Summary
Los modelos animales para la pancreatitis aguda grave permiten el estudio de los cambios fisiopatológicos en la etapa inicial, facilitando la observación de la evolución de los eventos inflamatorios. Aquí proporcionamos un protocolo para la inducción de pancreatitis biliar aguda grave por infusión retrógrada de taurocolato de sodio en el conducto pancreático de ratones C57BL/ 6 anestesiados.
Abstract
La inducción de la pancreatitis aguda biliar por infusión de taurocolato de sodio ha sido ampliamente utilizada por la comunidad científica debido a la representación de la condición clínica humana y la reproducción de eventos inflamatorios correspondientes a la aparición de pancreatitis biliar clínica. La gravedad del daño pancreático se puede evaluar midiendo la concentración, la velocidad y el volumen del ácido biliar infundido. Este estudio proporciona una lista de verificación actualizada de los materiales y métodos utilizados en la reproducción del protocolo y muestra los principales resultados de este modelo de pancreatitis aguda (AP). La mayoría de las publicaciones anteriores se han limitado a reproducir este modelo en ratas. Hemos aplicado este método en ratones, lo que proporciona ventajas adicionales (es decir, la disponibilidad de un arsenal de reactivos y anticuerpos para estos animales junto con la posibilidad de trabajar con cepas de ratones modificadas genéticamente) que pueden ser relevantes para el estudio. Para la inducción de pancreatitis aguda en ratones, presentamos un protocolo sistemático, con una dosis definida de taurocolato de sodio al 2,5% a una velocidad de infusión de 10 μL/min durante 3 min en ratones C57BL/6 que alcanza su nivel máximo de gravedad dentro de las 12 h de la inducción y destaca los resultados con resultados que validan el método. Con la práctica y la técnica, el tiempo total estimado, desde la inducción de la anestesia hasta la finalización de la infusión, es de 25 min por animal.
Introduction
En humanos, la presencia de cálculos biliares es la causa más frecuente de pancreatitis debido a la obstrucción de la porción terminal del coledocal, interrumpiendo el flujo de secreciones pancreáticas y provocando un intenso proceso inflamatorio en el páncreas, con un aumento de la concentración de enzimas digestivas en el suero y mediadores inflamatorios1,2.
Se han propuesto dos teorías diferentes para explicar el desarrollo de la pancreatitis aguda (PA). La teoría del "canal común" sugiere que los cálculos presentes en la vesícula biliar obstruyen el sistema de conductos biliares comunes distales, permitiendo que la secreción biliar fluya retrógrada hacia el conducto pancreático. La segunda teoría (la teoría de la "obstrucción del conducto") sugiere que la obstrucción del conducto pancreático por exceso de cálculos biliares provoca un bloqueo en el flujo de secreción pancreática al duodeno, causando hipertensión ductal3. Aunque los mecanismos que conducen a la pancreatitis biliar aguda no se comprenden completamente, el resultado es un proceso inflamatorio intenso. La erupción enzimática digestiva y la autodigestión del páncreas conducen a cambios histopatológicos, un aumento de las citoquinas inflamatorias (IL-1β, IL-6, TNF-α) en el líquido ascítico y el suero, y un aumento de las proteínas de fase aguda4,5,6.
La pancreatitis aguda grave es una afección que merece atención clínica debido a la afectación de múltiples órganos y a un alto riesgo de mortalidad. Los modelos animales para la reproducción de la pancreatitis aguda (PA) son importantes ya que explican los mecanismos fisiopatológicos de la enfermedad y ayudan a monitorear la evolución de los eventos inflamatorios, a partir de las etapas iniciales de la enfermedad. Esto generalmente no es posible en las clínicas2,7. Además, el acceso a los tejidos pancreáticos es fácil en estudios preclínicos, favoreciendo la elucidación de los cambios vinculados a las condiciones clínicas8 junto con la posibilidad de trabajar con especies isogénicas, eliminando variables indeseables y reflejando la similitud clínica con los resultados observados en la condición humana9.
Los modelos biliares y no biliares para la inducción de pancreatitis aguda en especies de ratas y ratones se han estudiado con frecuencia en la literatura científica. Los métodos no biliares de inducción incluyen la administración de dosis estimulantes supramáximas del secretagogo colecistoquinina o su análogo ceruleína10; administración de dosis casi letales de L-arginina; o la administración de una dieta deficiente en colina suplementada con etionina11. Aunque estos métodos son fáciles de reproducir y dan lugar a la inflamación pancreática, no replican los mecanismos que en teoría desencadenan la PA (es decir, el reflujo de la secreción biliar en el conducto pancreático). La técnica que aborda el modelo biliar se basa en la infusión retrógrada de ácidos biliares en el conducto pancreático y requiere de investigadores bien formados para llevar a cabo este protocolo. Se han publicado varios estudios utilizando este método en ratas (aparentemente por razones técnicas ya que estos experimentos implican procedimientos quirúrgicos)12,13. Sin embargo, el abordaje en ratones puede ofrecer resultados más interesantes en el estudio de la inflamación3,14,15. En este estudio, mostraremos una lista de verificación de los pasos a seguir para la reproducción de la pancreatitis aguda grave por infusión de taurocolato de sodio en ratones anestesiados C57BL/6.
Para trabajos que impliquen la necesidad de experimentos con anticuerpos y análisis de la expresión génica y proteica, es preferible el uso de ratones por el mayor arsenal de materiales para estos animales y la posibilidad de trabajar con especies isogénicas y knockout, entre otras que pueden ser utilizadas relevantes para estudios16. Ratones C57BL/6 es una cepa endogámica de ratones desarrollada originalmente para el estudio de la actividad antitumoral y la inmunología. Esta cepa está siendo cada vez más preferida por los investigadores por ser isogénica, lo que permite una mayor reproducibilidad de los resultados, lo que puede implicar el uso de un menor número de animales en un experimento y una menor variabilidad de resultados entre un mismo grupo17,18.
Perides et al. (2010)14 publicaron un protocolo para la inducción de AP en ratones por infusión de taurocolato de sodio. Aquí actualizamos este modelo utilizando una mayor concentración de taurocolato de sodio (2,5%) en ratones C57BL/6, con un volumen y velocidad de infusión definidos (Figura 1). El nivel máximo de gravedad se alcanza dentro de las 12 h de la inducción en ratones. La elevación de la concentración de IL-6 tanto en el suero como en la cavidad peritoneal se correlaciona con la progresión de la PA. Con la práctica, el tiempo total estimado desde la inducción de la anestesia hasta la finalización de la infusión, es de 25 min por animal. Es esencial que un investigador capacitado realice este experimento. Para asegurarse de que la solución se inyecta correctamente en el conducto biliar común, realice varias sesiones de entrenamiento piloto utilizando azul de metileno en lugar de taurocolato de sodio.
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Protocol
Este protocolo fue aprobado por el Comité de Ética para el uso de animales de la Facultad de Medicina de la USP, Num. Proyecto: 1343/2019-CEUA: FMUSP. Para este protocolo se utilizaron ratones C57BL/6, de 6 semanas de edad, con un peso de 20 ± 2 g (n = 9/grupo).
1. Laparotomía
- Anestesiar a los animales con xilazina (10 mg/kg) y solución de ketamina (80 mg/kg), por vía subcutánea (0,1 ml/10 g de peso corporal) utilizando una jeringa de 1 ml y una aguja de 13x0,45 mm 26G 1/2. Compruebe si hay suficiente profundidad de anestesia pellizcando el dedo del pie. Controle la temperatura corporal con almohadillas térmicas. Asegúrese de que todos los materiales quirúrgicos sean estériles.
- Limpie el área abdominal con una solución de povidona yodada al 5% y use un recortador para eliminar el vello entre el pecho y la parte inferior del abdomen (aproximadamente 2 cm2). Limpie el área quirúrgica con alcohol al 70%.
- Inmovilizar al animal en el tablero quirúrgico usando cinta quirúrgica. Use tijeras para cortar 5 mm de la piel horizontalmente, en la parte superior del abdomen y 1 cm por debajo del proceso xifoide. Repita el corte en el peritoneo. Esto dará como resultado una laparotomía con una exposición mínima de la cavidad.
2. Localizar y exponer el páncreas
- Con la ayuda de un retractor, tire del hígado hacia la cabeza del ratón, ~ 1 cm del intestino.
- Localice la región del páncreas a la que se le inyectará taurocolato de sodio (cabeza del páncreas). Ubique el duodeno con referencia al hígado, debajo del hígado, en el lado derecho (a la izquierda como se ve el ratón). El duodeno es la primera parte del intestino delgado y está conectado a la porción final del estómago.
- Con la ayuda de fórceps, levante el hígado hacia la cabeza del animal y tire suavemente de la porción del intestino delgado. Fije los dos extremos laterales del intestino delgado con una sutura de polipropileno 6-0 para ver mejor la porción distal del conducto biliar común.
3. Inducción de pancreatitis aguda grave
- Ocluya temporalmente el conducto biliar común proximal con un clip de microvasos para evitar que la infusión retrógrada se filtre en el hígado. El conducto biliar común se puede ver en el lado hepático del duodeno y su unión con el duodeno aparecerá blanca. Exponga el órgano fuera de la cavidad abdominal.
- Punción de la región periampular (parte blanquecina de la pared del intestino delgado) para acceder al conducto biliar común con una aguja de 0,4 mm conectada a un tubo de polietileno de 0,54 mm.
- Hacer una oclusión temporal del conducto biliar común distal con 8-0 sutura para evitar que la solución de taurocolato de sodio se filtre en el duodeno.
- Inicie la bomba de perfusión y programe una infusión de solución de taurocolato de sodio al 2,5% (diluida en solución salina al 0,9%) a una velocidad constante de 10 μL/10 g de peso corporal durante 3 min.
- Después de la infusión, retire el clip de microvaso, el temporal 8-0 sutura y la aguja de inyección del conducto pancreático biliar para reconstituir el flujo fisiológico de la bilis.
- Al final, suture el abdomen con 6-0 sutura de polipropileno monofilamento no absorbente. El tiempo entre la laparotomía y la sutura final debe ser de un máximo de 30 min (ver Figura 1).
- Después de la cirugía, aloje a los animales en cajas de polietileno forradas con virutas de madera y agua y alimentos ad libitum.
- Trate a los ratones de control de la misma manera que a los ratones experimentales, pero asegúrese de que la infusión consista solo en solución salina. Realizar el procedimiento quirúrgico y la infusión de solución salina (10 ml/min, durante 3 min) en un grupo control (SHAM) para eliminar el sesgo inflamatorio causado por la cirugía y la canulación.
- Use tramadol 12,5 mg/kg por vía subcutánea cada 8 horas, comenzando después de la recuperación postquirúrgica.
4. Métodos de análisis
- A las 12 h después de la inducción de AP, anestesiar a los animales con xilazina (10 mg/kg) y ketamina (80 mg/kg) para recolectar aproximadamente 250 μL de sangre a través del plexo orbitario.
- Sostenga suavemente la piel en la espalda, promoviendo una ligera protuberancia del globo ocular, y colóquelo con el ojo hacia arriba.
- Inculque una gota de ungüento para los ojos que contenga anestésico local en el ojo del animal.
- Coloque el extremo del tubo capilar en la esquina medial del ojo e insértelo suavemente debajo del globo ocular, con un ángulo de ~ 30 ° -45 °. Gire el tubo capilar hasta que comience el flujo sanguíneo. Recuerde que no es necesario usar la fuerza para el procedimiento.
- Una vez finalizada la recolección, asegure la homeostasis manteniendo los párpados cerrados por compresión ligera con la gasa. Deseche el tubo capilar en el contenedor de objetos punzantes19.
- Centrifugar el suero (700 x g, 15 min) y almacenar el sobrenadante para la dosis de amilasa e IL-6 (pasos 4.7 y 4.8).
- Sacrificar ratones por asfixia de CO2 .
- Use una aguja de 27 G para inyectar 4 ml de 1x PBS helado en la cavidad peritoneal. Tensar la piel abdominal y asegurarse de que la aguja se empuja lentamente en el peritoneo para no perforar ningún órgano. Después de la inyección, masajee suavemente el peritoneo durante 10 s para eliminar las células adheridas al peritoneo.
- Usando tijeras y pinzas, haga un pequeño corte (0,5 cm) en la piel interna y la musculatura para exponer la cavidad abdominal. Inserte una pipeta de bulbo en el peritoneo y recoja el líquido. Tenga cuidado de no aspirar tejido graso u otros órganos.
- Recolecte la mayor cantidad de líquido posible y deposite la suspensión celular recolectada en tubos mantenidos en hielo. Deseche la pipeta de la bombilla en el contenedor de objetos punzantes20. Centrifugar el líquido peritoneal (250 x g, 5 min) y almacenar el sobrenadante para la dosificación de IL-6 (paso 4.9).
- Recoger la región del páncreas adyacente al duodeno (<5 mm).
- Procesa el páncreas fijando en formalina al 10% e incorpóralo a la parafina.
- Tiñe los portaobjetos con hematoxilina y eosina para análisis histopatológicos bajo microscopía de luz. Utilice el protocolo de Schmidt21 (edema pancreático, célula acinar, lesión/necrosis, inflamación pancreática) para evaluar la extensión de la PA.
- Mida la amilasa (U/dL) utilizando kits disponibles comercialmente de acuerdo con las recomendaciones del fabricante.
- Mida IL-6 mediante ensayos Luminex utilizando kits comerciales de acuerdo con las recomendaciones del fabricante.
- Guarde el suero y el sobrenadante de líquido peritoneal obtenidos en los pasos 4.1 y 4.4 en un congelador a -80 °C si es necesario.
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Representative Results
La gravedad de la pancreatitis se puntuó entre 0-3 según la escala de Schmidt21 donde cero corresponde a la ausencia, 1 corresponde a una presencia leve (<25%), 2 corresponde a una presencia moderada (entre 25 y 50%) y 3 corresponde a una presencia intensa (> 50%) (Tabla 1). Las mediciones realizadas fueron actividad plasmática de la amilasa, edema pancreático, célula acinar, lesión/necrosis, inflamación pancreática (por análisis histológico de secciones teñidas con H&E) y concentración de citoquinas IL-6 en el suero y el líquido PerC. Después de 12 h de AP grave, el grupo apta mostró un aumento en la concentración sérica de amilasa (6194 ± 336,7 U/dL), en comparación con el grupo simulado (3845 ± 135,7 U/dL). Al mismo tiempo, el grupo APTA mostró un aumento de la concentración de citoquinas IL-6 en el suero y el líquido PerC (Figura 2). La Figura 3 muestra una tinción representativa de hematoxilina-eosina del grupo simulado y APTA .
Figura 1: Esquemas de inducción de pancreatitis aguda grave por taurocolato de sodio al 2,5% en ratones C57BL/6. (A) vesícula biliar; (B) conducto biliar común; (C) conducto pancreático; (D) vena porta; (E) clip de microvaso; (F) sitio de punción (aguja unida a un tubo de polietileno y conectada a la bomba de infusión); (G) fijación temporal de aguja en el conducto biliar común. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Resultados representativos después de 12 h de pancreatitis aguda grave. (A) Concentración sérica de amilasa (U/dL) en animales. (B) Concentración de citoquinas IL-6 en suero y líquido PerC. Las diferencias entre los grupos se evaluaron mediante análisis de prueba t no apareada * p <0,05 si APTA ≠ simulación (n = 9 / grupo). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Edema intersticial | Infiltración inflamatoria | Necrosis del parénquima | Hemorragia por parénquima | |
| FINGIR | 1±0* | 0.0 | 0.0 | 0.0 |
| APTA | 3±0* | 3±0 | 3±0 | 3±0 |
| *P<0,05 si SHAM≠APTA. |
Tabla 1: Cambios histológicos en el tejido pancreático después de 12 h de PA grave. El páncreas fue procesado y analizado según la escala de Schmidt21. Los resultados se expresaron como media ± SEM y las diferencias entre los grupos se evaluaron mediante la prueba t de Student. * p <0,05 si APTA ≠ SHAM; (n=9/grupo).
Figura 3: Tinción representativa de hematoxilina-eosina en tejido pancreático después de 12 h de PA grave. Cambios histológicos en (A) SHAM y (B) APTA tejido pancreático (tinción de hematoxilina-eosina- aumento de 40x). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
El método de inducción de la pancreatitis aguda por infusión retrógrada de taurocolato de sodio ya se ha demostrado en ratas22,23,24. Tres trabajos similares, publicados en 2008, 2010 y 2015, sirvieron de referencia para el protocolo3,14,15. En este trabajo, enumeramos todos los pasos críticos para reproducir este método en ratones C57BL / 6 y algunas posibilidades para validarlo.
Un paso crítico en esta prueba es bloquear el conducto biliar a nivel del hilio con un clip de microvaso (paso 3.1) para evitar el reflujo de taurocolato de sodio en el hígado. Este paso requiere mucha atención, ya que la vena porta está al lado del conducto (Figura 1D), por lo que se debe tener cuidado de no bloquearla. La aguja debe insertarse solo en la porción del conducto más distal. Si se introduce profundamente en el conducto, puede provocar una ruptura con el ácido desbordándose al parénquima glandular y/o a otros conductos14. Verifique que el tubo de polietileno tenga aire en su interior para evitar la obstrucción del conducto biliar común.
Este modelo requiere una incisión en el abdomen del ratón. La inserción de la cánula a través del orificio del conducto pancreático requiere experiencia, pero eso se puede lograr con entrenamiento15,25. Es importante destacar que la gravedad de la pancreatitis en este modelo depende proporcionalmente de la concentración, el volumen de la infusión, la presión de la infusión y el tiempo de inducción de AP. Por lo tanto, se debe utilizar una máquina de infusión constante con volumen y presión controlados.
Para este estudio, estandarizamos una concentración de 2,5%, con una velocidad de infusión de 10 μL/min, durante 3 min y presión constante. A las 12 h de AP, se observó un aumento de los parámetros inflamatorios y necrosis de los tejidos pancreáticos, con animales que murieron dentro de las 16 h posteriores a la inducción de AP.
Aunque las principales causas de la PA son el consumo de alcohol o los cálculos biliares, estos modelos no son reproducibles experimentalmente26. Actualmente, el protocolo más utilizado para la inducción de AP en ratones consiste en 7 inyecciones intraperitoneales de ceruleína (50 μg/kg de peso corporal) a intervalos de 1 h27. La ceruleína también se ha utilizado para inducir una pancreatitis aguda leve o moderada. La variabilidad en este modelo limita su uso en el estudio de los efectos destructivos de la enfermedad, que confieren morbilidad y mortalidad clínica10. Los modelos que desencadenan una alta mortalidad en poco tiempo son relevantes para el estudio de la PA grave (necrotizante), ya que pueden evaluar la efectividad de nuevos fármacos o intervenciones. Entre estos modelos se encuentran la inducción hemorrágica de AP en roedores hembras jóvenes (entre 4 y 6 semanas) mediante una dieta deficiente en colina28 y la inducción de pancreatitis aguda basada en L-arginina (por ejemplo, 3 x 3 g/kg o 2 x 4 g/kg) en ratones, pero la dosificación adecuada de L-arginina para inducir AP debe ser probada por cada laboratorio y en cada cepa de ratón29. En 2015, un estudio mostró que una infusión intraductal de taurocolato seguida de ligadura distal del conducto biliar común conduce a un modelo necrótico severo de pancreatitis en ratones3. Sin embargo, este modelo no es útil para probar la eficacia de los medicamentos y las intervenciones debido a su condición irreversible.
Los resultados encontrados en este estudio se correlacionan con la literatura reciente, como la elevación de la concentración sérica de amilasa y la IL-6 asociada con la progresión de la enfermedad. Es posible que en el futuro, la medición de proteínas como el TNF-α, la IL-1β y la mieloperoxidasa sea un parámetro pronóstico clínico para la pancreatitis aguda grave30,31,32.
En conclusión, el protocolo utilizado en el presente estudio para inducir AP en ratones mediante la infusión de taurocolato de sodio directamente en el conducto biliar común da como resultado una pancreatitis aguda grave con necrosis del tejido pancreático que se puede observar incluso a las 12 h después de la inducción con elevación de la citoquina IL-6 en el suero y el líquido peritoneal y con alta letalidad (100% de mortalidad en 16 h, datos no mostrados).
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores agradecen el Programa de Postgrado en Clínica Médica de la Universidad de São Paulo; Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) y Facultad de Medicina de la Universidad de São Paulo (FMUSP).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.4 mm needle | INTRAG MEDICAL TECH | 90183210 | 30G |
| 0.54 mm polyethylene tube | Tygon | 730010 | - |
| Styrofoam block | - | - | - |
| masking tape for mounting the mouse | Missner | 1236 | - |
| Infusion pump scheduled to 10µL / min. | Havard aparatus-Peristaltic Pump Series | MA1 55-7766 | Model 66 Small Peristaltic |
| Scissors and forceps | |||
| Antiseptic providine iodine | Pfizer | 12086OR | antisepsis |
| 70% ethanol | SIGMA | 459836 | Mix 700 mL 100% ethanol with 300 mL dH2O |
| Razor blade | Lord | bdk9a1ghk6 | For trichotomy |
| Sodium taurocholate | Sigma-Aldrich | 86339- 1G | CAS NUMBER- 345909-26-4 |
| microvessel clip | Medicon Surgical | 56.87.35 | Approximator, opening 4.0 mm, closing pressure 30 - 40 g |
| 6-0 prolene | Bioline | 5162 | Suture line |
| Ketamin NP (cloridrato de dextrocetamina) 50mg/mL | Cristália | ||
| Xilazine 2% | Syntec | ||
| Sterile saline solution (0.9% (wt/vol) saline) | Farmace | 105851 | |
| Methyl Blue | Sigma-Aldrich Chemicals | M5528 | |
| MILLIPLEX MAP Mouse Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel - Immunology Multiplex Assay | MERCK | MCYTOMAG-70K | Simultaneously analyze multiple cytokine and chemokine biomarkers with Bead-Based Multiplex Assays using the Luminex technology, in mouse serum, plasma and cell culture samples. |
| Amylase Assay | Labtest | 11 | |
| Desmarres retractor 13-mm width |
ROBOZ | RS-6672 |
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