchstechflasche hinzu, um eine Lagerkonzentration von 10 mM zu erreichen. Als nächstes bereiten Sie die Arbeitskonzentration von 93,75 m vor, indem Sie 75 l des CFDA-Bestands auf 8 ml warmes PBS anfügen. Mischen Sie die Rohre ein paar Mal und bedecken Sie das Rohr mit Aluminiumfolie.
HINWEIS: Es ist ratsam, den CFDA-Farbstoff vor jedem Gebrauch frisch zuzubereiten. - Jede Folie mit 1 ml CFDA-Farbstoff in einer 24-Well-Platte inkubieren. Bedecken Sie die Platte mit Aluminiumfolie und bebrüten Sie die Platte bei 37 °C für 15 min.
- Waschen Sie die Metallfolien 3x mit PBS, um überschüssigen Farbstoff zu entfernen. Bild mit dem invertierten Fluoreszenzmikroskop.
7. Monozytenaufsatz und Makrophagenerweiterung auf den pepCD47-modifizierten und blanken Metalloberflächen
- Sammeln Sie 10 ml peripheres Blut über den Vena cava Zugang während des Opfers einer 400-450 g männlichen Sprague-Dawley Ratte. Mischen Sie sofort mit 1.000 I.E. Natriumheparin, um die Gerinnung zu verhindern.
- Pipette 10 ml Dichtegradientenmedium in ein 50 ml kegelförmiges Rohr. Mischen Sie das Blut mit 5 ml PBS, und schichten Sie das blutverdünnte Blut sorgfältig über das Dichtegradientenmedium mit einer Pasteur Pipette. Zentrifuge in einem schwingenden Schaufelrotor bei 800 x g und 18-25 °C für 20 min mit minimalen Einstellungen der Beschleunigung und Verzögerung.
- Sammeln Sie mit einer Pasteur-Pipette eine undurchsichtige Schicht buffy Mantel auf der Schnittstelle zwischen Plasma und Ficoll. Buffy Mantel 1:3 mit PBS und Zentrifuge bei 550 x g und 4 °C für 10 min bis zu buffy Fellzellen verdünnen.
- Buffy-Beschichtungszellen in 3 ml ACK-Lysepuffer wieder aussetzen, um kontaminierende Erythrozyten zu lyse. 4 min auf Eis bebrüten. Fügen Sie 12 ml Zelltrennpuffer hinzu (CSB; 0,5% BSA, 0,5% FBS, 2 mM EDTA/PBS).
- Zentrifuge bei 550 x g und 4 °C für 10 min. Das Pellet in 10 ml CSB wieder aufhängen.
- Zentrifuge bei 200 x g und 4 °C für 10 min, um Thrombozyten zu eliminieren. Wiederholen Sie dies zweimal.
- Setzen Sie das Pellet in 500 l CSB wieder auf. Fügen Sie 10 g der folgenden Anti-Ratten-Antikörper der Maus hinzu: CD8a (Klon OX-8), Anti-CD5 (Klon OX-19), Anti-CD45RA (Klon OX-33) und Anti-CD6 (Klon OX-52).
- Bei 4 °C auf einem vertikalen Rohrrotator für 1 h inkubieren. 9,5 ml CSB hinzufügen. Zentrifuge bei 300 x g und 4 °C für 10 min. Überstand entsorgen, das Pellet in 10 ml CSB wieder aufhängen und zentrifugieren.
- Setzen Sie das Pellet in 500 l CSB wieder auf. Fügen Sie 150 L Ziegen-Anti-Maus-IgG-Mikroperlen hinzu. Bei 4 °C auf einem vertikalen Rohrrotator für 20 min inkubieren. 9,5 ml CSB hinzufügen. Zentrifuge bei 300 x g und 4 °C für 10 min.
- Entsorgen Sie den Überstand. Das Pellet in 1 ml CSB wieder aufhängen.
- Legen Sie eine LS-Säule in ein magnetisches Trennzeichen. Primieren Sie die LS-Säule mit 3 ml CSB. Verwerfen Sie den Spaltendurchsatz. Fügen Sie 1 ml wieder aufgehängtes Zellpellet aus dem Schritt 7.10 hinzu. Beginnen Sie mit dem Sammeln des Durchsatzes. Fügen Sie nach dem Ablaufstopp 5 ml CSB hinzu und sammeln Sie den Spaltendurchsatz, bis der Durchfluss stoppt.
- Zentrifugieren Sie den Säulendurchsatz (6 ml) mit negativ ausgewählten Monozyten bei 300 x g und 4 °C für 10 min. Das resultierende kleine Pellet in 2 ml RPMI-1640 Medium, ergänzt durch 10% FCS, 1% Pen/Strep und 100 ng/mL Ratte Makrophagenkolonie stimulierenden Faktor (M-CSF) wieder aufsetzen.
- Zählen Sie die Monozyten mit Hämozytometer. Monozytenkonzentration auf 5 x 105 Zellen/ml einstellen.
- Fügen Sie 1 ml Volumen Monozytenaufhängung in die einzelnen Bohrungen einer 12-Well-Platte mit den blanken Edelstahlfolienproben (N=3) oder Mit RattenpepCD47 (N=3) modifizierten Edelstahlproben gemäß 1.1-1.10 und 3.1-3.6 hinzu.
- Ändern Sie das Medium an den Tagen 3 und 5 nach der Aussaat. Am 6. Tag nach der Aussaat die Zellen mit PBS waschen und mit 4% Paraformaldehyd bei Raumtemperatur für 15 min fixieren. Zweimal mit PBS für 5 min waschen.
- Entfernen Sie die Edelstahlfolien und legen Sie sie einzeln in eine neue 12-Well-Platte. Drehen Sie die Folien nicht um.
- Inkubieren Sie in 0,5% Tween-20/PBS für 15 min, um die Zellen zu permeabilisieren. Zweimal mit PBS für 5 min waschen.
- Block in 10% Ziegenserum/PBS für 20 min. Aspirieren Sie das Serum. Nicht waschen. Fügen Sie Maus Anti-Ratten CD68 Antikörper hinzu (verdünnt 1:100 in 1%BSA/PBS). Bei Raumtemperatur 1 h inkubieren. Waschen Sie 3x in PBS für je 5 min.
- Fügen Sie Ziege Anti-Maus IgG Alexa Fluor 546 (verdünnt 1:200 in 1% BSA/PBS). Inkubieren Sie im Dunkeln bei Raumtemperatur für 45 min. Waschen Sie in PBS für 5 min. Gegenfärbung mit 1 g/mL Hoechst 33342 Farbstoff in dunkel bei Raumtemperatur für 10 min. Waschen Sie 3x in PBS für je 5 min.
- Drehen Sie die Folien und das Bild mit einem Fluoreszenzmikroskop mit der invertierten Optik. Erfassen Sie Bilder mit 200-facher Vergrößerung mit blauen und roten Filtereinstellungen.
- Zählen Sie die angehängten Monozyten in den einzelnen Bildern und berechnen Sie die Gruppendurchschnitte und Standardabweichungen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Die Metalloberflächen werden thiol-reaktiv für die Peptidbefestigung durch eine Reihe chemischer Modifikationen gerendert, wie in Abbildung 1dargestellt. PaBT-Inkubation gefolgt von PEI-PDT-Behandlung macht die Metalloberfläche für Peptid-Befestigung zugänglich. Peptid CD47 (pepCD47) mit Cysteinrückstand am C-Terminus, der über eine flexible duale AEEAc-Brücke mit der Pepcd47-Sequenz verbunden ist, wird über Disulfidbindungen kovalent an den Thiol-reaktiven Oberflächen befestigt. Mit diesem Protokoll haben wir gezeigt, dass pepCD47 bis zu sechs Monate stabil an der Metalloberfläche befestigt bleibt und normalen physiologischen Scherbelastungen und Sterilisationsverfahren standhalten kann17.
Die maximale Peptidretention wurde durch angehängte TAMRA-konjugierte pepCD47 an die Metalloberfläche bestimmt, gefolgt von der umfangreichen Wäsche, um nicht kovalent gebundenes Peptid, Spaltung von TAMRA-pepCD47 durch Reduktion von Disulfidbrücken, die das Peptid an die Oberfläche binden, und analytische Quantifizierung mittels eines fluorimetrischen Assays zu beseitigen. Insbesondere wurden an die PEI-PDT-beschichteten Oberflächen erhöhte Eingangsmengen von TAMRA-konjugiertem pepD47 (1 ml von 10 - 200 g/ml Lösung) angehängt und mehrmals gewaschen, um das nicht kovalent gebundene Peptid zu entfernen. Die Konzentration des kovalent gebundenen TAMRA-konjugierten PepCD47 wurde durch die Verwendung eines Reduktionsmittels TCEP zur Freisetzung des kovalent angehängten Peptids und die Beurteilung seiner Fluoreszenz anhand der Normen bestimmt. Die Eingangskonzentration von 10, 30, 100 und 200 g/ml zeigte eine Peptidretention von 28 ± 2, 78 ± 2, 182 ± 14 bzw. 157 ± 25 ng/cm2 (Abbildung 2). So wurde die maximale Immobilisierungsdichte von pepCD47 auf der Metalloberfläche bei2 ca. 180 ng/cm2 festgestellt, die mit einer Eingangskonzentration von 100 g/ml erreicht wurde. Die richtige Immobilisierung von TAMRA-konjugiertem PepCD47 auf den PABT/PEI-PDT-modifizierten Metalloberflächen wurde durch die Fluoreszenzmikroskopie (Abbildung 3) weiter bestätigt, die eine gleichmäßige Fluoreszenz von der Oberfläche von TAMRA-konjugierten pepCD47-behandelten Netzscheiben zeigte (Abbildung 3A). Nur eine minimale Fluoreszenz wurde auf der Oberfläche der Kontrollnetze ohne PABT/PEI-PDT-Modifikation nachgewiesen (Abbildung 3B), wodurch ein nicht spezifisch gebundenes TAMRA-konjugiertes PepCD47 als Hauptquelle der Fluoreszenz ausgeschlossen wurde.
Als nächstes haben wir die Fähigkeit der pepCD47 beschichteten Oberflächen bewertet, eine akute blutgetragene Zellanhaftung im Vergleich zu den unveränderten und verkrürten Peptid-modifizierten Oberflächen zu verhindern. Das Rührpeptid hat die gleiche Aminosäurezusammensetzung wie pepCD47, aber in einer anderen Reihenfolge14,17. Die blutgetragene Zellanhaftung wurde durch Rotation des Blutes von gesunden menschlichen Probanden über unveränderte, verwirrte und pepCD47 modifizierte Oberflächen im Chandler-Loop-Apparat bewertet, gefolgt von Waschen, um nicht angeschlossene Zellen zu entfernen, Fixierung und Färbung mit CFDA-Farbstoff. Die Oberflächen wurden durch Fluoreszenzmikroskopie visualisiert. In Übereinstimmung mit unseren zuvor veröffentlichten Datenzeigen 14,17 pepCD47 beschichtete Oberflächen eine drastische Verringerung der blutgetragenen Zellanhaftung im Vergleich zu den modifizierten und unveränderten Kontrollen (Abbildung 4).
Um die Auswirkungen der pepCD47-Oberflächenmodifikation auf die entzündliche Zellanhaftung und -proliferation zu erweitern, verwendeten wir eine negative Immunauswahl von Rattenbuffy-Coat-Zellen, um Monozyten zu isolieren19, und kultivierten die isolierten Monozyten auf Blankmetal und pepCD47-modifizierten Edelstahlfolien 6 Tage lang in Gegenwart von M-CSF. Die Ergebnisse dieser Studie zeigen eine kombinierte 58%ige Dämpfung der akuten Monozytenanhaftung, ihre phänotypische Umwandlung in Makrophagen und die Makrophagenproliferation auf den pepCD47 funktionalisierten Oberflächen (Abbildung 5A) im Vergleich zu den Bare-Metal-Kontrollen (Abbildung 5 B,C).
Abbildung 1: Schematische Darstellung der Schritte beim Anfügen von pepCD47 an Metalloberflächen. (A) Die sauberen Metallproben wurden bei 220 °C gebacken, um die Metalloberfläche zu oxidieren. Die Bisphosphonatgruppen des Polallaminbisphosphonats mit latenten Thiolgruppen (PABT) bildeten koordinatengebundene Bindungen mit den Metalloxiden und beschichten die Metalloberflächen zu einer funktionalisierten Monoschicht. Die PABT-beschichteten Metalloberflächen wurden zur Deprotection der Thiolgruppen mit TCEP weiter behandelt. (B) Die Struktur von PEI-PDT und symbolische Darstellung. (C) Die PABT-beschichteten und TCEP-reduzierten Oberflächen wurden mit PEI-PDT behandelt, was die Gesamtzahl der thiol-reaktiven Gruppen, die für die Befestigung des thiolierten Peptids zur Verfügung standen, verstärkte. Schließlich wurden PEI-PDT-beschichtete Oberflächen mit terminalen Cysteingruppen von pepCD47 reagiert und das Peptid wurde über Disulfidbindungen an der Oberfläche befestigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Bestimmung der Immobilisierungsdichte von pepCD47 auf Metalloberfläche. 1 cm x 1 cm Metallfolien wurden mit zunehmenden Konzentrationen (10, 30, 100 und 200 g/ml) des fluorophorkonjugierten pepCD47 modifiziert. Das überschüssige Peptid wurde mit mehreren Waschschritten entfernt und dann mit 1 ml TCEP-Lösung behandelt, um das fluorophor konjugierte Fluorophor zu spalten. Die Konzentration des peptids, das kovalent an der Metalloberfläche befestigt ist, wurde fluorimetrisch mit einer Standardkurve analysiert, die mit definierten Konzentrationen von fluorophorkonjugiertem PepCD47 hergestellt wurde. Die Immobilisierungsdichte wurde als ng/cm2 Peptid dargestellt, das an der Metalloberfläche befestigt war. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM ausgedrückt und sind repräsentativ für mindestens drei unabhängige Experimente. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Fluoreszenzmikroskopie-Bildgebung der Edelstahloberfläche modifiziert mit TAMRA-konjugiertem pepCD47. Mesh-Scheiben aus Edelstahl, nacheinander modifiziert mit PABT, TCEP, PEI-PDT (A) oder unverändert (B) wurden mit TAMRA-konjugiertem pepCD47 reagiert. Die richtig konjugierten und kontrollierten Blankmetallgitter wurden ausgiebig gewaschen und mit 100-facher Vergrößerung abgebildet. Die Länge der Skalenstange beträgt 100 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Bewertung der akuten entzündungshemmenden und antithrombotischen Funktionen von pepCD47. 0,65 cm x 1 cm Metallfolien wurden mit 100 g/ml entweder menschlichen PepCD47 oder Rührpeptid beschichtet und im Chandler-Schlaufenapparat blutüberströmt ausgesetzt. Die ungebundenen Zellen wurden durch Waschen mit PBS entfernt und die Folien wurden in 2% Glutaraldehyd fixiert. Die unveränderten, rührmodifizierten und humanen pepCD47 modifizierten Oberflächen wurden dann mit dem CFDA-Farbstoff für 15 Min. bei 37 °C inkubiert, mit PBS gewaschen und mit einem Fluoreszenzmikroskop analysiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Eine Prävalenz von CD68-positiven Makrophagen auf den nackten und pepCD47-funktionalisierten Metalloberflächen. Die peripheren blutabgeleiteten Monozyten der Ratte wurden durch Gradientendichtezentrifugation isoliert, gefolgt von einer negativen Immunauswahl mit magnetischen Mikroperlen. 5 x 105 Monozyten wurden in die Brunnen einer 12-Well-Platte mit individuell platzierten Blankmetallfolienproben (N=3) oder den mit Ratten pepCD47 ableitenden Proben zugegeben. Die Makrophagendifferenzierung wurde durch 100 ng/ml M-CSF stimuliert. Sechs Tage nach der Aussaat wurden die Zellen fixiert und mit antiratären CD68-Antikörpern immungefärbt, sekundäre Alexa Fluor-546 (rot) konjugierte Antikörper und mit Hoechst 33342 Kernfarbstoff (blau) kontragefärbt. Repräsentative Bilder der Blankmetalloberflächen (A) und pepCD47-funktionalisiert (B) wurden bei 200-facher Vergrößerung aufgenommen und zusammengeführt. Die Länge der Skalenstange beträgt 100 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Wir zeigen und beschreiben eine relativ neuartige chemische Strategie, um therapeutische Peptidmoieties an eine Edelstahloberfläche anzuhängen, mit dem übergeordneten Ziel, die Reaktivität der Oberfläche mit entzündlichen Zellen im Blut zu reduzieren. Die hier beschriebene Bisphosphonatchemie beinhaltet die Koordinatenbildung zwischen den Metalloxiden und Bisphosphonatgruppen von PABT. Die Dicke der auf der Metalloberfläche gebildeten Polybisphosphonat-Monoschicht überschreitet 5 nm18nicht und ist daher für die potentiellen proinflammatorischen Wirkungen der dicken Polymerbeschichtungen20unerheblich. Der Deprotection der latenten Thiolgruppe in den aliphatischen Seitenketten von PABT grundiert die Metalloberflächen zur weiteren chemischen Modifikation mit Thiol-reaktiven Verbindungen. PEI-PDT ist verzweigtes Polyethyleneimin (durchschnittlich Mw=25.000), bei dem 20% der Ethylenimin-Verbindungen mit Thiol-reaktiven Pyridyldithio-Gruppen modifiziert werden. Da in der Reaktion mit den PABT-abgeleiteten Thiolen nur eine Minderheit der PDT-Gruppen in PEI-PDT verbraucht wird, wird die Oberflächenchemie nach PEI-PDT-Tethering in Thiol-reaktiv geändert, um die Anhaftung thiolierter Peptide zu ermöglichen18. Diese chemische Strategie wurde in unserem Labor für die Befestigung mehrerer Biomoleküle, wie rekombinante Proteine14, Peptide14,17und virale Genvektoren18 an der Metalloberfläche entwickelt und weit verbreitet. Obwohl PABT für die meisten unserer Arbeiten Edelstahloberflächen verwendet hat, kann es mit anderen Metalllegierungen21 interagieren und hat somit das Potenzial, die Biokompatibilität und das therapeutische Potenzial einer breiten Palette metallischer Biomaterialien zu verbessern.
Unsere aktuelle Methodik zeigt, dass die maximale Immobilisierungsdichte von fluorophorkonjugiertem PepCD472auf Metalloberflächen 180 ng/cm2 beträgt, was weniger im Vergleich zu unseren zuvor veröffentlichten Daten17ist. Wir führen diese Diskrepanz auf die unterschiedlichen Waschstrategien in beiden Studien zu. In unserem aktuellen Protokoll haben wir SDS verwendet, das nicht kovalent gebundene Peptide im Vergleich zu Tween-20, das in unseren ersten Studien verwendet wurde, vollständig entfernt. 180 ng/cm2 entspricht jedoch etwa 4 x 106 Molekülen/m2 pepCD47.2 Diese Immobilisierungsdichte ist viel höher als die physiologischen Konzentrationen von CD47 auf Zelloberflächen, die etwa 390 Moleküle/m2,22betragen. Daher sagen wir voraus, dass strenge Waschbedingungen die entzündungshemmenden Eigenschaften von pepCD47 modifizierten Metalloberflächen nicht signifikant beeinflussen würden.
Diese Methode der Befestigung von pepCD47 an Metall ist sehr reproduzierbar, aber es gibt mehrere Schritte im Protokoll, die sorgfältige Aufmerksamkeit erfordern. Erstens sind die Thiole nach der Beschichtung der Metalloberfläche mit PABT und der Reduzierung mit TCEP anfällig für Oxidation, wenn sie der Luft ausgesetzt sind. Daher ist es von größter Bedeutung, dass die Oberflächen immer in entgastes Wasser getaucht werden. Aus dem gleichen Grund wird die PEI-PDT-Lösung in entgastem Wasser hergestellt und Argon wird während der Inkubation von mit PEI-PDT beschichteten Folien zu den Durchstechflaschen hinzugefügt. Zweitens muss man das Potenzial für die Ausfällung von löslichen Peptiden berücksichtigen. PepCD47 hat einen terminalen Cysteinrückstand sowie Cysteinrückstände in der Sequenz. Somit besteht bei unsachgemäßer Lagerung eine hohe Wahrscheinlichkeit, dass die Peptide polymerisieren und aus der Lösung herausragen. Um dieses potenzielle Problem zu lösen, wird empfohlen, die Peptide mit TCEP-Perlen für 20 min bis 1 h vor der Inkubation mit PEI-PDT-beschichteten Oberflächen zu reduzieren. TCEP würde dazu beitragen, die Peptide zu reduzieren und ihre Löslichkeit in ihrem jeweiligen Verdünnungsstoff zu erhöhen. Es wird auch empfohlen, Umgebungsluft mit Argon in den Durchstechflaschen zu verdrängen, während die PEI-PDT-beschichteten Proben mit thioliertem Peptid inkubiert werden.
Werden die oben genannten Vorsichtsmaßnahmen befolgt, ist die Beschichtungstechnik reproduzierbar und die einzige potenzielle Einschränkung für diesen Ansatz ist die kommerzielle Nichtverfügbarkeit von Reagenzien PABT und PEI-PDT.
Wir verwendeten ein Chandler-Schlaufengerät, um ex vivo Proof of Concept Analysis zu liefern, um die Wechselwirkung von pepCD47 modifizierten Metalloberflächen mit Blutzellen zu verstehen, und es wurde erfolgreich von unserem Labor verwendet, um die entzündungshemmenden Eigenschaften von pepCD47 beschichteten Oberflächen14,15,17,23zu zeigen. In dieser Studie verwendeten wir CFDA-Farbstoff, der erst nach dem Eindringen in die Zellen fluoresiert, wenn die Acetatgruppen des Farbstoffs durch die intrazelluläre Esterase gespaltet werden. Der Vorteil dieses Färbeverfahrens ist, dass es die anucleierten Blutplättchen und roten Blutkörperchen sowie die nukleierten Zellen wie Leukozyten färbt. Die Verwendung von CFDA-Farbstoff ermöglicht somit eine Bewertung sowohl der akuten antithrombotischen als auch der antiklebenden Eigenschaften von pepCD47-beschichteten Oberflächen. Eine detailliertere Bewertung kann durch Rasterelektronenmikroskopie und/oder Immunfärbung erfasst werden, die wir beide zuvor24beschrieben haben. Die Ergebnisse der aktuellen Studie bestätigen, dass die humanen pepCD47 beschichteten Metalloberflächen antithrombotisch und anti-klebend sind, verglichen mit den unveränderten und verwürfelten Sequenzkontrollen.
Um weiter zu untersuchen, ob pepCD47-modifizierte Oberflächen die Wachstumseigenschaften von angeschlossenen Entzündungszellen, blanken Edelstahlfolien oder mit pepCD47 formulierten Folien in Gegenwart von syngenem M-CSF isolierten Rattenmonozyten ausgesetzt waren. Die Zellen wurden unter stationären Bedingungen für 6 Tage kultiviert, um die phänotypische Umwandlung und Erweiterung von Makrophagen zu ermöglichen. In Übereinstimmung mit unseren bisherigen Ergebnissen, die in den verschiedenen experimentellen Einstellungen14beobachtet wurden, wurde in der aktuellen Studie eine tiefe Abnahme der entzündlichen Zellzahl auf pepCD47 funktionalisierten Oberflächen nachgewiesen.
So belegen unsere Studien letztlich, dass die neuartige Polybisphosphonatchemie zur Beschichtung von Metallen mit pepCD47 eine effektive Möglichkeit zur Verbesserung der Biokompatibilität von Metalloberflächen ist und in anderen biomedizinischen Anwendungen wie künstlichen Gelenken angewendet werden kann.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Die in diesem Dokument vorgestellten Studien zur Entwicklung von Protokollen und Studien wurden durch die NIH(NBIB) R01-Förderung (EB023921) an IF und SJS und die NIH (NHLBI) R01-Finanzierung (HL137762) an IF und RJL unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 M Tris-HCL | Invitrogen | 15567-027 | pH - 7.5 |
| 4% Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16539-07 | |
| 4% Sodium Citrate | Sigma | S5770 | |
| ACK lysing buffer | Quality Biologicals | 118-156-721 | |
| anti-CD45RA Ab (mouse anti-rat; clone OX-19) | Biolegend | 202301 | |
| anti-CD5 Ab (mouse anti-rat; clone OX-19) | Biolegend | 203501 | |
| anti-CD6 Ab (mouse anti-rat; clone OX-52) | BD Biosciences | 550979 | |
| anti-CD68 Ab (mouse anti-rat; clone ED-1) | BioRad | MCA341 | |
| anti-CD8a Ab (mouse anti-rat; clone OX-8) | Biolegend | 201701 | |
| Chloroform Certified ACS | Fisher Chemical | C298-500 | |
| Dimethyl Formammide (DMF) | Alfa Aesar | 39117 | |
| Embra stainless steel grid | Electron Microscopy Sciences | E200-SS | stainless steel mesh mesh disks |
| Ficoll Hypaque | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| Glacial acetic acid | ACROS organic | 148930025 | |
| goat anti-mouse IgG Alexa Fluor | ThermoFisher | A11030 | |
| Heparin sodium | Sagent Pharmaceuticals | 402-01 | |
| Human pepCD47 | Bachem | 4099101 | |
| Isopropanol | Fisher Chemical | A426P-4 | |
| Metal adapters | Leur Fitting | 6515IND | 1 way adapter 316 ss 1/4"-5/16" hoes end |
| Methanol | RICCA chemical company | 4829-32 | |
| Microscope | Nikon Eclipse | TE300 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | 14190-136 | |
| Pottasium Bicarbonate (KHCO3) | Fisher Chemical | P184-500 | |
| PVC tubes | Terumo-CVS | 60050 | 1/4" X 1/16 8' |
| sodium cacodylate buffer with 0.1M sodium chloride | Electron Microscopy Sciences | 11653 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Bio-Rad laboratories | 161-0302 | |
| Sodum actetate (C2H3NaO2) | Alfa Aesar | A13184 | |
| Src peptide | Bachem | 4092599 | |
| Stainless steel (AISI 304) cylinder-shaped samples with a lumen | Microgroup, Medway, MA | 20097328 | 1 cm X 6 mm OD |
| Stainless steel foils (AISI 316L) | Goodfellow, Coraopolis, PA | 100 mm X 100 mm X 0.05 mm | |
| Tetramethylrhodamine-conjugated pepCD47 (TAMRA-pepCD47) | Bachem | 4100277 | |
| TMB (3,3’ ,5,5’ -tetramethylbenzidine) substrate and tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride (TCEP) | Thermo Scientific | PG82089 | |
| Tween-20 | Bio-Rad laboratories | 170-6531 | |
| Vybrant CFDA SE Cell Tracer Kit | Invitrogen | V12883 |
References
- Buccheri, D., Piraino, D., Andolina, G., Cortese, B. Understanding and managing in-stent restenosis: a review of clinical data, from pathogenesis to treatment. Journal Thoracic Disease. 8 (10), 1150-1162 (2016).
- van Oeveren, W.
- Mitra, A. K., Agrawal, D. K. In stent restenosis: bane of the stent era. Journal of Clinical Pathology. 59 (3), 232-239 (2006).
- Iqbal, J., Gunn, J., Serruys, P. W. Coronary stents: historical development, current status and future directions. British Medical Bulletin. 106, 193-211 (2013).
- Hoffmann, R., et al. Patterns and mechanisms of in-stent restenosis. A serial intravascular ultrasound study. Circulation. 94 (6), 1247-1254 (1996).
- Stefanini, G. G., Windecker, S. Stent thrombosis: no longer an issue with newer-generation drug-eluting stents. Circulation: Cardiovascular Interventions. 5 (3), 332-335 (2012).
- Palmerini, T., et al. Clinical outcomes with bioabsorbable polymer- versus durable polymer-based drug-eluting and bare-metal stents: evidence from a comprehensive network meta-analysis. Journal of the American College of Cardiology. 63 (4), 299-307 (2014).
- Omar, W. A., Kumbhani, D. J. The Current Literature on Bioabsorbable Stents: a Review. Current Atherosclerosis Reports. 21 (12), 54 (2019).
- Slee, J. B., Christian, A. J., Levy, R. J., Stachelek, S. J. Addressing the Inflammatory Response to Clinically Relevant Polymers by Manipulating the Host Response Using ITIM Domain-Containing Receptors. Polymers (Basel). 6 (10), 2526-2551 (2014).
- Oldenborg, P. A., et al. Role of CD47 as a marker of self on red blood cells. Science. 288 (5473), 2051-2054 (2000).
- vanden Berg, T. K., vander Schoot, C. E. Innate immune 'self' recognition: a role for CD47-SIRPalpha interactions in hematopoietic stem cell transplantation. Trends in Immunology. 29 (5), 203-206 (2008).
- Tengood, J. E., Levy, R. J., Stachelek, S. J. The use of CD47-modified biomaterials to mitigate the immune response. Experimental Biology Medicine (Maywood). 241 (10), 1033-1041 (2016).
- Tsai, R. K., Rodriguez, P. L., Discher, D. E. Self inhibition of phagocytosis: the affinity of 'marker of self' CD47 for SIRPalpha dictates potency of inhibition but only at low expression levels. Blood Cells, Molecules and Diseases. 45 (1), 67-74 (2010).
- Slee, J. B., et al. Enhanced biocompatibility of CD47-functionalized vascular stents. Biomaterials. 87, 82-92 (2016).
- Finley, M. J., et al. Diminished adhesion and activation of platelets and neutrophils with CD47 functionalized blood contacting surfaces. Biomaterials. 33 (24), 5803-5811 (2012).
- Stachelek, S. J., et al. The effect of CD47 modified polymer surfaces on inflammatory cell attachment and activation. Biomaterials. 32 (19), 4317-4326 (2011).
- Inamdar, V. V., et al. Stability and bioactivity of pepCD47 attachment on stainless steel surfaces. Acta Biomaterialia. 104, 231-240 (2020).
- Fishbein, I., et al. Local delivery of gene vectors from bare-metal stents by use of a biodegradable synthetic complex inhibits in-stent restenosis in rat carotid arteries. Circulation. 117 (16), 2096-2103 (2008).
- Moser, K. V., Humpel, C. Primary rat monocytes migrate through a BCEC-monolayer and express microglia-markers at the basolateral side. Brain Research Bulletin. 74 (5), 336-343 (2007).
- vander Giessen, W. J., et al. Marked inflammatory sequelae to implantation of biodegradable and nonbiodegradable polymers in porcine coronary arteries. Circulation. 94 (7), 1690-1697 (1996).
- Fishbein, I., et al. Bisphosphonate-mediated gene vector delivery from the metal surfaces of stents. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (1), 159-164 (2006).
- Mouro-Chanteloup, I., et al. Evidence that the red cell skeleton protein 4.2 interacts with the Rh membrane complex member CD47. Blood. 101 (1), 338-344 (2003).
- Finley, M. J., Clark, K. A., Alferiev, I. S., Levy, R. J., Stachelek, S. J. Intracellular signaling mechanisms associated with CD47 modified surfaces. Biomaterials. 34 (34), 8640-8649 (2013).
- Slee, J. B., Alferiev, I. S., Levy, R. J., Stachelek, S. J. The use of the ex vivo Chandler Loop Apparatus to assess the biocompatibility of modified polymeric blood conduits. Journal of Visualized Experiments. (90), e51871 (2014).
