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Medicine

सोडियम टॉरोकोलेट प्रेरित गंभीर तीव्र अग्नाशयशोथ C57BL/

Published: June 28, 2021 doi: 10.3791/61547
Automatic Translation
*1, *1, *1, *1, *1
1Discipline of Clinical Emergencies, Department of Clinical Medicine, HCFMUSP / LIM 51, University of São Paulo Medical School
* These authors contributed equally

Summary

गंभीर तीव्र अग्नाशयशोथ के लिए पशु मॉडल प्रारंभिक चरण में pathophysiological परिवर्तनों के अध्ययन को सक्षम करते हैं, जो भड़काऊ घटनाओं के विकास के अवलोकन की सुविधा प्रदान करते हैं। यहां हम एनेस्थेटिक C57BL / 6 चूहों के अग्नाशय वाहिनी में सोडियम टॉरोकोलेट के प्रतिगामी जलसेक द्वारा गंभीर तीव्र पित्त अग्नाशयशोथ के प्रेरण के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं।

Abstract

सोडियम टॉरोकोलेट जलसेक द्वारा पित्त तीव्र अग्नाशयशोथ प्रेरण का व्यापक रूप से उपयोग किया गया है, जिसका उपयोग वैज्ञानिक समुदाय द्वारा मानव नैदानिक स्थिति के प्रतिनिधित्व और नैदानिक पित्त अग्नाशयशोथ की शुरुआत के अनुरूप भड़काऊ घटनाओं के प्रजनन के कारण किया गया है। अग्नाशय की क्षति की गंभीरता का आकलन संक्रमित पित्त एसिड की एकाग्रता, गति और मात्रा को मापकर किया जा सकता है। यह अध्ययन प्रोटोकॉल प्रजनन में उपयोग की जाने वाली सामग्रियों और विधियों की एक अद्यतन चेकलिस्ट प्रदान करता है और इस तीव्र अग्नाशयशोथ (एपी) मॉडल के मुख्य परिणामों को दिखाता है। पिछले प्रकाशनों में से अधिकांश ने चूहों में इस मॉडल को पुन: प्रस्तुत करने के लिए खुद को सीमित कर लिया है। हमने चूहों में इस विधि को लागू किया है, जो अतिरिक्त लाभ प्रदान करता है (यानी, चूहों के आनुवंशिक रूप से संशोधित उपभेदों के साथ काम करने की संभावना के साथ-साथ इन जानवरों के लिए अभिकर्मकों और एंटीबॉडी के शस्त्रागार की उपलब्धता) जो अध्ययन के लिए प्रासंगिक हो सकता है। चूहों में तीव्र अग्नाशयशोथ प्रेरण के लिए, हम एक व्यवस्थित प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं, जिसमें C57BL / 6 चूहों में 3 मिनट के लिए जलसेक गति 10 μL / मिनट पर 2.5% सोडियम टॉरोकोलेट की परिभाषित खुराक होती है जो प्रेरण के 12 घंटे के भीतर गंभीरता के अपने अधिकतम स्तर तक पहुंचती है और परिणामों के साथ परिणामों को उजागर करती है जो विधि को मान्य करती है। अभ्यास और तकनीक के साथ, कुल अनुमानित समय, संज्ञाहरण के प्रेरण से जलसेक के पूरा होने तक, प्रति जानवर 25 मिनट है।

Introduction

मनुष्यों में, पित्त पथरी की उपस्थिति कोलेडोकल के टर्मिनल भाग की बाधा के कारण अग्नाशयशोथ का सबसे आम कारण है, अग्नाशय के स्राव के प्रवाह को बाधित करती है और अग्न्याशय में एक तीव्र भड़काऊ प्रक्रिया का कारण बनती है, सीरम और भड़काऊ मध्यस्थों में पाचन एंजाइमों की एकाग्रता में वृद्धि के साथ1,2।

तीव्र अग्नाशयशोथ (एपी) के विकास की व्याख्या करने के लिए दो अलग-अलग सिद्धांतों का प्रस्ताव किया गया है। "सामान्य चैनल" सिद्धांत से पता चलता है कि पित्ताशय की थैली में मौजूद पत्थर डिस्टल सामान्य पित्त नलिका प्रणाली को बाधित करते हैं, जिससे पित्त स्राव अग्नाशयी वाहिनी में प्रतिगामी प्रवाहित हो जाता है। दूसरा सिद्धांत ("डक्ट बाधा" सिद्धांत) से पता चलता है कि अतिरिक्त पित्त पथरी द्वारा अग्नाशयी वाहिनी की रुकावट ग्रहणी में अग्नाशय के स्राव के प्रवाह में रुकावट का कारण बनती है, जिससे डक्टल हाइपरटेंशन 3 होता है। यद्यपि तीव्र पित्त अग्नाशयशोथ का कारण बनने वाले तंत्र पूरी तरह से समझ में नहीं आते हैं, परिणाम एक तीव्र भड़काऊ प्रक्रिया है। पाचन एंजाइम विस्फोट और अग्न्याशय आत्म-पाचन हिस्टोपैथोलॉजिकल परिवर्तनों का कारण बनता है, एसिटिक तरल पदार्थ और सीरम में भड़काऊ साइटोकिन्स (आईएल -1 π, आईएल -6, टीएनएफ-α) में वृद्धि, और तीव्र चरण प्रोटीन 4,5,6 में वृद्धि।

गंभीर तीव्र अग्नाशयशोथ एक ऐसी स्थिति है जो कई अंगों की भागीदारी और एक उच्च मृत्यु दर जोखिम के कारण नैदानिक ध्यान देने योग्य है। तीव्र अग्नाशयशोथ (एपी) के प्रजनन के लिए पशु मॉडल महत्वपूर्ण हैं क्योंकि ये रोग के pathophysiological तंत्र की व्याख्या करते हैं और बीमारी के प्रारंभिक चरणों से शुरू होने वाली भड़काऊ घटनाओं के विकास की निगरानी करने में मदद करते हैं। यह आमतौर पर क्लिनिक 2,7 में संभव नहीं है। इसके अलावा, अग्नाशय के ऊतकों तक पहुंच प्रीक्लिनिकल अध्ययनों में आसान है, जो आइसोजेनिक प्रजातियों के साथ काम करने की संभावना के साथ-साथ नैदानिक स्थितियों से जुड़े परिवर्तनों की व्याख्या के पक्ष में है, अवांछनीय चर को खत्म कर रही है, और मानव स्थिति में देखे गए परिणामों के साथ नैदानिक समानता को प्रतिबिंबित करती है।

चूहों और चूहों की प्रजातियों में तीव्र अग्नाशयशोथ के प्रेरण के लिए पित्त और गैर-पित्त मॉडल का अक्सर वैज्ञानिक साहित्य में अध्ययन किया गया है। प्रेरण के गैर-पित्त विधियों में कोलेसिस्टोकिन स्रावितागॉग या इसके एनालॉग सेरूलिन 10 की सुपरमैक्सिमल उत्तेजक खुराक का प्रशासन शामिल है; एल-आर्जिनिन की लगभग घातक खुराक का प्रशासन; या एथिओनिन 11 के साथ पूरक एक कोलीन-कमी वाले आहार का प्रशासन। यद्यपि इन तरीकों को पुन: उत्पन्न करना आसान है और इसके परिणामस्वरूप अग्नाशय की सूजन होती है, वे उन तंत्रों को दोहराते नहीं हैं जो सिद्धांत रूप में एपी को ट्रिगर करते हैं (यानी, अग्नाशय की नली में पित्त स्राव का भाटा)। पित्त मॉडल को संबोधित करने वाली तकनीक अग्नाशयी वाहिनी में पित्त एसिड के प्रतिगामी जलसेक पर आधारित है और इस प्रोटोकॉल को पूरा करने के लिए अच्छी तरह से प्रशिक्षित शोधकर्ताओं की आवश्यकता होती है। चूहों में इस विधि का उपयोग करके कई अध्ययन प्रकाशित किए गए हैं (जाहिरा तौर पर तकनीकी कारणों से क्योंकि इन प्रयोगों में सर्जिकल प्रक्रियाएं शामिल हैं)12,13। हालांकि, चूहों में दृष्टिकोण सूजन 3,14,15 के अध्ययन में अधिक दिलचस्प परिणाम प्रदान कर सकता है। इस अध्ययन में, हम C57BL/6 anesthetized चूहों में सोडियम टॉरोकोलेट के जलसेक द्वारा गंभीर तीव्र अग्नाशयशोथ के प्रजनन के लिए पालन किए जाने वाले चरणों की एक चेकलिस्ट दिखाएंगे।

उन कार्यों के लिए जिनमें एंटीबॉडी के साथ प्रयोगों की आवश्यकता और जीन और प्रोटीन अभिव्यक्ति के विश्लेषण की आवश्यकता शामिल है, चूहों का उपयोग इन जानवरों के लिए सामग्री के अधिक से अधिक शस्त्रागार और आइसोजेनिक और नॉकआउट प्रजातियों के साथ काम करने की संभावना के कारण बेहतर है, दूसरों के बीच जो अध्ययन के लिए प्रासंगिक उपयोग किया जा सकता है16। चूहों C57BL /6 मूल रूप से एंटीट्यूमर गतिविधि और इम्यूनोलॉजी के अध्ययन के लिए विकसित चूहों का एक inbred तनाव है। इस तनाव को शोधकर्ताओं द्वारा आइसोजेनिक होने के लिए तेजी से पसंद किया जा रहा है, जिससे परिणामों की अधिक पुनरुत्पादकता की अनुमति मिलती है, जो एक प्रयोग में जानवरों की एक छोटी संख्या के उपयोग और एक ही समूह 17,18 के बीच परिणामों की कम परिवर्तनशीलता का संकेत दे सकती है।

Perides et al. (2010)14 ने सोडियम टॉरोकोलेट जलसेक द्वारा चूहों में एपी प्रेरण के लिए एक प्रोटोकॉल प्रकाशित किया। यहां हम C57BL / 6 चूहों में एक उच्च सोडियम टॉरोकोलेट एकाग्रता (2.5%) का उपयोग करके इस मॉडल को अपडेट करते हैं, जिसमें एक परिभाषित मात्रा और जलसेक की गति (चित्रा 1) होती है। गंभीरता का अधिकतम स्तर चूहों में प्रेरण के 12 घंटे के भीतर पहुंच गया है। सीरम और पेरिटोनियल गुहा दोनों में आईएल -6 की एकाग्रता की ऊंचाई एपी की प्रगति के साथ सहसंबद्ध है। अभ्यास के साथ, जलसेक के पूरा होने के लिए संज्ञाहरण के प्रेरण से कुल अनुमानित समय, प्रति जानवर 25 मिनट है। यह आवश्यक है कि एक प्रशिक्षित शोधकर्ता इस प्रयोग का संचालन करे। यह सुनिश्चित करने के लिए कि समाधान को आम पित्त नलिका में ठीक से इंजेक्ट किया गया है, सोडियम टॉरोकोलेट के बजाय मेथिलीन ब्लू का उपयोग करके कई पायलट प्रशिक्षण सत्र करें।

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Protocol

इस प्रोटोकॉल को यूएसपी मेडिसिन स्कूल, Num. परियोजना के जानवरों के उपयोग के लिए नैतिकता समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था: 1343/2019-CEUA: FMUSP। इस प्रोटोकॉल के लिए, C57BL / 6 चूहों, जिनकी आयु 6 सप्ताह है, जिनका वजन 20 ± 2 ग्राम था, का उपयोग किया गया था (एन = 9 / समूह)।

1. लैपरोटॉमी

  1. Xylazine (10 मिलीग्राम / किग्रा) और केटामाइन समाधान (80 मिलीग्राम / किग्रा) के साथ जानवरों को एनेस्थेटिक करें, चमड़े के नीचे (शरीर के वजन का 0.1 एमएल / 10 ग्राम) 1 एमएल सिरिंज और 13x0.45 मिमी सुई 26 जी 1/2 का उपयोग करके। पैर की अंगुली चुटकी द्वारा पर्याप्त संज्ञाहरण गहराई के लिए जाँच करें। गर्म पैड का उपयोग करके शरीर के तापमान को नियंत्रित करें। सुनिश्चित करें कि सभी सर्जिकल सामग्री बाँझ हैं।
  2. 5% पोविडोन-आयोडीन समाधान के साथ पेट के क्षेत्र को साफ करें और छाती और निचले पेट (लगभग 2 सेमी 2) के बीच बालों को हटाने के लिए ट्रिमर का उपयोग करें। 70% अल्कोहल के साथ सर्जिकल क्षेत्र को साफ करें।
  3. सर्जिकल टेप का उपयोग कर सर्जिकल बोर्ड पर जानवर को स्थिर करें। त्वचा के 5 मिमी क्षैतिज रूप से काटने के लिए कैंची का उपयोग करें, पेट के ऊपरी हिस्से पर और xiphoid प्रक्रिया के नीचे 1 सेमी। पेरिटोनियम पर कट को दोहराएं। यह गुहा के न्यूनतम जोखिम के साथ एक लैप्रोटॉमी में परिणाम देगा।

2. पता लगाने और अग्न्याशय को उजागर

  1. एक रिट्रेक्टर की सहायता से, जिगर को माउस के सिर की ओर खींचें, ~ आंत से 1 सेमी।
  2. अग्न्याशय के क्षेत्र का पता लगाएं जिसे सोडियम टॉरोकोलेट (अग्न्याशय सिर) के साथ इंजेक्ट किया जाएगा। जिगर के संदर्भ में ग्रहणी का पता लगाएं- जिगर के नीचे, दाईं ओर (बाईं ओर जैसा कि माउस देखा जाता है)। ग्रहणी छोटी आंत का पहला हिस्सा है और पेट के अंतिम भाग से जुड़ा हुआ है।
  3. संदंश की सहायता से, जिगर को जानवरों के सिर की ओर उठाएं, और धीरे से छोटी आंत के हिस्से को खींचें। आम पित्त नलिका के दूरस्थ भाग को बेहतर ढंग से देखने के लिए 6-0 पॉलीप्रोपाइलीन सीवन के साथ छोटी आंत के दो पार्श्व सिरों को ठीक करें।

3. गंभीर तीव्र अग्नाशयशोथ प्रेरण

  1. अस्थायी रूप से एक माइक्रोवेसल क्लिप के साथ समीपस्थ आम पित्त नलिका occlude जिगर में रिसाव से प्रतिगामी जलसेक को रोकने के लिए. आम पित्त नलिका को ग्रहणी के जिगर की ओर देखा जा सकता है और ग्रहणी के साथ इसका जंक्शन सफेद दिखाई देगा। उदर गुहा से बाहर अंग बेनकाब.
  2. 0.54 मिमी पॉलीथीन ट्यूब से जुड़ी 0.4 मिमी सुई के साथ आम पित्त नली तक पहुंचने के लिए पेरिअम्पुलरी क्षेत्र (छोटी आंत की दीवार का सफेद हिस्सा) को पंचर करें।
  3. 8-0 के साथ डिस्टल सामान्य पित्त नलिका का एक अस्थायी रोड़ा बनाएं सोडियम टॉरोकोलेट समाधान को ग्रहणी में रिसाव से रोकने के लिए टांका।
  4. जलसेक पंप शुरू करें और 3 मिनट के लिए 10 μL / 10 ग्राम शरीर के वजन की निरंतर गति पर एक 2.5% सोडियम टॉरोकोलेट समाधान (0.9% खारा में पतला) जलसेक शुरू करें।
  5. जलसेक के बाद, microvessel क्लिप, अस्थायी 8-0 निकालें टांका, और पित्त अग्नाशय की नली से इंजेक्शन सुई पित्त के शारीरिक प्रवाह का पुनर्गठन करने के लिए।
  6. अंत में, 6-0 nonabsorbent monofilament polypropylene टांका के साथ पेट टांका। लैपरोटॉमी और अंत सीवन के बीच का समय अधिकतम 30 मिनट होना चाहिए ( चित्रा 1 देखें)।
  7. सर्जरी के बाद, लकड़ी के शेविंग और पानी और भोजन विज्ञापन लिबिटम के साथ पंक्तिबद्ध पॉलीथीन बक्से में जानवरों को घर दें।
  8. प्रयोगात्मक चूहों के रूप में एक ही तरीके से नियंत्रण चूहों का इलाज करें, लेकिन सुनिश्चित करें कि infusate केवल खारा के होते हैं। शल्य चिकित्सा प्रक्रिया और एक नियंत्रण समूह (एसएएम) में खारा समाधान (10 एमएल / मिनट, 3 मिनट के लिए) के जलसेक को सर्जरी और कैनुलेशन के कारण भड़काऊ पूर्वाग्रह को खत्म करने के लिए करें।
  9. ट्रामाडोल 12.5 मिलीग्राम / किलोग्राम चमड़े के नीचे हर 8 घंटे का उपयोग करें, पोस्ट-सर्जिकल वसूली के बाद शुरू करें।

4. विश्लेषण के लिए तरीके

  1. एपी प्रेरण के बाद 12 घंटे में, कक्षीय जाल के माध्यम से लगभग 250 μL रक्त एकत्र करने के लिए xylazine (10 मिलीग्राम / किग्रा) और केटामाइन (80 मिलीग्राम / किग्रा) के साथ जानवरों को एनेस्थेटिकाइज़ करें।
    1. धीरे से पीठ पर त्वचा को पकड़ो, नेत्रगोलक के एक मामूली फलाव को बढ़ावा देने के लिए, और इसे ऊपर की ओर सामना करने वाली आंखों के साथ स्थिति दें।
    2. जानवर की आंखों में स्थानीय संवेदनाहारी युक्त आंख मरहम की एक बूंद डालें।
    3. आंख के औसत दर्जे के कोने में केशिका ट्यूब के अंत की स्थिति और इसे धीरे से नेत्रगोलक के नीचे डालें, ~ 30 ° -45 ° के कोण के साथ। केशिका ट्यूब को तब तक घुमाएं जब तक कि रक्त का प्रवाह शुरू न हो जाए। याद रखें कि प्रक्रिया के लिए बल का उपयोग करना आवश्यक नहीं है।
    4. एक बार संग्रह समाप्त हो जाने के बाद, पलकों को धुंध के साथ हल्के संपीड़न द्वारा बंद करके होमियोस्टैसिस सुनिश्चित करें। शार्प कंटेनर 19 में केशिका ट्यूब को छोड़ दें।
    5. सीरम (700 x g, 15 मिनट) को सेंट्रीफ्यूज करें और एमिलेज और IL-6 खुराक (चरण 4.7 और 4.8) के लिए supernatant स्टॉक करें।
  2. CO2 श्वासावरोध द्वारा चूहों Euthanize.
  3. पेरिटोनियल गुहा में 4 मिलीलीटर बर्फ-ठंडा 1x पीबीएस इंजेक्ट करने के लिए 27 जी सुई का उपयोग करें। पेट की त्वचा को टेन करें और सुनिश्चित करें कि सुई को पेरिटोनियम में धीरे-धीरे धक्का दिया जाता है ताकि किसी भी अंग को पंचर न किया जा सके। इंजेक्शन के बाद, पेरिटोनियम का पालन करने वाली कोशिकाओं को हटाने के लिए धीरे से 10 सेकंड के लिए पेरिटोनियम की मालिश करें।
  4. कैंची और चिमटी का उपयोग करके, पेट की गुहा को उजागर करने के लिए आंतरिक त्वचा और मांसपेशियों पर एक छोटा सा कट (0.5 सेमी) बनाएं। पेरिटोनियम में एक बल्ब पिपेट डालें और तरल पदार्थ एकत्र करें। ध्यान रखें कि वसायुक्त ऊतक या अन्य अंगों को एस्पिरेट न करें।
  5. जितना संभव हो उतना तरल पदार्थ इकट्ठा करें और एकत्र सेल निलंबन को बर्फ पर रखी गई ट्यूबों में जमा करें। शार्प कंटेनर 20 में बल्ब पिपेट को छोड़ दें। पेरिटोनियल तरल पदार्थ (250 x g, 5 मिनट) को सेंट्रीफ्यूज करें और IL-6 खुराक (चरण 4.9) के लिए supernatant स्टॉक करें।
  6. ग्रहणी (<5mm) से सटे अग्न्याशय क्षेत्र ले लीजिए।
  7. 10% फॉर्मेलिन में फिक्सिंग करके अग्न्याशय को संसाधित करें और इसे पैराफिन में शामिल करें।
    1. प्रकाश माइक्रोस्कोपी के तहत हिस्टोपैथोलॉजिकल विश्लेषण के लिए हेमेटोक्सिलिन और ईोसिन के साथ स्लाइड को दाग दें। एपी की सीमा का आकलन करने के लिए श्मिट के प्रोटोकॉल 21 (अग्नाशयी एडिमा, एसीनार सेल, चोट / परिगलन, अग्नाशय की सूजन) का उपयोग करें।
  8. निर्माता की सिफारिशों के अनुसार व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट का उपयोग करके एमिलेज (यू / डीएल) को मापें।
  9. निर्माता की सिफारिशों के अनुसार वाणिज्यिक किट का उपयोग करके Luminex assays द्वारा IL-6 को मापें।
  10. यदि आवश्यक हो तो -80 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीजर में चरण 4.1 और 4.4 में प्राप्त सीरम और पेरिटोनियल द्रव supernatant को स्टोर करें।

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Representative Results

अग्नाशयशोथ गंभीरता श्मिट के स्केल 21 के अनुसार 0-3 के बीच स्कोर किया गया था, जहां शून्य अनुपस्थिति से मेल खाता है, 1 एक हल्की उपस्थिति (<25%) से मेल खाता है, 2 एक मध्यम उपस्थिति (25 और 50% के बीच) से मेल खाता है और 3 एक तीव्र उपस्थिति (> 50%) से मेल खाता है (तालिका 1)। किए गए माप प्लाज्मा एमाइलेज गतिविधि, अग्नाशयी एडिमा, एसीनर सेल, चोट / परिगलन, अग्नाशय की सूजन (एच एंड ई-दाग वर्गों के हिस्टोलॉजी विश्लेषण द्वारा) और सीरम और पीईआरसी तरल पदार्थ में आईएल -6 साइटोकाइन एकाग्रता थे। गंभीर एपी के 12 घंटे के बाद, एपीटीए समूह ने सीरम एमाइलेज एकाग्रता (6194 ± 336.7 यू / डीएल) में वृद्धि दिखाई, शाम समूह (3845 ± 135.7 यू / डीएल) की तुलना में। उसी समय, एपीटीए समूह ने सीरम और पीईआरसी तरल पदार्थ (चित्रा 2) में आईएल -6 साइटोकाइन एकाग्रता में वृद्धि दिखाई। चित्रा 3 एक प्रतिनिधि hematoxylin-eosin शाम और APTA समूह के धुंधला से पता चलता है.

Figure 1
चित्रा 1: C57BL/6 चूहों में 2.5% सोडियम टॉरोकोलेट द्वारा गंभीर तीव्र अग्नाशयशोथ प्रेरण की योजनाबद्धता। (ए) पित्ताशय की थैली; (बी) सामान्य पित्त नलिका; (सी) अग्नाशय वाहिनी; (डी) पोर्टल नस; (ई) माइक्रोवेसल क्लिप; (एफ) पंचर साइट (एक पॉलीथीन ट्यूब से जुड़ी सुई और जलसेक पंप से जुड़ी); (जी) आम पित्त नलिका में अस्थायी सुई निर्धारण। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: गंभीर तीव्र अग्नाशयशोथ के 12 घंटे के बाद प्रतिनिधि परिणाम। (ए) पशु की सीरम एमिलेज एकाग्रता (यू / डीएल)। (बी) सीरम और पीईआरसी तरल पदार्थ में आईएल -6 साइटोकाइन एकाग्रता। समूहों के बीच अंतर का मूल्यांकन अनपेयर्ड टी-टेस्ट विश्लेषण द्वारा किया गया था * पी <0.05 यदि एपीटीए ≠ शाम (एन = 9 / समूह) है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अंतरालीय एडिमा भड़काऊ घुसपैठ पैरेन्काइमा नेक्रोसिस पैरेन्काइमा रक्तस्राव
धोखा 1±0* 0.0 0.0 0.0
APTA 3±0* 3±0 3±0 3±0
* पी<0,05 अगर शाम≠एपीटीए।

तालिका 1: गंभीर एपी के 12 ज के बाद अग्नाशय के ऊतकों में हिस्टोलॉजिकल परिवर्तन। अग्न्याशय को श्मिट के स्केल 21 के अनुसार संसाधित और विश्लेषण किया गया था। परिणामों को SEM ± माध्य के रूप में व्यक्त किया गया था और समूहों के बीच अंतर का मूल्यांकन छात्र टी परीक्षण द्वारा किया गया था। * पी <0.05 अगर APTA ≠ शाम; (n = 9/group)।

Figure 3
चित्रा 3: प्रतिनिधिhematoxylin-eosin गंभीर एपी के 12 ज के बाद अग्नाशय के ऊतकों में धुंधला. (ए) एसएएम और (बी) एपीटीए अग्नाशय के ऊतकों (हेमेटोक्सिलिन-इओसिन स्टेनिंग- 40x आवर्धन) में हिस्टोलॉजिकल परिवर्तन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

प्रतिगामी सोडियम टॉरोकोलेट जलसेक द्वारा तीव्र अग्नाशयशोथ को प्रेरित करने की विधि पहले से ही चूहों 22,23,24 में दिखाई गई है। 2008, 2010 और 2015 में प्रकाशित तीन समान कार्यों ने प्रोटोकॉल 3,14,15 के लिए एक संदर्भ के रूप में कार्य किया। इस काम में, हम C57BL/6 चूहों में इस विधि को पुन: उत्पन्न करने के लिए सभी महत्वपूर्ण चरणों और इसे मान्य करने के लिए कुछ संभावनाओं को सूचीबद्ध करते हैं।

इस परीक्षण में एक महत्वपूर्ण कदम जिगर में सोडियम टॉरोकोलेट रिफ्लक्स से बचने के लिए एक माइक्रोवेसल क्लिप (चरण 3.1) के साथ हिलम के स्तर पर पित्त नलिका को अवरुद्ध कर रहा है। इस कदम पर बहुत ध्यान देने की आवश्यकता है, क्योंकि पोर्टल नस वाहिनी (चित्रा 1 डी) के बगल में है, इसलिए इसे एक साथ अवरुद्ध न करने के लिए ध्यान दिया जाना चाहिए। सुई को केवल सबसे दूरस्थ वाहिनी भाग में डाला जाना चाहिए। यदि इसे नलिका में गहराई से पेश किया जाता है, तो यह ग्रंथि के पैरेन्काइमा और / या अन्य नलिकाओं के लिए बहने वाले एसिड के साथ टूटने का कारण बन सकता है। जांचें कि पॉलीथीन ट्यूब में आम पित्त नलिका की बाधा को रोकने के लिए अंदर हवा है।

इस मॉडल को माउस पेट में एक चीरा की आवश्यकता होती है। अग्नाशयी वाहिनी छिद्र के माध्यम से कैनुला डालने के लिए अनुभव की आवश्यकता होती है लेकिन इसे प्रशिक्षण 15,25 के साथ प्राप्त किया जा सकता है। यह हाइलाइट करना महत्वपूर्ण है कि इस मॉडल में अग्नाशयशोथ की गंभीरता आनुपातिक रूप से एकाग्रता, जलसेक की मात्रा, जलसेक के दबाव और एपी प्रेरण के समय पर निर्भर करती है। इस प्रकार, नियंत्रित मात्रा और दबाव के साथ एक निरंतर जलसेक मशीन का उपयोग किया जाना चाहिए।

इस अध्ययन के लिए, हमने 2.5% की एकाग्रता को मानकीकृत किया, जिसमें 10 μL / मिनट की जलसेक गति, 3 मिनट और निरंतर दबाव के लिए। एपी के 12 घंटे में, अग्नाशय के ऊतकों के भड़काऊ मापदंडों और परिगलन में वृद्धि देखी गई, जिसमें एपी प्रेरण के बाद 16 घंटे के भीतर जानवरों की मृत्यु हो गई।

यद्यपि एपी के मुख्य कारण शराब की खपत या पित्त पथरी हैं, ये मॉडल प्रयोगात्मक रूप से पुन: प्रस्तुत करने योग्य नहीं हैं26। वर्तमान में, चूहों में एपी प्रेरण के लिए सबसे अधिक उपयोग किए जाने वाले प्रोटोकॉल में 1 घंटे के अंतराल पर सेरूलिन (50 μg / kg शरीर का वजन) के 7 इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन शामिल हैं। सेरूलिन का उपयोग हल्के या मध्यम तीव्र अग्नाशयशोथ को प्रेरित करने के लिए भी किया गया है। इस मॉडल में परिवर्तनशीलता बीमारी के विनाशकारी प्रभावों का अध्ययन करने में इसके उपयोग को सीमित करती है, जो नैदानिक रुग्णता और मृत्यु दर प्रदान करती है। कम समय में उच्च मृत्यु दर को ट्रिगर करने वाले मॉडल गंभीर एपी (नेक्रोटाइज़िंग) के अध्ययन के लिए प्रासंगिक हैं, क्योंकि वे नई दवाओं या हस्तक्षेपों की प्रभावशीलता का मूल्यांकन कर सकते हैं। इन मॉडलों में से युवा मादा कृन्तकों (4 और 6 सप्ताह के बीच) में रक्तस्रावी एपी प्रेरण एक कोलीन-कमी वाले आहार 28 और एल-आर्जिनिन (उदाहरण के लिए, 3 x 3 ग्राम / किग्रा या 2 x 4 ग्राम / किग्रा) आधारित तीव्र अग्नाशयशोथ प्रेरण चूहों में आधारित हैं, लेकिन एपी को प्रेरित करने के लिए एल-आर्जिनिन की उचित खुराक का परीक्षण प्रत्येक प्रयोगशाला द्वारा और प्रत्येक माउस स्ट्रेन 29 में किया जाना चाहिए। 2015 में, एक अध्ययन से पता चला है कि डिस्टल सामान्य पित्त नलिका बंधाव के बाद एक इंट्रा-डक्टल टॉरोकोलेट जलसेक चूहों में अग्नाशयशोथ के एक गंभीर, परिगलित मॉडल की ओर जाता है3। हालांकि, यह मॉडल अपनी अपरिवर्तनीय स्थिति के कारण दवा की प्रभावकारिता और हस्तक्षेप के परीक्षण के लिए उपयोगी नहीं है।

इस अध्ययन में पाए गए परिणाम हाल के साहित्य के साथ सहसंबंधित हैं जैसे कि सीरम एमाइलेज एकाग्रता की ऊंचाई और आईएल -6 रोग की प्रगति से जुड़ा हुआ है। यह संभव है कि भविष्य में, टीएनएफ-α, आईएल -1 और मायलोपेरोक्सीडेज जैसे प्रोटीन का माप गंभीर तीव्र अग्नाशयशोथ 30,31,32 के लिए एक नैदानिक पूर्वानुमान पैरामीटर होगा।

अंत में, वर्तमान अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले प्रोटोकॉल का उपयोग किया जाता है ताकि आम पित्त वाहिनी में सीधे सोडियम टॉरोकोलेट के जलसेक द्वारा चूहों में एपी को प्रेरित किया जा सके, जिसके परिणामस्वरूप अग्नाशय के ऊतकों के परिगलन के साथ गंभीर तीव्र अग्नाशयशोथ होता है जिसे सीरम और पेरिटोनियल तरल पदार्थ में आईएल -6 साइटोकाइन की ऊंचाई के साथ प्रेरण के बाद 12 घंटे में भी देखा जा सकता है और उच्च घातकता के साथ (16 घंटे में 100% मृत्यु दर) डेटा नहीं दिखाया गया है)।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

लेखकों साओ पाउलो विश्वविद्यालय के मेडिकल क्लिनिक में स्नातकोत्तर कार्यक्रम के लिए धन्यवाद; Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) और साओ पाउलो मेडिकल स्कूल (FMUSP) के विश्वविद्यालय।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.4 mm needle INTRAG MEDICAL TECH 90183210 30G
 0.54 mm polyethylene tube Tygon 730010 -
Styrofoam block - - -
masking tape for mounting the mouse Missner 1236 -
Infusion pump scheduled to 10µL / min. Havard aparatus-Peristaltic Pump Series MA1 55-7766  Model 66 Small Peristaltic
Scissors and forceps
Antiseptic providine iodine Pfizer 12086OR antisepsis
70% ethanol SIGMA 459836 Mix 700 mL 100% ethanol with 300 mL dH2O
Razor blade Lord bdk9a1ghk6 For trichotomy
Sodium taurocholate Sigma-Aldrich 86339- 1G CAS NUMBER- 345909-26-4
microvessel clip Medicon Surgical 56.87.35 Approximator, opening 4.0 mm, closing pressure 30 - 40 g
6-0 prolene Bioline 5162 Suture line
Ketamin NP (cloridrato de dextrocetamina) 50mg/mL Cristália
Xilazine 2% Syntec
Sterile saline solution (0.9% (wt/vol) saline) Farmace 105851
Methyl Blue Sigma-Aldrich Chemicals M5528
MILLIPLEX MAP Mouse Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel - Immunology Multiplex Assay MERCK MCYTOMAG-70K Simultaneously analyze multiple cytokine and chemokine biomarkers with Bead-Based Multiplex Assays using the Luminex technology, in mouse serum, plasma and cell culture samples.
Amylase Assay Labtest 11
Desmarres retractor 13-mm
width		 ROBOZ RS-6672

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References

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दवा मुद्दा 172 तीव्र अग्नाशयशोथ सोडियम taurocholate चूहों अग्नाशयशोथ अग्न्याशय सूजन गंभीर अग्नाशयशोथ C57BL /
सोडियम टॉरोकोलेट प्रेरित गंभीर तीव्र अग्नाशयशोथ C57BL/
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Serra, M. B., Koike, M. K.,… More

Serra, M. B., Koike, M. K., Barbeiro, D. F., Machado, M. C. C., de Souza, H. P. Sodium Taurocholate Induced Severe Acute Pancreatitis in C57BL/6 Mice. J. Vis. Exp. (172), e61547, doi:10.3791/61547 (2021).

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