Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

التخفيف من مرفق الخلايا المنقولة بالدم إلى يزرع المعادن من خلال CD47-المشتقة الببتيد تجميد

Published: December 3, 2020 doi: 10.3791/61545
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 1,2, *1,2, *1,2
1The Children's Hospital of Philadelphia, 2Department of Pediatrics, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania
* These authors contributed equally

Summary

هنا هو بروتوكول لإلحاق CD47 الببتيد (pepCD47) إلى الدعامات المعدنية باستخدام الكيمياء polybisphosphonate. وظيفية من الدعامات المعدنية باستخدام pepCD47 يمنع المرفق وتفعيل الخلايا الالتهابية وبالتالي تحسين التوافق الحيوي.

Abstract

المضاعفات الرئيسية المرتبطة الدعامات المعدنية العارية والدعامات التي تُمَرّد المخدرات هي إعادة الدعامات في الدعامات والتخثر الدعامات المتأخر، على التوالي. وبالتالي، فإن تحسين التوافق الحيوي للدعامات المعدنية لا يزال يشكل تحديا كبيرا. الهدف من هذا البروتوكول هو وصف تقنية قوية لتعديل السطح المعدني بواسطة الببتيدات النشطة بيولوجيا لزيادة التوافق الحيوي للدم الاتصال يزرع الطبية، بما في ذلك الدعامات داخل الأوعية الدموية. CD47 هو علامة مناعية خاصة بالأنواع الذاتية ولها خصائص مضادة للالتهابات. وقد أظهرت الدراسات أن 22 ببتيد الأحماض الأمينية المقابلة للمجال Ig من CD47 في المنطقة خارج الخلية (pepCD47), له خصائص مضادة للالتهابات مثل البروتين كامل الطول. في دراسات الجسم الحي في الفئران، ودراسات الجسم الحي السابق في الأرانب وأنظمة الدم البشري التجريبية من مختبرنا قد أظهرت أن pepCD47 شل الحركة على المعادن يحسن التوافق الحيوي عن طريق منع التعلق الخلوية الالتهابية والتنشيط. تصف هذه الورقة البروتوكول خطوة بخطوة لإضفاء الطابع الوظيفي على الأسطح المعدنية ومرفق الببتيد. يتم تعديل الأسطح المعدنية باستخدام البايفوسفات بوليولامين مع مجموعات الثيول الكامنة (PABT) تليها إزالة البروتكشن من الثيول وتضخيم المواقع الثيول التفاعلية عن طريق رد فعل مع البولي إثيلينمين مثبتة مع مجموعات بيريديلديثيو (PEI-PDT). وأخيرا، pepCD47، دمج بقايا السيستين المحطة متصلة تسلسل الببتيد الأساسية من خلال المزدوج 8-أمينو-3،6-ديوكسا-أوكتانويل الفضاء، تعلق على السطح المعدني عن طريق السندات كبريتيد. هذه المنهجية من التعلق الببتيد إلى سطح معدني فعالة وغير مكلفة نسبيا، وبالتالي يمكن تطبيقها لتحسين التوافق الحيوي من عدة المواد الحيوية المعدنية.

Introduction

التدخل التاجي عن طريق الجلد هو السطر الأول من العلاج لعلاج أمراض الشريان التاجي (CAD) وينطوي في المقام الأول على الدعامات الشرايين المريضة. ومع ذلك، في الدعامات إعادة تناضح (ISR) وجلخ الدعامات هي المضاعفات الشائعة المرتبطة نشر الدعامات1. يتميز تفاعل الدم في واجهة الدعامات الدموية من خلال الامتزاز الفوري تقريبا من بروتينات البلازما على السطح المعدني ، تليها الصفائح الدموية والخلايا الالتهابية مرفق وتفعيل2. يؤدي إطلاق السيتوكينات الالتهابية وchemokines من الخلايا الالتهابية المنشطة إلى تعديل فينوتيبين من خلايا العضلات السلسة الوعائية (VSMCs) في وسائط tunica ويحفز هجرتهم إلى المقصورة الإلتميمية. انتشار VSMC المنشط في نتائج intima في سماكة طبقة intimal ، التجويف تضييق و في الدعامات restenosis3. وقد تم تطوير الدعامات المُستَرَدَة من المخدرات (DES) لمنع انتشار الـ VSMC؛ ومع ذلك، هذه الأدوية لها تأثير خارج الهدف السامة للخلايا على الخلايا البطانية4،5. ولذلك، في وقت متأخر من الخثار الدعامات هو من المضاعفات الشائعة المرتبطة DES6،7. الدعامات المصنوعة من البوليمرات القابلة للتحلل الحيوي، مثل بولي-L-lactide أظهرت الكثير من الوعد في التجارب الحيوانية والتجارب السريرية الأولية، ولكن تم التذكير في نهاية المطاف عندما "الحياة الحقيقية" الاستخدام السريري أظهرت دونيتها إلى الجيلالثالث DES8. لذلك، هناك حاجة لتحسين التوافق الحيوي للدعامات المعدنية العارية من أجل نتائج أفضل للمريض.

CD47 هو بروتين عبرmembrane أعرب عنه في كل مكان الذي يمنع الاستجابة المناعية الفطرية عندما ملزمة لمستقبلاتها cognate إشارة بروتين ألفا التنظيمية (SIRPα)9. مستقبلات سيربوا لديه الخلايا المناعية التيروزين المثبطة عزر (ITIM) المجال والأحداث إشارة على SIRPα - CD47 التفاعل يؤدي في نهاية المطاف في downregulation من تنشيط الخلايا الالتهابية10,11,12,13. وقد أظهرت الأبحاث في مختبرنا أن CD47 المؤتلف أو مشتق الببتيد، المقابلة ل22 مجال إيغ الأحماض الأمينية من المنطقة خارج الخلية من CD47 (pepCD47)، يمكن أن تقلل من الاستجابة المناعية المضيفة لمجموعة من المواد الحيوية ذات الصلة سريريا14،15،16. في الآونة الأخيرة، وقد أثبتنا أن pepCD47 يمكن أن تكون مشلولة إلى الأسطح الدعامات الفولاذ المقاوم للصدأ والحد بشكل كبير من الاستجابة المرضية المرتبطة ريسينسيس. ملاحظة، الأسطح المعدلة pepCD47 قابلة لشروط الاستخدام ذات الصلة مثل التخزين على المدى الطويل وتعقيم أكسيد الإيثيلين17. وتحقيقا لهذه الغاية، قد يكون pepCD47 هدفا علاجيا مفيدا لمعالجة القيود السريرية للدعامات داخل الأوعية.

استراتيجية للتعلق التساهمي من pepCD47 إلى سطح معدني ينطوي على سلسلة من التعديلات الكيميائية الجديدة من سطح المعدن. يتم أولا المغلفة الأسطح المعدنية مع البيسفوسفونات بوليولامين مع مجموعات ثيول كامنة (PABT) تليها deprotection من ثيولس ومرفق من البولي ايثيلينمين (PEI) مع مجموعات ثبت pyridyldithio (PDT). مجموعات PDT من PEI unconsumed في رد الفعل مع deprotected PABT thiols ثم تتفاعل مع pepCD47 دمج thiols في بقايا السيستين المحطة الطرفية، مما أدى إلى pepCD47 ملزمة إلى السطح المعدني عن طريق السندات كبريتيد14،17،18. استخدمنا الفلوروفور مترافق pepCD47 (TAMRA-pepCD47) لتحديد تركيز المدخلات من الببتيد الذي يؤدي إلى تثبيت السطح الأقصى من الببتيد. وأخيرا، قمنا بتقييم القدرة الحادة والمزمنة المضادة للالتهابات من الأسطح المعدنية المغلفة pepCD47، والكيفو السابق، وذلك باستخدام جهاز حلقة تشاندلر، وملحق monocyte / مقايسة التوسع الضامة، على التوالي.

توفر هذه الورقة بروتوكولاً منهجياً لتعلق الببتيدات ذات الثياتيد بالسطح المعدني؛ تحديد كثافة الشل الأقصى للببتيد؛ وتقييم خصائص مضادة للالتهابات من الأسطح المعدنية المغلفة pepCD47 المعرضة للدم كله ومحاديات معزولة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

وقد تم الحصول على جميع العينات البشرية لهذه التجربة وفقاً لـ IRB لمستشفى الأطفال في فيلادلفيا. وقد أجريت جميع التجارب على الحيوانات بناء على موافقة من IACUC من مستشفى الأطفال في فيلادلفيا.

1. طلاء الأسطح المعدنية العارية مع PEI-PDT

  1. غسل القسائم احباط الفولاذ المقاوم للصدأ (1 سم × 1 سم أو 0.65 سم × 1 سم) أو أقراص شبكة الفولاذ المقاوم للصدأ مع 2-isopropanol في شاكر (60 درجة مئوية، وسرعة 200 دورة في الدقيقة) لمدة 5 دقائق. تنفيذ هذه الخطوة 2 x. ثم غسل 2x مع الكلوروفورم (60 درجة مئوية، وسرعة 200 دورة في الدقيقة) لمدة 10 دقيقة لكل من.
  2. ضع عينات الفولاذ المقاوم للصدأ المطهرة في فرن على حرارة 220 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
  3. إعداد 5 مل من 0.5٪ من حل PABT عن طريق حل 25 ملغ من البيسفوسفونات بوليولامين مع مجموعات ثيول كامنة (PABT) و 5 ملغ من بيكاربونات البوتاسيوم (KHCO3)في 5 مل من DDW واحتضان في 72 درجة مئوية في شاكر في 200 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة.
    ملاحظة: بالنسبة لـ PABT، تشير إلى المؤلفات المنشورةسابقاً 18.
  4. غمر رقائق المخبوزات أو أقراص شبكة في 0.5٪ محلول مائي من PABT واحتضان في شاكر (72 درجة مئوية، وسرعة 200 دورة في الدقيقة) لمدة 1 ساعة.
  5. اغسل العينات المعدلة من قبل PABT بالماء المقطر (DDW) لمدة 5x ، ونقل العينات في قارورة جديدة وغسلها مرة أخرى مع DDW لمدة 5x.
  6. إعداد ما مجموعه 5 مل من حل TCEP (12 ملغ / مل) عن طريق حل 60 ملغ من تريس (2-carboxyethyl) هيدروكلوريد فوسفين (TCEP) في 5 مل من 0.1 M العازلة الخليك (0.57 مل من حمض الخليك الجليدي، 820 ملغ من خلات الصوديوم في 100 مل من DDW).
  7. علاج العينات المعدلة PABT مع TCEP لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT) على شاكر.
    ملاحظة: TCEP يتم استخدام لإلغاء الحماية من المجموعات ثيول.
  8. ديغا DDW في قارورة أسفل مستديرة باستخدام جهاز توليد فراغ، مثل مزيل الزفيلي وغسل رقائق TCEP المعالجة أو أقراص شبكة مع ديغاوسيد DDW لمدة 5x. نقل العينات في قارورة جديدة، وبالإضافة إلى ذلك غسل 5x مع دي.دي.دبليو.
    ملاحظة: من الأهمية بمكان العمل بسرعة لمنع أكسدة الثيول على السطح المعدني بواسطة الأكسجين في الغلاف الجوي.
  9. إعداد 5 مل من 1٪ PEI-PDT الحل عن طريق تخفيف 212.5 ميكرولتر من المخزون PEI-PDT و 125 ميكرولتر من 0.4 M خلات الصوديوم في ديغاوز دي دبليو. تنفيذ الخطوة 1-9 في وقت واحد مع الخطوة 1-8 لتقليل تعرض العينات إلى الهواء في الغلاف الجوي.
    ملاحظة: تم وصف تركيب PEI-PDT في المؤلفات المنشورة سابقا18.
  10. احتضان عينات الفولاذ المقاوم للصدأ غسلها مع 1٪ PEI-PDT. استبدال الهواء مع غاز الأرجون، وختم قوارير الهواء ضيق ومزيج على شاكر في RT لمدة 1 ساعة. إما المضي قدما على الفور مع اقتران الببتيد أو تخزين في 4 درجة مئوية تصل إلى 1 أسبوع.

2. التعلق والتقييم النوعي/الكمي للاحتفاظ بالفلوروهور pepCD47 على السطح المعدني باستخدام المجهر الفلوري والفلوري

  1. غسل رقائق كوبونات أو أقراص شبكة أعدت كما هو موضح في القسم 1، والخطوات 1.1-1.10 أعلاه مع DDW 5x. نقل العينات إلى قارورة جديدة وغسل مع DDW ل5x إضافية. أخيرا غسل 2x مع الإيثانول ديغازيد و 2x مع ديغاسيد ثنائي الفينيل (DMF).
  2. إعداد tetramethylrhodamine (TAMRA)-مترافق بيبCD47 حل الأسهم عن طريق حل TAMRA-مترافق بيبكد47 مسحوق في ثنائي الفينيل متعدد الأشكال ثنائي الغاز (DMF) إلى تركيز نهائي من 1 ملغم / مل. Aliquot حل الأسهم في تخصيصات 1 مل. تخزينها في أنابيب مختومة جيدا تحت الغلاف الجوي الأرجون في -20 درجة مئوية.
  3. تخفيف 1 ملغ / مل من محلول الأسهم من TAMRA-مترافق pepCD47 باستخدام DMF دي الغاز لإعداد التركيزات التالية من الفلوروفور pepCD47 - 10 و 30 و 100 و 200 ميكروغرام / مل.
    ملاحظة: إذا كان TAMRA-مترافق pepCD47 يبدو أن عجلت، والحد من الأسهم TAMRA-مترافق بيب 47 حل باستخدام الخرز TCEP في نسبة 1:1، في RT لمدة 20 دقيقة. لاحظ أنه قبل إضافة PEPCD47 TAMRA-مترافق إلى الخرز TCEP، تدور TCEP حبات الحل، وإزالة supernatant ومن ثم المضي قدما مع إضافة PEPCD47 TAMRA-مترافق.
  4. احتضان كوبونات احباط PEI-PDT المعدلة مع 10، 30، 100 أو 200 ميكروغرام / مل من PEPCD47 TAMRA-مترافق في ثلاث نسخ لكل حالة على شاكر في RT تحت الغلاف الجوي الأرجون لمدة 1 ساعة. احتضان بي آي - PDT تعديل أقراص الشبكة ، فضلا عن قرص شبكة لم يتم تعديلها وراء الخطوة 1.2 (ضوابط المعادن العارية) مع 100 ميكروغرام / مل من PEPCD47 TAMRA - مترافق في ثلاثية الاطليكات في RT تحت الغلاف الجوي الأرجون على شاكر لمدة 1 ساعة.
    ملاحظة: من هذه الخطوة فصاعدا، يتم تغليف قارورة في رقائق الألومنيوم لحماية محتويات من الضوء.
  5. غسل السطوح المترافقة مع الفلوروفور pepCD47 المغلفة لإزالة الببتيد غير التكافؤ المرفقة بالترتيب التالي: DMF (3x)، DMF / DDW في 1:1، DDW (3x)، 0.3٪ SDS في 20 mM تريس درجة PH 7.4 (3x، 5 دقائق لكل من 70 درجة مئوية على شاكر)، DDW (3x)، تغيير قنينة، وغسل DDW النهائي.
  6. ضع التحكم والأقراص الشبكية المترافقة بشكل متكاوي على زجاج المجهر ، أضف 50 ميكرولتر من PBS ووضع غطاء. أقراص شبكة الصورة باستخدام مجهر الفلورانس المقلوب مجهزة مجموعة مرشح رودامين. التقاط صور تمثيلية في التكبير 100x.
  7. إعداد 15 مل من 12 ملغ / مل حل TCEP عن طريق حل 180 ملغ من TCEP في 1:1 v / الخامس خليط من الميثانول و 0.1 M العازلة الخليك.
  8. احتضان كل احباط غسلها مع 1 مل من حل TCEP على شاكر في RT لمدة 15 دقيقة.
  9. إعداد المعايير التالية عن طريق تخفيف تسلسلي للمخزون PEPCD47 TAMRA-مترافق (1 ملغ / مل) – 100 ميكروغرام / مل, 10 ميكروغرام / مل, 1 ميكروغرام / مل, 0.1 ميكروغرام / مل, و 0.01 ميكروغرام/مل. استخدم حل TCEP كمسيل.
  10. تحليل PEPCD47 TAMRA-مترافق أطلقت من السطح المعدني ضد منحنى المعايرة التي تم إنشاؤها باستخدام المعايير من قبل الفلوريتري في 544/590 نانومتر الإثارة والانبعاثات الطول الموجي.

3. إرفاق pepCD47 الإنسان إلى PEI-PDT السطوح المعدلة

  1. غسل العينات المغلفة PEI-PDT وضعت على النحو المبين في القسم 1، والخطوات 1.1-1.10 أعلاه، مع ديغاوست DDW 5x، وتغيير القارورة وغسل مع ديغاز دي دبليو 5x.
  2. إعداد حل الأسهم pepCD47 الإنسان (1 ملغ / مل) عن طريق حل مسحوق pepCD47 الإنسان في حمض الخليك degassed 50٪ لتحقيق تركيز 1 ملغ / مل.
  3. إعداد تركيز العمل من pepCD47 الإنسان (100 ميكروغرام / مل) عن طريق حل 500 ميكرولتر من مخزون pepCD47 الإنسان في 4500 ميكرولتر من degassed 1x الفوسفات المخزنة المالحة (PBS).
  4. احتضان العينات المغلفة PEI-PDT غسلها مع 100 ميكروغرام / مل من pepCD47 في RT مع اهتزاز لمدة 1 ساعة.
  5. غسل العينات pepCD47 الإنسان المغلفة لإزالة الببتيد الزائد في برنامج تلفزيوني النظام التالي (3x)، DDW (3x)، 0.2٪ توين-20 (3x، 5 دقائق لكل منها)، DDW (3x)، تغيير قنينات وغسل DDW النهائي.
    ملاحظة: يمكن تخزين الأسطح المغلفة pepCD47 الإنسان الجافة في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر.

4. طلاء الأسطح المعدلة PEI-PDT مع تسلسل مشوش (Scr)

  1. قم بحل مسحوق تسلسل مخفوق في حمض الخليك 0.1٪ لإعداد محلول مخزون من 1 ملغ / مل.
  2. إعداد حل من 100 ميكروغرام / مل من الببتيد المشوش عن طريق حل 500 ميكرولتر من في 4500 ميكرولتر من حمض الخليك 0.1٪ ديغاسيد.
  3. معطف العينات بي بي-PDT غسلها مع 100 ميكروغرام / مل من الببتيد المشوش في RT مع اهتزاز لمدة 1 ساعة.
  4. لإزالة الببتيد المشوش غير المُعَطَّق، اغسل الأسطح بالترتيب التالي 0.01% من حمض الخليك (3x)، DDW (3x)، 0.2% توين-20 (3x، 5 دقائق)، DDW (3x)، قارورة التغيير، وغسيل DDW واحد.

5. تشاندلر حلقة لتحليل المرفق الخلوية إلى الأسطح المعدنية

  1. معطف احباطات معدنية (0.65 سم × 1 سم) مع إما pepCD47 الإنسان أو الببتيد المشوش وفقا للوصف على القسم 1 متبوعا 3 أو 4.
  2. قطع 1/4 "أنابيب PVC إلى ثلاث قطع 38 سم طويلة.
  3. إدراج ما يصل إلى 8 غير معدلة، الببتيد المشوش أو pepCD47 رقائق معدنية معدلة في ثلاثة أنابيب مختلفة.
  4. جمع 30 مل من الدم من متبرعين صحيين بشرية خالية من أي الأدوية المضادة للصفائح الدموية وفقا لبروتوكول IRB المؤسسية. قبل تحميل حقنة مع 1 مل من 4٪ سيترات الصوديوم لمنع تخثر الدم الذي تم جمعه.
  5. وضع 10 مل من الدم في كل أنبوب باستخدام حقنة 10 مل وربط نهايات مع محولات معدنية. ضع الأنابيب المليئة بالدم على عجلات جهاز حلقة تشاندلر.
  6. تمرير الدم على طول رقائق معدنية بالتناوب عجلة في 37 درجة مئوية في السرعة المحسوبة لإنتاج القص من 25 dyns/cm2 ل 4 ح.
  7. استنزاف الدم من الأنابيب والتخلص من الدم وفقا لمتطلبات IRB.
  8. قطع الأنابيب باستخدام مشرط لاسترداد رقائق من كل أنبوب.
  9. إعداد 2٪ حل الجلوتارالديهيد عن طريق تخفيف 10 مل من 4٪ حل الجلوتارالدهيد باستخدام 10 مل من الصوديوم cacodylate العازلة مع 0.1 M كلوريد الصوديوم.
  10. احتضان رقائق في 2٪ حل جلوتارالدهيد لمدة 15 دقيقة وتخزينها في 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها. قبل التحليل، وغسل احباطات معدنية 3X مع برنامج تلفزيوني.

6. تحليل المرفق الخلوية إلى الأسطح المعدنية باستخدام صبغة CFDA

  1. دافئ 8 مل من برنامج تلفزيوني في 15 مل أنبوب في حمام مائي تعيين إلى 37 درجة مئوية.
  2. إعداد CFDA (carboxy-fluorescein diacetate، succinimidyl استر) حل صبغ على النحو التالي - إضافة 90 ميكرولتر من DMSO إلى قارورة صبغ CFDA واحد لتحقيق تركيز المخزون من 10 mM. المقبل، وإعداد تركيز العمل من 93.75 μM عن طريق إضافة 75 ميكرولتر من CFDA الأسهم إلى 8 مل من برنامج تلفزيوني دافئ. مزيج عن طريق عكس الأنابيب عدة مرات وتغطية الأنبوب مع رقائق الألومنيوم.
    ملاحظة: من المستحسن إعداد صبغة CFDA حديثًا قبل كل استخدام.
  3. احتضان كل احباط مع 1 مل من صبغة CFDA في لوحة 24 جيدا. غطي الطبق بورق الألمنيوم ويحضن اللوحة عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
  4. غسل رقائق معدنية 3x مع برنامج تلفزيوني لإزالة صبغة الزائدة. صورة باستخدام المجهر المقلوب الفلوري.

7. أحادية الملحق وتوسيع الضامة على pepCD47- تعديل الأسطح المعدنية العارية

  1. جمع 10 مل من الدم المحيطي عن طريق الوصول فينا كافا خلال التضحية من 400-450 غرام ذكور Sprague-Dawley الفئران. تخلط على الفور مع 1000 وحدة دولية من الهيبارين الصوديوم لمنع التخثر.
  2. Pipette 10 مل من الكثافة المتوسطة التدرج في أنبوب مخروطي 50 مل. مزيج الدم مع 5 مل من برنامج تلفزيوني، وطبقة بعناية المخفف الدم على المتوسط الانحدار الكثافة باستخدام ماصة باستور. أجهزة الطرد المركزي في الدوار دلو يتأرجح في 800 × ز و 18-25 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة مع إعدادات الحد الأدنى من التسارع والتباطؤ.
  3. باستخدام ماصة باستور، وجمع طبقة مبهمة من معطف بافي على واجهة بين البلازما وفيكول. تمييع معطف بافي 1:3 مع برنامج تلفزيوني وطاردة مركزية في 550 × ز و 4 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة لخلايا معطف بافي.
  4. إعادة تعليق خلايا معطف بافي في 3 مل من ACK تحلل العازلة لlyse تلوث كريات الدم الحمراء. احتضان على الجليد لمدة 4 دقائق. إضافة 12 مل من العازلة فصل الخلية (CSB؛ 0.5٪ BSA، 0.5٪ FBS، 2 mM EDTA / PBS).
  5. جهاز طرد مركزي عند 550 x ز و4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق. إعادة تعليق بيليه في 10 مل من CSB.
  6. جهاز طرد مركزي في 200 × ز و 4 درجة مئوية لمدة 10 دقائق للقضاء على الصفائح الدموية. كرر مرتين.
  7. إعادة تعليق بيليه في 500 ميكرولتر من CSB. إضافة 10 ميكروغرام من كل من الأجسام المضادة الجرذان الماوس التالية: CD8a (استنساخ OX-8)، مكافحة CD5 (استنساخ OX-19)، المضادة CD45RA (استنساخ OX-33)، ومكافحة CD6 (استنساخ OX-52).
  8. احتضان في 4 درجة مئوية على أنبوب دوار عمودي لمدة 1 ساعة. إضافة 9.5 مل من CSB. جهاز طرد مركزي عند 300 x ز و4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق. تجاهل supernatant، إعادة تعليق بيليه في 10 مل من CSB وتكرار الطرد المركزي.
  9. إعادة تعليق بيليه في 500 ميكرولتر من CSB. أضف 150 ميكرولتر من ميكروبات IgG المضادة للماوس. احتضان في 4 درجة مئوية على أنبوب دوار عمودي لمدة 20 دقيقة. إضافة 9.5 مل من CSB. جهاز طرد مركزي عند 300 x ز و4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق.
  10. تجاهل المُندفع. إعادة تعليق بيليه في 1 مل من CSB.
  11. ضع عمود LS في فاصل مغناطيسي.  رئيس العمود LS مع 3 مل من CSB. تجاهل سرعة نقل العمود. إضافة 1 مل من بيليه خلية إعادة تعليق من الخطوة 7.10. ابدأ في تجميع الإنتاجية. بعد توقف التدفق، إضافة 5 مل من CSB والحفاظ على جمع الإنتاجية العمود حتى توقف تدفق.
  12. الطرد المركزي الإنتاجية العمود (6 مل) التي تحتوي على monocytes مختارة بشكل سلبي في 300 × ز و 4 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. إعادة تعليق بيليه الصغيرة الناتجة في 2 مل من 1640 1640 10 متوسطة مكمّلة مع FCS 10٪ ، 1 ٪ من القلم / العقدية و 100 نانوغرام / مل الجرذان الضامة عامل تحفيز مستعمرة (M-CSF).
  13. عدّ الخلايا الأحادية باستخدام مقياس الدم. ضبط تركيز أحادية إلى 5 × 105 خلايا / مل.
  14. إضافة 1 مل مجلدات من تعليق monocyte إلى الآبار الفردية من 12 لوحة بئر مع عينات رقائق الفولاذ المقاوم للصدأ العارية (N = 3) أو عينات الفولاذ المقاوم للصدأ المعدلة مع الجرذان pepCD47 (N = 3) وفقا ل1.1-1.10 و 3.1-3.6.
  15. تغيير الوسيلة في أيام 3 و 5 بعد البذر. في اليوم 6 بعد البذر غسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني وإصلاح مع 4٪ شبهformaldehyde في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. غسل مرتين مع برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق.
  16. إزالة رقائق الفولاذ المقاوم للصدأ ووضعها بشكل فردي في لوحة جديدة 12 جيدا. لا تقلب الرقائق.
  17. احتضان في 0.5٪ Tween-20/PBS لمدة 15 دقيقة ل Permeabilize الخلايا. غسل مرتين مع برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق.
  18. كتلة في مصل الماعز 10٪ / برنامج تلفزيوني لمدة 20 دقيقة. استلهم المصل لا تغسل. إضافة الماوس المضادة للجرذة CD68 الأجسام المضادة (المخفف 1:100 في 1٪ BSA / PBS). احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة. غسل 3x في برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق لكل من.
  19. إضافة الماعز المضادة للماوس IgG اليكسا فلور 546 (المخفف 1:200 في 1٪ BSA / PBS). احتضان في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة 45 دقيقة. غسل في برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق. مضادة مع 1 ميكروغرام / مل Hoechst 33342 صبغ في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة. غسل 3x في برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق لكل من.
  20. اقلب الرقائق والصورة باستخدام مجهر فلوري مع البصريات المقلوبة. التقط الصور بتكبير 200x مع إعدادات التصفية الزرقاء والأحمرة.
  21. حساب أحادية المرفقة في الصور الفردية وحساب متوسطات المجموعة والانحرافات المعيارية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

يتم تقديم الأسطح المعدنية thiol التفاعلية لمرفق الببتيد عن طريق سلسلة من التعديلات الكيميائية، كما هو موضح في الشكل 1. PABT حضانة تليها PEI-PDT العلاج يجعل سطح معدني قابل للتعلق الببتيد. وانضم ببتيد CD47 (pepCD47) التي تحتوي على بقايا السيستين في C-terminus إلى تسلسل pepCD47 الأساسية من خلال جسر AEEAc مرنة مزدوجة covalented على الأسطح ثيول التفاعلية عن طريق السندات كبريتيد. باستخدام هذا البروتوكول، وقد أثبتنا أن pepCD47 لا تزال تعلق بشكل ثابت على سطح المعدن لمدة تصل إلى ستة أشهر، ويمكن أن تحمل الإجهاد القص الفسيولوجية العادية وإجراءات التعقيم17.

تم تحديد الحد الأقصى للاحتفاظ الببتيد عن طريق إلحاق TAMRA-مترافق pepCD47 إلى السطح المعدني متبوعاً بالغسيل المكثف للقضاء على الببتيد غير التكافؤ ملزمة، انشقاق TAMRA-pepCD47 عن طريق الحد من جسور كبريتيد ربط الببتيد إلى السطح، والكم التحليلي باستخدام مقايسة الفلوريوم. على وجه التحديد، تم إلحاق كميات متزايدة من المدخلات من TAMRA-مترافق pepD47 (1 مل من 10 - 200 ميكروغرام / مل) إلى الأسطح المغلفة PEI-PDT وغسلها عدة مرات لإزالة الببتيد غير المرتبط التكافؤ. تم تحديد تركيز TAMRA-مترافقة covalently pepCD47 باستخدام عامل تقليل TCEP لإطلاق الببتيد covalently المرفقة وتقييم الفلوريسنس لها مقابل المعايير. وأظهر تركيز المدخلات البالغ 10 و 30 و 100 و 200 ميكروغرام/مل احتباس الببتيد 28 ± 2 و 78 ± 2 و 182 ± 14 و 157 ± 25 نانوغرام/سم2 على التوالي (الشكل 2). وهكذا، تبين أن كثافة الجمود القصوى لـ pepCD47 على السطح المعدني تبلغ حوالي 180 نانوغرام/سم2، وهو ما تحقق بتركيزات من المدخلات تبلغ 100 ميكروغرام/مل. وقد تم تأكيد التثبيت السليم لـ TAMRA-الاقتران pepCD47 على الأسطح المعدنية المعدلة PABT/PEI-PDT-PDT بواسطة المجهر المفلور(الشكل 3)الذي أظهر الفلوريسنسي الموحد المنبعث من سطح أقراص الشبكة المعالجة PEPCD47(الشكل 3A). تم الكشف عن الحد الأدنى من الفلور على سطح الشبكات التحكم التي تفتقر إلى تعديل PABT /PEI-PDT(الشكل 3B)،وبالتالي استبعاد غير ملزمة على وجه التحديد TAMRA-مترافق pepCD47 كمصدر رئيسي للفلوريسنس.

بعد ذلك، قمنا بتقييم قدرة الأسطح المغلفة pepCD47 لمنع مرفق الخلايا المنقولة بالدم الحادة مقارنة بالأسطح المعدلة المعدلة والمشوشة بالتسلسل. الببتيد التدافع لديه نفس تكوين الأحماض الأمينية مثل pepCD47 ولكن في ترتيب مختلف14,17. تم تقييم مرفق الخلايا المنقولة بالدم عن طريق تناوب الدم من المتطوعين البشريين الأصحاء عبر الأسطح المعدلة والمشوشة وpepeCD47 المعدلة في جهاز حلقة تشاندلر متبوعًا بالغسيل لإزالة الخلايا غير المرفقة ، والتشلط ، والتلطخ بصبغة CFDA. تم تصور الأسطح عن طريق المجهر الفلوري. بما يتفق مع البيانات التي سبق نشرها14،17 السطوح المغلفة pepCD47 تظهر انخفاضا كبيرا في مرفق الخلايا المنقولة بالدم بالمقارنة مع الضوابط المعدلة وغير المعدلة(الشكل 4).

للتوسع في آثار تعديل السطح pepCD47 على مرفق الخلايا الالتهابية والانتشار، استخدمنا الاختيار المناعي السلبي لخلايا معطف الجرذان بافي لعزل monocytes19، واستزراع أحاديات معزولة على المعادن العارية وpeCD47- تعديل رقائق الفولاذ المقاوم للصدأ لمدة 6 أيام في وجود M-CSF. تظهر نتائج هذه الدراسة مجتمعة 58٪ التوهين من المرفق أحادية حادة، وتحويلها إلى الضامة، وانتشار الضامة على الأسطح pepCD47 وظيفية(الشكل 5A)بالمقارنة مع الضوابط المعادن العارية (الشكل 5 B, C).

Figure 1
الشكل 1: التمثيل التخطيطي للخطوات التي ينطوي عليها إلحاق pepCD47 بالأسطح المعدنية. (أ) تم خبز عينات معدنية نظيفة في 220 درجة مئوية لأكسدة سطح المعدن. شكلت مجموعات البيسفوسفونات من البيسفوسفونات polallylamine مع مجموعات ثيول كامنة (PABT) السندات المنسقة مع أكاسيد المعادن ومعطف السطوح المعدنية لتشكيل أحادية وظيفية. وجرى كذلك التعامل مع الأسطح المعدنية المغلفة PABT مع TCEP لفك الحماية من المجموعات ثيول. (ب) هيكل PEI-PDT والتمثيل الرمزي. (C)تم التعامل مع PABT المغلفة وCEP انخفاض الأسطح مع بي بي آي - PDT التي تضخم العدد الإجمالي للمجموعات ثيول التفاعلية المتاحة للتعلق الببتيد thiolated. وأخيراً، تفاعلت الأسطح المغلفة بي أيه بي آي-PDT مع مجموعات السيستين الطرفية من بيب سي دي 47، وتم ربط الببتيد بالسطح عن طريق روابط ثاني كبريتيد. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: تحديد كثافة الشل من pepCD47 على سطح معدني. تم تعديل 1 سم × 1 سم معدن رقائق باستخدام زيادة تركيزات (10، 30، 100 و 200 ميكروغرام / مل) من الفلوروفهور مترافق pepCD47. تمت إزالة الببتيد الزائد باستخدام عدة خطوات الغسيل ثم تعامل مع 1 مل TCEP حل لشق فلوريوورو مترافق fluorophore. تم تحليل تركيز الببتيد المُلحق بـ السطح المعدني بالفلوري باستخدام منحنى قياسي معد بتركيزات محددة من الفلوروفور المترافق بيبCD47. تم تمثيل كثافة الجمود على أنها نانوغرام/سم² من الببتيد تعلق على السطح المعدني. يتم التعبير عن البيانات على أنها متوسط ± SEM وهي تمثل ثلاث تجارب مستقلة على الأقل. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: التصوير المجهري للفلوريسنس لسطح الفولاذ المقاوم للصدأ المعدلة مع PEPCD47 TAMRA-مترافق. أقراص شبكة الفولاذ المقاوم للصدأ، تعديل على التوالي مع PABT، TCEP، PEI-PDT (A) أو غير معدلة (B) كانت تتفاعل مع PEPCD47 TAMRA-مترافق. تم غسلها بشكل صحيح ومترافقة والسيطرة على الشبكات المعدنية العارية على نطاق واسع وصورت في التكبير 100x. طول شريط المقياس هو 100 ميكرومتر.

Figure 4
الشكل 4: تقييم الوظائف الحادة المضادة للالتهابات ومضادة للجلطات من pepCD47. 0.65 سم × 1cm رقائق معدنية كانت مغلفة مع 100 ميكروغرام / مل من أي pepCD47 الإنسان أو الببتيد المشوشة وتعرض للدم في جهاز حلقة تشاندلر. تمت إزالة الخلايا غير المنضمة عن طريق الغسيل مع PBS وتم إصلاح الرقائق في 2٪ من الجلوتارالدلديهايد. ثم تم احتضان الأسطح المعدلة والمعدلة المشوشة والبشرية pepCD47 المعدلة مع صبغة CFDA لمدة 15 دقيقة في 37 درجة مئوية ، وغسلها مع PBS وتحليلها باستخدام مجهر الفلورانس. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: انتشار الضامة CD68 إيجابية على الأسطح المعدنية العارية و pepCD47 وظيفية. تم عزل الخلايا الأحادية المشتقة من الدم المحيطي للفئران بواسطة الطرد المركزي لكثافة التدرج تليها الإقصاء المناعي السلبي مع الميكروبات المغناطيسية. 5 × 105 monocytes أضيفت إلى آبار 12 لوحة بئر مع وضع عينات من المعادن العارية وضعت بشكل فردي (N = 3) أو العينات المشتقة مع الجرذان pepCD47. تم تحفيز تمايز الضامة بنسبة 100 نانوغرام/مل M-CSF. بعد ستة أيام من البذر تم إصلاح الخلايا ، والمثبطة بالمناعة مع الأجسام المضادة CD68 الجرذان ، الثانوية اليكسا فلور - 546 (الحمراء) مترافق الأجسام المضادة ومضادة مع Hoechst 33342 صبغة نووية (زرقاء). صور تمثيلية من المعدن العاري (A) و pepCD47 -functionalized (B) تم التقاط الأسطح في 200x التكبير ودمجها. طول شريط المقياس هو 100 ميكرومتر.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

نحن نبرهن ونصف استراتيجية كيميائية جديدة نسبيا لإلحاق مزيتات الببتيد العلاجية إلى سطح الفولاذ المقاوم للصدأ مع الهدف الشامل للحد من التفاعل السطح مع الخلايا الالتهابية الموجودة في الدم. وتشمل كيمياء البيسفوسفونات الموصوفة هنا تنسيق تكوين السندات بين أكاسيد المعادن ومجموعات البيسفوسفونات من باب. سمك بولي فوسفونات monolayer شكلت على سطح معدني لا يتجاوز 5 نانومتر18، وبالتالي ، هو غير منطقي للآثار proinflammatory المحتملة من الطلاء البوليمرسميكة 20. Deprotection من مجموعة ثيول الكامنة في سلاسل جانبية أليفاتية من PABT يعبي الأسطح المعدنية لمزيد من التعديل الكيميائي مع المركبات ذات التفاعل thiol. يتفرع بي إي-PDT البولي ايثيلينمين (متوسط Mw = 25000) الذي يتم فيه تعديل ~ 20٪ من وصلات الإيثيلين مع مجموعات بيريديلديثيو ذات التفاعل thiol. منذ يتم استهلاكها فقط أقلية من مجموعات PDT في PEI-PDT في رد فعل مع thiols PABT المستمدة، يتم تغيير الكيمياء السطحية بعد PEI-PDT الربط إلى thiol التفاعلية لتمكين المرفق من الببتيدات thiolated18. وقد وضعت هذه الاستراتيجية الكيميائية وتستخدم على نطاق واسع في مختبرنا لتعلق الجزيئات الحيوية العديدة، مثل البروتيناتالمؤتلفة 14،الببتيدات14،17، ونواقل الجينات الفيروسية18 إلى السطح المعدني. على الرغم من أن معظم عملنا استخدمنا أسطح الفولاذ المقاوم للصدأ، يمكن أن تتفاعل PABT مع سبائك معدنية أخرى21 وبالتالي لديها القدرة على تحسين التوافق الحيوي والإمكانات العلاجية لمجموعة واسعة من المواد الحيوية المعدنية.

تشير منهجيتنا الحالية إلى أن الحد الأقصى للكثافة الشلائية لفلوروفور pepCD47 على الأسطح المعدنية هو 180 نانوغرام/سم2، وهو أقل مقارنة ببياناتنا المنشورة سابقا17. نحن نعزو هذا التناقض إلى استراتيجيات الغسيل المختلفة المستخدمة في كلتا الدراستين. في بروتوكولنا الحالي استخدمنا SDS الذي يزيل الببتيدات غير التكافؤ تماما بالمقارنة مع Tween-20 التي استخدمت في دراساتنا الأولية. ومع ذلك، 180 نانوغرام/سم2 يتوافق مع حوالي 4 × 106 جزيئات/ميكرومتر2 من pepCD47. هذه الكثافة الجمود أعلى بكثير من المستويات الفسيولوجية من CD47 على أسطح الخلايا التي هي ما يقرب من 390 جزيئات / μm2،22. وهكذا، فإننا نتوقع أن ظروف الغسيل الصارمة لن تؤثر بشكل كبير على الخصائص المضادة للالتهابات من الأسطح المعدنية المعدلة pepCD47.

هذه المنهجية من التعلق pepCD47 إلى المعدن هو استنساخ للغاية، ولكن هناك عدة خطوات في البروتوكول التي تحتاج إلى عناية دقيقة. أولا، بعد طلاء السطح المعدني مع PABT والحد منه باستخدام TCEP، thiols عرضة للأكسدة عندما تتعرض للهواء. وهكذا ، فإنه من الأهمية القصوى أن تكون الأسطح مغمورة دائما في المياه دي الغاز. لنفس السبب يتم إجراء حل PEI-PDT في المياه ديغاوست وأرغون يضاف إلى قارورة أثناء حضانة رقائق المغلفة مع بي أيه بي تي- PDT. ثانيا، يجب على المرء أن ينظر في إمكانية هطول الأمطار من الببتيدات المنمقة. PepCD47 لديه بقايا السيستين محطة, فضلا عن بقايا السيستين في تسلسل. وهكذا، عندما يتم تخزينها بشكل غير صحيح، هناك احتمال كبير أن الببتيدات البلمرة وعجلة للخروج من الحل. لمعالجة هذه المشكلة المحتملة، فمن المستحسن أن الببتيدات ينبغي أن تخفض باستخدام TCEP الخرز لمدة 20 دقيقة إلى 1 ساعة قبل الحضانة مع الأسطح المغلفة بي اي-PDT. سوف تساعد على تقليل الببتيدات و زيادة ذوبانها في الذوبان في كل منها. ويوصى أيضاً بتهجير الهواء المحيط مع الأرجون في القنينات أثناء احتضان العينات المغلفة PEI-PDT مع الببتيد ذي الثوليد.

إذا تم اتباع الاحتياطات المذكورة أعلاه ، فإن تقنية الطلاء قابلة للاستنساخ والقيد الوحيد المحتمل لهذا النهج هو عدم توفر الكواشف الكاشفة PABT و PEI-PDT.

استخدمنا جهاز حلقة تشاندلر لتوفير إثبات vivo السابقين تحليل المفهوم لفهم التفاعل بين السطوح المعدنية المعدلة pepCD47 مع خلايا الدم، وقد تم استخدامه بنجاح من قبل مختبرنا لإظهار خصائص مضادة للالتهابات من الأسطح المغلفة pepCD4714،15،17،23.  في هذه الدراسة، استخدمنا صبغة CFDA التي تفلور فقط بعد دخول الخلايا عندما يتم شق مجموعات خلات من الصبغة من قبل استراز داخل الخلايا. فوائد هذا الإجراء تلطيخ هو أنه يلطخ الصفائح الدموية anucleated وخلايا الدم الحمراء والآبار والخلايا النووية مثل الكريات البيض. وهكذا، فإن استخدام صبغة CFDA يوفر تقييمًا لكل من الخصائص الحادة المضادة للتخثر والخصائص المضادة لللصق للأسطح المغلفة من بيب سي 47. ويمكن الحصول على تقييم أكثر تفصيلا من خلال المسح المجهري الإلكترون و / أو المناعة، وكلاهما نحن مفصلة سابقا24. نتائج الدراسة الحالية التحقق من صحة أن الإنسان pepCD47 الأسطح المعدنية المغلفة هي المضادة للتخثر ومكافحة اللصق بالمقارنة مع الضوابط تسلسل غير معدلة وتدافع.

لمزيد من التحقيق في ما إذا كانت الأسطح المعدلة pepCD47 تغير خصائص النمو للخلايا الالتهابية المرفقة، رقائق الفولاذ المقاوم للصدأ عارية أو رقائق وضعت مع pepCD47 تعرضت لوحدات الفئران المعزولة في وجود سينجينيك M-CSF. كانت الخلايا مثقفة في ظل ظروف ثابتة لمدة 6 أيام للسماح لتحويل الظاهرة والتوسع في الضامة. وفقا لنتائجنا السابقة لوحظت في إعدادات تجريبية مختلفة14، تم إظهار انخفاض عميق في عدد الخلايا الالتهابية على الأسطح الوظيفية pepCD47 في الدراسة الحالية.

وهكذا، دراساتنا تثبت في نهاية المطاف أن الكيمياء بولي فوسفونات رواية لطلاء المعادن مع pepCD47 هو وسيلة فعالة لتحسين التوافق الحيوي للأسطح المعدنية ويمكن تطبيقها في التطبيقات الطبية الحيوية الأخرى، مثل المفاصل الاصطناعية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

وقد تم دعم تطوير البروتوكول والدراسات المقدمة في هذه الورقة من قبل تمويل NIH (NBIB) R01 (# EB023921) إلى IF و SJS ، و NIH (NHLBI) R01 تمويل (# HL137762) إلى IF و RJL.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 M Tris-HCL Invitrogen 15567-027 pH - 7.5
4% Glutaraldehyde Electron Microscopy Sciences 16539-07
4% Sodium Citrate Sigma S5770
ACK lysing buffer Quality Biologicals 118-156-721
anti-CD45RA Ab (mouse anti-rat; clone OX-19) Biolegend 202301
anti-CD5 Ab (mouse anti-rat; clone OX-19) Biolegend 203501
anti-CD6 Ab (mouse anti-rat; clone OX-52) BD Biosciences 550979
anti-CD68 Ab (mouse anti-rat; clone ED-1) BioRad MCA341
anti-CD8a Ab (mouse anti-rat; clone OX-8) Biolegend 201701
Chloroform Certified ACS Fisher Chemical C298-500
Dimethyl Formammide (DMF) Alfa Aesar 39117
Embra stainless steel grid Electron Microscopy Sciences E200-SS stainless steel mesh mesh disks
Ficoll Hypaque GE Healthcare 17-1440-02
Glacial acetic acid ACROS organic 148930025
goat anti-mouse IgG Alexa Fluor ThermoFisher A11030
Heparin sodium Sagent Pharmaceuticals 402-01
Human pepCD47 Bachem 4099101
Isopropanol Fisher Chemical A426P-4
Metal adapters Leur Fitting 6515IND 1 way adapter 316 ss 1/4"-5/16" hoes end
Methanol RICCA chemical company 4829-32
Microscope Nikon Eclipse TE300
Phosphate buffered saline (PBS) Gibco 14190-136
Pottasium Bicarbonate (KHCO3) Fisher Chemical P184-500
PVC tubes Terumo-CVS 60050 1/4" X 1/16 8'
sodium cacodylate buffer with 0.1M sodium chloride Electron Microscopy Sciences 11653
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) Bio-Rad laboratories 161-0302
Sodum actetate (C2H3NaO2) Alfa Aesar A13184
Src peptide Bachem 4092599
Stainless steel (AISI 304) cylinder-shaped samples with a lumen Microgroup, Medway, MA 20097328 1 cm X 6 mm OD
Stainless steel foils (AISI 316L) Goodfellow, Coraopolis, PA 100 mm X 100 mm X 0.05 mm
Tetramethylrhodamine-conjugated pepCD47 (TAMRA-pepCD47) Bachem 4100277
TMB (3,3’ ,5,5’ -tetramethylbenzidine) substrate and tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride (TCEP) Thermo Scientific PG82089
Tween-20 Bio-Rad laboratories 170-6531
Vybrant CFDA SE Cell Tracer Kit Invitrogen V12883

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Buccheri, D., Piraino, D., Andolina, G., Cortese, B. Understanding and managing in-stent restenosis: a review of clinical data, from pathogenesis to treatment. Journal Thoracic Disease. 8 (10), 1150-1162 (2016).
  2. van Oeveren, W. Obstacles in haemocompatibility testing. Scientifica. 2013, Cairo. 392584 (2013).
  3. Mitra, A. K., Agrawal, D. K. In stent restenosis: bane of the stent era. Journal of Clinical Pathology. 59 (3), 232-239 (2006).
  4. Iqbal, J., Gunn, J., Serruys, P. W. Coronary stents: historical development, current status and future directions. British Medical Bulletin. 106, 193-211 (2013).
  5. Hoffmann, R., et al. Patterns and mechanisms of in-stent restenosis. A serial intravascular ultrasound study. Circulation. 94 (6), 1247-1254 (1996).
  6. Stefanini, G. G., Windecker, S. Stent thrombosis: no longer an issue with newer-generation drug-eluting stents. Circulation: Cardiovascular Interventions. 5 (3), 332-335 (2012).
  7. Palmerini, T., et al. Clinical outcomes with bioabsorbable polymer- versus durable polymer-based drug-eluting and bare-metal stents: evidence from a comprehensive network meta-analysis. Journal of the American College of Cardiology. 63 (4), 299-307 (2014).
  8. Omar, W. A., Kumbhani, D. J. The Current Literature on Bioabsorbable Stents: a Review. Current Atherosclerosis Reports. 21 (12), 54 (2019).
  9. Slee, J. B., Christian, A. J., Levy, R. J., Stachelek, S. J. Addressing the Inflammatory Response to Clinically Relevant Polymers by Manipulating the Host Response Using ITIM Domain-Containing Receptors. Polymers (Basel). 6 (10), 2526-2551 (2014).
  10. Oldenborg, P. A., et al. Role of CD47 as a marker of self on red blood cells. Science. 288 (5473), 2051-2054 (2000).
  11. vanden Berg, T. K., vander Schoot, C. E. Innate immune 'self' recognition: a role for CD47-SIRPalpha interactions in hematopoietic stem cell transplantation. Trends in Immunology. 29 (5), 203-206 (2008).
  12. Tengood, J. E., Levy, R. J., Stachelek, S. J. The use of CD47-modified biomaterials to mitigate the immune response. Experimental Biology Medicine (Maywood). 241 (10), 1033-1041 (2016).
  13. Tsai, R. K., Rodriguez, P. L., Discher, D. E. Self inhibition of phagocytosis: the affinity of 'marker of self' CD47 for SIRPalpha dictates potency of inhibition but only at low expression levels. Blood Cells, Molecules and Diseases. 45 (1), 67-74 (2010).
  14. Slee, J. B., et al. Enhanced biocompatibility of CD47-functionalized vascular stents. Biomaterials. 87, 82-92 (2016).
  15. Finley, M. J., et al. Diminished adhesion and activation of platelets and neutrophils with CD47 functionalized blood contacting surfaces. Biomaterials. 33 (24), 5803-5811 (2012).
  16. Stachelek, S. J., et al. The effect of CD47 modified polymer surfaces on inflammatory cell attachment and activation. Biomaterials. 32 (19), 4317-4326 (2011).
  17. Inamdar, V. V., et al. Stability and bioactivity of pepCD47 attachment on stainless steel surfaces. Acta Biomaterialia. 104, 231-240 (2020).
  18. Fishbein, I., et al. Local delivery of gene vectors from bare-metal stents by use of a biodegradable synthetic complex inhibits in-stent restenosis in rat carotid arteries. Circulation. 117 (16), 2096-2103 (2008).
  19. Moser, K. V., Humpel, C. Primary rat monocytes migrate through a BCEC-monolayer and express microglia-markers at the basolateral side. Brain Research Bulletin. 74 (5), 336-343 (2007).
  20. vander Giessen, W. J., et al. Marked inflammatory sequelae to implantation of biodegradable and nonbiodegradable polymers in porcine coronary arteries. Circulation. 94 (7), 1690-1697 (1996).
  21. Fishbein, I., et al. Bisphosphonate-mediated gene vector delivery from the metal surfaces of stents. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (1), 159-164 (2006).
  22. Mouro-Chanteloup, I., et al. Evidence that the red cell skeleton protein 4.2 interacts with the Rh membrane complex member CD47. Blood. 101 (1), 338-344 (2003).
  23. Finley, M. J., Clark, K. A., Alferiev, I. S., Levy, R. J., Stachelek, S. J. Intracellular signaling mechanisms associated with CD47 modified surfaces. Biomaterials. 34 (34), 8640-8649 (2013).
  24. Slee, J. B., Alferiev, I. S., Levy, R. J., Stachelek, S. J. The use of the ex vivo Chandler Loop Apparatus to assess the biocompatibility of modified polymeric blood conduits. Journal of Visualized Experiments. (90), e51871 (2014).

Tags

الهندسة الحيوية، القضية 166، وظيفية السطح، والمعادن، يزرع، الدعامات، CD47، التهاب، تخثر، الببتيدات، والاجتناف الحيوي
التخفيف من مرفق الخلايا المنقولة بالدم إلى يزرع المعادن من خلال CD47-المشتقة الببتيد تجميد
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Inamdar, V. V., Fitzpatrick, E. G.,… More

Inamdar, V. V., Fitzpatrick, E. G., Alferiev, I. S., Levy, R. J., Stachelek, S. J., Fishbein, I. Mitigation of Blood Borne Cell Attachment to Metal Implants through CD47-Derived Peptide Immobilization. J. Vis. Exp. (166), e61545, doi:10.3791/61545 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter