Summary
Burada sunulan peptid CD47 (pepCD47) polibisfosfonat kimya kullanarak metal stentler için ekiçin bir protokoldür. PepCD47 kullanarak metal stentlerin fonksiyonelleştirilmesi inflamatuar hücrelerin bağlanmasını ve aktivasyonunu önler ve böylece biyouyumluluğunu artırır.
Abstract
Çıplak metal stentler ve ilaç eluting stentleri ile ilişkili önemli komplikasyonlar sırasıyla in-stent restenozisi ve geç stent trombozudur. Bu nedenle, metal stentlerin biyouyumluluğunun iyileştirilmesi önemli bir sorun olmaya devam etmektedir. Bu protokolün amacı, endovasküler stentler de dahil olmak üzere, kanla temas eden tıbbi implantların biyouyumluluğunu artırmak için biyolojik olarak aktif peptidler tarafından metal yüzey modifikasyonu için sağlam bir teknik tanımlamaktır. CD47 kendini bir immünolojik tür-özgü belirteç ve anti-inflamatuar özelliklere sahiptir. Çalışmalar, ekstrasellüler bölgede CD47'nin Ig etki alanına karşılık gelen 22 amino asit peptidin (pepCD47), tam uzunlukta protein gibi anti-inflamatuar özelliklere sahip olduğunu göstermiştir. Farelerde in vivo çalışmalar, ve bizim laboratuvardan tavşan ve insan kanı deneysel sistemlerde ex vivo çalışmalar metaller üzerinde pepCD47 immobilizasyon inflamatuar hücre eki ve aktivasyon önleyerek biyouyumluluğu artırdığını göstermiştir. Bu makalede, metal yüzeylerin ve peptit eki işlevselleştirilmesi için adım adım protokol açıklanmaktadır. Metal yüzeyler, gizli tiyol grupları (PABT) ile poliallilin bifosfat kullanılarak modifiye edilir ve ardından tiyollerin korunması ve piriyldithio grupları (PEI-PDT) ile yüklü polietileninile reaksiyon yoluyla tiyol-reaktif bölgelerin güçlendirilmesi sağlanır. Son olarak, pepCD47, bir çift 8-amino-3,6-dioksan-oktavoil spacer ile çekirdek peptid dizisine bağlı terminal sistein artıkları içeren, disülfür bağları ile metal yüzeye bağlı. Metal yüzeye peptit eki Bu metodoloji verimli ve nispeten ucuz ve böylece çeşitli metalik biyomalzemelerin biyouyumluluğu artırmak için uygulanabilir.
Introduction
Perkütan koroner girişim koroner arter hastalıkları (CAD) tedavisinde tedavinin ilk satırı ve öncelikle hastalıklı arterler stentleme içerir. Ancak stent restenozisi (ISR) ve stent trombozu stent konuşlandırma ile ilişkili sık karşılaşılan komplikasyonlardır1. Kan stent arayüzünde kan etkileşimi metal yüzeyinde plazma proteinlerinin neredeyse hemen adsorpsiyon ile karakterizedir, trombosit ve inflamatuar hücre eki ve aktivasyon takip2. Aktive inflamatuar hücrelerden inflamatuar sitokinler ve kemokinlerin salınımı, tunica media'daki vasküler düz kas hücrelerinin (VSMC) fenotibik modifikasyonuna yol açar ve merkezsel intimal bölmeye merkezsel göçlerini tetikler. İntimada aktive vsmc'nin çoğalması intimal tabaka kalınlaşması, lümen daralması3ve stent içi restenoz 3 ile sonuçlanır. VSMC proliferasyonlarını önlemek için uyuşturucu eluting stentleri (DES) geliştirilmiştir; ancak, bu ilaçların endotel hücreleri üzerinde hedef dışı sitotoksik etkisi var4,5. Bu nedenle, geç stent trombozu DESileilişkili sık görülen bir komplikasyondur6 ,7. Poli-L-laktit gibi biyolojik olarak parçalanabilir polimerlerden yapılmış stentler hayvan deneylerinde ve ilk klinik çalışmalarda çok umut vaat etmiş, ancak "gerçek hayattaki" klinik8kullanım3. Bu nedenle, daha iyi hasta sonuçları için çıplak metal stentbiyouyumluluğunu artırmak için bir ihtiyaç vardır.
CD47, konjenital reseptörSignal Regulatory Protein alpha (SIRPα)9'abağlandığında doğuştan gelen bağışıklık yanıtını inhibe eden her yerde ifade edilen transmembran proteinidir. SIRPα reseptörü bir bağışıklık hücresi tirozin inhibitör motifi vardır (ITIM) etki alanı ve SIRPα üzerine sinyal olaylar - CD47 etkileşimsonuçta inflamatuar hücre aktivasyonu10downregulation neden10 ,11,12,13. Laboratuarımızda araştırma rekombinant CD47 veya peptit türevi, CD47 (pepCD47) ekstrasellüler bölgenin 22 amino asit Ig etki alanına karşılık, klinik olarak ilgili biyomalzemeler14bir dizi ev sahibi bağışıklık yanıtı azaltabilir göstermiştir 14,15,16. Son zamanlarda, pepCD47 paslanmaz çelik stent yüzeylere hareketsiz olabilir ve önemli ölçüde restenosis ile ilişkili patofizyolojik yanıtı azaltmak göstermiştir. Not, pepCD47 modifiye yüzeyler uzun süreli depolama ve etilen oksit sterilizasyonu17gibi ilgili kullanım koşullarına uygundur. Bu amaçla, pepCD47 endovasküler stentlerin klinik sınırlamaları gidermek için yararlı bir terapötik hedef olabilir.
PepCD47'nin metal bir yüzeye kovalent bağlanması için strateji, metal yüzeyin inyeni kimyasal modifikasyonları içerir. Metal yüzeyler ilk olarak poliallilin bifosfonat ile gizli tiyol grupları (PABT) ile kaplanır ve ardından tiyollerin korunması ve polietilenin (PEI) yüklü piriyldithio grupları (PDT) ile bağlanması nı sağlar. PEI PDT grupları deprotected PABT tiols ile reaksiyonda tüketilmemiş sonra pepCD47 terminal sistein artıkları thiols içeren ile tepki, bir disülfür bağı ile metal yüzeyine bağlayıcı pepCD47 sonuçlanan14,17,18. Biz peptid maksimum yüzey immobilizasyonu ile sonuçlanan peptit giriş konsantrasyonu belirlemek için bir florofor konjuge pepCD47 (TAMRA-pepCD47) kullanılır. Son olarak, pepCD47 kaplı metal yüzeylerin akut ve kronik anti-inflamatuar kapasitesi, chandler döngü aparatı kullanılarak ex vivo ve monosit eki/makrofaj genleşme tayini sırasıyla değerlendirildi.
Bu kağıt, metal yüzeye tiolated peptidlerin bağlanması için sistematik bir protokol sağlar; peptidin maksimum hareketsizlik yoğunluğunun belirlenmesi; ve tam kan ve izole monositlere maruz kalan pepCD47 kaplamalı metal yüzeylerin anti-inflamatuar özelliklerini değerlendirmek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu deney için tüm insan örnekleri Philadelphia Çocuk Hastanesi IRB uyarınca elde edildi. Tüm hayvan deneyleri Philadelphia Çocuk Hastanesi IACUC onayı üzerine yapıldı.
1. Çıplak metal yüzeylerin PEI-PDT ile kapasımı
- Paslanmaz çelik folyo kuponları (1 cm x 1 cm veya 0,65 cm x 1 cm) veya paslanmaz çelik kafes diskleri bir shaker 'da (60 °C, 200 rpm hız) 5 dakika boyunca 2 izopropanol ile yıkayın. Bu adımı 2x gerçekleştirin. Daha sonra 2x kloroform (60 °C, hız 200 rpm) ile 10 dakika boyunca yıkayın.
- Temizlenmiş paslanmaz çelik numuneleri 220 °C'de 30 dk fırında pişirin.
- 25 mg poliallilin bifosfonat'ı latent tiyol grupları (PABT) ve 5 mg potasyum bikarbonat (KHCO3)5 mL DDW'de eriterek PABT çözeltisinin %0,5'inin 5 mL'sini hazırlayın ve 72 °C'de 30 dakika boyunca çalkalayıcı olarak kuluçkaya yatın.
NOT: PABT sentezi için daha önce yayınlanmış literatür18bakın. - Pişmiş folyoları veya kafes diskleri PABT'nin %0,5 sulu çözeltisi içine batırın ve 1 saat boyunca bir çalkalayıcıya (72 °C, 200 rpm hız) inkübatın.
- PABT modifiye edilmiş numuneleri 5 kat deiyonize edilmiş distile su (DDW) ile yıkayın, numuneleri yeni bir şişeye aktarın ve 5 kat için DDW ile tekrar yıkayın.
- 60 mg Tris (2 karboksitil) fosfin hidroklorür (TCEP) 5 mL 0,1 M asetik tampon (0,57 mL buzul asetik asit, 820 mg sodyum asetat 100 mL DDW) eriterek toplam 5 mL TCEP çözeltisi (12 mg/mL) hazırlayın.
- PABT modifiye edilmiş numuneleri 15 dakika oda sıcaklığında (RT) çalkalayıcı üzerinde TCEP ile tedavi edin.
NOT: TCEP tiyol gruplarını korumak için kullanılır. - Bir lyophilizer gibi bir vakum üreten cihaz kullanarak yuvarlak bir alt şişede Degas DDW ve 5x için gazsız DDW ile TCEP tedavi folyo veya örgü diskler yıkayın. Örnekleri yeni bir şişeye aktarın ve ayrıca gazsız DDW ile 5 kat yıkayın.
NOT: Metal yüzeyindeki tiyollerin atmosferik oksijen le oksidasyonunu önlemek için hızlı çalışmak çok önemlidir. - Gazsız DDW'de 212,5 μL pei-PDT ve 0,4 M sodyum asetat 212,5 μL seyrelterek %1 PEI-PDT çözeltisinin 5 mL'sini hazırlayın. Numunelerin atmosferik havaya maruz kalmasını en aza indirmek için adım 1.9'u adım 1.8 ile aynı anda gerçekleştirin.
NOT: PEI-PDT sentezi daha önce yayınlanmışliteratürde 18açıklanmıştır. - Yıkanmış paslanmaz çelik numuneleri %1 PEI-PDT ile kuluçkaya yatırın. Havayı argon gazıyla değiştirin, şişeleri hava geçirmez kapatın ve RT'de 1 saat çalkalayın. Ya hemen peptit çekimi ile devam edin ya da 4 °C'de 1 haftaya kadar saklayın.
2. Florosemik mikroskopi ve florimetri kullanılarak metal yüzeyinde florofor konjuge pepCD47 retansiyonunun bağlanması ve nitel/nicel değerlendirilmesi
- Yıkama folyo kuponlar veya örgü diskler bölüm 1 açıklandığı gibi hazırlanan, ddw 5x ile yukarıda adımlar 1.1-1.10. Örnekleri yeni bir şişeye aktarın ve ek 5x için DDW ile yıkayın. Son olarak degassed etanol ve gazlı dimetil formamid (DMF) ile 2x yıkayın.
- Tamra konjuge pepCD47 tozunu gazsız dimetilformamid (DMF) içinde eriterek tetrametiloid (TAMRA)-konjuge pepCD47 stok çözeltisini 1 mg/mL'lik son konsantrasyona hazırlayın. Aliquot stok çözeltisi 1 mL tahsisatta. -20 °C'de argon atmosferinin altında iyi kapatılmış tüplerde saklayın.
- Tamra konjuge pepCD47 stok çözeltisinin seyreltilmesini 1 mg/mL ile gazsız DMF kullanarak aşağıdaki florofofor konjuge pepCD47 - 10, 30, 100 ve 200 μg/mL konsantrasyonlarını hazırlayın.
NOT: TAMRA konjuge pepCD47 çöktürülmüş gibi görünüyorsa, 20 dk için RT, oran 1:1 TCEP boncukkullanarak stok TAMRA konjuge pepCD47 çözüm azaltmak. TCEP boncuklar için TAMRA konjuge pepCD47 eklemeden önce, TCEP boncuk çözeltisi spin, supernatant kaldırmak ve sonra TAMRA konjuge pepCD47 eklenmesi ile devam unutmayın. - PEI-PDT modifiye folyo kuponları 1 saat boyunca argon atmosferi altında RT'de bir çalkalayıcı üzerinde her durum için triplicates TAMRA konjuge pepCD47 10, 30, 100 veya 200 μg/mL ile inkübon. Incubate PEI-PDT değiştirilmiş örgü diskler, yanı sıra 1 saat için bir shaker argon atmosfer altında RT de trilicates TAMRA konjuge pepCD47 100 μg/mL ile adım 1.2 (çıplak metal kontroller) ötesinde modifiye değil örgü disk.
NOT: Bu adımdan itibaren şişeler, içindekileri ışıktan korumak için alüminyum folyoya sarılır. - Aşağıdaki sırayla kovalent bağlı olmayan peptid kaldırmak için florofor konjuge pepCD47 kaplı yüzeyleri yıkayın: DMF (3x), DMF/DDW 1:1, DDW (3x), 20 mM Tris pH 7.4'te %0.3 SDS (shaker'da 70 °C'de 3x, 5 dk), DDW (3x), şişeleri değiştirin ve son bir DDW yıkayın.
- Kontrol ve kovalent konjuge örgü diskleri bir mikroskop camı üzerine yerleştirin, 50 μL PBS ekleyin ve bir kapak kayması yerleştirin. Eşkenar dörtgen filtre seti ile donatılmış ters floresan mikroskobu kullanarak kafes diskleri görüntüleyin. 100x büyütmede temsili görüntüler alın.
- 1:1 v/v metanol ve 0.1 M asetik tampon karışımında 180 mg TCEP eriterek 12 mg/mL TCEP çözeltisinin 15 mL'sini hazırlayın.
- Her yıkanmış folyo15 dakika boyunca RT bir shaker üzerinde 1 mL TCEP çözeltisi ile inkübün.
- TAMRA konjuge pepCD47 stokunun (1 mg/mL) – 100 μg/mL, 10 g/mL, 1 μg/mL, 0.1 μg/mL ve 0.01 μg/mL'yi seri olarak seyrelterek aşağıdaki standartları hazırlayın. TCEP çözeltisini dilüent olarak kullanın.
- 544/590 nm uyarma ve emisyon dalga boylarında florimetri tarafından standartlar kullanılarak oluşturulan kalibrasyon eğrisine karşı metal yüzeyinden salınan TAMRA konjuge pepCD47'yi analiz edin.
3. PEI-PDT modifiye yüzeylere insan pepCD47 takmak
- PeI-PDT kaplamalı numuneleri bölüm 1'de açıklandığı gibi, yukarıdaki adım 1.1-1.10'u, gazdan arındırılmış DDW 5x ile yıkayın, şişeyi değiştirin ve gazdan arındırılmış DDW 5x ile yıkayın.
- İnsan pepCD47 stok çözeltisi (1 mg/mL) kurutarak insan pepCD47 tozunu gazsız %50 asetik asiter leyerek konsantrasyon1 mg/mL'yi elde edin.
- İnsan pepCD47 (100 μg/mL) insan pepCD47 stokunun 500 μL'sini 4.500 μL gazsız 1x fosfat tamponlu salin (PBS) içinde eriterek çalışma konsantrasyonu hazırlayın.
- Yıkanmış PEI-PDT kaplı numuneleri 1 saat boyunca titreyerek RT'de 100 μg/mL pepCD47 ile inkübedin.
- Aşağıdaki sırada PBS (3x), DDW (3x), 0.2% Tween-20 (3x, 5 dk her), DDW (3x), şişeleri değiştirmek ve son DDW yıkama fazla peptid kaldırmak için insan pepCD47 kaplı örnekleri yıkayın.
NOT: İnsan pepCD47 kaplamalı yüzeyler 4 °C'de 6 aya kadar kuru olarak saklanabilir.
4. PEI-PDT modifiye edilmiş yüzeylerin karıştırılmış sıra (Scr) ile kaplandırılma
- 1 mg/mL'lik bir stok çözeltisi hazırlamak için çırpılmış sıra tozunu gazdan arındırılmış %0,1 asetik asitte çözün.
- 4.500 μL'lik gaz giderilmiş %0.1 asetik asitin 500 μL'sini eriterek 100 μg/mL'lik çırpılmış peptid çözeltisi hazırlayın.
- Yıkanmış PEI-PDT numunelerini RT'de 1 00 0g/mL'lik çırpılmış peptid ile 1 saat sallayarak katın.
- Bekar çırpılmış peptidkaldırmak için, aşağıdaki sırayla yüzeyleri yıkayın 0.01% asetik asit (3x), DDW (3x), 0.2% Tween-20 (3x, 5 dk), DDW (3x), şişeleri değiştirmek ve bir DDW yıkama.
5. Metal yüzeylere hücresel bağlanmayı analiz etmek için Chandler döngüsü
- Kat metal folyolar (0.65 cm x 1cm) ya insan pepCD47 veya 3 veya 4 takip bölüm 1 açıklamasına göre çırpılmış peptid ile.
- Üç 38 cm uzunluğunda parçalar halinde 1/4 "PVC tüpler kesin.
- Üç farklı tüpe 8 adete kadar değiştirilmemiş, karıştırılmış peptid veya pepCD47 modifiye edilmiş metal folyo yerleştirin.
- Kurumsal IRB protokolü uyarınca herhangi bir anti-trombosit ilaç ücretsiz sağlıklı insan donörlerden kan 30 mL toplamak. Toplanan kanın pıhtılaşmasını önlemek için 1 mL%4 sodyum sitrat içeren şırınganın önceden yüklenmesi.
- 10 mL şırınga kullanarak her tüpe 10 mL kan koyun ve uçları metal adaptörlerle bağlayın. Chandler döngü aparatının tekerleklerine kan dolu tüpler yerleştirin.
- 4 saat boyunca 25 dyns/cm2 makası üretmek için hesaplanan hızda 37 °C'de tekerlek rotasyonu ile metal folyolar boyunca kan geçirin.
- Tüplerden kan drenaj ve IRB gereksinimlerine göre kan atmak.
- Her tüpten folyo almak için neşter kullanarak tüpleri kesin.
- 0,1 M sodyum klorür ile 10 mL sodyum kacodylate tampon kullanarak% 4 glutaraldehit çözeltisi 10 ml seyrelterek% 2 glutaraldehit çözeltisi hazırlayın.
- Folyoları 15 dakika boyunca %2 glutaraldehit çözeltisi içinde kuluçkaya yatırın ve gece boyunca 4 °C'de saklayın. Analiz etmeden önce metal folyoları PBS ile 3x yıkayın.
6. CFDA boya kullanarak metal yüzeylere hücresel bağlanmanın analizi
- 37 °C'ye ayarlanmış bir su banyosunda 15 mL tüpte 8 mL PBS Sıcak.
- 10 mM'lik stok konsantrasyonu elde etmek için CFDA (karboksi-floresan disetat, succinimidyl ester) boya çözeltisini hazırlayın - 10 mM'lik bir stok konsantrasyonu elde etmek için bir CFDA boya şişesine 90 μL DMSO ekleyin. Daha sonra, 8 mL sıcak PBS'ye CFDA stokunun 75 μL'sini ekleyerek 93,75 μM'lik çalışma konsantrasyonuna hazırlayın. Tüpleri birkaç kez ters çevirerek karıştırın ve tüpü alüminyum folyo ile kaplayın.
NOT: CfDA boyasını her kullanımdan önce taze olarak hazırlamak tavsiye edilir. - Her folyoyu 24 kuyu plakalı 1 mL CFDA boya ile kuluçkaya yatırın. Plakayı alüminyum folyo ile kaplayın ve 37 °C'de 15 dakika kuluçkaya yatırın.
- Fazla boyayı çıkarmak için metal folyoları 3x PBS ile yıkayın. Ters floresan mikroskobu kullanarak görüntü.
7. PepCD47-modifiye edilmiş ve çıplak metal yüzeylerde monosit eki ve makrofaj genleşmesi
- 400-450 g erkek Sprague-Dawley sıçan kurban sırasında vena kava erişim yoluyla periferik kan 10 mL toplamak. Pıhtılaşmayı önlemek için hemen 1.000 IU sodyum heparin ile karıştırın.
- Pipet 10 mL yoğunluk gradyan orta 50 mL konik tüp içine. Pasteur pipeti kullanarak kanı 5 mL PBS ile karıştırın ve yoğunluk gradyan ortamının üzerinde dikkatlice seyreltilmiş kanı katlayın. 800 x g ve 18-25 °C'de 20 dk hızlanma ve yavaşlama ayarlarıyla sallanan kova rotorunda santrifüj.
- Pasteur pipeti kullanarak, plazma ve Ficoll arasındaki arayüz üzerinde buffy ceket opak bir tabaka toplamak. Seyreltik buffy kat 1:3 PBS ve santrifüj ile 550 x g ve 4 ° C için 10 dakika buffy kat hücreleri için.
- Kontamine eritrositleri lyse için 3 mL ACK lysis tamponundaki buffy coat hücrelerini yeniden askıya alın. 4 dakika buz üzerinde kuluçka. Hücre ayırma tamponunun 12 mL'sini ekleyin (CSB; %0.5 BSA, %0.5 FBS, 2 mM EDTA/PBS).
- Santrifüj 550 x g ve 4 °C 10 dakika. CSB'nin 10 mL'lik peletini yeniden askıya alın.
- Trombositleri ortadan kaldırmak için 10 dk için 200 x g ve 4 °C'de santrifüj. İki kez tekrarlayın.
- 500 μL CSB'de peleti yeniden askıya alın. Aşağıdaki fare anti-sıçan antikorlarının her biri 10 μg ekleyin: CD8a (klon OX-8), anti-CD5 (klon OX-19), anti-CD45RA (klon OX-33), ve anti-CD6 (klon OX-52).
- 1 saat boyunca dikey bir tüp rotatörü üzerinde 4 °C'de kuluçkaya yatırın. Santrifüj 300 x g ve 4 °C 10 dakika. Supernatant atın, CSB 10 mL pelet yeniden askıya ve tekrar santrifüj.
- 500 μL CSB'de peleti yeniden askıya alın. Keçi anti-fare IgG mikroboncuklar 150 μL ekleyin. 20 dk. CSB 9,5 mL ekleyin dikey bir tüp rotator üzerinde 4 °C'de kuluçka. Santrifüj 300 x g ve 4 °C 10 dakika.
- Supernatant atın. CSB'nin 1 mL'lik peletini yeniden askıya alın.
- Manyetik ayırıcıya bir LS sütunu yerleştirin. 3 mL CSB ile LS sütununa asal. Sütun masını atın. Adım 7.10 yeniden askıya hücre pelet 1 mL ekleyin. Elde edilen işeyin isini toplamaya başlayın. Akış durduktan sonra, 5 mL CSB ekleyin ve akış durana kadar sütun çıkışını toplamaya devam edin.
- Negatif olarak seçilmiş monositleri içeren kolon çıkışını (6 mL) 300 x g ve 4 °C'de 10 dakika santrifüj edin. RPMI-1640 orta 2 mL ortaya çıkan küçük pelet yeniden askıya 10% FCS, 1% kalem / strep ve 100 ng / mL sıçan makrofaj koloni uyarıcı faktör (M-CSF) ile desteklenmektedir.
- Hemositometre kullanarak monositleri say. Monosit konsantrasyonu 5 x 105 hücre/mL olarak ayarlayın.
- 1.1-1.10 ve 3.1-3.6 uyarınca fare pepCD47 (N=3) ile modifiye edilmiş çıplak paslanmaz çelik folyo numuneleri (N=3) veya paslanmaz çelik numuneleri ile 12 kuyu plakasının bireysel kuyularına 1 mL monosit süspansiyon ekleyin.
- 3 ve 5 gün sonra tohumlama orta değiştirin. Gün 6 post-tohumlama PBS ile hücreleri yıkayın ve 15 dakika oda sıcaklığında% 4 paraformaldehit ile düzeltmek. 5 dakika PBS ile iki kez yıkayın.
- Paslanmaz çelik folyoları çıkarın ve yeni bir 12 kuyu plaka içine ayrı ayrı yerleştirin. Folyoları çevirmeyin.
- Hücreleri permeabilize etmek için 15 dakika için% 0.5 Tween-20/PBS inkübat. 5 dakika PBS ile iki kez yıkayın.
- 20 dk için % 10 keçi serumu/PBS blok. Serumu aspire edin. Yıkamayın. Fare anti-rat CD68 antikor (seyreltilmiş 1:100% 1 BSA / PBS) ekleyin. 1 saat oda sıcaklığında kuluçka. Her biri 5 dakika boyunca PBS'de 3 x yıkayın.
- Keçi anti-fare IgG Alexa Fluor 546 (seyreltilmiş 1:200% 1 BSA / PBS) ekleyin. 45 dakika oda sıcaklığında karanlıkta kuluçka. 5 dakika PBS'de yıkayın. 10 dakika oda sıcaklığında karanlıkta 1 μg/mL Hoechst 33342 boya ile karşı lekesi. Her biri 5 dakika boyunca PBS'de 3 x yıkayın.
- Ters optik ile floresan mikroskop kullanarak folyo ve görüntü çevirin. Mavi ve kırmızı filtre ayarlarıyla 200x büyütmede görüntüleri yakalayın.
- Tek tek görüntülerdeki ekli monositleri sayın ve grup ortalamalarını ve standart sapmaları hesapla.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Metal yüzeyler, Şekil 1'degösterildiği gibi bir dizi kimyasal modifikasyon yoluyla peptit eki için tiyol-reaktif hale getirilir. PEI-PDT tedavisinin ardından PABT kuluçka makinesi metal yüzeyini peptit eki için uygun hale getirir. C-terminus'ta sistein kalıntısı içeren peptid CD47 (pepCD47) esnek bir çift AEEAc köprüsü ile çekirdek pepCD47 dizisine katıldı ve disülfür bağları ile tiyol-reaktif yüzeylere kovalent olarak bağlıdır. Bu protokolü kullanarak, pepCD47'nin metal yüzeye altı aya kadar bağlı kaldığını ve normal fizyolojik kesme stresine ve sterilizasyon prosedürlerine dayanabileceğini gösterdik17.
Maksimum peptit retansiyonu, tamra konjuge pepCD47'nin metal yüzeyine eklenmesi ve ardından kovalent bağlı olmayan peptidin ortadan kaldırılması için kapsamlı yıkama, tamra-pepCD47'nin dekoltesinin disülfür köprülerinin yüzeye indirilmesi ve florimetrik bir test kullanılarak analitik nicelleştirme ile belirlendi. Özellikle, TAMRA konjuge pepD47 (1 mL 10 - 200 μg/mL çözeltisi) artan giriş miktarları PEI-PDT kaplı yüzeylere eklenmiş ve kovalent bağlı olmayan peptidi çıkarmak için birkaç kez yıkanmış. Kovalent bağlı TAMRA konjuge pepCD47 konsantrasyonu kovalent bağlı peptid serbest bırakmak için bir azaltıcı ajan TCEP kullanılarak ve standartlara karşı floresan değerlendirilmesi ile belirlendi. 10, 30, 100 ve 200 μg/mL'lik giriş konsantrasyonu, sırasıyla 28 ± 2, 78 ± 2, 182 ± 14 ve 157 ± 25 ng/cm2 peptit retansiyonu gösterdi(Şekil 2). Böylece metal yüzeyindepepCD47'nin maksimal hareketsizlik yoğunluğunun yaklaşık 180 ng/cm2 olduğu ve 100 μg/mL giriş konsantrasyonu ile elde edildiği saptandı. PABT/PEI-PDT modifiye metal yüzeylerde TAMRA konjuge pepCD47'nin uygun immobilizasyonu, TAMRA konjuge pepCD47-işlenmiş örgü disklerin yüzeyinden yayılan tek tip floresan gösteren floresan mikroskopi(Şekil 3)ile daha da doğrulandı (Şekil 3A). PABT/PEI-PDT modifikasyonundan yoksun kontrol meshes yüzeyinde sadece minimal floresan tespit edildi(Şekil 3B),bu nedenle floresan ana kaynağı olarak özel olarak bağlı olmayan TAMRA konjuge pepCD47 hariç.
Daha sonra pepCD47 kaplamalı yüzeylerin, modifiye edilmemiş ve karıştırılmış sıra peptid modifiye edilmiş yüzeylere göre akut kan yoluyla bulaşan hücre bağlanmasını önleme yeteneğini değerlendirdik. Scramble peptid pepCD47 aynı amino asit bileşimi vardır ama farklı bir sırada14,17. Kandan bulaşan hücre eki, kullanılmayan, karıştırılmış ve pepCD47 modifiye edilmiş yüzeylerde, kullanılmayan hücreleri, fiksasyonu ve CFDA boyasıyla boyama yıkayarak sağlıklı insan gönüllülerden gelen kan rotasyonu ile değerlendirildi. Yüzeyler floresan mikroskopi ile görselleştirildi. Daha önce yayınlanmış verilerimizle tutarlı14,17 pepCD47 kaplamalı yüzeyler, karıştırılmış modifiye edilmiş ve değiştirilmemiş kontrollere kıyasla kan yoluyla bulaşan hücre ekinde ciddi bir azalma göstermektedir(Şekil 4).
PepCD47 yüzey modifikasyonunun inflamatuar hücre eki ve proliferasyon üzerindeki etkilerini genişletmek için, monositleri izole etmek için fare soytarı kat hücrelerinin negatif immünoseçimini kullandık19, ve m-CSF varlığında 6 gün boyunca çıplak metal ve pepCD47 modifiye paslanmaz çelik folyolar üzerinde izole monositler kültürlü. Bu çalışmanın sonuçları, akut monosit ekinin kombine %58 oranında azaldığını, makrofajlara fenotipik dönüşümlerini ve pepCD47 fonksiyonel yüzeylerde makrofaj proliferasyonunu(Şekil 5A)çıplak metal kontrollere göre göstermektedir(Şekil 5 B,C).
Şekil 1: PepCD47'nin metal yüzeylere ekilmesinde yer alan adımların şematik gösterimi. (A) Temiz metal numuneleri metal yüzeyini oksitlemek için 220 °C'de pişirildi. Gizli tiyol grupları (PABT) ile polallilin bifosfonat bifosfonat grupları metal oksitler ile koordinat bağları oluşturdu ve fonksiyonel bir monolayer oluşturmak için metal yüzeyleri kaplama. PABT kaplamalı metal yüzeyler, tiyol gruplarının korunması için TCEP ile daha fazla işlem gördü. (B) PEI-PDT'nin yapısı ve sembolik temsili. (C) PABT kaplamalı ve TCEP azaltılmış yüzeyler, tiolated peptid eki için mevcut olan tiyol-reaktif grupların toplam sayısını artıran PEI-PDT ile tedavi edildi. Son olarak, PEI-PDT kaplamalı yüzeyler pepCD47 terminal sistein grupları ile reaksiyona girdi ve peptid disülfür bağları ile yüzeye bağlandı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Metal yüzeyde pepCD47'nin hareketsizlik yoğunluğunun belirlenmesi. 1 cm x 1cm metal folyolar florofor konjuge pepCD47 artan konsantrasyonları (10, 30, 100 ve 200 μg/mL) kullanılarak değiştirildi. Aşırı peptid birkaç yıkama adımları kullanılarak çıkarıldı sonra florofor konjuge florofor cleave 1 mL TCEP çözeltisi ile tedavi edildi. Metal yüzeyine kovalent olarak bağlı peptit konsantrasyonu florofor konjuge pepCD47 tanımlanmış konsantrasyonları ile hazırlanan standart bir eğri kullanılarak florimetrik olarak analiz edildi. Hareketsizlik yoğunluğu metal yüzeye bağlı peptidng/cm² olarak temsil edildi. Veriler sem ± ortalama olarak ifade edilir ve en az üç bağımsız deneyi temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: TAMRA konjuge pepCD47 ile modifiye paslanmaz çelik yüzeyin floresan mikroskopi görüntüleme. Paslanmaz çelik kafes diskler, ardışık PABT ile modifiye, TCEP, PEI-PDT (A) veya değiştirilmemiş (B) TAMRA konjuge pepCD47 ile tepki verildi. Düzgün konjuge ve kontrol çıplak metal meshes kapsamlı yıkanmış ve 100x büyütme görüntülenmiştir. Ölçek çubuğu uzunluğu 100 μm'dir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: PepCD47'nin akut anti-inflamatuar ve antitrombotik fonksiyonlarının değerlendirilmesi. 0.65 cm x 1cm metal folyolar 100 μg/mL insan pepCD47 veya şifreli peptid ile kaplandı ve Chandler döngü aparatında kana maruz kaldı. Bağlanmamış hücreler PBS ile yıkanarak çıkarıldı ve folyolar %2 glutaraldehit ile sabitlendi. Değiştirilmemiş, karıştırılmış modifiye edilmiş ve insan pepCD47 modifiye edilmiş yüzeyler cfda boya ile 37 °C'de 15 dakika kuluçkaya yatırıldı, PBS ile yıkandı ve floresan mikroskop kullanılarak analiz edildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Çıplak ve pepCD47-fonksiyonel metal yüzeylerde CD68-pozitif makrofajların yaygınlığı. Sıçan periferik kan türetilmiş monositler degrade yoğunluk santrifüjü ile izole edildi ve ardından manyetik mikroboncuklar ile negatif immünoseçimi yapıldı. 5 x 105 monositler 12 kuyuluk tabakasının kuyularına tek tek yerleştirilen çıplak metal folyo numuneleri (N=3) veya sıçan pepCD47 ile türemiş numuneler eklenmiştir. Makrofaj farklılaşması 100 ng/ml M-CSF ile uyarıldı. Altı gün sonra hücreleri sabit edildi ve anti-sıçan CD68 antikor, ikincil Alexa Fluor-546 (kırmızı) konjuge antikor ve Hoechst 33342 nükleer boya (mavi) ile sayaçlı ile immünolekeli edildi. Çıplak metal(A)ve pepCD47-fonksiyonel (B)yüzeylerinin temsili görüntüleri 200x büyütme de yakalanarak birleştirilmiştir. Ölçek çubuğu uzunluğu 100 μm'dir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Biz göstermek ve kanda bulunan inflamatuar hücreler ile yüzeyin reaktivitesini azaltmak için kapsamlı amacı ile paslanmaz çelik bir yüzeye terapötik peptid moieties eklemek için nispeten yeni bir kimyasal strateji açıklar. Burada açıklanan bifosfonat kimyası, metal oksitler ve PABT'nin bifosfonat grupları arasındaki koordinat bağı oluşumunu içerir. Metal yüzeyde oluşan polibisfosfonat monolayer kalınlığı 5 nm18aşmaz, ve bu nedenle, kalın polimer kaplamaların potansiyel proinflamatuar etkileri için önemsiz20. PABT'nin alifatik yan zincirlerinde gizli tiyol grubunun korunması, tiyol-reaktif bileşiklerle daha fazla kimyasal modifikasyon için metal yüzeyleri asalhale alır. PEI-PDT, etilenin bağlantılarının ~%20'sinin tiyol-reaktif piriyyldithio grupları ile değiştirildiği dallı polietileninin (ortalama Mw=25,000) olduğunu. PEI-PDT PDT gruplarının sadece bir azınlık PABT türetilmiş tiyolile reaksiyon tüketilen bu yana, PEI-PDT tethering sonra yüzey kimyası tiyol-reaktif tiyol-reaktif tiyol-reaktif için tiyol-reaktif olarak değiştirilmiş tiroitler18. Bu kimyasal strateji, laboratuarımızda rekombinant proteinler14, peptidler 14,17ve viral gen vektörleri1718 metal yüzeyine ek olarak geliştirildi ve yaygın olarak kullanıldı. Her ne kadar, çalışmalarımızın çoğu için paslanmaz çelik yüzeyler kullanmış olsa da, PABT diğer metal alaşımları ile etkileşime girebilirsiniz21 ve böylece metalik biyomalzemelerin geniş bir yelpazede biyouyumluluk ve tedavi potansiyelini geliştirmek için potansiyele sahiptir.
Mevcut metodolojimiz, metal yüzeylerde florofor konjuge pepCD47 maksimum immobilizasyon yoğunluğu 180 ng / cm2olduğunu gösterir , hangi bizim daha önce yayınlanan veri17göre daha azdır. Bu tutarsızlığı her iki çalışmada da kullanılan farklı yıkama stratejilerine bağlılıyoruz. Mevcut protokolümüzde kovalent bağlı olmayan peptidleri ilk çalışmalarımızda kullanılan Tween-20'ye göre tamamen ortadan kaldıran SDS kullanılmıştır. Ancak, 180 ng/cm2 pepCD47'nin yaklaşık 4 x 106 molekül/μm2'sine karşılık gelir. Bu hareketsizlik yoğunluğu yaklaşık 390 molekül/μm2,22olan hücre yüzeylerindeki CD47'nin fizyolojik seviyelerinden çok daha yüksektir. Bu nedenle, sıkı yıkama koşullarının pepCD47 modifiye metal yüzeylerin anti-inflamatuar özelliklerini önemli ölçüde etkilemeyeceğini öngörüyoruz.
PepCD47'nin metale bağlanmasının bu metodolojisi son derece tekrarlanabilir, ancak protokolde dikkatli dikkat gerektiren birkaç adım vardır. İlk olarak, PABT ile metal yüzey kaplama ve TCEP kullanılarak azaltarak sonra, tiols havaya maruz kaldığında oksidasyon eğilimli. Bu nedenle, yüzeylerin her zaman gazdan arındırılmış suya batırılmış olması son derece önemlidir. Pei-PDT çözeltisi gazdan arındırılmış suda yapılır ve PEI-PDT ile kaplanmış folyoların kuluçka sırasında şişelere argon eklenir. İkinci olarak, bir çözünürpeptid peptidlerin yağış potansiyeli göz önünde bulundurulmalıdır. PepCD47'de terminal sistein kalıntısının yanı sıra sırasistein kalıntıları da vardır. Bu nedenle, yanlış depolandığında, peptidlerin çözeltinin polimerize edilmesi ve çökeltme olasılığı yüksektir. Bu olası sorunu gidermek için, PEI-PDT kaplamalı yüzeylerde kuluçkadan önce peptidlerin 20 dk ila 1 saat tcep boncuklar kullanılarak azaltılması önerilir. TCEP peptidler azaltmak ve kendi dilüent onların çözünürlüğünü artırmak için yardımcı olacaktır. Pei-PDT kaplı numuneleri tiyal peptid ile kuluçkaya yatırırken, ortam havasının şişelerde argon ile yer değiştirmesi de tavsiye edilir.
Yukarıda belirtilen önlemlere uyulması halinde, kaplama tekniği tekrarlanabilir ve bu yaklaşım için tek potansiyel sınırlama reaktifler PABT ve PEI-PDT'nin ticari olarak bulunamamasıdır.
Biz kan hücreleri ile pepCD47 modifiye metal yüzeylerin etkileşimini anlamak için kavram analizi ex vivo kanıtı sağlamak için bir Chandler döngü aparatı kullanılan ve başarıyla pepCD47 kaplamalı yüzeylerin anti-inflamatuar özelliklerini göstermek için laboratuarımız tarafından kullanılmıştır14,15,17,23. Bu çalışmada, boyanın asetat grupları hücre içi esteraz tarafından ayrılınca hücrelere girdikten sonra floresan olan CFDA boyasını kullandık. Bu boyama işleminin yararları, lökositler gibi çekirdekli hücreler lezkositler gibi ekinasyonlu trombositler ve kırmızı kan hücreleri lekeleri vardır. Böylece CFDA boyasının kullanılması pepCD47 kaplamalı yüzeylerin hem akut anti-trombotik hem de yapışkanlı özelliklerinin değerlendirilmesini sağlar. Daha ayrıntılı değerlendirme tarama elektron mikroskobu ve / veya immünboyama yoluyla elde edilebilir, her ikisi de daha önce ayrıntılı24. Mevcut çalışmanın sonuçları, insan pepCD47 kaplamalı metal yüzeylerin değiştirilmemiş ve karıştırılmış sıra kontrollerine kıyasla anti-trombotik ve yapışkan olduğunu doğrular.
PepCD47 modifiye edilmiş yüzeylerin bağlı inflamatuar hücrelerin büyüme özelliklerini değiştirip değiştirmediğini araştırmak için, pepCD47 ile formüle edilmiş çıplak metal paslanmaz çelik folyolar veya folyolar syngeneic M-CSF varlığında izole sıçan monositlerine maruz kalmıştır. Hücreler, fenotipik dönüşüm ve makrofajların genişlemesine izin vermek için 6 gün boyunca sabit koşullar altında kültürlendi. Farklı deneysel ortamlarda gözlenen önceki sonuçlarımıza uygun olarak14,pepCD47 fonksiyonel yüzeylerde inflamatuar hücre sayısının derin bir azalma mevcut çalışmada gösterilmiştir.
Bu nedenle, çalışmalarımız sonuçta pepCD47 ile metal kaplama için yeni polibisfosfonat kimya metal yüzeylerin biyouyumluluğu artırmak için etkili bir yol olduğunu ve yapay eklemler gibi diğer biyomedikal uygulamalarda uygulanabilir kanıtlamak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu makalede sunulan protokol geliştirme ve çalışmalar NIH (NBIB) R01 finansmanı (# EB023921) tarafından IF ve SJS'e, NIH (NHLBI) R01 finansmanı (# HL137762) ile IF ve RJL'ye desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 M Tris-HCL | Invitrogen | 15567-027 | pH - 7.5 |
| 4% Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16539-07 | |
| 4% Sodium Citrate | Sigma | S5770 | |
| ACK lysing buffer | Quality Biologicals | 118-156-721 | |
| anti-CD45RA Ab (mouse anti-rat; clone OX-19) | Biolegend | 202301 | |
| anti-CD5 Ab (mouse anti-rat; clone OX-19) | Biolegend | 203501 | |
| anti-CD6 Ab (mouse anti-rat; clone OX-52) | BD Biosciences | 550979 | |
| anti-CD68 Ab (mouse anti-rat; clone ED-1) | BioRad | MCA341 | |
| anti-CD8a Ab (mouse anti-rat; clone OX-8) | Biolegend | 201701 | |
| Chloroform Certified ACS | Fisher Chemical | C298-500 | |
| Dimethyl Formammide (DMF) | Alfa Aesar | 39117 | |
| Embra stainless steel grid | Electron Microscopy Sciences | E200-SS | stainless steel mesh mesh disks |
| Ficoll Hypaque | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| Glacial acetic acid | ACROS organic | 148930025 | |
| goat anti-mouse IgG Alexa Fluor | ThermoFisher | A11030 | |
| Heparin sodium | Sagent Pharmaceuticals | 402-01 | |
| Human pepCD47 | Bachem | 4099101 | |
| Isopropanol | Fisher Chemical | A426P-4 | |
| Metal adapters | Leur Fitting | 6515IND | 1 way adapter 316 ss 1/4"-5/16" hoes end |
| Methanol | RICCA chemical company | 4829-32 | |
| Microscope | Nikon Eclipse | TE300 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | 14190-136 | |
| Pottasium Bicarbonate (KHCO3) | Fisher Chemical | P184-500 | |
| PVC tubes | Terumo-CVS | 60050 | 1/4" X 1/16 8' |
| sodium cacodylate buffer with 0.1M sodium chloride | Electron Microscopy Sciences | 11653 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Bio-Rad laboratories | 161-0302 | |
| Sodum actetate (C2H3NaO2) | Alfa Aesar | A13184 | |
| Src peptide | Bachem | 4092599 | |
| Stainless steel (AISI 304) cylinder-shaped samples with a lumen | Microgroup, Medway, MA | 20097328 | 1 cm X 6 mm OD |
| Stainless steel foils (AISI 316L) | Goodfellow, Coraopolis, PA | 100 mm X 100 mm X 0.05 mm | |
| Tetramethylrhodamine-conjugated pepCD47 (TAMRA-pepCD47) | Bachem | 4100277 | |
| TMB (3,3’ ,5,5’ -tetramethylbenzidine) substrate and tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride (TCEP) | Thermo Scientific | PG82089 | |
| Tween-20 | Bio-Rad laboratories | 170-6531 | |
| Vybrant CFDA SE Cell Tracer Kit | Invitrogen | V12883 |
References
- Buccheri, D., Piraino, D., Andolina, G., Cortese, B. Understanding and managing in-stent restenosis: a review of clinical data, from pathogenesis to treatment. Journal Thoracic Disease. 8 (10), 1150-1162 (2016).
- van Oeveren, W.
- Mitra, A. K., Agrawal, D. K. In stent restenosis: bane of the stent era. Journal of Clinical Pathology. 59 (3), 232-239 (2006).
- Iqbal, J., Gunn, J., Serruys, P. W. Coronary stents: historical development, current status and future directions. British Medical Bulletin. 106, 193-211 (2013).
- Hoffmann, R., et al. Patterns and mechanisms of in-stent restenosis. A serial intravascular ultrasound study. Circulation. 94 (6), 1247-1254 (1996).
- Stefanini, G. G., Windecker, S. Stent thrombosis: no longer an issue with newer-generation drug-eluting stents. Circulation: Cardiovascular Interventions. 5 (3), 332-335 (2012).
- Palmerini, T., et al. Clinical outcomes with bioabsorbable polymer- versus durable polymer-based drug-eluting and bare-metal stents: evidence from a comprehensive network meta-analysis. Journal of the American College of Cardiology. 63 (4), 299-307 (2014).
- Omar, W. A., Kumbhani, D. J. The Current Literature on Bioabsorbable Stents: a Review. Current Atherosclerosis Reports. 21 (12), 54 (2019).
- Slee, J. B., Christian, A. J., Levy, R. J., Stachelek, S. J. Addressing the Inflammatory Response to Clinically Relevant Polymers by Manipulating the Host Response Using ITIM Domain-Containing Receptors. Polymers (Basel). 6 (10), 2526-2551 (2014).
- Oldenborg, P. A., et al. Role of CD47 as a marker of self on red blood cells. Science. 288 (5473), 2051-2054 (2000).
- vanden Berg, T. K., vander Schoot, C. E. Innate immune 'self' recognition: a role for CD47-SIRPalpha interactions in hematopoietic stem cell transplantation. Trends in Immunology. 29 (5), 203-206 (2008).
- Tengood, J. E., Levy, R. J., Stachelek, S. J. The use of CD47-modified biomaterials to mitigate the immune response. Experimental Biology Medicine (Maywood). 241 (10), 1033-1041 (2016).
- Tsai, R. K., Rodriguez, P. L., Discher, D. E. Self inhibition of phagocytosis: the affinity of 'marker of self' CD47 for SIRPalpha dictates potency of inhibition but only at low expression levels. Blood Cells, Molecules and Diseases. 45 (1), 67-74 (2010).
- Slee, J. B., et al. Enhanced biocompatibility of CD47-functionalized vascular stents. Biomaterials. 87, 82-92 (2016).
- Finley, M. J., et al. Diminished adhesion and activation of platelets and neutrophils with CD47 functionalized blood contacting surfaces. Biomaterials. 33 (24), 5803-5811 (2012).
- Stachelek, S. J., et al. The effect of CD47 modified polymer surfaces on inflammatory cell attachment and activation. Biomaterials. 32 (19), 4317-4326 (2011).
- Inamdar, V. V., et al. Stability and bioactivity of pepCD47 attachment on stainless steel surfaces. Acta Biomaterialia. 104, 231-240 (2020).
- Fishbein, I., et al. Local delivery of gene vectors from bare-metal stents by use of a biodegradable synthetic complex inhibits in-stent restenosis in rat carotid arteries. Circulation. 117 (16), 2096-2103 (2008).
- Moser, K. V., Humpel, C. Primary rat monocytes migrate through a BCEC-monolayer and express microglia-markers at the basolateral side. Brain Research Bulletin. 74 (5), 336-343 (2007).
- vander Giessen, W. J., et al. Marked inflammatory sequelae to implantation of biodegradable and nonbiodegradable polymers in porcine coronary arteries. Circulation. 94 (7), 1690-1697 (1996).
- Fishbein, I., et al. Bisphosphonate-mediated gene vector delivery from the metal surfaces of stents. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (1), 159-164 (2006).
- Mouro-Chanteloup, I., et al. Evidence that the red cell skeleton protein 4.2 interacts with the Rh membrane complex member CD47. Blood. 101 (1), 338-344 (2003).
- Finley, M. J., Clark, K. A., Alferiev, I. S., Levy, R. J., Stachelek, S. J. Intracellular signaling mechanisms associated with CD47 modified surfaces. Biomaterials. 34 (34), 8640-8649 (2013).
- Slee, J. B., Alferiev, I. S., Levy, R. J., Stachelek, S. J. The use of the ex vivo Chandler Loop Apparatus to assess the biocompatibility of modified polymeric blood conduits. Journal of Visualized Experiments. (90), e51871 (2014).
